KR20180058737A - 암 선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거-활성화 대사성 당 전구체 - Google Patents

암 선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거-활성화 대사성 당 전구체 Download PDF

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KR20180058737A
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후아 왕
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더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈
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Abstract

암 세포의 세포-표면 당의 선택적 표지화를 위한 화합물이 개시되어 있된다. 본 화합물은 암 세포에 특이적인 트리거에 의해 활성화 가능하고, 대사작용되는 경우, 아지드 화학기를 갖는 암 세포 표면 당을 표지화한다. 클릭 화학 반응에 의해 촉진되는 경우, 알키닐-약물 콘주게이트와 세포 표면-발현된 아지드의 조합은 감소된 독성으로 암 세포에 효율적인 표적화된 약물 전달을 가능하게 한다. 또한, 아지드 함유 암 세포에 약물을 전달하기 위한 화합물, 및 본 발명의 화합물을 사용하는 암의 치료 방법이 개시된되어 있다.

Description

암 선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거-활성화 대사성 당 전구체
관련 출원
본 출원은 2015년 10월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/238,326호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
암 표적 요법은 암에서의 약물의 축적을 개선하고, 신체의 다른 부분에의 원하지 않는 이의 노출을 최소화하기 위해 추구되어 왔다. 암 조직에서의 특유의 수용체의 확인 및 대응하는 표적화된 리간드의 개발이 주요 극복과제이다. 다수의 유형의 표적화 리간드가 개발되었고, 이는 소분자, 펩타이드, 및 압타머를 포함한다. 그러나, 그것의 대응하는 수용체는 거의 암 특이적이지 않고, 단백질 수용체와 이들 리간드 사이의 결합 친화성은 상대적으로 낮다. 지금까지 개발된 가장 유망한 표적화 리간드는 단클론성 항체 (mAb)이다. 이러한 분야에서의 진전은 세포외/세포 표면 단백질에 대해 특이적인 mAb를 생성하는 것을 가능하게 하였고, 다수의 암-배타적인 단백질이 확인되었다. 임상적으로 가장 성공적인 표적화 리간드임에도 불구하고, mAb는 높은 생산 비용, 큰 크기, 중증 면역원성, 수용체 포화, 및 좋지 못한 고형 종양 침투와 같은 다수의 단점이 문제된다. 또한, 개발된 각각의 mAb는 특정 유형의 암에 대해서만 잘 작용하고, 이는 표적화된 단백질 수용체가 암에 따라 변화되기 때문이다.
현저하게는, 모든 현존하는 활성 표적화 전략 중에서 일반적인 특징은 세포 표면 단백질이 표적으로 간주되는 것이다. 단백질은 표적화 리간드와의 특이적 결합을 위해 다수의 소수성이고 하전된 부분을 제공하기 때문에 이러한 선택은 일리가 있다. 그러나, 세포 표면 단백질의 수밀도는 세포막 상의 다른 2개의 주요 구성요소인 당류 및 지질과 비교하여 매우 낮다. 표면-부착 당류는 유망한 표적을 나타내고, 세포 인식 및 소통을 조절하는데 있어서 생명 유지 관련 역할을 하는 것으로 이미 알려져 있다. 비천연 당류 (예를 들면, 테트라아세틸 N-아지도아세틸만노스아민 (Ac4ManAz))이 세포 표면 상에 대사성으로 발현될 수 있음이 최근에 발견되었다.1-11 그러나, 비천연 당류의 이들 대사 표지화 과정은 정상 세포뿐만 아니라 암 세포에서도 일어나고, 이로써 이러한 대사 표지화 과정이 암 세포에 대해 선택적이거나 또는 배타적인 것이 되게 하는 중요한 극복과제가 존재한다.
따라서, 암 세포의 세포 표면 상에 선택적으로 대사성으로 발현되는 당류를 개발할 필요성이 존재한다. 또한, 선택적 대사 표지화 과정을 이용할 수 있는 암의 치료를 위한 제제 및 방법을 추가로 개발할 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 일 양태는 암 세포의 세포 표면 상에 아지도당 (예를 들면, 아지도 시알산; 도면을 참조함)을 발현하기 위해 유용한 조성물 및 방법이다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티, 트리거에 의해 분리되는 트리거-반응성 모이어티 및 자기-희생 링커을 포함하는 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 여기서 상기 자기-희생 링커는 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티에 공유결합된다.
특정 양태에서, 그와 같은 화합물은 하기 화학식 (I) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00001
식 중, R1은 H 또는 트리((C1-C6)알킬)실릴을 나타내고;
R2는 각 경우에 대해 독립적으로 H 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
R3 및 R4는 각 경우에 대해 독립적으로 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
A1은 자기-희생 링커를 나타내고; 그리고
m은 1, 2, 또는 3이다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00002
식 중, K는 임의로 치환된 사이클로알키닐, 헤테로사이클로알키닐, 또는 알키닐 모이어티를 나타내고,
Pol은 폴리머 모이어티를 나타내고;
Pep는 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열을 나타내고;
A2는 자기-희생 링커를 나타내고;
D는 파마코포어를 나타내고;
여기서, 폴리머 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 이미드이고; 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 (i) 상대적인 건강한 세포에 비해 악성 세포에서 과발현되는 또는 (ii) 상대적인 건강한 세포에서 발현되지 않는 악성 세포에서 발현되는 효소에 의해 절단되는 아미드 결합을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 (예를 들면, 화학식 (I) 또는 화학식 (III)의 화합물), 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 악성 조직을 갖는 포유동물에게 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티, 트리거에 의해 절단된 트리거-반응성 모이어티, 및 자기-희생 링커 (예를 들면, 화학식 (I)의 화합물)를 포함하는 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 악성 조직에서 아지도당 (예를 들면, 아지도 시알산)을 발현하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 악성 조직을 갖는 포유동물에게 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티, 트리거에 의해 절단된 트리거-반응성 모이어티, 및 자기-희생 링커 (예를 들면, 화학식 (I)의 화합물)를 포함하는 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화학식 (III)의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 Ac4ManAz의 대사 표지화 및 Ac3ManAz 유도체의 트리거-활성화된 표지화 과정을 도시하는 반응식이다. P는 보호기를 나타낸다.
도 2는 패널 a-e로 구성된다. 패널 (a)는 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB를 포함하는 Ac3ManAz 유도체의 합성 경로를 나타낸다. 패널 (b)는 Ac3ManAzNB의 UV 조사-활성화된 대사 표지화 및 구리-무함유 클릭 반응을 통한 DBCO-Cy5에 의한 아지도기의 차후의 검출을 도시하는 반응식이다. 패널 (c)는 72시간 동안 50 μM Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, Ac3ManAzNB-UV, 또는 Ac3ManAzNB+UV와의 인큐베이션 및 이후의 1시간 동안의 50 μM DBCO-Cy5와의 추가의 인큐베이션 이후의 LS174T 결장암 세포의 CLSM 이미지를 포함한다. 10 mW/cm2의 강도로의 UV 조사를 10분 동안 인가하였다. 세포 핵을 DAPI로 염색하였다. 기준자는 10 ㎛를 나타낸다. 패널 (d)는 상이한 그룹: Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, Ac3ManAzNB-UV, Ac3ManAzNB+UV, 및 PBS에 대한 LS174T 세포의 유세포측정 분석을 도시하는 그래프이다. 패널 (e)는 각각 72시간 동안 50 μM Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, Ac3ManAzNB-UV, 및 Ac3ManAzNB+UV로 처리된 LS174T 세포의 웨스턴 블랏 분석이다.
도 3은 패널 a-d로 이루어지고, Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, 및 Ac3ManAzNB의 생체내 표지화 연구를 도시한다. 패널 (a)는 생체내 표지화 연구의 시간 축이다. 당-N3를 3일 동안 1일 1회 좌측 종양에 주사하였고, 이후 DBCO-Cy5에 의해 검출하였다. 우측 종양을 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 패널 (b)는 DBCO-Cy5의 정맥내 주사 후 48시간 시점에서 Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, 및 Ac3ManAzNB로 각각 전처리된 마우스의 생체내 전체의 바디 형광 이미지화를 도시하는 일련의 이미지이다. 종양은 황색 화살표로 나타낸다. 패널 (c)는 종양 및 주요 기관 (1-간, 2-비장, 3-심장, 4-신장, 5-신장, 6-폐, 7-우측 종양, 8-좌측 종양)의 생체외 형광 이미지화를 도시하는 일련의 이미지이다. 패널 (d)는 상이한 그룹 (R은 좌측 종양을 나타내고, L은 좌측 종양을 나타냄)으로부터의 종양의 형광 강도의 정량화를 나타내는 그래프이다. 형광 강도는 크기화된 수/s로 정규화하였다. 데이터를 평균 ± SEM (n=3)로 나타내었고, 원-웨이 ANOVA로 분석하였다 (피셔(Fisher); 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001).
도 4는 3개의 패널로 이루어진다. 패널 (a)는 종래의 전구약물 시스템에서 사용되는 2개의 종래의 자기-희생 링커 (CL1 및 CL2)의 사용을 나타내는 반응식을 도시하고 있다. 패널 (b)는 CL2로부터 유도된 제시된 제1 링커 PL1을 나타낸다. 패널 (c)는 PL1로부터 변형된 제시된 제2 링커 (PL2)를 나타낸다. 추가의 페닐 고리는 절단된 생성물을 안정화시키고, 이에 따라 분해 과정을 촉진한다.
도 5는 제어된 세포 표지화에 대한 트리거-활성가능 Ac3ManAz 유도체(H2O2-반응성 Ac3ManAzBB, 저산소증-반응성 Ac3ManAzAB, NQO1-반응성 Ac3ManAzHQ, 및 HDAC/CTSL-반응성 E-S)의 라이브러리를 도시하고 있다.
도 6은 시험관내 HDAC/CTSL 반응성 E-S 매개된 제어된 세포 표지화를 도시하고 있다. 패널 (a)는 E-S의 HDAC/CTSL-유도된 분해의 개략적 도면이다. 패널 (b)는 1시간 동안 DBCO-Cy5 (50 μM)로 표시된, 각각 72시간 동안 50 μM E-S, 50 μM E-S + 1 μM TSA, 및 50 μM E-S + 50 μM Z-FY-CHO과 함께 인큐베이션된 이후의 LS174T 결장암 세포 및 4T1 유방암 세포의 일련의 CLSM 이미지이다. 세포 핵을 DAPI로 염색하였다. 기준자는 10 ㎛를 나타낸다. 패널 (c)는 1시간 동안 DBCO-Cy5로 표시된, 72시간 동안 50 μM E-S 또는 PBS와 함께 인큐베이션된 이후의 IMR-90 인간 섬유아세포 세포의 CLSM 이미지를 포함한다. 세포 핵을 DAPI로 염색시켰다. 기준자: 10 ㎛. 패널 (d)는 상이하게 처리된 LS174T 세포 또는 IMR-90 세포의 평균 Cy5 형광 강도를 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM로서 나타내고, 원-웨이 ANOVA에 의해 분석하였다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ** P ≤ 0.001). 패널 (e)는 각각 E-S, E-S + TSA, E-S + Z-FY-CHO, 및 PBS로 처리된 LS174T 세포의 웨스턴 블랏 분석이다. 세포 용해물을 겔화를 실시하기 이전에 37℃에서 1시간 동안 DBCO-Cy5와 함께 인큐베이션시켰다. 단백질 밴드를 ImageQuant LAS 4010 시스템을 사용하여 시각화하였다. 패널 (f)는 LS174T 세포에서의 농도- 및 시간- 의존적 E-S 표지화를 나타내는 그래프이다. 세포를 상이한 시간 (0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 및 72 h) 동안 다양한 농도의 E-S (10 μM, 50 μM, 200 μM, 및 1 mM)로 처리되었고, 2시간 동안 DBCO-Cy5 (50 μM)로 표지화하였다.
도 7은 생체내 E-S 매개된 선택적 종양 표지화를 나타내는 일련의 이미지이다. 패널 (a)는 생체내 표지 연구의 시간 축을 나타낸다. E-S (60 mg/kg) 또는 Ac4ManAz (40 mg/kg) 또는 PBS를 3일 동안 1일 1회 정맥내로 주사하였다. 아지도기의 대사 발현을 웨스턴 블랏 분석에 의해 또는 정맥내로 주사된 DBCO-Cy5 (10 mg/kg)의 체내분포의 모니터링에 의해 분석하였다. 패널 (b)는 3일 동안 1일 1회 E-S, Ac4ManAz, 및 PBS로 각각 처리된 마우스에서 확립된 조직의 웨스턴 블랏 분석을 포함한다. 패널 (c)는 DBCO-Cy5의 주사 후 24시간 시점에서 E-S 및 PBS로 각각 전처리된 마우스의 생체외 전체의 바디 형광 이미지화를 나타내는 이미지이다. 종양은 황색 화살표로 나타내었다. 패널 (d)는 종양 및 기관의 형광 강도의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다. 패널 (e)는 E-S (60 mg/kg)의 i.v. 주사후 각각 8 h, 12 h, 및 24 h 시점에서 무흉선 누드 마우스으로부터 채취한 종양 조직 절편의 CLSM 이미지이다. 종양 조직 절편을 30분 동안 DBCO-Cy5로 표지화하였다. 기준자: 10 ㎛. 패널 (f)는 E-S 주사 후 상이한 시점에서 채취한 종양 조직 절편의 정규화된 평균 Cy5 형광 강도를 나타내는 막대 그래프이다. 패널 (g)는 상이한 수의 E-S 용량로 처리된 마우스로부터의 종양 조직 절편의 정규화된 Cy5 형광 강도를 나타내는 막대 그래프이다. 모든 수치 데이터는 평균 ± SEM로 나타내고, 원-웨이 ANOVA에 의해 분석하였다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤0.01; **P ≤ 0.001).
도 8은 패널 a-f로 이루어지고, E-S 매개된 종양 표지화는 LS174T 원발성 종양 모델에 대한 DBCO-약물 콘주게이트의 항종양 효능을 개선함을 입증한다. 패널 (a)는 카텝신 B 반응성 DBCO-Val-Cit-DOXO (D-D)의 구조를 나타낸다. 패널 (b)는 급성 항종양 효능 연구에서 상이한 그룹으로부터의 LS174T 종양의 대표적인 TUNEL 염색 구간을 나타내는 일련의 이미지이다. 기준자: 50 ㎛. 패널 (c)는 ImageJ를 통한 TUNEL 염색의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다. 세포자멸사 지수를 세포자멸적 세포수 (TUNEL) 대 총 세포수 (DAPI)의 비로 결정하였다. 20개의 조직 절편을 종양당 계수하였다; n=4. 패널 (d)는 장기간 효능 연구의 과정에 걸친 각각의 그룹의 평균 종양 크기를 나타내는 그래프이다. 패널 (e)는 모든 그룹에 대한 카플란-마이어 플랏을 포함한다. 마우스의 손실은 치료 관련 사망 또는 비치료 관련 사망 또는 예정된 종점이 도달된 이후의 안락사로 인한 것이었다. 패널 (f)는 각각의 그룹에서의 무흉선 누드 마우스의 생존 분석을 포함한다. TTE: 종점까지의 시간. TGD: 종양 성장 지연; TGD = TTE (처리된 그룹)-TTE (PBS 그룹). %TGD = 100%ХTGD/TTE (PBS 그룹). 모든 수치 데이터는 평균 ± SEM를 나타내었고, 원-웨이 ANOVA에 의해 분석하였다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001).
도 9는 패널 a-g로 이루어지고, E-S 매개된 종양 표지화는 4T1 전이성 종양 모델에 대한 DBCO-약물 콘주게이트의 항종양 효능을 개선하는 것을 나타냄을 입증한다. 패널 (a)는 효능 연구의 시간 프레임을 나타낸다. 4T1 전이성 종양은 루시퍼라아제-조작된 4T1 유방암 세포의 i.v. 주사에 의해 Balb/c 마우스에 대해 확립되었다. E-S는 3일 동안 (1, 2, 및 3 일차) 1일 1회 i.v. 주사되었고, 약물을 4, 8, 및 12일 차에 i.v. 투여하였다. 패널 (b)는 각각 5, 9, 및 13일차에 상이하게 처리된 Balb/c 마우스의 생물발광 이미지화를 도시하고 있다. 패널 (c)는 시간에 따른 상이하게 처리된 마우스의 적분된 생물발광 강도의 변화를 나타내는 그래프이다. 패널 (d)는 상이한 그룹으로부터의 페 조직에 대한 평균 종양의 수를 나타내는 그래프이다. 패널 (e)는 상이한 그룹으로부터의 페 조직의 대표적인 사진을 나타낸다. 패널 (f)는 상이한 그룹에 대한 총 폐 조직 면적에 대한 종양 표면적의 백분율을 나타내는 막대 그래프이다. 패널 (g)는 골수 및 비장 절편의 대표적인 이미지를 포함하고, 이는 유리 DOXO와 비교하여 E-S+D-D 그룹의 상당하게 감소된 전신 독성을 나타내었다. 모든 수치 데이터는 평균 ± SEM (n = 7-8)로서 나타내었고, 원-웨이 ANOVA에 의해 분석되었다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; **P ≤ 0.001).
