CN103937491A - 一种试剂及其在硫化氢检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测硫化氢(H2S)的试剂，它是5-曡氮荧光素醌。此试剂由5-氨基荧光素在亚硝酸钠和叠氮钠条件下，在醋酸和水中室温下反应2.5小时制得，原料便宜，反应条件简单，易于生产。本发明提供了硫化氢的定量检测方法，是基于5-曡氮荧光素醌，在乙腈/HEPES(pH7.4)的溶液中定量地检测硫化氢的含量。该检测方法，对硫化氢显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种试剂及其在硫化氢检测中的应用
技术领域
本发明涉及硫化氢的检测技术，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测硫化氢中的应用。
背景技术
硫化氢具有臭鸡蛋味一直被视为环境有毒气体。然而，最近的研究表明H2S是除了两种众所周知的气体信号传送器一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)外的第三种具有细胞保护作用的内源性气体信号化合物。硫化氢在许多病症中具有保护作用：如血管生成、血管舒张、细胞凋亡、炎症调节、神经调制等。另一方面，细胞中异常硫化氢水平能引起许多疾病如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、糖尿病、肝硬化。这些新兴的生物学作用的发现导致人们对H2S的研究兴趣与日俱增。因此，要求发展快速、准确、可靠的方法来检测H2S，以便为更好地理解它的生物学功能提供有用的信息。近年来，一些仪器的分析技术已经发展到检测各种环境，医疗和细胞中的H2S。事实上，基于荧光的测定法，因为发射信号的快速、非破坏性、选择性、敏感的优点在活细胞，组织和生物体的各种分析物的荧光成像上有广泛的用途。在本发明中我们合成了一种新的化合物，5-曡氮荧光素醌，通过H2S将曡氮还原为胺基，化合物的荧光性质在反应前后的变化实现了硫化氢的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种选择性高、水溶性好的定量检测硫化氢的试剂，以及该试剂在硫化氢检测中的应用。
本发明提供的快速检测硫化氢的试剂和方法，是基于一种5-曡氮荧光素醌，在pH为7.4的HEPES溶液和乙腈混合溶液中定量地检测硫化氢的含量。该检测方法，对硫化氢显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
该试剂的结构式是：
该试剂的合成方法，步骤为：将5-氨基荧光素溶解在体积比2:1的醋酸和H2O的混合溶液中，冷却到0℃，然后加入NaNO2搅拌15分钟，再加入NaN3，在0℃反应1小时，升温到室温再反应1小时，悬浮液真空抽滤，固体用盐酸和水洗涤，真空干燥后，得到黄色的5-曡氮荧光素醌固体；5-氨基荧光素、NaNO2和NaN3的摩尔比1:1.5:1.5。
用该试剂检测硫化氢的方法，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液；
(2)、按体积比1000:1000:1，将HEPES缓冲溶液、乙腈溶液和5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,531nm的荧光强度逐渐增强；
(3)、用蒸馏水配制2mM的硫化氢溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液1μL的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入硫化氢溶液的体积为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL时，在荧光分光光度仪上测定531nm对应的荧光强度F为95、175、273、382、467、539、643、717、802、883，以硫化氢浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦17，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝-3.14+440c，c的单位为μM；
(4)、将HEPES缓冲溶液1000uL、乙腈溶液1000μL和5-曡氮荧光素醌乙腈溶液1uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝(2000+V待测样)μL×c×10-6/VμL,即可求得硫化氢的浓度。
本发明具有如下优点和效果：1、合成了一种新型的醌类化合物；2、本发明的检测方法，对硫化氢显示了高的灵敏性和选择性；3、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。
附图说明
图1a实施例1制备得到的试剂的核磁1HNMR图谱
图1b实施例1制备得到的试剂的核磁13CNMR图谱
图1c实施例1制备得到的试剂的质谱图
图2实施例2试剂与硫化氢作用的荧光发射图
图3实施例3试剂与各种分析物的荧光柱状图
图4实施例4测定硫化氢的工作曲线
图5实施例5细胞成像图
具体实施方式
实施例1
0.35g5-氨基荧光素溶解在10mL2:1的醋酸/H2O中，冷却到0℃，然后加入0.1g的NaNO2搅拌15分钟，再加入0.1g的NaN3，在0℃反应1小时，升温到室温再反应1小时，悬浮液真空抽滤，固体用20mL2M的盐酸和100mL水洗涤，真空干燥后，得到黄色的5-曡氮荧光素醌固体。
1H NMR(DMSO-d6):δ7.89(s,1H),6.71(d,J＝8.0Hz,4H),6.21(s,4H),5.4(s,2H)(图1a).13C NMR(DMSO-d6):δ168.6,159.0,154.4,151.3,148.2,128.5,127.4,126.2,125.1,113.8,112.1,108.7,82.7(图1b).元素分析(calcd.％)for C20H11N3O5:C,64.17；H,3.23；N11.23,Found:C,64.20；H,3.20；N11.22.ESI-MS m/z:[试剂+H]+，374.25(图1c).