도 10은 패널 a-d로 이루어진다. 패널 (a)는 1시간 동안 DBCO-Cy5로 표지화된, 72시간 동안 50 μM E-S, 50 μM E-S + 1 μM TSA, 및 50 μM E-S + 50 μM Z-FY-CHO 각각과 함께 인큐베이션한 이후의 MDA-MB-231 유방암 세포의 CLSM 이미지를 나타낸다. 세포 핵 및 세포막을 각각 DAPI 및 CellMask 오렌지 원형질막 염색제로 염색하였다. 기준자: 10 ㎛. 패널 (b)는 1시간 동안 DBCO-Cy5로 표지화된, 72시간 동안 50 μM E-S, 50 μM E-S + 1 μM TSA, 및 50 μM E-S + 50 μM Z-FY-CHO 각각과 함께 인큐베이션한 이후의 MDA-MB-231 세포의 평균 Cy5 형광 강도를 나타내는 막대 그래프이다. 패널 (c)는 상이한 인큐베이션 시간 (30 min, 1 h, 및 2 h)에 걸쳐 E-S 전처리 (72 h)가 되거나 되지 않은 MDA-MB-231 유방암 세포에 의한 D-D 흡수를 나타내는 막대 그래프이다. 모든 수치 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타내었고, 원-웨이 ANOVA에 의해 분석되었다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001).
도 11은 패널 a-f로 이루어지고, 피하로 이식된 MDA-MB-231 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스에서의 E-S+D-D의 장기간 항종양 효능 연구의 결과를 도시하고 있다. 패널 (a)는 종양 감소 연구의 시간 프레임을 도시하고 있다. E-S (60 mg/kg)을 0, 1, 및 2일차에 i.v. 주사하였다. D-D (DOXO 당량으로의 12 mg/kg)를 3, 7, 및 11일차에 i.v. 주사하였다. 마우스의 종양 크기, 체중, 및 음식 섭취를 밀접하게 모니터링하였다. 패널 (b)는 장기간 효능 연구 과정에 걸쳐 각각의 그룹의 평균 MDA-MB-231 종양 크기를 그래프화하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 나타내었다. 유의성 분석을 원-웨이 ANOVA에 의해 수행하였다 (피셔; 0.01 < *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001). 패널 (c) 는 모든 그룹에 대한 카플란-마이어 플롯을 포함한다. 마우스의 손실은 치료 관련 사망 또는 비치료 관련 사망 또는 예정된 종점이 도달된 이후의 안락사로 인한 것이었다. 패널 (d)는 각각의 그룹에서의 무흉선 누드 마우스의 생존 분석을 제공한다. TTE: 종점까지의 시간. TGD: 종양 성장 지연; TGD = TTE (처리된 그룹)-TTE (PBS 그룹). %TGD = 100%ХTGD/TTE (PBS 그룹). 패널 (e)는 효능 연구의 과정에 걸친 상이한 그룹으로부터의 마우스의 체중을 나타내는 차트이다. 2개 이상의 마우스가 사멸되거나 또는 희생되는 경우에 곡선을 절단하였다.
암 표적 요법은 암에서의 약물의 축적을 개선시키고, 신체의 다른 부분에 원하지 않는 그것의 노출을 최소화하기 위해 추구되어 왔다. 그러나, 현존하는 암 표적화 기술은 치료 응용분야에 대해 만족스럽지 않다. 대부분의 현존하는 암 표적화 전략은 표적으로 암 세포 표면 단백질을 이용하지만, 본 발명자는 부분적으로 그것의 더 높은 세포-표면 밀도로 인하여 치료 표적으로서의 암 세포 표면 당류를 찾는 것을 추구하였다. 비천연 당류의 당대사공학(metabolic glycoengineering process)은 화학 기를 세포 표면 상에 도입하기 위한 용이한 방법을 제공하고, 이는 그렇지 않으면 달성하기 어려운 세포 생물학 논의, 예컨대 세포 내재화, 세포 융합, 및 세표 표적화의 심도 있는 연구를 가능하게 한다. 암 세포-표면 당의 조절된 표지화를 용이하게 하는 화합물 및 방법, 및 이러한 암-표적 능력을 이용하는 추가적인 치료 조성물을 개시하고 있다.
본 발명을 기반으로 한 원리는 아지도-당의 대사 표지화 능력이 구조 관점으로부터 조절될 수 있는 것을 나타낸다. Ac4ManAz의 대사 표지화 과정은 도 1에 나타나 있다. Ac4ManAz는 세포로의 유입시의 비특이적 에스테라아제, 그 다음 6-OH의 인산화 및 개환 이성질체화에 의해 가수분해된다. 포스포에놀피루브산 (PEP)은 그 다음 새로 형성된 카보닐기를 공격하여 시알산을 형성하고, 이는 이후 (1) 포스페이트기가 결여되고, (2) 단백질과 컨쥬게이션되고, 마지막으로 (3) 당단백질의 형태로 세포 표면 상에 발현된다. 개환 이성질체화 단계가 성공적인 대사 표지화를 위해 필수적인 것이고, C1 부위 (1-OH)에서의 하이드록실기의 노출은 성공적인 개환 이성질체화를 위해 필요한 것으로 예상할 수 있다. 본 발명자는 놀랍게도 세포 에스테라아제를 견딘 글리코시드 결합을 형성함으로써 Ac4ManAz의 C1 부위를 변형시키는 것은 개환 이성질체화 단계를 방해하고, 이에 따라 전체 대사 표지화 과정을 차단한다. 특정 트리거의 존재 하에 1-OH를 나타낼 수 있는 트리거-반응성 글리코시드 (에테르) 결합을 설계함으로써, 대사 표지화 과정은 제어될 수 있다. 암 선택적 화학 표지화는 특정 암-관련 트리거에 대해 반응성인 Ac3ManAz 유도체를 사용하여 잠재적으로 달성될 수 있다. 예시적인 암-관련 트리거는 산화환원 조절장애, 증가된 산화제 수준, 및 과발현된 효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물
본 발명의 양태는 하기를 포함하는 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염과 관련된다:
임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티;
트리거에 의해 절단된 트리거-반응성 모이어티; 및
자기-희생 링커;
여기서, 상기 자기-희생 링커는 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티에 공유결합된다.
특정 구현예에서, 트리거는 건강한 조직에 비해 암 조직에서 고조되고, 과발현되거나, 또는 그렇지 않으면 향상된다.
특정 구현예에서, 트리거는 세포성 과산화물 (cellular peroxide)이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 트리거-반응성 모이어티는 붕산기, 디알킬 보로네이트기, 디아릴 보로네이트기, 디(아르알킬)보로네이트기, 보롤란기, 또는 디옥사보롤란기를 포함한다. 예시적인 구현예는 도 5에 나타나 있다.
이와 같은 특정 구현예에서, 세포성 과산화물에 의한 트리거-반응성 모이어티의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하다.
대안적인 구현예에서, 트리거는 저산소증이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 트리거-반응성 모이어티는 2-니트로이미다졸 모이어티 또는 아조기, 예컨대 아조벤젠을 포함한다. 예시적인 구현예는 도 5에 나타나 있다.
이와 같은 특정 구현예에서, 저산소 조건 하에 트리거-반응성 모이어티의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출한다.
대안적인 구현예에서, 트리거는 설프하이드릴- 또는 티올레이트-함유 화합물, 예컨대 글루타티온이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 트리거-반응성 모이어티는 이황화 결합을 포함한다. 예시적인 구현예는 하기에 나타나 있다:
Figure pct00003
이와 같은 특정 구현예에서, 설프하이드릴- 또는 티올레이트-함유 화합물에 의한 이황화 결합의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로서 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출한다.
대안적인 구현예에서, 트리거는 NAD(P)H 탈수소효소 (퀴논 1) (NQO1)이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 트리거-반응성 모이어티는 임의로 치환된 프로피온산 또는 프로피온산 아미드 모이어티에 공유결합된 임의로 치환된 퀴논을 포함한다. 예시적인 구현예는 도 5에 나타나 있다.
이와 같은 특정 구현예에서, NAD(P)H 탈수소효소 (퀴논 1) (NQO1)에 의해 임의로 치환된 프로피온산 또는 프로피온산 아미드 모이어티에 공유결합된 임의로 치환된 퀴논의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출한다.
특정 구현예에서, 트리거는 카텝신 효소이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 트리거-반응성 모이어티는 카텝신 효소에 의해 절단된 아미드 결합을 포함하는 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열이다.
추가 구현예에서, 트리거-반응성 기는 산-감수성 모이어티, 예컨대 이민, 아세탈, 케탈, 또는 카바메이트를 포함한다. 예시적인 트리거-반응성 기는 하기 나타낸 구현예에 도시되어 있다:
Figure pct00004
이와 같은 특정 구현예에서, 아미드 결합을 포함하는 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 Phe-Lys, Val-Lys, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg(NO2), Phe-Arg(Ts)를 포함한다. Cit는 시트룰린을 나타내고, Ts는 토실레이트 보호기를 나타낸다.
특정 구현예에서, 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 치환된 라이신 아미드이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 카텝신 효소에 의한 아미드 결합의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드가 방출된다.
특정 구현예에서, 카텝신 효소는 카텝신 L이다.
특정 구현예에서, 본 화합물은 하기 화학식 (I) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염로 나타낸다:
Figure pct00005
식 중, R1은 H 또는 트리((C1-C6)알킬)실릴을 나타내고;
R2는 각 경우에서 독립적으로 H 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
R3 및 R4는 각 경우에서 독립적으로, H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
A1 은 자기-희생 링커를 나타내고;
m은 1, 2, 또는 3이다.
특정 구현예에서, R1은 H를 나타낸다.
특정 구현예에서, R2는 각 경우에서 독립적으로, H 또는 -C(O)CH3를 나타낸다.
특정 구현예에서, 모든 경우의 R2는 동일하다.
특정 구현예에서, R3 및 R4는 H이다.
특정 구현예에서, m은 1이다.
본 발명의 화합물은 이격시키고, 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티를 함께 공유결합시키는 자기-희생 링커를 포함한다. 자기-희생 링커는 2개의 이격된 화학적 모이어티 (즉, 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티)를 정상적으로 안정적인 3분체 분자로 함께 공유결합시킬 수 있는 이중작용성 화학적 모이어티이다. 자기-희생 링커는 트리거-유도된 절단 (예를 들면, 효소 절단)의 의해 3분체 분자로부터 이격된 화학적 모이어티 중 하나를 방출할 수 있고, 이러한 절단은 나머지의 분자로부터 분리되어 다른 이격된 화학적 모이어티를 방출할 수 있다.
특정 구현예에서:
A1은 기 -X1-Y1-을 나타내고;
X1은 결합 또는 -C(O)2-를 나타내고;
Y1은 결합 또는 임의로 치환된 -((C1)알킬렌)-아릴렌- 또는 -((C1)알킬렌)-헤테로아릴렌-을 나타내고;
X1 및 Y1은 둘 모두 결합을 나타내지 않는다.
이와 같은 특정 구현예에서, Y1은 임의로 치환된 -((C1)알킬렌)-아릴렌-을 나타낸다.
이와 같은 특정 구현예에서, 자기-희생 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00006
식 중,
R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
R6 는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
q는 1 또는 2를 나타낸다.
이와 같은 추가의 특정 구현예에서, R7은 H이다.
특정 구현예에서, 자기-희생 링커는
Figure pct00007
이다.
이와 같은 특정 구현예에서, 자기-희생 링커는
Figure pct00008
이다.
이와 같은 특정 구현예에서, R7은 H이다.
대안적인 구현예에서, 자기-희생 링커는 하기의 것로부터 선택된다:
Figure pct00009
식 중, R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고,
R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고,
n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, 암 세포의 세포 표면 상에 아지도당 (예를 들면, 아지도 시알산)을 발현하기 위한 화합물은 하기 화학식 (II) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00010
식 중, R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
q는 1 또는 2이다.
추가 구현예에서, 본 화합물은 하기 화학식 (II') 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00011
추가의 구현예에서, R7은 H이다.
다른 양태에서, 본 발명은 그것의 세포 표면 상에 아지도당 (예를 들면, 아지도 시알산)을 발현하는 세포에 대해 선택적으로 치료제를 전달할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00012
식 중, K는 임의로 치환된 사이클로알키닐, 헤테로사이클로알키닐, 또는 알키닐 모이어티를 나타내고;
Pol은 폴리머 모이어티를 나타내고;
Pep는 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열을 나타내고;
A2는 자기-희생 링커를 나타내고;
D는 파마코포어를 나타내고;
식 중,
폴리머 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 이미드이고;
아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 (i) 상대적인 건강한 세포에 비해 악성 세포에서 과발현되거나 또는 (ii) 상대적인 건강한 세포에서 발현되지 않는 악성 세포에서 발현되는 효소에 의해 절단되는 아미드 결합을 포함한다.
특정 구현예에서, 효소에 의한 아미드 결합의 절단시, 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 파마코포어를 방출한다.
특정 구현예에서, 효소는 카텝신 효소이다. 예를 들면, 효소는 카텝신 B일 수 있다.
특정 구현예에서, Pep는 임의로 치환된 Val-Cit를 나타낸다.
특정 구현예에서, 화학식 (III)의 화합물은 하기 화학식 (IV)로 나타낸다:
Figure pct00013
식 중, R1, R2, 및 R3는 각 경우에서 독립적으로, H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타낸다.
특정 구현예에서, R1, R2, 및 R3는 H이다.
특정 구현예에서, K는 임의로 치환된 헤테로사이클로알키닐 또는 사이클로알키닐을 포함한다. 특정 구현예에서, K는 임의로 치환된 디벤조사이클로옥틴 모이어티를 포함한다.
특정 구현예에서, Pol은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 모이어티를 나타낸다.
특정 구현예에서, Pol은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜의 10 내지 30개의 반복 단위를 나타낸다.
특정 구현예에서, Pol은 폴리에틸렌 글리콜의 10 내지 30개의 반복 단위, 또는 폴리에틸렌 글리콜의 15 내지 25개의 반복 단위를 나타낸다.
특정 구현예에서,
A2는 기 -Y2-X2-를 나타내고;
X2는 결합 또는 -C(O)2-를 나타내고;
Y2는 결합 또는 임의로 치환된 -아릴렌-((C1)알킬렌)- 또는 -헤테로아릴렌-((C1)알킬렌)-을 나타내고;
X2 및 Y2는 둘 모두 결합을 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, Y2는 임의로 치환된 -아릴렌-((C1)알킬렌)-을 나타낸다.
이와 같은 특정 구현예에서, 자기-희생 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Figure pct00014
식 중, R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
q는 1 또는 2이다.
이와 같은 특정 구현예에서, R7은 H이다.
특정 구현예에서, 자기-희생 링커는
Figure pct00015
이다.
대안적인 구현예에서, 자기-희생 링커는 하기의 것으로부터 선택되고,
Figure pct00016
식 중, R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고,
R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 화합물의 파마코포어는 진경제, 마취제, 항-염증제 예컨대 비스테로이드 항-염증성 (NSAID) 제제, 항-암 치료제, 칼슘 채널 차단제, 항생제, 면역억제제, 항바이러스제, 항-증식성 제제, 항미생물제, 신경-성장 유도제, 또는 평활근 이완제이다.
특정 구현예에서, 파마코포어는 항-암 치료제이다.
특정 구현예에서, 항-암 치료제는 악티노마이신-D, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 벨락토신 A, 바이칼루타마이드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부세렐린, 부설판, 캠포테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르필조밉, 카무스틴, 클로르암부실, 클로로퀸, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데메톡시비리딘, 덱사메타손, 디클로로아세테이트, 디엔스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에폭소마이신, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에버롤리무스, 엑세메스탄, 펠루타미드 B, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 젬시타빈, 게니스테인, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론, 이리노테칸, 익사베필론, 레날리도마이드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 로니다민, 마리조밉, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메트포르민, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모노메틸 아우리스타틴, 닐루타마이드, 노코다졸, 옥트레오타이드, 오무랄라이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔미드로네이트, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페리포신, 플리카마이신, 포말리도마이드, 포르피머, 프레드니손, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 소라페닙, 스트렙토조신, 수니티닙, 수라민, 타목시펜, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 티타노센 이염화물, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, MG-132, PSI, CEP-18770, MLN-2238, MLN-9708, NC-005, YU-101, LU-005, YU-102, NC-001, LU-001, NC-022, PR-957 (LMP7), CPSI (β5), 10 LMP2-sp-ek, BODIPY-NC-001, 아지도-NC-002, ONX-0912, PS-519, 125I-NIP-L3VS, NC-005-VS, 또는 MV151이다.
특정 구현예에서, 항-암 치료제는 독소루비신이다.
화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 화합물의 특정 구현예에서, D는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 파마코포어를 나타낸다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
대안적인 구현예에서, D는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 파마코포어를 나타낸다:
Figure pct00022
Figure pct00023
특정 구현예에서, 상기 화학식 (III)의 화합물을 하기의 것으로 나타난다:
Figure pct00024
식 중, j는 10-30의 정수이다.
특정 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 하기에 상세하게 기재되어 있다.
치료 방법
특정 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 암 세포의 표면 상에 아지도당(예를 들면, 아지도 시알산; 도면 참조)을 발현하는 방법에 관한 것이다:
암 세포를 화합물과 접촉시키는 단계로서,
상기 화합물은 본원에 기재되어 있고, 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티; 트리거에 의해 절단된 트리거-반응성 모이어티; 및 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티에 공유결합된 자기-희생 링커를 포함하는 단계;
이로써 암 세포의 표면 상에 아지도당을 발현시키는 단계.
특정 양태에서, 암 세포의 표면 상에 아지도당을 발현하는 방법은 상기 화학식 (I)의 화합물을 암 세포와 접촉시키는 단계; 이로써 암 세포의 표면 상에 아지도당을 발현하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 화합물은 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티; 트리거에 의해 절단된 트리거-반응성 모이어티; 및 만노피라노실 모이어티 및 트리거-반응성 모이어티에 공유결합된 자기-희생 링커를 포함한다.
특정 구현예에서, 이와 같은 암의 치료 방법은 추가로 상기 대상체에게 치료적 유효량의 상기 화학식 (III)의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 대상체 치료적 유효량의 상기 화학식 (III)의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 암은 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련된 암 (카포시 육종 및 림프종), 항문암, 맹장암, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담도암 (간외 포함), 방광암, 골암 (골육종 및 악성 섬유질 조직구종 포함), 뇌종양 (예컨대 별아교세포종, 뇌 및 척수 종양, 뇌간 신경아교종, 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추신경계 배아 종양, 두개인두종, 상의모세포종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 수질상피종, 등도분화의 송과 실질세포 종양, 천막상 원시 신경외배엽성 종양 및 송과체아세포종), 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 기저 세포 암종, 담도암 (간외 포함), 방광암, 골암 (골육종 및 악성 섬유질 조직구종 포함), 유암종, 적인 암종, 중추신경계 (예컨대 비정형 기형/횡문근양 종양, 배아 종양 및 림프종), 자궁경부암, 소아기 암, 척색종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종 (균상식육종 및 세자리 증후군), 담낭관, 담즙 (간외), 담낭 제자리 암종 (DCIS), 배아 종양 (중추신경계), 자궁내막암, 상의모세포종, 뇌실막세포종, 식도암, 비강신경교세포종, 유잉 육종 계열의 종양, 두개외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 간외 담도암, 안암 (안구내 흑색종, 망막모세포종 포함), 골의 섬유질 조직구종 (악성 및 골육종 포함) 담낭암, 위 (위선) 암, 위장 유암종, 위장 기질 종양 (GIST), 생식세포 종양 (두개외, 고환외, 난소), 임신성 융모성 종양, 신경아교종, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간)암, 조직구증, 랑게르한스 세포, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 소도세포 종양 (내분비, 췌장), 카포시 육종, 신장 (신장 세포 포함), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병 (급성 림프아구성 (ALL), 급성 골수 (AML), 만성 림프구성 (CLL), 만성 골수성 (CML), 모발 세포 포함), 입술 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽 제자리 암종 (LCIS), 폐암 (비-소세포 및 소세포), 림프종 (AIDS-관련된, 버킷, 피부 T-세포 (균상식육종 및 세자리 증후군), 호지킨, 비-호지킨, 기본적인 중추신경계 (CNS), 거대글로불린혈증, 왈덴스트롬, 남성 유방암, 골의 악성 섬유질 조직구종 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종 (안구내 (눈) 포함), 머켈 세포 암종, 중피종 (악성), 잠복 원발성의 전이성 편평상피 목암, NUT 유전자와 관련된 정중선 관 암종, 구강암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수성 백혈병, 만성 (CML), 골수 백혈병, 급성 (AML), 골수종 및 다발성 골수종, 골수증식성 장애 (만성), 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경교세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구순, 구강암, 입술 및, 구강인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유질 조직구종, 난소암 (예컨대 상피성, 생식세포 종양, 및 낮은 악성 잠재적 종양), 췌장암 (소도세포 종양 포함), 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 등도분화의 송과체 실질 종양, 송과체아세포종 및 천막상 원시 신경외배엽성 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 기본적인 중추신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 (신장) 암, 신우 및 요관, 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액샘암, 육종 (예컨대 유잉 육종 계열의 종양, 카포시, 연조직, 자궁), 세자리 증후군, 피부암 (예컨대 흑색종, 머켈 세포 암종, 비흑색종), 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평상피 세포 암종, 잠복 원발성의 전이성 편평상피 경부암, 전이성, 위선암 (위) 암, 천막상 원시 신경외배엽성 종양, T-세포 림프종 (피부, 균상식육종 및 세자리 증후군), 고환암, 인후두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 융모성 종양 (임신성), 미공지된 기본적인, 소아기의 희귀암, 요관 및 신우, 이행 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁내막, 자궁 육종, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 및 윌름스 종양으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물, 예를 들면, 인간이다.
정의
본원에 사용되는 어구 "보호기"는 바람직하지 않은 화학적 반응으로부터 반응성 작용기를 보호하는 치환기를 의미한다. 이러한 보호기의 예는 카복실산 및 붕산의 에스테르, 알코올의 에테르, 및 알데하이드 및 케톤의 아세탈 및 케탈을 포함한다. 예를 들면, 본원에 사용되는 어구 "N-말단 보호기" 또는 "아미노-보호기"는 합성 과정에서 원하지 않는 반응에 대해 아미노산의 N-말단 또는 펩타이드를 보호하기 위해 이용될 수 있는 다양한 아미노-보호기를 지칭한다. 적합한 기는 아실 보호기, 예컨대 설명을 위해서 포르밀, 단실, 아세틸, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 석시닐, 및 메톡시석시닐; 방향족 우레탄 보호기, 예를 들면, 벤질옥시카보닐 (Cbz); 및 지방족 우레탄 보호기 예컨대 t-부톡시카보닐 (Boc) 또는 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc)을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "아미노-말단 보호기"는 유기 합성, 특히 펩타이드 합성에 전형적으로 이용되는 말단 아미노 보호기를 지칭한다. 아실 보호기, 예컨대 아세틸, 및 벤조일; 방향족 우레탄 보호기, 예컨대 벤질옥시카보닐; 및 지방족 우레탄 보호기, 예컨대 tert-부톡시카보닐를 포함하는 보호기의 임의의 공지된 카테고리가 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Gross and Mienhoffer, Eds., The Peptides, Academic Press: New York, 1981;, Vol. 3, 3-88; and Green, T. W.; Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed, Wiley: New York, 1991]을 참조한다. 바람직한 보호기는 아릴-, 아르알킬-, 헤테로아릴- 및 헤테로아릴알킬-카보닐 및 설포닐 모이어티를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "생리적 조건"은 온도, pH, 이온 강도, 점도, 및 예컨대 생화학적 파라미터 (생존가능 유기체에게 양립가능하고, 및/또는 전형적으로 생존가능한 포유동물 세포에서 세포 중에 존재함)를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "전구약물"은 생리적 조건 하에 치료적 활성제로 전환되는 화합물을 포괄한다. 전구약물을 제조하기 위한 일반 방법은 원하는 분자를 나타내는 생리적 조건 하에 가수분해되는 선택된 모이어티를 포함하는 것이다. 다른 구현예에서, 전구약물은 숙주 동물의 효소 활성에 의해 전환된다.
본원에 사용되는 어구 "약제학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 신체의 하나의 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 본 발명의 화학물질을 이송하거나 또는 수송하는데 관련되는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 캐리어는 환자에게 해롭지 않고, 실질적으로 비발열성인 제형의 다른 성분과 양립가능한 것과 관련하여 "허용가능"하여야 한다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어로서 작용할 수 있는 물질의 일부의 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토오스, 글루코스, 및 수크로오스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그것의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸쓰; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 잇꽃 오일, 참께 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원 물; (17) 등장의 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약제학적 제형에서 이용되는 다른 무독성의 상용가능한 물질. 특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비발열성이고, 즉, 환자에게 투여지 상당한 온도 상승을 유도하지 않는다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 무독성의 무기 및 유기산 부가염을 지칭한다. 이들 염은 화합물(들)의 최종 분리 및 정제 과정에서, 또는 적합한 유기 또는 무기산을 갖는 그것의 유리 염기성 형태로 정제된 화합물(들)을 개별적으로 반응시키고, 이에 따라 형성된 염을 분리함으로써 원위치에서 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토바이오네이트, 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다. 예를 들면, 문헌 [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19]을 참조한다.
다른 경우에서, 본 발명의 방법에서 유용한 화합물은 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있고, 이에 따라 약제학적으로 허용가능한 염기를 갖는 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 이러한 경우에서 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 상대적으로 무독성의 무기 및 유기 염기 부가염을 지칭한다. 이들 염은 마찬가지로 화합물(들)의 최종 분리 및 정제 과정에서, 또는 적합한 염기를 갖는 이의 유리산 형태로의 정제된 화합물(들), 예컨대 약제학적으로 허용가능한 금속 양이온의 수산화물, 카보네이트, 또는 바이카보네이트를 암모니아와, 또는 약제학적으로 허용가능한 유기의 1차, 2차, 또는 3차 아민과 반응시여 원위치에서 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성을 위해 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다 (예를 들면, 상기 문헌 [Berge et al.]을 참조한다).
치료시의 사용과 관련하여 "치료적으로 유효량"의 화합물은 (포유동물, 바람직하게는 인간에게) 원하는 복용 요법의 일부로서 투여되는 경우에, 예를 들면 임의의 의료 치료에 이용가능한 합리적인 유익/유해 비율로 치료되는 장애 또는 병태 또는 미용 목적을 위한 임상적으로 허용가능한 표준에 따라 증상을 경감시키거나, 질병을 완화시키거나 또는 질환 상태의 개시를 느리게 하는 제제에서의 화합물의 양을 지칭한다.
용어 "예방적 또는 치료적" 치료는 본 기술분야에 기술적으로 인식되어 있으며, 숙주에게의 하나 이상의 본 발명의 조성물의 투여를 포함한다. 이것이 원치 않는 질병 (예를 들면, 질환 또는 숙주 동물의 원치 않는 다른 상태)의 임상적 징후 이전에 투여되는 경우, 이후 치료는 예방적인 것이고, (즉, 이는 원치 않는 질병일 발달되는 것에 대해 숙주를 보호한다), 반면에 이것이 원치 않는 질병의 징후 이후에 투여되는 경우에, 치료는 치료적인 것이다 (즉, 이는 현존하는 원치않는 질병 또는 이의 부작용을 감소시키거나, 완화시키거나, 또는 안정화시키는 것으로 의도된다).
용어 "자기-제거 링커" 또는 "자기-희생 링커"는 2개의 분자를 방출하기 위한 정의된 조건 하에 절단된 화학 결합에 의해 2종 이상의 분자를 함께 부착시키는 일시적 증량제, 스페이서, 또는 플레이스홀더 (placeholder)를 지칭하다. 자기-제거 링커의 예는 비제한적으로 p-아미노벤질옥시카보닐 (PABC), 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린, 및 4-(페닐메틸렌)아닐린을 포함한다. 자기-제거 또는 자기-희생 링커는 선형 또는 분지형일 수 있고, 2개 이상의 동일한 분자와 함께 연결되거나, 또는 2개 이상의 상이한 분자와 함께 연결될 수 있다. 자기-제거 또는 자기-희생 링커는 예를 들면, 생리적 조건, 산성 조건, 염기성 조건 하에 또는 특이적인 화학적 제제의 존재 하에 저해되거나, 분해되거나 또는 분리될 수 있다.
본 발명에 사용되는 파마코포어는 상응하는 약물이 유효한 통상적 목적에 대해 유효하고, 특정 구현예에서, 약물을 이것이 특히 유리한 원하는 세포에 수송시키는 아지도-당 표적화 모이어티에서 고유한 능력으로 인해 우수한 효능을 가진다.
본 구현예에서 사용하기 위한 바람직한 치료제는 예컨대 암 요법에 사용되는 세포독성 약물이다. 이와 같은 약물은 일반적으로, 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제 예컨대 안트라사이클린, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 및 코르티코스테로이드를 포함한다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명의 콘주게이트를 제조하기 위한 목적을 위해 보다 편리한 화합물의 반응을 위해 원하는 화합물에 대한 화학적 변형을 이룰 수 있다.
특정 구현예에서, D는 파마코포어가 자기-희생 링커에 결합되는 것에 의해 화학적 반응성 작용기를 갖는 파마코포어이다. 특정 경우에서, 작용기는 1차 아민, 2차 아민, 하이드록실, 및 설프하이드릴로부터 선택된다. 특정 경우에서, 작용기는 1차 아민 또는 2차 아민이다. 특정 경우에서, 작용기는 하이드록실이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 특정 화합물은 특정 기하학적 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (d)-이성질체, (l)-이성질체, 이의 라세미 혼합물 및 이의 다른 혼합물을 포함하는 모든 이러한 화합물이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려한다. 추가의 비대칭 탄소 원자는 치환기 예컨대 알킬기로 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 뿐만 아니라 이들의 혼합물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
예를 들면, 본 발명의 화합물의 특정 거울상이성질체가 바람직한 경우에, 이는 비대칭 합성에 의해 또는 키랄 보조제로의 유도체화에 의해 제조될 수 있고, 생성된 부분입체이성질체 혼합물이 분리되고, 보조기는 절단되어 순수한 바람직한 거울상이성질체를 제공한다. 대안적으로, 분자가 염기성 작용기, 예컨대 아미노, 또는 산성 작용기, 예컨대 카복실을 포함하는 경우에, 부분입체이성질체 염은 적절한 광학적으로-활성인 산 또는 염기와 함께 형성되고, 그 다음 이에 따라 본 기술분야에 잘 알려진 분별 결정 또는 크로마토그래피 수단에 의해 형성되는 부분입체이성질체의 분해, 및 그 다음 순수 거울상이성질체가 후속된다.
지방족 사슬은 하기 정의된 일정 부류의 알킬, 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 지방족 직쇄는 비분지형 탄소 사슬 모이어티로 제한된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "지방족기"는 직쇄, 분지형-사슬, 또는 환형 지방족 탄화수소기를 지칭하고, 포화된 및 불포화된 지방족기, 예컨대 알킬기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 포함한다.
"알킬"은 구체화되지 않은 경우에 특정 수의 탄소 원자, 또는 최대 30개의 탄소 원자를 갖는 완전 포화된 환형 또는 비환형, 분지형 또는 비분지형 탄소 사슬 모이어티를 지칭한다. 예를 들면, 1 내지 8개의 탄소 원자의 알킬은 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸과 같은 모이어티 및 이들 모이어티의 위치상 이성질체인 모이어티를 지칭한다. 10 내지 30개의 탄소 원자의 알킬은 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 에이코실, 헤네이코실, 도코실, 트리코실 및 테트라코실을 포함한다. 특정 구현예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그것의 골격 내에 30개 이하의 탄소 원자 (예를 들면, 직쇄에 대해 C1-C30, 분지쇄에 대해 C3-C30), 그리고 더 바람직하게는 20개 이하를 가진다.
"사이클로알킬"은 모노- 또는 비사이클릭 또는 가교된 포화 카보사이클릭 고리를 의미하고, 각각은 3 내지 12개의 탄소 원자를 가진다. 마찬가지로, 바람직한 사이클로알킬은 그것의 고리 구조에 5-12개의 탄소 원자를 가지고, 더 바람직하게는 고리 구조에 6-10개의 탄소를 가진다.
탄소의 수가 달리 특정되지 않는 경우, 본원에 사용되는 "저급 알킬"은 상기 정의된 바와 같으나 그의 골격 구조 내에 1 내지 10개의 탄소, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 tert-부틸을 의미한다. 마찬가지로, "저급 알케닐" 및 "저급 알키닐"은 유사한 사슬 길이를 가진다. 본 출원에 걸쳐, 바람직한 알킬기는 저급 알킬이다. 특정 구현예에서, 본원에서 알킬로서 지정된 치한기는 저급 알킬이다.
"알케닐"은 특정된 탄소 원자의 수, 또는 탄소원자의 수에 대한 제한이 지정되지 않는 경우에 최대 26개의 탄소 원자를 갖고, 모이어티 내에 하나 이상의 이중 결합을 갖는 임의의 환형 또는 비환형, 분지형 또는 비분지형 불포화된 탄소 사슬 모이어티를 지칭한다. 6 내지 26개의 탄소 원자의 알케닐은 그것의 다양한 이성질체 형태로의 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데닐, 트리데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 노나데세닐, 에이코세닐, 헤네이코소에닐, 도코세닐, 트리코세닐, 및 테트라코세닐로 예시되고, 여기서 불포화된 결합(들)은 모이어티 내의 임의에 부분에 배치될 수 있고, 이중 결합(들) 주위에 (Z) 또는 (E) 구조를 가질 수 있다.
"알키닐"은 모이어티 내의 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 알케닐의 범위의 하이드로카르빌 모이어티를 지칭한다.
용어 "알킬티오"는 이에 부착된 황 모이어티를 가지는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 특정 구현예에서, "알킬티오" 모이어티는 -(S)-알킬, -(S)-알케닐, -(S)-알키닐, 및 -(S)-(CH2)m-R1 중의 하나로 표시되고, 여기서 m 및 R1은 하기에 정의되어 있다. 대표적인 알킬티오기는 메틸티오, 에틸티오 등을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "알콕실" 또는 "알콕시"는 이에 부착된 산소 모이어티를 갖는 하기에 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알콕실기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, tert-부톡시 등을 포함한다. "에테르"는 산소에 의해 공유결합된 2개의 탄화수소이다. 따라서, 알킬이 에테르가 되게 하는 알킬의 치환기가 예컨대 -O-알킬, -O-알케닐, -O-알키닐, -O-(CH2)m-R1 중의 하나에 의해 표시될 수 있는 알콕실이거나 또는 이와 비슷하고, 여기서 m 및 R1은 하기에 기재되어 있다.