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的5-曡氮荧光素醌溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液及1μL的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，取硫化氢的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着硫化氢的加入，531nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图2。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的5-曡氮荧光素醌溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液及1μL的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，再分别加入2摩尔当量的硫化氢，以及50摩尔当量的各种分析物：F-,Br-,I-,AcO-,ClO-,HCO3 -,HPO4 2-,NO2 -,HSO3 -,S2O3 2-,S2O4 2-,S2O5 2-,SCN-,CN-,SO4 2-,C2O4 2-,SiO3 2-,Cys和GSH在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的531nm相对荧光强度的柱状图，(见图3)。硫化氢使得5-曡氮荧光素醌荧光强度由17变到883，其它的分析物基本没有引起5-曡氮荧光素醌荧光强度的变化。
经实验证明，其它分析物不干扰体系对硫化氢的测定。
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的5-曡氮荧光素醌溶液，用蒸馏水配制2mM的硫化氢溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液和1μL的5-曡氮荧光素醌溶液加到荧光比色皿中，分别在加入硫化氢溶液的体积为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL时，在荧光分光光度仪上测定531nm对应的荧光强度F为95、175、273、382、467、539、643、717、802、883，以硫化氢浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦17，得到硫化氢浓度的工作曲线(见图4)；线性回归方程为：F－F0＝-1.61+264.9c，c的单位为μM。
实施例5
用乙腈配制2mM的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液；将5-曡氮荧光素醌加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为1μM，与肝癌细胞HepG2在37℃下，反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下无荧光发射；将5-曡氮荧光素醌溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为1μM，与肝癌细胞HepG2在37℃下，反应30min，再加入外源的硫化氢(0.5μM)，在37℃下，再反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下有弱的绿色荧光发射；将5-曡氮荧光素醌溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为1μM，与肝癌细胞HepG2在37℃下，反应30min，再加入外源的硫化氢(2μM)，在37℃下，再反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下有强的绿色荧光发射。图5为荧光共聚焦成像仪下与5-曡氮荧光素醌反应的细胞a(无荧光发射)、d(a的明场)以及先与5-曡氮荧光素醌作用再与外源的硫化氢作用的细胞b(弱的绿色荧光)、e(b的明场)和c(强的绿色荧光)、f(c的明场)成像图。

Claims (3)

1.一种试剂，它是5-曡氮荧光素醌，其特征在于结构式为：
2.如权利要求1所述的一种试剂的合成方法，其特征在于步骤为：将5-氨基荧光素溶解在体积比2:1的醋酸和H2O的混合溶液中，冷却到0℃，然后加入NaNO2搅拌15分钟，再加入NaN3，在0℃反应1小时，升温到室温再反应1小时，悬浮液真空抽滤，固体用盐酸和水洗涤，真空干燥后，得到黄色的5-曡氮荧光素醌固体；5-氨基荧光素、NaNO2和NaN3的摩尔比1:1.5:1.5。
3.一种检测硫化氢的方法：其特征在于，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液；
(2)、按体积比1000:1000:1，将HEPES缓冲溶液、乙腈溶液和5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,531nm的荧光强度逐渐增强；
(3)、用蒸馏水配制2mM的硫化氢溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液1μL的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入硫化氢溶液的体积为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL时，在荧光分光光度仪上测定531nm对应的荧光强度F为95、175、273、382、467、539、643、717、802、883，以硫化氢浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦17，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝-3.14+440c，c的单位为μM；
(4)、将HEPES缓冲溶液1000uL、乙腈溶液1000μL和5-曡氮荧光素醌乙腈溶液1uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝(2000+V待测样)μL×c×10-6/VμL,即可求得硫化氢的浓度。
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