용어 "아민" 및 "아미노"는 기술분야에 인식되어 있고, 비치환된 및 치환된 아민, 예를 들면 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티 모두를 지칭한다:
Figure pct00025
식 중, R3, R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R1를 나타내고, 이들이 부착되는 N 원자와 함께 취해지는 R3 및 R5는 고리 원자 내에 4 내지 8개의 원자를 갖는 폴리사이클릭을 이루고; R1은 알케닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클릴, 또는 폴리사이클릴을 나타내고; m은 제로 또는 내지 8의 범위의 정수이다. 특정 구현예에서, R3 또는 R5 중 단지 하나가 카보닐일 수 있고, 예를 들면 R3, R5, 및 질소는 함께 이미드를 형성하지 DSKG는다. 보다 더 특정한 구현예에서, R3 및 R5 (및 임의로 R6)는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 또는 -(CH2)m-R1을 나타낸다. 따라서, 본원에 사용되는 용어 "알킬아민"은 상기 정의된 바와 같이 이에 부착되는 치환된 또는 비치환된 알킬을 갖는 아민기를 의미하고, 즉 R3 및 R5 중 적어도 하나는 알킬기이다. 특정 구현예에서, 아미노기 또는 알킬아민은 염기성이고, 이는 이것이 pKa > 7.00을 갖는 콘주게이트 산을 가지고, 이들 작용기의 양성자화된 형태는 물에 비해 약 7.00 초과의 pKa를 가지는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "아릴"은 3- 내지 12-원 치환된 또는 비치환된 단일-고리 방향족기를 포함하고, 여기서 상기 고리의 각각의 원자는 탄소이거나 (즉, 카보사이클릭 아릴) 또는 하나 이상의 원자는 헤테로원자이다 (즉, 헤테로아릴). 바람직하게는, 아릴기는 5- 내지 12-원 고리, 더 바람직하게는 6- 내지 10-원 고리를 포함한다. 특정 구현예에서, 아릴은 (C6-C10)아릴을 포함한다. 또한, 용어 "아릴"은 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리계를 포함하고, 여기서 2개 이상의 탄소는 2개의 인접한 고리에 공통되고, 여기서 하나 이상의 고리는 방향족이고, 예를 들면, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 카보사이클릭 아릴기는 벤젠, 나프탈렌, 펜안트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다. 헤테로아릴기는 치환된 또는 비치환된 방향족 3- 내지 12-원 고리 구조, 더 바람직하게는 5- 내지 12-원 고리, 더 바람직하게는 6- 내지 10-원 고리를 포함하고, 이의 고리 구조는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴은 (C2-C9)헤테로아릴을 포함한다. 헤테로아릴기는 예를 들면, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 포함한다.
용어 "아르알킬"은 본 기술분야에 인식되어 있으며, 아릴기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
용어 "헤테로아르알킬"은 본 기술분야에 인식되어 있으며, 헤테로아릴기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
용어 "헤테로원자"는 본 기술분야에 인식되어 있으며, 탄소 또는 수소 이외의 임의의 성분의 원자를 지칭한다. 예시적인 헤테로원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황 및 셀레늄이다.
용어 "헤테로사이클릴" 또는 "폴리사이클릭기"는 3- 내지 12-원 고리 구조, 더 바람직하게는 5- 내지 12-원 고리, 더 바람직하게는 6- 내지 10-원 고리를 지칭하고, 이 고리 구조는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 또한 폴리사이클일 수 있다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴은 (C2-C9)헤테로사이클릴을 포함한다. 헤테로사이클릴기는 예를 들면, 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 크로멘, 크산텐, 펜옥사티인, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 시놀린, 프테리딘, 카바졸, 카보린, 펜안트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 펜안트롤린, 펜아진, 펜아르사진, 페노티아진, 푸라잔, 펜옥사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모폴린, 락톤, 락탐 예컨대 아제티디논 및 피롤리디논, 설탐, 설톤 등을 포함한다. 폴리사이클릭 고리는 하나 이상의 위치에서 상기 기재된 바와 같은 이러한 치환기, 예를 들면 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 설파모일, 설피닐, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
용어 "카보닐"은 본 기술분야에 인식되어 있으며, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 이러한 모이어티를 포함한다:
Figure pct00026
식 중, X는 결합이거나 또는 산소 또는 황을 나타내고, R7은 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R1 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 나타내고, R8은 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R1을 나타내고, m 및 R1은 상기에 정의된 바와 같다. X가 산소이고, R7 또는 R8은 수소가 아닌 경우에, 상기 화학식은 "에스테르"를 나타낸다. X가 산소이고, R7이 상기 정의된 바와 같은 경우에, 모이어티는 본원에서 카복실기로 지칭되고, 특히 R7이 수소인 경우에, 상기 화학식은 "카복실산"을 나타낸다. X가 산소이고, R8이 수소인 경우에, 상기 화학식은 "포르메이트"를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 대체되는 경우, 상기 화학식은 "티오카보닐" 기를 나타낸다. X가 황이고, R7 또는 R8이 수소가 아닌 경우에, 상기 화학식은 "티오에스테르" 기를 나타낸다. X가 황이고, R7이 수소인 경우, 상기 화학식은 "티오카복실산" 기를 나타낸다. X가 황이고, R8이 수소인 경우, 상기 화학식은 "티오포르메이트" 기를 나타낸다. 다른 한편으로, X가 결합이고, R7이 수소가 아닌 경우, 상기 화학식은 "케톤" 기를 나타낸다. X가 결합이고, R7이 수소인 경우, 상기 화학식은 "알데하이드" 기를 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "티옥사마이드"는 하기 화학식으로 나타낼 수 있는 모이어티를 지칭한다:
Figure pct00027
식 중, Rt는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아르알킬, 또는 아릴, 바람직하게는 수소 또는 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, "티옥사미드-유도된" 화합물 또는 "티옥사미드 유사체"는 하나 이상의 아미드기가 하나 이상의 대응되는 티옥사미드기로 대체된 화합물을 지칭한다. 티옥사미드는 또한 본 기술분야에서 "티오아미드"로서 지칭된다.
용어 "아미도"는 아미노-치환된 카보닐로서 본 기술분야에 인식되어 있고, 하기 일반 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 포함한다:
Figure pct00028
식 중, R50 및 R51은 상기에 정의된 바와 같다. 본 발명에서 아미드의 특정 구현예는 불안정할 수 있는 이미드를 포함하지 않을 것이다.
본원에 사용되는 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용가능한 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 광범위한 양태에서, 허용가능한 치환기는 유기 화합물의 비환형 또는 환형, 분지형 및 비분지형, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 예시적인 치환기는 에를 들면 상기 본원에 기재된 것을 포함한다. 허용가능한 치환기는 하나 이상일 수 있고, 적절한 유기 화합물에 대해 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로원자 예컨대 질소는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 허용가능한 임의의 치환기를 가질 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용가능한 치환기에 의해 임의의 방식으로 제한되지 않는 것으로 의도된다. "치환" 또는 "~로 치환된"은 이러한 치환은 치환된 원자 및 치환기의 허용가능한 원자가에 따르고, 치환은, 예를 들면 이는 예컨대 재배열, 고리화, 제거 등에 의해 자발적으로 전환이 되지 않는 안정한 화합물을 생성한다는 암시적인 조건을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "니트로"는 -NO2를 의미하고; 용어 "할로겐"은 -F, -Cl, -Br, 또는 -I를 지칭하고; 용어 "설프하이드릴"은 -SH를 의미하고; 용어 "하이드록실"은 -OH를 의미하고; 용어 "설포닐"은 -SO2-를 의미하고; 용어 "아지도"는 -N3를 의미하고; 용어 "시아노"는 -CN을 의미하고; 용어 "이소시아나토"는 -NCO를 의미하고; 용어 "티오시아나토"는 -SCN을 의미하고; 용어 "이소티오시아나토"는 -NCS를 의미하고; 용어 "시아나토"는 -OCN을 의미한다.
용어 "할로알킬"은 본원에 정의된 바와 같이 알킬기를 통해 모 분자 모이어티에 부착되는 본원에 정의된 하나 이상의 할로겐을 의미한다. 할로알킬의 대표적인 예는 비제한적으로, 클로로메틸, 2-플루오로에틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 및 2-클로로-3-플루오로펜틸을 포함한다.
용어 "설파모일"은 본 기술분야에 인식되어 있고, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 포함한다:
Figure pct00029
식 중, R3 및 R5는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "설페이트"는 본 기술분야에 인식되어 있고, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 포함한다:
Figure pct00030
식 중, R7은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "설폰아미드"는 본 기술분야에 인식되어 있고, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 포함한다:
Figure pct00031
식 중, R3 및 R8는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "설포네이트"는 본 기술분야에 인식되어 있고, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 포함한다:
Figure pct00032
식 중, R7은 전자쌍, 수소, 알킬, 사이클로알킬, 또는 아릴이다.
본원에 사용되는 용어 "설폭시도" 또는 "설피닐"은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 모이어티를 지칭한다:
Figure pct00033
식 중, R12는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용되는 각각의 표현의 정의, 예를 들면, 알킬, m, n, 등는 임의의 구조에서 1회 초과로 나타나는 경우에, 동일한 구조에서 임의의 부분에 이의 정의와 독립적인 것으로 의도된다.
본 발명의 목적을 위해, 화학 원소는 이의 커버 내부에서의 문헌 [원소 주기율표, CAS 버전, Handbook of Chemistry and Physics, 67th ed., 1986-87]에 따라 확인된다.
약제학적 조성물
또한, 본 발명의 화합물 (예를 들면, 화학식 I, II, III, 또는 IV의 임의의 하나의 화합물), 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한, 이러한 약제학적 조성물의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어 중에 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 배치시키는 것을 포함한다.
본 발명의 화합물 및 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에서의 암의 치료에 유용하다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 그것을 필요로 하는 대상체에 투여되고, 이로써 암을 치료한다.
본원에 사용되는 "억제하다" 또는 "억제함"은 객관적으로 대조군과 비교하여 측정가능한 양 또는 정도로의 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 억제하다 또는 억제함은 대조군과 비교하여 적어도 통계적으로 상당한 양으로의 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 억제하다 또는 억제함은 대조군과 비교하여 적어도 5%까지의 감소를 의미한다. 다양한 개별적인 구현예에서, 억제하다 또는 억제함은 대조군과 비교하여 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 33, 40, 50, 60, 67, 70, 75, 80, 90, 또는 95 퍼센트 (%)까지의 감소를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "치료하다" 및 "치료함"은 (a) 질병 또는 질환이 발달될 위험에 있거나 또는 이를 앓을 수 있으나, 아직까지 질병 또는 질환을 가지는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병 또는 질환이 발생되는 것을 예방하거나; (b) 질병 또는 질환을 억제하고, 예를 들면 그것의 발달을 느리게 하거나 또는 방지하거나; 또는 (c) 질병 또는 질환을 경감하거나 또는 완화하고, 예를 들면, 질병 또는 질환의 퇴행을 초래하는 개입을 수행하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "치료함" 및 "치료하다"는 (a) 질병 또는 질환을 억제하고, 예를 들면 그것의 발달을 느리게 하거나 또는 방지하거나; 또는 (b) 병 또는 질환을 경감하거나 또는 완화하고, 예를 들면, 질병 또는 질환의 퇴행을 초래하는 개입을 수행하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 "대상체"는 살아 있는 포유동물을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 대상체는 비제한적으로, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 양, 염소, 고양이, 개, 돼지, 말, 소, 또는 비-인간 영장류를 포함하는 비-인간 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
특정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
본원에 사용되는 "투여함"은 그의 통상적 의미를 가지고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 복강내, 척추강내, 안구내 (예를 들면, 초자체내), 피하, (예를 들면, 종양 내로의) 직접적인 주사 , 점막, 흡입, 경구, 및 국소를 포함하는 임의의 적합한 투여 경로에 의한 투여를 포괄한다.
일 구현예에서, 투여는 정맥내로의 것이다.
일 구현예에서, 투여는 경구로의 것이다.
본원에 사용되는 어구 "유효량"은 원하는 생물학적 효과를 달성하는데 충분한 임의의 양을 지칭한다.
본 발명의 화합물은 다른 치료제와 조합될 수 있고, 본 발명의 다른 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 다른 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료제가 동시에 투여되는 경우에, 이는 동일하거나 또는 별개의 제형으로 투여될 수 있고, 그러나 이는 실질적으로 동시에 투여된다. 다른 치료제의 투여 및 본 발명의 화합물이 일시적으로 분리되는 경우에, 다른 치료제는 서로 그리고 본 발명의 화합물과 함께 순차적으로 투여된다. 이들 화합물의 투여 사이에 시간적 분리는 분 단위일 수 있거나 또는 이는 더 길 수 있다.
다른 치료제의 예는 항생제, 항-바이러스제, 항-염증제, 면역억제성 제제, 항부정맥제, 베타 차단제, 진통제, 및 항암제를 포함한다.
상기에서 언급된 바와 같은 "유효량"은 원하는 생물학적 효과를 달성하는데 충분한 임의의 양을 지칭한다. 본원에 제공된 교시와 조합하여, 다양한 활성 화합물 및 칭량 인자 예컨대 효력, 상대적 생체이용률, 환자 체중, 부정적인 부작용의 중증도 및 바람직한 투여 방식, 효과적인 예방적 또는 치료적 치료 요법에서 선택함으로써 계획될 수 있고, 이는 실질적인 원치않는 독성을 야기하지 않으며, 여전히 특정 대상체의 치료에 효과적이다. 유효량의 임의의 특정한 적용은 치료되는 질환 또는 질병, 투여되는 본 발명의 특정 화합물, 대상체의 크기, 또는 질환 또는 질병의 중증도와 같은 이러한 인자에 따라 변화될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험과정을 요구함 없이 본 발명의 특정한 화합물 및/또는 다른 치료제의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있다. 때때로, 최대 용량, 즉 일부 의료 판단에 따라 최고 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 일일당 다중 용량은 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 고려될 수 있다. 적절한 전신 수준은 예를 들면, 환자의 피크 또는 약물의 지속된 혈장 수준의 측정에 의해 결정될 수 있다. "용량" 및 "복용량"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일반적으로, 활성 화합물의 일일 경구 용량은 인간 대상체에 대해 0.01 밀리그램/kg/일 내지 1000 밀리그램/kg/일일 것이다. 일일당 1회 이상의 투여에 있어서의 0.5 내지 50 밀리그램/kg의 범위로의 경구 용량은 원하는 결과를 산출할 것으로 기대된다. 복용량은 투여 방식에 따라 국소 또는 전신으로의 원하는 약물 수준을 달성하기 위해 적절하게 조정될 수 있다. 예를 들면, 정맥내 투여는 일일당 10의 1승 내지 다수 자릿수의 자승으로 더 낮은 용량일 수 있는 것으로 기대된다. 대상체에서의 반응이 이러한 용량에서 불충분한 경우에, 더욱더 높은 용량 (또는 상이한 보다 국소화된 전달 경로에 의해 유효한 보다 높은 용량)이 환자 내성이 허용되는 한도에서 이용될 수 있다. 일일당 다중 용량이 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 고려된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물의 정맥내 투여는 전형적으로 0.1 mg/kg/일 내지 20 mg/kg/일일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물에 경우, 유효량은 동물 모델로부터 초기에 결정될 수 있다. 치료적 유효량은 또한 인간에서 시험되는 본 발명의 화합물에 대해 그리고 유사한 약리적 활성을 나타내는 것으로 알려진 화합물, 예컨대 다른 관련된 활성제에 대한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 더 높은 용량은 비경구 투여에 대해 요구될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효력에 기초하여 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 당해 분야에 공지된 다른 방법에 기초한 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명의 제형은 약제학적으로 허용가능한 용액으로 투여될 수 있고, 이는 일상적으로 약제학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 보존제, 양립가능한 캐리어, 아쥬반트, 및 임의로 다른 치료 성분을 포함할 수 있다.
요법에서 사용하기 위해, 유효량의 본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물을 원하는 위치 또는 표면으로 전달하는 임의의 방식에 의해 대상체로 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것은 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 투여 경로는 비제한적으로 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, (예를 들면, 종양 또는 농양 내로의) 직접적인 주사, 점막, 흡입, 및 국소를 포함한다.
정맥내 및 다른 비경구 투여 경로의 경우, 화합물은 디옥시콜산과 동결건조된 제제로서, 리포좀-개재된 또는 -캡슐화된 활성 화합물의 동결건조된 제제로서, 수성 현탁액 중의 지질 복합체로서, 또는 콜레스테릴 설페이트 복합체로서 제형화될 수 있다. 동결건조된 제형은 일반적으로 투여 직전에 적합한 수용액, 예를 들면, 멸균수 또는 염수 중에 재구성된다.
경구 투여 경우에, 화합물 (즉, 본 발명의 화합물, 및 다른 치료제)는 당해 분야에서 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 캐리어와 활성 화합물(들)을 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 캐리어는 본 발명의 화합물이 치료되는 대상체에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화되게 할 수 있다. 경구 사용을 위한 약제학적 제제는 수득한 혼합물로서 수득될 수 있고, 이는 임의로 생성된 혼합물이 분쇄되고, 원하는 경우 정제 또는 당의정 코어를 얻기 위해 적합한 보조물을 첨가한 이후에 과립의 혼합물이 가공된다. 적합한 부형제는 특히 충전제 예컨대 당이고, 이는 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨; 셀룰로오스 제제 예컨대, 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)를 포함한다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그것의 염 예컨대 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다. 임의로, 경구 제형은 또한 내부 산 조건을 중화하기 위해 염수 또는 완충액, 예를 들면, EDTA 중에서 제형화될 수 있거나 또는 임의의 캐리어 없이 투여될 수 있다.
또한, 상기 성분 또는 성분들의 경구 복용 형태가 특별하게 고려된다. 성분 또는 성분들은 화학적으로 개질될 수 있고, 이로써 유도체의 경구 전달이 유효하다. 일반적으로, 고려되는 화학적 개질은 성분 분자 자체에의 하나 이상의 모이어티의 부착이고, 여기서 상기 모이어티는 (a) 산성 가수분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장으로부터 혈류로의 흡수가 허용된다. 또한, 성분 또는 성분들의 전반적 안정성에서의 증가 및 신체 내의 순환 시간에서의 증가가 바람직하다. 이러한 모이어티의 예는 하기의 것을 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린. 문헌 [Abuchowski and Davis, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., pp. 367-383 (1981); Newmark et al., J Appl Biochem 4:185-9 (1982)]. 사용될 수 있는 다른 폴리머는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이다.
성분 (또는 유도체)의 경우, 방출 위치는 위, 소장 (샘창자, 지주넴(jejunem) 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 위장에서는 용해되지 않지만, 샘창자 또는 장 내의 임의의 부분에서 물질을 방출하는 이용 가능한 제형을 가진다. 바람직하게는, 방출은 본 발명의 화합물 (또는 유도체)를 보호함으로써, 또는 위장 환경을 넘어서, 장과 같은 곳에서 생물학적 활성 물질을 방출하게 함으로써 위장 환경의 유해한 효과를 피할 것이다.
완전한 위장 저항성을 보장하기 위하여 pH 5.0 이상까지 비투과성인 코팅이 필수적이다. 장용 코팅으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), Eudragit L, Eudragit S, 및 쉘락 (shellac)이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로서 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물은 위장에 대하여 보호하고자 하는 것이 아닌 정제에 대해서도 사용될 수 있다. 이것은 당류 코팅, 또는 정제를 씹기 쉽게 하는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제 (예를 들면, 분말) 전달용으로서 경질 쉘 (예컨대 젤라틴)로 이루어질 수 있고, 액체 형태의 경우 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 알약의 쉘 물질은 두꺼운 전분 또는 기타의 식용 가능한 종이(paper)일 수 있다. 알약, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 가루약(triturates)의 경우, 습기 집적(massing) 기술이 사용될 수 있다.
치료제는 약 1mm의 입자 크기의 과립 또는 펠렛 형태의 미세 다중 미립자로서 제형에 포함시킬 수 있다. 캡슐 투여용 물질 제형은 또한 분말, 가볍게 압착된 플러그(plugs), 또는 정제로 제공될 수 있다. 이들 치료제는 압착에 의하여 제조될 수 있었다.
착색제 및/또는 향료가 모두 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 (또는 유도체)는 (예컨대, 리포솜 또는 미소 구체 캡슐화에 의한 것과 같이) 제형화한 다음, 착색제 및 향료를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 추가로 함유시킬 수 있다.
불활성 물질로 희석하거나 또는 치료제의 체적을 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 개질된 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 포함하는 특정 무기염 역시 충전제로서 사용될 수 있다. 일부 상업적으로 이용가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
붕해제는 고체 복용 형태의 치료제 제형에 포함될 수 있다. 붕해제로 사용되는 물질은 비제한적으로 전분을 포함하고, 이는 전분에 기초한 상업적 붕해제, Explotab를 포함한다. 나트륨 전분 글라이콜레이트, 앰벌라이트, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 울트라밀로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 필, 산 카복시메틸 셀룰로오스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두가 사용될 수 있다. 다른 형태의 붕해제는 불용성 양이온성 교환 수지이다. 분말화된 검은 붕해제로서 결합제로서 사용될 수 있고, 이는 분말화된 검 예컨대 한천, 카라야 또는 트라가칸쓰를 포함할 수 있다. 알긴산 및 그것의 나트륨염이 또한 붕해제로서 유용하다.
결합제는 경질 정제를 형성하기 위해 치료제를 유지하기 위해 사용될 수 있고, 천연 생성물 예컨대 아카시아, 트라가칸쓰, 전분 및 젤라틴으로부터의 물질을 포함한다. 다른 것은 메틸 셀룰로오스 (MC), 에틸 셀룰로오스 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로오스 (CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC)는 모두 치료제를 과립화하기 위해 알코올성 용액에서 모두 사용될 수 있다.
제형화 과정에서 붙는 것을 방지하기 위해 항-마찰제(anti-frictional agent)가 상기 치료제의 제형에 포함될 수가 있다. 윤활제가 상기 치료제와 그 다이(die) 벽 사이의 층에 사용될 수가 있고 이들은 비제한적으로 이의 마그네슘 및 칼슘 염을 포함하는 스테아릭산, 폴리 테트라 플루오르 에틸렌(PTFE), 유동 파라핀, 식물유 및 왁스를 포함한다. 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜, 카보왁스(Carbowax) 4000 및 6000과 같은 가용성 윤활제도 사용될 수가 있다.
압축 중에 재배열을 돕고 제형화 동안 상기 약물의 흐름 성질을 개량할 수가 있는 활제(glidant)가 첨가될 수가 있다. 상기 활제는 전분, 활석, 발열성 실리카 및 수화된 실리코알루마네이트를 포함할 수가 있다.
수용성 환경으로 상기 치료제의 용해를 돕기 위해, 계면활성제가 습윤제로 첨가될 수가 있다. 계면활성제는 음이온성 세제, 예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트를 포함할 수 있다. 양이온 세제가 또한 사용될 수 있고, 벤즈알코늄 염화물 및 벤즈에토늄 염화물을 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제형에 포함될 수가 있는 잠재적인 비이온성의 세제는 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 본 발명의 화합물의 제형 또는 이의 유도체 단독 또는 상이한 비로의 혼합물로서 존재할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 압입형 캡슐은 충전제 예컨대 락토오스, 결합제 예컨대 전분, 및/또는 윤활제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘 및, 임의로, 안정화제와 함께 혼합물 내에 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서 활성 화합물은 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 유동 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위해 제형화된 마이크로구형체가 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 마이크로구형체는 당해 분야에 잘 정의되어 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이러한 투여를 위해 적합한 복용량이어야 한다.
구강 투여를 위해, 조성물은 종래의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 가질 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제공의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 복용량 단위는 계량된 양으로 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 화합물 및 적합한 분말 베이스 예컨대 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 포함하도록 제형화될 수 있다.
또한, 본원에서 본 발명의 화합물 (또는 그것의 유도체)의 폐 전달이 고려된다. 본 발명의 화합물 (또는 유도체)은 흡입되어 폐 상피를 통해 혈류로 전달되면서 포유동물의 폐로 전달된다. 흡입된 분자의 다른 기록은 문헌 [Adjei et al., Pharm Res 7:565-569 (1990); Adjei et al., Int J Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (leuprolide acetate); Braquet et al., J Cardiovasc Pharmacol 13(suppl. 5):143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annal Int Med 3:206-212 (1989) (α1-antitrypsin); Smith et al., 1989, J Clin Invest 84:1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (recombinant human growth hormone); Debs et al., 1988, J Immunol 140:3482-3488 (interferon-gamma and tumor necrosis factor alpha)] 및 Platz 그외 다수의 미국특허 제5,284,656호 (과립구 집락 자극 인자)를 포함한다. 전신 효과를 위한 약물의 폐 전달을 위한 방법 및 조성물은 Wong 그외 다수의 1995년 9월 19일에 발행된 미국특허 제5,451,569호에 기재되어 있다.
비제한적으로 분무기, 정량 흡입기, 및 분말 흡입기를 포함하는 치료 제품의 폐 전달을 위해 설계된 광범위한 기계적 디바이스가 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려되고, 이들 모두는 당해 분야의 숙련가에 익숙한 것이다.
본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 이용가능한 디바이스의 일부의 특정 예는 Mallinckrodt, Inc.(세인트 루이스, Mo. 소재)에 의해 제조된 Ultravent 분무기; Marquest Medical Products(엥글우드, Colo. 소재)에 의해 제조된 Acorn II 분무기; Glaxo Inc., Research Triangle Park(노스 캐롤리나 소재)에 의해 제조된 Ventolin 정량 흡입기; 및 Fisons Corp.(베드포드, 매스 소재)에 의해 제조된 Spinhaler 분말 흡입기이다.
모든 이러한 디바이스는 본 발명의 화합물 (또는 유도체)을 분배를 위해 적합한 제형의 사용을 요구한다. 전형적으로, 각각의 제형은 이용되는 디바이스의 유형에 특이적이고, 보통 요법에 유용한 희석제, 아쥬반트 및/또는 캐리어 이외에 적절한 추진제 물질의 사용을 수반할 수 있다. 또한, 리포좀, 마이크로캡슐 또는 마이크로구형체, 봉입체 복합체, 또는 다른 유형의 캐리어의 사용이 고려된다. 또한, 본 발명의 화학적으로 개질된 화합물은 화학적 개질의 유형 또는 이용되는 디바이스의 유형에 따라 상이한 제형에서 준비될 수 있다.
제트 또는 초음파의 분무기에 사용하기 위해 적합한 제형은 전형적으로 용액의 1mL당 0.1 내지 25 mg의 본 발명의 생물학적 활성 화합물의 농도로 물에 용해된 본 발명의 화합물 (또는 유도체)를 포함할 것이다. 또한, 제형은 (예를 들면, 본 발명의 화합물의 안정화 및 삼투압의 조절을 위해) 완충액 및 단당을 포함할 수 있다. 또한, 분무기 제형은 에어로졸의 형성시 용액의 분무화에 의해 야기되는 본 발명의 화합물의 표면 유도된 응집을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 계면활성제를 포함할 수 있다.
정량 흡입기 디바이스에 사용하기 위한 제형은 일반적으로 계면활성제의 도움으로 추진제에 현탁되는 본 발명의 화합물 (또는 유도체)를 포함하는 미분된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 이러한 목적을 위해 이용되는 임의의 종래의 물질, 예컨대 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올, 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함하는 탄화수소, 또는 이들의 조합일 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴을 포함한다. 또한, 올레산은 계면활성제로서 유용할 수 있다.
분말 흡입기 디바이스로부터 분배되기 위한 제형은 본 발명의 화합물 (또는 유도체)를 포함하는 미분된 건조 분말을 포함할 것이고, 또한 디바이스로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양, 예를 들면 제형의 50 내지 90 중량%로 팽화제, 예컨대 락토오스, 소르비톨, 수크로오스, 또는 만니톨를 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물 (또는 유도체)는 유리하게는 폐로 깊게 효과적으로 전달하기 위해 10 마이크로미터 (㎛) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛의 평균 입자 크기를 갖는 미립자 형태로 제조되어야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 비강 전달이 또한 고려된다. 비강 전달은 폐에서의 생성물의 침착을 위한 필요성 없이 코로 치료 제품을 직접적으로 투야한 이후에 본 발명의 약제학적 조성물의 혈류로의 통과를 가능하게 한다. 비강 전달을 위한 제형은 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 갖는 것이다.
비강 투여를 위한, 유용한 디바이스는 정량 분무기가 부착된 작은 단단한 병이다. 일 구현예에서, 정의된 용적의 챔버로 본 발명의 용액의 약제학적 조성물을 취출하여 정량이 전달되고, 이 챔버는 챔버 내의 액체가 압축된 경우에 분무를 형성하는 것에 의한 에어로졸 제형을 에어로졸화시키는 크기의 구멍을 가진다. 챔버는 압축되어 본 발명의 약제학적 조성물을 투여한다. 특정 구현예에서, 챔버는 피스톤 구조체(piston arrangement)이다. 이러한 디바이스는 상업적으로 이용가능하다.
대안적으로, 스퀴즈화되는 경우에 분무를 형성하는 것에 의한 에어로졸 제형을 에어로졸화시키는 구멍 또는 개구를 갖는 플라스틱 스퀴즈 병이 사용된다. 개구는 일반적으로 병의 최상부에서 발견되고, 최상부는 일반적으로 에어로졸 제형의 효율적인 투여를 위해 콧구멍에 부분적으로 맞추어지도록 가늘어진다. 바람직하게는, 비강 흡입기는 측정된 용량의 약물의 투여를 위해 계량된 양의 에어로졸 제형을 제공할 것이다.
전신으로 이들을 전달하는 것이 바람직한 경우에 화합물은 주사, 예를 들면 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 복용 형태, 예를 들면 첨가된 보존제와 함께 앰풀 또는 다중-용량 컨테이너에 존재할 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있고, 제제를 현탁시키고, 안정화시키고, 및/또는 분산시키는 제형제를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 수성 형태로의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일 예컨대 참께 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 고농축 용액을 제조할 수 있도록 화합물의 용해도를 증가시키는 제제 또는 적합한 안정화제를 포함할 수 있다.
대안적으로, 활성 화합물은 사용하기 이전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된 무발열원 물로 구성하기 위해 분말 형태일 수 있다.
또한, 화합물은 직장 또는 질 조성물 예컨대, 예를 들면, 종래의 좌약 염기 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 포함하는 좌약 또는 정체 관장제로 제형화될 수 있다.
상기 기재된 제형 이외에, 또한 화합물은 데포 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 지효성 제형은 적합한 폴리머 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온교환수지, 또는 난용성 유도체, 예를 들면, 난용성 염을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 적합한 고체 또는 겔 상의 캐리어 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 캐리어 또는 부형제의 예는 비제한적으로 탈산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 및 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
적합한 액체 또는 고체 약제학적 제제 형태는 예를 들면, 마이크로캡슐화되고, 코클레이트화되고, 리포좀에 포함되고, 분무되는 미세한 금 입자,, 피부에의 이식을 위한 에어로졸, 펠렛 상에 코팅되거나, 또는 피부를 긁는 날카로운 물체 상에 건조되는 흡입을 위한 수성 또는 염수 용액이다. 또한, 약제학적 조성물은 과립, 분말, 정제, 코팅된 정제, (마이크로)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 드롭스 또는 활성 화합물이 장기 방출되는 제제를 포함하고, 이 제제에서 부형제 및 첨가제 및/또는 보조물 예컨대 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 윤활제, 풍미제, 감미제 또는 가용화제가 상기 기재된 바와 같이 종래와 같이 사용된다. 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 검토를 위해, 문헌 [Langer R, Science 249:1527-33 (1990)]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 화합물 및 임의로 다른 치료제는 그 자체로 (순수하게) 또는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약에 사용되는 경우에, 염은 약제학적으로 허용가능하여야 하고, 그러나 비-약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 그것의 염의 제조를 위해 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 염은 비제한적으로 하기 산으로부터 제조된 것을 포함한다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 설폰산, 포름산, 말론산, 석신산, 나프탈렌-2-설폰산, 및 벤젠 설폰산. 또한, 이러한 염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 염, 예컨대 카복실산의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
적합한 완충제는 하기의 것을 포함한다: 아세트산 및 염 (1-2% w/v); 시트르산 및 염 (1-3% w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5% w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2% w/v). 적합한 보존제는 벤즈알코늄 염화물 (0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9% w/v); 파라벤 (0.01-0.25% w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02% w/v)을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효량의 본 발명의 화합물 및 임의로 약제학적으로 허용가능한 캐리어에 포함되는 치료제를 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 하나 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미하고, 이는 인간 또는 다른 척추동물 동물에의 투여에 적합하다. 용어 "캐리어"는 활성 성분이 적용을 용이하도록 조합되는 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 성분을 의미한다. 약제학적 조성물의 성분은 또한 원하는 약제학적 효율을 실질적으로 손상시키는 상호작용 없는 방식으로 본 발명의 화합물과 서로 혼합될 수 있다.
비제한적으로 본 발명의 화합물을 특별하게 포함하는 치료제(들)은 입자에 제공될 수 있다. 본원에 사용되는 입자는 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에서 기재된 다른 치료제(들)로 이루어질 수 있는 나노입자 또는 극미립자 (또는 일부 경우에서 더 큰 입자)를 의미한다. 입자는 비제한적으로, 장용 코팅을 포함하는 코팅에 의해 둘러싸인 코어 내에 치료제(들)을 포함할 수 있다. 치료제(들)은 또한 입자 전반에 분산될 수 있다. 또한, 치료제(들)은 입자에 흡착될 수 있다. 입자는 영차 방출, 1차 방출, 2차 방출, 지연 방출, 지속 방출, 즉시 방출, 및 이들의 임의의 조합 등을 포함하는 임의의 차수의 방출 동력학의 것일 수 있다. 입자는 치료제(들) 이외에 약학 및 의약의 기술분야에서 일반적으로 사용되는 물질 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 이는 비제한적으로 침식가능, 비침식가능, 생분해성, 또는 비생분해성 물질 또는 이들의 조합을 포함한다. 입자는 용액 또는 반-고체 상태로 본 발명의 화합물을 포함하는 마이크로캡슐일 수 있다. 입자는 사실상 임의의 형상의 것일 수 있다.
비-생분해성 및 생분해성 폴리머 물질 모두는 치료제(들)을 전달하기 위한 입자의 제조시 사용될 수 있다. 이러한 폴리머는 천연 또는 합성 폴리머일 수 있다. 폴리머는 방출이 요망되는 기간에 기초하여 선택된다. 특정 관심 대상의 생체적합성 폴리머는 문헌 [Sawhney H S et al. (1993) Macromolecules 26:581-7]에 기재된 생체붕괴성 하이드로겔을 포함하고, 이의 교시는 본원에 포함되어 있다. 이들은 폴리하이알루론산, 카세인, 젤라틴, 글루틴, 폴리무수물, 폴리아크릴산, 알기네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트)를 포함한다.
치료제(들)은 조절 방출 시스템에 포함될 수 있다. 용어 "조절 방출"은 제형으로부터의 약물 방출의 방식 및 프로파일이 제어되는 임의의 약물-함유 제형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 즉각적뿐만 아니라 비즉각적 방출 제형을 지칭하고, 비즉각적 방출 제형은 비제한적으로 지속 방출 및 지연 방출 제형을 포함한다. 용어 "지속 방출" (또한 "연장 방출"을 지칭함)은 장시간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 위해 제공되고, 바람직하게는 필연적은 아니지만 장기간에 걸쳐 실질적으로 일정한 약물의 혈중 농도를 야기하는 약물 제형을 지칭하는 이의 종래의 의미로 사용된다. 용어 "지연 방출"은 제형의 투여와 이로부터의 약물의 방출 사이의 시간 지연이 존재하는 약물 제형을 지칭하는 이의 종래의 의미로 사용된다. "지연 방출"은 장시간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 수반할 수 었거나 수반하지 않을 수 있고, 이에 따라 "지속 방출"이거나 또는 아닐 수 있다.
장기간 지속 방출 이식물의 사용은 만성적 질병의 치료를 위해 특히 적합할 수 있다. 본원에 사용되는 "장기간" 방출은 이식물이 구성되고 배열되어 적어도 7일 동안, 바람직하게는 30-60 일 동안 치료 수준의 활성 성분을 전달하는 것을 의미한다. 장기간 지속 방출 이식물은 당해 분야의 숙련가에게 공지도어 있고, 상기 기재된 방출 시스템의 일부를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 대한 적합한 다른 변형 및 적용이 당업자에게 공지된 정보와 관련하여 본원에 포함된 본 발명의 설명으로부터 자명하고, 본 발명 또는 이의 임의의 구현예의 범위를 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술분야의 당업자에게 이해될 것이다.
실시예
본 발명을 이하 상세하게 설명하며, 이는 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 될 것이며, 이는 단지 예시적인 목적을 위해 포함되며, 이는 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. Ac 4 ManAz 유도체의 합성
Figure pct00034
2-아지도아세트산 (1) 의 합성. 브로모아세트산 (2.78 g, 20 mmol)을 탈이온수 (30 mL)에 용해시키고, 그 다음 아지드화나트륨 (2.60 g, 40 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 용액을 염화수소 용액을 사용하여 pH = 1로 조정하였고, 그 다음 디에틸 에테르로 3회 (100 mL Х 3) 추출하였다. 유기상을 수집하였고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰고, 농축시켜 무색의 오일을 얻었다 (80% 수율, 1.62 g).
N -(2-아지도아세틸) 석신이미드 (2)의 합성. N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC, 2.06 g, 10 mmol) 및 1 (1.01 g, 10 mmol)을 무수 DMF에 용해시켰고, 그 다음 N-하이드록시석신이미드 (1.15 g, 10 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 침전물의 제거 이후, 용매를 제거하여 황색 고형물을 산출하였다. 조 생성물을 디클로로메탄/헥산으로 재결정화시켜 백색 고형물을 얻었다 (70% 수율, 1.39 g). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 4.25 (s, 2H, N3CH 2), 2.88 (s, 4H, CH 2CH 2). 13C NMR (CDCl3, 500 MHz): 168.7, 164.4, 48.2, 25.8. LRMS (ESI) m/z: C6H7N4O4 [M + H]+에 대한 계산치 199.0, 실측치 199.0.
Ac 4 ManAz 의 합성. D-만노스아민 하이드로클로라이드 (539 mg, 2.5 mmol) 및 트리에틸아민 (253 mg, 2.5 mmol)을 메탄올 (40 mL)에 용해시키고, 그 다음 2 (545 mg, 2.75 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 피리딘에 재용해시켰다. 아세트산 무수물 (10 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 추가의 24시간 동안 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 용리액으로서 아세트산에틸/헥산 (1/1, v/v) 을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물을 산출하였다 (45% 수율, 484.5 mg). LRMS (ESI) m/z: C16H22N4O10Na [M + Na]+에 대한 계산치 453.1, 실측치 453.1.
Ac 3 ManAzEt의 합성. Ac4ManAz (43 mg, 0.1 mmol) 및 무수 에탄올 (14 mg, 0.3 mmol)을 건조 DCM (1.5 mL)에 용해시켰고, 질소로 10분 동안 퍼징하였다. 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 (71 mg, 0.5 mmol)를 주사기로 첨가하였다. 혼합물을 암 조건 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이후 DCM (30 mL)을 첨가하고, 용액을 각각 포화된 중탄산나트륨 용액 2회 (10 mL Х 2) 및 탈이온수로 2회 (10 mL Х 2) 세정하였다. 유기상을 수집하였고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰고, 농축시켜 황색 오일을 산출하였다. 조 생성물을 용리액으로 아세트산에틸/헥산 (1/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물을 산출하였다 (30% 수율, 12.5 mg). LRMS (ESI) m/z: C16H25N4O9 [M + H]+에 대한 계산치 417.2, 실측히 417.2.
Ac 3 ManAzNB 의 합성. Ac4ManAz (43 mg, 0.1 mmol) 및 2-니트로벤질알코올 (30 mg, 0.2 mmol)을 건조 DCM (1.5 mL)에 용해시켰고, 질소로 10분 동안 퍼징시켰다. 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 (70.9 mg, 0.5 mmol)을 주사기를 통해 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 교반하였다. 이후 DCM (30 mL)을 첨가하고, 용액을 각각 포화된 중탄산나트륨 용액 2회 (10 mL Х 2) 및 탈이온수로 2회 (10 mL Х 2) 세정하였다. 유기상을 수집하였고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰고, 농축시켜 갈색 오일을 산출하였다. 조 생성물을 용리액으로 아세트산에틸/헥산 (1/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 옅은 적색 고형물을 산출하였다 (25% 수율, 13.0 mg). LRMS (ESI) m/z: C21H25N5O11Na [M + Na]+에 대한 계산치 546.2, 실측치 546.2.
Ac 3 ManAzNB의 UV 유도된 분해. Ac3ManAzNB (1 mg)을 무수 DCM (1.0 mL)에 용해시켰고, UV 조사 하에 실온에서 교반하였다. UV 조사의 강도를 20 mW/cm2으로 설정하였다. 20 ㎕의 반응 용액을 취하고, 선택된 시점 (0, 5, 15, 및 30 min)에서 HPLC 측정 이전에 600 μL로 희석시켰다. HPLC이 개시 물질의 완전한 분해를 나타낸 이후에, 반응 용액의 ESI 질량 스펙트럼을 측정하여 분해된 생성물을 확인하였다.
반응식 S2. Ac3ManAzHB의 합성 경로
Figure pct00035
Ac 3 ManAzHB의 합성. Ac3ManAzHB를 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB와 유사하게 합성하였다. Ac4ManAz (43 mg, 0.1 mmol) 및 4-하이드록시페닐붕산 피나콜 에스테르 (44 mg, 0.2 mmol)을 건조 DCM (1.5 mL)에 용해시켰고, 질소로 10분 동안 퍼징하였다. 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 (71 mg, 0.5 mmol)을 주사기를 통해 첨가하였다. 혼합물을 암 조건 하에 밤새 실온에서 교반하였다. DCM (30 mL)을 첨가하고 용액을 각각 포화된 중탄산나트륨 용액 2회 (10 mL Х 2) 및 탈이온수로 2회 (10 mL Х 2) 세정하였다. 유기상을 수집하였고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰고, 농축시켜 황색 오일을 산출하였다. 조 생성물을 용리액으로 아세트산에틸/헥산 (2/1 내지 1/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일을 산출하였다 (50% 수율, 30.0 mg). LRMS (ESI) m/z: C27H38BN4O11 [M + H]+에 대한 계산치 605.3, 실측치 605.1.
H 2 O 2 의 존재 하의 Ac 3 ManAzHB 의 분해 연구. Ac3ManAzHB (2 mg)을 건조 메탄올 (1.0 mL)에 용해시켰다. 10mM의 최종 H2O2 농도를 가진 H2O2 수용액을 첨가하였고, 생성된 혼합물을 37℃에 인큐베이션시켰다. 20 ㎕의 반응 용액을 취하였고, 상이한 시점에서 (0 min, 1 h, 6 h, 24 h, 및 48 h) HPLC 측정 이전에 600 μL로 희석시켰다. 분해된 생성물을 ESI 질량 스펙트럼에 의해 확인하였다.
반응식 S3. Ac3ManAzHQ 합성 경로
Figure pct00036
HQ-NHS (4)의 합성. HQ-COOH를 보고된 절차에 따라 합성하였다.1 HQ-COOH (2.0 mmol, 501 mg), N-하이드록실석신이미드 (NHS, 2.1 mmol, 242 mg) 및 트리메틸아민 (2.0 mmol, 202 mg)을 무수 DMF (30 mL)에 용해시켰고, 그 다음 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC, 2.1 mmol, 433 mg)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과 제거하였고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 용리액으로서 헥산/아세트산에틸 (3/1, v/v)을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 고형물을 산출하였다 (75% 수율). LRMS (ESI) m/z: C18H22NO6 [M + H]+에 대한 계산치 348.1, 실측치 348.1.
화합물 5의 합성. 4-아미노벤조페논 (5mmol, 985 mg)을 건조 메탄올 (50 mL)에 용해시켰고, 그 다음 NaBH4 (10 mmol, 378 mg)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 용리액으로서 헥산/아세트산에틸 (6/1 내지 3/1)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물 5를 밝은 황색 고형물로서 수득하였다 (80% 수율). LRMS (ESI) m/z: C13H14NO [M + H]+에 대한 계산치 200.1, 실측치 200.1.
화합물 6의 합성. 화합물 4 (1.0 mmol, 347 mg) 및 5 (1.0 mmol, 199 mg)을 무수 DMF (40 mL)에 용해시켰고, 그 다음 트리에틸아민 (1.0 mmol, 101 mg)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 48시간 동안 50℃에서 교반하였다. 이후 용매의 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 용리액으로서 헥산/아세트산에틸 (1/1)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물 6을 밝은 황색 고형물로서 수득하였다. LRMS (ESI) m/z: C27H30NO4 [M + H]+에 대한 계산치 432.2, 실측치 432.2.
Ac 3 ManAzHQ의 합성. Ac4ManAz (0.2 mmol, 86 mg)을 무수 THF에 용해시켰고, 그 다음 THF 중의 TMSOTf (0.25 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 분자체 (3 Å)를 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 6시간 동안 추가로 교반하였다. 화합물 6을 이후 첨가하였고, 반응 용액을 24시간 동안 실온에서 추가로 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 용리액으로서 아세트산에틸 내지 아세트산에틸/메탄올 (95/5, v/v)을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 밝은 황색 고형물을 수득하였다 (35% 수율). LRMS (ESI) m/z: C41H47N5O12Na [M + Na]+에 대한 계산치 824.3, 실측치 824.3.
Ac 3 ManAzHQ의 Na 2 S 2 O 4 유도된 분해. Ac3ManAzHQ (1 mg)을 메탄올/H2O (9/1, v/v, 1 mL)에 용해시키고, 그 다음 Na2S2O4 (1 mg)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 37℃에서 교반하였다 (100 rpm). 선택된 시점에서, 20 ㎕의 용액을 HPLC에 주입하여 Ac3ManAzHQ의 분해 과정을 모니터링하였다. HPLC가 완전한 분해를 나타난 이후에, ESI 질량 스펙트럼을 측정하여 분해된 생성물을 확인하였다.
실시예 2. 세포-표지에서의 Ac 4 ManAz 유도체의 조사
글리코시드 (에테르) 결합을 형성하는 것에 의한 Ac4ManAz의 C1 부위의 개질이 대사 표지화 과정을 차단할 수 있느지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자는 우선 Ac3ManAzEt, 대응하는 에틸 글리코사이드 (도 2, 패널 a)를 합성하였고, 시험관내 그것의 세포 표지 능력을 조사하였다. LS174T 결장암 세포를 각각 3일 동안 Ac4ManAz, Ac3ManAzEt, 및 PBS와 함께 인큐베이션시켰고, 잠재적으로 발현된 아지도기가 클릭 반응을 통해 DBCO-Cy5에 의해 검출되었다. 도 2, 패널 c에서 나타난 바와 같이, Ac4ManAz로 처리된 세포는 세포 표면 상에서 강한 Cy5 형광을 나타내었고, 이는 아지도기의 성공적인 발현을 나타낸다. 비교하자면, Ac3ManAzEt 또는 PBS로 처리된 LS174T 세포는 세포 표면 상에 무시할만한 Cy5 형광을 나타내었고, 이는 Ac3ManAzEt가 대사 표지화 과정을 통해 세포 표면 상에 아지도기를 도입하는데 실패하였음을 나타낸다. 또한, Ac4ManAz로 처리된 LS174T 세포의 유세포측정 분석은 Ac3ManAzEt 또는 PBS로 처리된 세포보다 상당하게 형성된 Cy5 형광을 나타내었다 (도 2, 패널 d). 아지도기가 당단백질의 형태로 세포 표면 상에 발현된 것을 확인하기 위해, 각각 Ac4ManAz, Ac3ManAzEt 및 PBS로 처리된 LS174T 세포의 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 아지도-당단백질은 포스핀-PEG3-바이오틴과 함께 인큐베이션시켜 바이오티닐화시켰고, 이에 따라 용이하게 검출할 수 있었다. 그 결과는 도 2, 패널 e에 나타나 있고, 이는 Ac4ManAz 기에서 일련의 단백질 밴드, 그러나 Ac3ManAzEt 및 PBS 기에서의 LS174T 세포의 단지 2개의 내인성 바이오티닐화된 단백질을 나타내었다. 이들 데이터는 Ac3ManAzEt가 아지도기를 갖는 암 세포를 대사성으로 표지화하는데 실패하였음을 입증하였다.
C1 부위에서 글리코시드 결합이 대사 표지화 과정의 차단과 관련있고, 1-OH을 노출시키는 이러한 결합의 절단이 표지화 과정을 재활성화하는 것을 추가로 입증하기 위해, UV-절단가능한 Ac3ManAzNB를 합성하였고 (도 2, 패널 b), 그것의 제어된 표지화 능력을 시험관내에서 조사하였다. LS174T 세포를 3일 동안 UV 처리 (10 min, 10 mW/cm2)를 하거나 또는 하지 않고 Ac3ManAzNB와 함께 인큐베이션시켰고, 세포-표면 아지도기를 DBCO-Cy5에 의해 검출하였다. UV 조사 없이, Ac3ManAzNB로 처리된 LS174T 세포는 세포 표면 상에 무시할만한 Cy5 형광을 나타내었고, 이는 추가로 C1 부위에서 화학적 개질의 차단 효과를 추가로 입증하였다 (도 2, 패널 c). 그러나, UV 조사의 존재 하에, LS174T 세포는 표지화 과정을 재활성화시키는 Ac3ManAzOH로의 Ac3ManAzNB의 분해로 인하여 강한 Cy5 형광을 나타내었다. 또한, 유세포측정 분석은 Ac3ManAzNB만으로 처리된 세포와 비교하여 Ac3ManAzNB 및 UV 조사로 처리된 LS174T 세포에서 상당히 향상된 Cy5 형광을 나타내었다 (도 2, 패널 d). Ac3ManAzNB/UV로 처리된 LS174T 세포의 웨스턴 블랏 분석은 일련의 단백질 밴드를 나타내었고, 이는 세포-표면 당단백질로의 아지도기의 성공적인 혼입을 나타낸다. 비교하자면, Ac3ManAzNB만으로 처리된 LS174T 세포는 PBS 기와 동일한 2개의 내인성 바이오티닐화된 단백질 밴드를 나타내었다. 이런 방식으로, 본 발명자는 글리코시드를 형성함으로써 Ac4ManAz의 C1 부위의 화학적 개질은 전체의 대사적 표지화 과정을 차단할 수 있고, 이는 글리코시드 결합을 분리하여 1-OH를 노출시킬 수 있는 특이적인 트리거의 존재 하에 재활성화될 수 있다는 과정을 완전하게 입증하였다.
아지도-당 표지된 세포의 공초점 이미지화를 위한 일반 절차. 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버슬립 상에 시딩하였다. Ac4ManAz 또는 Ac3ManAz 유도체를 50 μM의 최종 농도로 첨가하였고, 세포를 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 배지를 제거하였고, 3회 동안 PBS로 세정하였다. Opti-MEM 중의 DBCO-Cy5 (50 μM)를 이후 첨가하였고, 세포를 추가의 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후 배지를 제거하였고, 세포를 3회 동안 PBS로 세정하였다. 4% 파라포름알데하이드 (PFA) 용액을 첨가하여 10분 동안 세포를 고정하였고, 그 다음 10분 동안 DAPI (2 ㎍/mL)로의 세포 핵의 염색을 후속하였다. 커버슬립을 ProLong Gold 안티페드 시약이 첨가된 현미경 슬라이드 상에 설치하였고, 제조된 샘플을 암실에서 이미지화를 위해 저장하였다.
아지도-당 표지된 세포의 유세포측정 분석을 위한 일반 절차. 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버슬립 상에 시딩하였다. Ac4ManAz 또는 Ac3ManAz 유도체를 첨가하고, 72시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 배지의 제거 및 복수회의 세정 단계 이후, opti-MEM 중의 DBCO-Cy5를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, opti-MEM을 제거하였고, 세포를 3회 동안 PBS로 세정하였다. 3분 동안 37℃에서 트립신 용액 (1 mL)과 함께 인큐베이션시켜 세포를 리프팅시켰고, 4% PFA 용액 (0.5 mL)이 첨가된 시험관에 이송시켰다. 샘플당 2만개의 세포를 유세포측정에 의해 분석하였고, 분석을 FCS Express 소프트웨어 상에서 수행하였다.
Ac 3 ManAzNB 매개된 제어된 세포 표지화. LS174T 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버슬립 상에 시딩하였다. 50 μM의 최종 농도로 Ac3ManAzNB를 첨가하였다. 세포를 12시간 동안 부착시켰고, 이 시점에서 UV 광 (20 mW/m2)을 10분 동안 적용하고, 세포를 60시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. UV 조사 없는 세포를 계속하여 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 공초점 이미지화 및 유세포측정을 위한 세포 샘플을 이후 상기-언급된 절차에 따라 제조하였다.
Ac 3 ManAzHQ 매개된 제어된 세포 표지화. LS174T 결장암 세포 또는 Caco-2 결장암 세포 또는 인간 섬유아세포 IMR90 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버슬립 상에 시딩하였고, 밤새 부착시켰다. 50 μM의 최종 농도로 Ac3ManAzHQ를 첨가하였고, 그 다음 50 μM의 최종 농도의 쿠르쿠민의 첨가를 후속하였다. PBS 또는 Ac3ManAzHQ만으로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 72시간 인큐베이션 이후, 공초점 이미지화 및 유세포측정을 위한 세포 샘플을 상기-언급된 절차에 따라 제조하였다.
아지도-당으로 처리된 세포의 웨스턴 블랏 분석. LS174T 세포를 5 mL의 배지에서 플레이트당 1 × 106 세포의 밀도로 세포 배양 플라스크 (25 cm2 성장 면적) 상에 시딩하였다. 상이한 아지도-당을 첨가하고, 72시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS로 2회 세정하였고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크로부터 얻었다. 세포를 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 1개의 정제 프로테아제 억제제 (EDTA-무함유)를 포함하는 200 ㎕의 세포용해 버퍼 (1% SDS, 100 mM 트리스.HCl, pH 7.4)에 재용해시켰다. 용해물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰고, 그 다음 10분 동안 3000 rcf에서 원심분리시켜 불용성 잔류물을 제거하였다. 각각의 샘플에서의 가용성 단백질의 총 농도는 비시코닌산 (BCA) 검정에 의해 결정하였고, 동일한 농도로 조정하였다. 이후, 20 ㎕의 용해물을 취하였고, 6시간 동안 37℃에서 포스핀-PEG3-바이오틴 (2 μL, PBS 중의 5 mM)과 함께 인큐베이션시켰다. 장입 완충액을 각 샘플에 첨가하였고, 샘플은 95℃에에서 가열한 이후 10% SDS-PAGE 겔 상에 장입하였다. 100분 동안 겔화를 실시한 이후, 단백질을 Hybond P 멤브레인으로 이송시켰고, 2시간 동안 TBST (50 mM 트리스.HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4) 중의 5% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 멤브레인의 차단을 후속하였다. 멤브레인을 이후 밤새 4℃에서 스트렙타비딘-HRP (TBST의 희석된 1:2000)와 함께 인큐베이션시켰고, TBST로 3회 헹구고, ECL 웨스턴 블랏팅 기재 상에 발달시켰다. 단백질 밴드의 형광 가시화를 위해, 20 ㎕의 세포 용해물을 3시간 동안 DBCO-Cy3 용액과 함께 직접적으로 인큐베이션시켰다. 겔화 실시 및 멤브레인 수송 이후, 단백질 밴드를 Cy3/Cy3 (여기/방출) 채널을 갖는 Image Quant LAS 4010 시스템을 사용하여 시각화시켰다.
실시예 3. 생체내에서의 세포-표지화에서의 Ac 4 ManAz 유도체의 조사
다음으로, 본 발명자는 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB를 포함하는 Ac3ManAz 유도체가 생체내에서 그것의 차단 효과를 유지할 수 있는지 여부를 연구하였다. 피하 LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스에는 Ac4ManAz, Ac3ManAzEt 또는 Ac3ManAzNB가 각각 3일 동안 1일 1회로 좌측 종양에 주입하였다. 우측 종양을 대조군으로서 사용하였다. 24시간 주사후 (p.i.), 종양을 채취하여 종양 세포가 아지도기로 대사성으로 표지화되었는지 여부를 결정하였다. 기대한 바와 같이, Ac4ManAz로 처리된 종양은 일련의 아지도-변형된 당단백질을 나타내었고, 한편 Ac3ManAzEt 또는 Ac3ManAzNB로 처리된 종양은 PBS기와 동일한 내인성 단백질 밴드를 나타내었고, 이는 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB가 생체내에서 아지도기로 암 세포를 대사성으로 표지화하는데 실패하였음을 나타내었다. 발현된 아지도기가 별도의 연구에서 DBCO-카고의 종양 축적을 개선하는 방법을 이해하기 위해, 본 발명자는 아지도-당의 24시간 p.i. 시점에서 DBCO-Cy5를 정맥내로 (i.v.) 주사하였고, 생체내 형광이미지화를 사용하여 그것의 체내분포를 모니터링하였다 (도 3, 패널 a). 24 h p.i. 시점에서, Ac4ManAz로 사전처리된 좌측 종양은 우측 종양보다 더 강한 Cy5 형광 강도 (FI)를 나타내었고 (도 3, 패널 b), 이는 Ac4ManAz에 의한 종양 세포의 성공적인 표지화 및 생체내 클릭 반응을 통한 DBCO-Cy5의 생성된 상당하게 향상된 종양 유지를 제시한다. 비교하자면, Ac3ManAzEt 또는 Ac3ManAzNB로 사전처리된 종양은 대조군 종양과 비교하여 무시할만한 Cy5 유지 향상을 나타내었다. Ac4ManAz-처리된 종양의 생체외 이미지화는 대조군 종양과 비교하여 Cy5 FI에 있어서 4배 초과의 증가를 나타내었다 (도 3, 패널 c 및 d). Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB 그룹에 경우, 처리된 종양과 대조군 종양 사이의 Cy5 FI에서의 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, Ac4ManAz으로 처리된 종양 단편의 공초점 이미지화는 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB 그룹에서의 무시할만한 Cy5 형광에 대해 현저하게 비교되는 강한 Cy5 형광을 나타내었다. 이들 실험은 생체내의 Ac3ManAzEt 및 Ac3ManAzNB의 차단 효과를 입증할 뿐만 아니라 효율적인 클릭 화학에 의해 매개되는 생체내 우수한 암 표적화 효과를 나타내었다.
Ac 4 ManAz, Ac 3 ManAzEt, 및 Ac 3 ManAzNB의 생체내 종양 표지화. LS174T 종양 모델을 두 옆구리로 HBSS/매트리겔 (1/1, v/v) 중의 LS174T 결장암 세포 (1.5 백만)의 피하 주사로 6 주령 무흉선 누드 마우스에 확립시켰다. 종양이 5-6 mm로 성장되는 경우에, Ac4ManAz 또는 Ac3ManAzEt 또는 Ac3ManAzNB (25 mM, 20 μL)을 3일 동안 1일 1회로 좌측 종양에 주사하였고, 한편 동일한 양의 PBS를 대조군 (그룹당 N=3)으로서 우측 종양에 주사하였다. 마지막 주사 이후 24시간 시점에, DBCO-Cy5 (5 mg/kg)을 i.v.로 주사하였고, 그것의 체내분포를 생체내 형광 이미지화를 통해 모니터링하였다. 이미지화 이전에, 누드 마우스를 마취제 유입구 및 배출구 포트가 구비된 샘플 스테이지 상에 배치하였고, Maestro 생체내 형광 이미지화 시스템에 의해 이미지화하였다. 575-605 nm의 여기 필터를 사용하였다. 각각의 파장에서 취해진 이미지를 위해 50 ms의 노출 시간을 사용하여, 조절가능한 방출 필터를 자동으로 630으로부터 850 nm까지 10-nm 증분으로 단계화하였다. 수집된 이미지를 Maestro 소프트웨어에 의해 분석하였고, 이는 Cy5 신호로부터 자동형광을 차감하기 위해 분광 혼합 알고리즘을 사용한다. 종양 및 주요 기관을 DBCO-Cy5의 주사후 24시간 시점에 마우스로부터 채취하였다. 생체외 이미지를 Maestro 시스템을 사용하여 유사하게 얻었다. 선택된 ROI에서의 형광 강도는 Maestro 이미지화 소프트웨어를 사용하여 정량화시켰다. 모든 값을 평균 ±표준 편차 (n = 3)으로서 나타내었다.
조직의 웨스턴 블랏 분석. 아지도-당 처리된 마우스로부터 얻은 종양 및 기관을 2 mL의 세포용해 버퍼 (1% SDS, 100 mM 트리스.HCl, pH 7.4)를 포함하는 유리관으로 전달시켰고, 균질화시켰고, 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 용해물을 이후 10분 동안 3000 rcf로 원심분리시켜 불용성 잔류물을 제거하였다. 총 가용성 단백질 농도를 BCA 검정에 의해 결정하고, 각각의 그룹에 대해 5 mg/mL로 조정하였다. 나머지 절차는 세포의 상기-언급된 웨스턴 블랏 분석과 동일하였다.
종양 조직 절편의 공초점 이미지화. 생체외 이미지화 이후, 종양을 O.C.T. 화합물 중에 냉동시켰고, 6-8 ㎛의 두께로 크라이오스탯 (Leica CM3050S) 상에서 절단하였다. PBS (2 ㎍/mL) 중의 DAPI를 세포 핵을 염색하기 위해 조직-부착 현미경 슬라이드 상에 첨가하였다. 10분 이후, DAPI 용액을 제거하고, 조직을 3회 동안 PBS로 세정하였다. 커버슬립을 ProLong Gold 안티페드 시약이 첨가된 현미경 슬라이드 상에 설치하였고, 제조된 샘플을 암실에서 공초점 이미지화를 위해 저장하였다.
실시예 4. 대안적인 자기-희생 링커의 조사
제어된 표지 전략을 입증한 이후, 본 발명자는 다음으로 이를 생체내 암 표지와 및 표적화에 적용하는 것을 목표로 하였다. 그것의 좋지 못한 조직 침투 및 건강한 조직에 대한 잠재적 손상으로 인해 UV는 실제적인 트리거가 아니기 때문에, 본 발명자는 내부 암-특이적인 트리거 예컨대 산화환원 조절장애, 상승된 산화제 수준, 및 과발현된 효소에 대해 반응성인 Ac3ManAz 유도체를 개발하는 것을 목표로 하였다. 그러나, 2-니트로벤질 글리코시드 결합을 하이드록실기로 직접적으로 분리할 수 있는 UV 조사와는 달리, 이들 트리거는 글리코시드 결합을 직접적으로 분리할 수 없고, 이에 따라 보호기의 트리거-유도된 절단 이후 결국에는 하이드록실기를 방출하는 자기-희생 링커의 혼입을 필요로 한다. 2개의 종래의 자기-희생 링커, CL1 및 CL2는 전구약물 설계에 널리 사용되고 있다 (도 4, 패널 a). 보호기의 제거시, CL1은 CO2 분자를 빠르게 제거하여 하이드록실기를 노출시킬 수 있다. 그러나, CL1은 세포 에스테라제에 의해 용이하게 분해될 수 있는 카보네이트 결합을 포함하고, 이에 따라 이러한 설계에 사용될 수 없다. CL2는 보호기의 제거시 양호한 이탈기로서 페놀 구조체를 빠르게 방출할 수 있다. 마스킹되지 않은 1-OH을 갖는 당 화합물이 양호한 이탈기일 수 있음을 고려하면, 본 발명자는 CL2와 유사한 구조를 갖는 PL1 (도 4, 패널 b)을 설계하고, 이를 과산화수소 (H2O2)-반응성 Ac3ManAzHB에 혼입한다. 그러나, Ac3ManAzHB는 보호기가 H2O2에 의해 용이하게 제거되었지만 Ac3ManAzOH를 방출하는데 실패하였다. 본 발명자는 이후 매우 안정화된 분해 생성물이 자기-희생 링커의 절단을 촉진할 수 있을 거라는 가정에 기초하여 PL1의 α-탄소에 연결되는 추가의 페닐기를 갖는 PL2를 설계하였다 (도 4, 패널 c).
실시예 5. 트리거-반응성 그룹의 조사
자기-희생 링커로서 PL2의 실행가능성을 조사하기 위해, Ac3ManAzHQwith NQO1 효소-반응성 보호기를 합성하였고, 시험관내 그것의 분해를 대표적인 환원제로서 나트륨 디티오나이트를 사용하여 연구하였다. Ac3ManAzHQ는 나트륨 디티오나이트의 존재 하에 급속 분해가 진행되었고, ESI MS는 분해 생성물로서 Ac3ManAzOH의 형성을 확인하였다. 본 발명자는 이후 시험관내 NQO1-반응성 Ac3ManAzHQ의 제어된 대사 표지화 능력을 시험하였다. 3일 동안 Ac3ManAzHQ와 그리고 1시간 동안 DBCO-Cy5와 함께 인큐베이션한 이후에, NQO1 효소가 풍부한 LS174T 결장암 세포는 세포 표면 상에 균일한 Cy5 형광을 나타내었고, 이는 아지도기의 성공적인 발현을 나타내었다. 그러나, NQO1-결핍된 카코-2 결장암 및 IMR-90 인간 섬유아세포 세포주는 세포 표면 상에 무시할만한 Cy5 형광을 나타내었다. Ac3ManAzHQ의 대사 표지화 능력를 활성화하는데 있어서의 NQO1 효소의 중요한 역할을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자는 NQO1 효소, 쿠르쿠민의 억제제가 Ac3ManAzHQ-매개된 세포 표지화를 억제할 수 있는지 여부를 연구하였다. 그 결과, 표지화 효율의 상당한 감소가 Ac3ManAzHQ만으로 처리된 세포와 비교하여 Ac3ManAzHQ 및 쿠르쿠민화 공동 인큐베이션된 LS174T 세포에서 관측되었다.
외부 트리거 (근적외선 (NIR) 광) 또는 내부 트리거 (H2O2, 종양 저산소증 환경, NAD(P)H 탈수소효소 퀴논 1 (NQO1), 및 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC)/카텝신 L (CTSL))에 대해 반응성인 트리거-활성가능 Ac3ManAz 유도체의 라이브러리는 도 5에 나타나 있다. 이들 중에서, HDAC/CTSL 반응성 당 유도체, E-S는 시험관내 및 생체내 모두에서 선택적 암 표지화를 가능하게 하였다.
실시예 6. HDAC/CTSL 반응성 당 유도체 E-S의 합성
Figure pct00037
AcLys(NHS) (7)의 합성. AcLys(OH) (2.0 mmol, 460 mg) 및 트리메틸아민 (2.1 mmol, 212 mg)을 무수 DMF (40 mL)에 용해시켰고, 그 다음 DCC (2.1 mmol, 433 mg) 및 NHS (2.1 mmol, 242 mg)의 첨가를 후속하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과 제거하였고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 용리액으로서 아세트산에틸을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 밝은 황색 고형물을 산출하였다 (70% 수율).
화합물 8의 합성. AcLys(NHS) (1.2 mmol) 및 화합물 5 (1.2 mmol)을 무수 DMF (30 mL)에 용해시켰고, 그 다음 트리메틸아민 (1.2 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 40℃에서 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 용리액으로서 아세트산에틸 내지 아세트산에틸/메탄올 (20/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 밝은 황색 고형물을 산출하였다 (60% 수율).1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 7.50 (d, 2H, Ph), 7.34 (d, 2H, Ph), 7.29 (m, 4H,Ph), 7.21 (t, 1H, Ph), 5.74 (s, 1H, CH(OH)), 4.39 (m, 1H, CHCH2CH2CH2CH2NHC(O)CH3), 3.15 (t, 2H, CHCH2CH2CH2CH 2NHC(O)CH3), 2.00 (s, 3H, CHCH2CH2CH2CH2NHC(O)CH 3), 1.89 (s, 3H, CHNHC(O)CH 3), 1.83&1.72 (m, 2H, CHCH 2CH2CH2CH2NHC(O)CH3), 1.53 (m, 2H, CHCH2CH2CH 2CH2NHC(O)CH3), 1.41 (m, 2H, CHCH2CH 2CH2CH2NHC(O)CH3). 13C NMR (CD3OD, 500 MHz): 172.2, 172.0, 171.7, 144.7, 140.9, 137.3, 128.1, 127.0, 126.5, 120.1, 75.3, 54.4, 38.9, 31.7, 28.9, 23.1, 21.4, 21.2. ESI MS (m/z): C23H29N3O4Na [M+Na]+에 대한 계산치 434.2, 실측치 434.2.
AcLys(DPM-CNCCl 3 ) (9)의 합성. 화합물 8 (0.5 mmol) 및 CNCCl3 (5.0 mmol)을 무수 THF에 용해시켰고, 그 다음 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔 (DBU, 0.5 mmol)의 첨가를 후속하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고형물을 산출하였다. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ (ppm) 7.99 (m, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38-7.19 (m, 7H), 5.27 (s, 1H), 4.43 (m, 1H), 3.73 (m, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.84&1.73 (m, 2H), 1.55 (m, 2H), 1.44 (m, 2H). 13C NMR (CD3OD, 500 MHz): 208.42, 172.2, 172.1, 171.7, 142.4, 138.5, 137.6, 128.2, 127.3, 126.8, 120.2, 101.8, 85.0, 64.4, 54.3, 39.1, 31.7, 28.9, 23.1, 21.4, 21.3.
Ac 3 ManAzOH (10)의 합성. Ac4ManAz (0.5 mmol) 및 탄산암모늄 (0.75 mmol)을 THF/메탄올 (2/1, v/v)에 용해시켰고, 실온에서 교반하였다. 12시간 이후, 용매를 제거하였고, 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물을 산출하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 6.56 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.44 (dd, J = 10.1, 4.2 Hz, 1H), 5.22 (s, 1H), 5.18 (t, 1H), 4.63 (ddd, J = 9.2, 4.2, 1.8 Hz, 1H), 4.31 - 4.01 (m, 5H), 3.74 (m, 1H), 2.14&2.08&2.05 (s, 9H). 13C NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 171.0, 170.4, 170.1, 167.1, 93.4, 69.2, 68.4, 66.0, 62.5, 52.7, 50.9, 21.1, 21.0, 20.9.
E-S의 합성. Ac3ManAzOH (0.2 mmol) 및 AcLys(DPM-CNCCl3))을 무수 아세토니트릴에 용해시켰고, 그 다음 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 (2.0 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하였다. 용매의 제거 이후, 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 백색 고형물을 산출하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 7.55 (m, 2H, Ph), 7.35-7.28 (m, 7H, Ph), 6.73 (m, 1H, CH3C(O)NHCH), 6.50 (m, 1H, CH2C(O)NHCH), 5.95 (m, 1H, CH3C(O)NHCH2), 5.65 (s, 1H, PhCH), 5.43 (ddd, J = 10.1, 8.3, 4.2 Hz, 1H, CH2CHCHCH), 5.17 (td, J = 10.2, 3.2 Hz, 1H, CH2CHCHCH), 4.75-4.80 (m, 1H, NHCHCHO), 4.68 (m, 1H, NHCHCHO), 4.55 (q, J = 7.3 Hz, 1H, CHCH2CH2CH2CH2NHC(O)CH3), 4.18&4.05 (m, 2H, CH 2CHCHCH), 4.02 (m, 2H, COCH 2N3), 3.94 (m, 1H, CH2CHCHCH), 3.22 (m, 2H, CHCH2CH2CH2CH 2NHC(O)CH3), 2.12&2.06&2.03&1.99&1.96(15H, CH 3C(O)O), 1.93&1.74 (m, 2H, CHCH 2CH2CH2CH2NHC(O)CH3), 1.51 (m, 2H, CHCH2CH2CH 2CH2NHC(O)CH3), 1.38 (m, 2H, CHCH2CH 2CH2CH2NHC(O)CH3). 13C NMR (CDCl3, 500 MHz): δ(ppm) 171.5, 171.2, 170.7, 170.4, 170.0, 170.0, 166.8, 141.2, 137.8, 137.2, 135.6, 129.1, 128.8, 128.5, 127.5, 126.7, 120.2, 80.0, 77.5, 77.5, 77.3, 77.2, 77.0, 69.9, 69.0, 65.8, 62.3, 53.9, 52.7, 50.5, 38.8, 31.3, 29.1, 23.4, 22.5, 21.1, 20.9. HR ESI MS (m/z): C37H48N7O12 [M+H]+에 대한 계산치 782.3361, 실측치 782.3354.
실시예 7. 암 세포를 표지화하기 위한 선택성을 개선하기 위한 시험관내 연구
트리거-활성가능 케이지형 당 전구체의 설계를 위해 PL2의 실행성을 입증한 이후에, 본 발명자는 더 나은 암-선택적 표지화 능력을 갖는 Ac3ManAz 유도체를 개발하는 것으로 목표로 하였다. NQO1 효소와 비교하여, 다수의 다른 효소는 암 세포와 정상 세포의 일반적인 차이를 더 잘 나타낸다. 예를 들면, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 및 카텝신 L (CTSL) 모두는 암 세포주에서 과발현되는 것으로 보고되고 있다. 단일 트리거로서 HDAC 및 CTSL를 조합하는 E-S의 본 발명자의 설계에서, HDAC는 우선 라이신 잔기의 아세틸기를 제거하고, 그 다음 CTSL에 의한 펩타이드 결합의 절단 및 자기-희생 링커의 제거를 후속하고, 이는 대사성으로 활성인 Ac3ManAzOH를 방출한다 (도 6, 패널 A). 상이한 세포주에서의 HDAC/CTSL 활성을 검출하기 위해, 본 발명자는 우선 형광 리포터 (Naph-Lys)를 합성하였고, 이의 형광은 HDAC 및 CTSL 둘 모두의 존재 하에 발생하였다. LS174T 결장암 세포, MCF-7 유방암 세포, 4T1 삼중 음성 유방암 세포, HeLa 세포, 및 HepG2 간암 세포를 포함하는 대부분의 암 세포에서의 HDAC/CTSL 활성은 IMR-90 인간 섬유아세포 세포를 포함하는 건강한 세포주에서의 것보다 훨씬 높았다. 그러나, HDAC (트리코스타틴 (TSA)) 또는 CTSL (Z-FY-CHO)에 대한 억제제의 존재 하에, Naph-Lys의 턴온 형광 강도는 감소된 효소 활성의 결과로서 크게 감소되었다. 본 발명자는 이후 3일 동안 E-S와 함께 상이한 세포주를 인큐베이션시키고, 이후 DBCO-Cy5를 사용하여 잠재적으로 발현된 아지도기를 검출함으로써 시험관내 E-S의 제어된 세포 표지화 능력을 조사하였다. CLSM 이미지는 IMR-90 세포의 표면 상에서 관측되는 무시할만한 Cy5 형광과 매우 대조적으로 LS174T 세포의 표면 상에 맑고, 밝은 Cy5 형광 신호를 나타내었고 (도 6, 패널 b 및 c), 이는 인간 섬유아세포 세포에 대한 LS174T 결장암 세포에서의 E-S의 선택적 표지화 능력을 제시한다. LS174T 세포가 E-S 및 HDAC (TSA) 또는 CTSL (Z-FY-CHO)의 억제제와 함께 공동 인큐베이션되는 경우, E-S의 표지 효율은 크게 감소되고 (도 6, 패널 b 및 d), 이는 E-S의 표지화 과정의 HDAC/CTSL-유도된 재활성화를 암시하였다.
E-S의 표지화 과정의 더 나은 이해를 얻기 위해, 본 발명자는 시험과내 E-S의 표지 동력학을 분석하였다. 상이한 시간 (1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 및 72 h) 동안 E-S의 다양한 농도 (10 μM, 50 μM, 200 μM, 및 1 mM)로 LS174T 세포를 인큐베이션시킨 이후, 세포 표면 아지드는 DBCO-Cy5에 의해 검출되었다. DBCO-Cy5의 낮은 세포 흡수로 인해, 세포 표면 아지드는 Cy5 형광 강도의 측정을 통해 반-정량적으로 결정하고, 비교할 수 있다. E-S의 대사 표지화 과정은 시간- 및 농도-의존적이고, 세포-표면 아지드의 수는 48시간에서의 안정기 값(plateau value)에 근접한다. 세포 표면 아지드의 수밀도의 추정은 48시간 동안 E-S (200μM)과 함께 LS174T 세포를 인큐베이팅시킨 이후 세포당 106-107 아지드의 값을 나타내었다. 세포당 ~103 내지 104인 것으로 보고된 종래의 표적화 전략에서의 단백질 수용체의 수밀도와 비교하여, 클릭 반응과 커플링되는 아지도-당으로부터 생성된 표적화 효율은 잠재적으로 더 높을 수 있다.
HDAC/CTSL 형광 리포터 (Naph-Lys)의 합성 경로
Figure pct00038
Naph-NH 2 의 합성. 4-아미노-1,8-나프탈산 무수물 (10 mmol, 2.13 g)을 질소 분위기 하에 에탄올에 용해시키고, 환류시켰다. 1-부틸아민을 이후 첨가하였고, 혼합물을 8시간 동안 추가로 환류시켰다. 냉각시킨 이후, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 용리액으로 DCM/아세트산에틸 (2/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.60 (d, 1H, C(O)CCHCHCH), 8.42 (d, 1H, C(O)CCHCHCH), 8.10 (d, 1HC(O)CCHCHCH), 7.66 (t, 1 H, C(O)CCHCH), 6.89 (d, 1H, C(O)CCHCH), 4.94 (s, 2H, NH 2), 4.18 (t, 2H, CH 2CH2CH2CH3), 1.71 (m, 2H, CH2CH 2CH2CH3), 1.45 (m, 2H, CH2CH2CH 2CH3), 0.97 (s, 3H, CH2CH2CH2CH 3).
Naph-Lys의 합성. Naph-NH2 (1.0 mmol) 및 AcLys(OH) (1.0 mmol)을 무수 DMF (40 mL)에 용해시켰고, 그 다음 DCC (1.1 mmol), NHS (1.1 mmol), 및 트리에틸아민 (1.0 mmol)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 48시간 동안 45℃에서 교반하였다. 침전물을 여과 제거하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 용리액으로서 헥산/아세트산에틸 (3/1, v/v)을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 고형물을 산출하였다 (60% 수율). LRMS (ESI) m/z: C26H33N4O5 [M + H]+에 대한 계산치 481.2, 실측치 481.2. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.57 (dd, 1H, C(O)CCHCHCH), 8.52 (d, 1H C(O)CCHCH), 8.51 (dd, 1H, C(O)CCHCHCH), 8.12 (dd, 1H, C(O)CCHCH), 7.84 (dd, 1H, C(O)CCHCHCH), 4.62 (dd, 1H, CHCH2CH2CH2CH2), 4.14 (t, 2H, CH 2CH2CH2CH3), 3.22 (t, 2H, CHCH2CH2CH2CH 2), 2.06 (s, 3H, CH 3C(O)NHCH), 1.98 (m, 2H, CHCH 2CH2CH2CH2), 1.92 (s, 3H, CH 3C(O)NHCH2), 1.69 (m, 2H, CH2CH 2CH2CH3), 1.60 (m, 2H, CHCH2CH2CH 2CH2), 1.53 (m, 2H, CHCH2CH 2CH2CH2), 1.43 (m, 2H, CH2CH2CH 2CH3), 0.99 (m, 3H, CH2CH2CH2CH 3).
세포 HDAC/CTSL 활성의 검출. 세포를 8 k/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였고, 밤새 부착시켰다. OptiMEM 중의 Naph-Lys (50 μM)을 첨가하였고, 상이한 시간 (30 min, 1 h, 2 h, 및 4 h) 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. OptiMEM의 제거 및 PBS로의 2회 세정 이후, 세포를 10분 동안 4% PFA로 고정하였고, 10분 동안 DAPI (2 ㎍/mL)로 염색하였다. 세포의 평균 형광 강도를 DAPI 및 FITC 채널을 사용하는 GE-분석기 상에서 측정하였다. DAPI 채널을 세포 수/웰을 결정하기 위해 사용하였다. FITC 채널을 사용하여 방출된 Naph-NH2/웰의 총 형광 강도를 결정하였다. 데이터는 세포당 평균 형광 강도를 나타내었다.
세포 HDAC/CTSL 활성에 대한 TSA 및 Z-FY-CHO의 억제 효과. TSA 및 Z-FY-CHO는 각각 HDAC 및 CTSL의 억제제인 것으로 알려져 있다. 그것의 억제성 효과를 연구하기 위해, 세포를 8 k/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였고, 밤새 부착시켰다. 세포를 이후 하기 4개의 그룹으로 분할하였다: 그룹 1 세포는 Naph-Lys (50 μM)가 첨가되었고; 그룹 2 세포는 Naph-Lys (50 μM) + TSA (1μM)가 첨가되었고; 그룹 3 세포는 Naph-Lys (50 μM) + Z-FY-CHO (20 μM)가 첨가되었고; 그룹 4 세포는 음성 대조군으로서 PBS가 첨가되었다. 세포를 4시간 동안 인큐베이션시켰고, PBS로 세정하고, 10분 동안 4% PFA로 고정시켰고, 10분 동안 DAPI (2 ㎍/mL)로 염색시켰다. 세포의 평균 형광 강도는 DAPI 및 FITC 채널을 사용하는 GE-분석기 상에서 측정하였다.
시험관내 E-S 매개된 제어된 세포 표지화. LS174T 결장암 세포 또는 인간 섬유아세포 IMR90 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트의 커버슬립 상에 시딩하였다. 50 μM의 최종 농도로 E-S를 첨가하고, 그 다음 TSA (1 μM) 또는 Z-FY-CHO (50 μM)의 첨가를 후속하였다. PBS 또는 E-S만으로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 72시간 인큐베이션 이후, 배지를 제거하고, 공초점 이미지화 및 GE-분석기 측정에 대한 세포 샘플을 상기 언급된 절차와 유사하게 제조하였다.
시험관내에서의 E-S의 표지화 동력화. LS174T 세포를 흑색 96-웰 플레이트 내에 시딩하고, 상이한 시간 (3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 및 72 h) 동안 E-S의 다양한 농도 (10 μM, 50 μM, 200 μM, 및 1 mM)로 인큐베이션시켰다. 배지의 제거 및 PBS로의 3회 세정 이후, 세포를 2시간 동안 OptiMEM 중의 DBCO-Cy3 (20 μM)와 함께 인큐베이션시켰다. DBCO-Cy3 용액의 제거 이후, 3개의 트리플리케이트 웰 중의 세포를 트립신으로 리프팅시켰고, 세포 수/웰 (N세포/웰)의 결정을 위해 현미경 하에 계수하였고; 또 다른 3개의 트리플리케이트 웰에서의 세포를 용해시켰고, Cy3 형광을 플레이트 리더 상에서 측정하였다. DBCO-Cy3 용액의 구배 농도를 표준 곡선의 결정 및 세포 표면 상의 아지도기의 수의 계산을 위해 사용하였다. 세포당 발현된 아지도기의 수 (N아지드/세포)를 하기 방법을 사용하여 추정하였다:
Figure pct00039
세포당 DBCO-Cy3의 질량: (7.5 ng/mL* 200㎕)/100000 세포 = 1.5*10-5 ng/세포
세포당 아지드의 몰: (1.5*10-5 ng/세포)(983.18g/mol)= 1.5*10-17 mol
세포당 아지드의 수: 1.5*10-17 mole*(6.02*1023 mol-1)=9.0*106
E-S 처리된 세포의 웨스턴 블랏 분석. LS174T 세포를 5 mL의 배지 중의 플레이트당 1 × 106 세포의 밀도에서 세포 배양 플라스크 (25 cm2 성장 면적) 상에 시딩하였다. 세포를 이후 72시간 동안 E-S (50μM), E-S (50 μM) + TSA (1 μM), E-S (50 μM) + Z-FY-CHO (50μM), 및 PBS로 각각 처리하였다. 용매의 제거 및 PBS로의 수회의 세정 이후, 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 플라스크로부터 채취하였다. 나머지 절차를 세포의 웨스턴 블랏 분석에 대한 상기 언급된 일반적인 절차와 동일하였다.
E-S의 약동학적 프로파일
E-S의 방사선표지화
Figure pct00040
DBCO-DOTA의 합성. P-SCN-Bn-DOTA (0.05 mmol, 34 mg) 및 DBCO-아민 (0.05 mmol, 14 mg)을 무수 DMF (1 mL)에 현탁시켰다. 트리에틸아민 (0.2 mmol, 20 mg)을 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 교반하였다. HPLC 측정을 12시간 이후 완전한 반응을 나타낸다. 용매를 감압 하에 제거하여, 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다. LRMS (ESI) m/z: C42H50N7O9S [M + H]+에 대한 계산치 828.3, 실측치 828.2.
E-S-DOTA의 합성. DBCO-DOTA (0.003 mmol, 2.5 mg) 및 E-S (0.003 mmol, 2.3 mg)을 메탄올에 용해시켰다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였고, 이 시점에서 HPLC는 개시 물질의 완전한 소모를 나타내었다.
E-S-DOTA의 64 CU-표지화. NH4OAc 완충 용액 (0.1 M, pH = 5.5, 1 mL) 중의 64Cu 염화물 (400 μCi, 0.1 ng의 64Cu)을 PBS 중의 E-S-DOTA (2 mg)와 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 80℃에서 강하게 교반하였고, 이 시점에서 HPLC는 유리 64Cu의 완전한 소모를 나타낸다. 생성물 용액을 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
E-S-DOTA- 64 Cu의 약동학 연구. LS174T 종양 (N=3)을 갖는 암컷 무흉선 누드 마우스로 E-S-DOTA-64Cu 용액 (~100 μCi)을 i.v. 주사하였다. 선택된 시점 (10 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 및 24 h p.i.)에서, 혈액을 모세관 튜브를 사용하여 안와정맥동(orbital sinus)으로부터 수집하였다. 모세관 튜브를 채혈 이전에 계량하였다. 수집된 혈액 샘플을 511 KeV의 광피크에서의 적절한 에너지 윈도우를 사용하는 Wizard2 자동 γ-계수기로 64Cu 방사능에 대해 계량하고 측정하였다. 미가공 계수(raw count)를 배경, 분해, 및 체중에 대해 보정하였다. 보정된 계수를 앞서 결정된 보정 곡선을 통해 혈액 그램당 마이크로퀴리 (μCi)로 전환시켰다. 각각의 혈액 샘플에서의 방사능을 계산하고, 혈액의 그램당 주사된 용량의 백분율 (% ID/g)로 나타내었다. 24 h p.i.에서의 채혈 이후, 종양 및 주요 기관을 잔류 방사능의 측정을 위해 채취하였다. 각각의 조직 샘플에서의 방사능을 조직의 그램당 주사된 용량의 백분율 (% ID/g)로서 계산하였다.
실시예 8. 암 세포를 표지화를 위한 선택도를 개선하기 위한 생체내 연구
시험관내 HDAC/CTSL-반응성 E-S의 제어된 표지화 특성을 입증하기 위해, 본 발명자는 다음으로 생체내 E-S의 암-선택적 표지화 능력을 연구하였다. LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스로 3 연속일 동안 1일 1회로 E-S를 i.v. 주사하였다. Ac4ManAz 및 PBS를 i.v.로 처리한 마우스를 대조군으로서 사용하였다 (도 7, 패널 (a)). 아지도-당의 24 h p.i.에서 종양 조직의 웨스턴 블랏팅 분석은 PBS 그룹과 비교하여 E-S 그룹에서 아지도-개질된 단백질의 양에서의 증가를 나타내었고, 한편 간, 비장, 심장, 및 폐에서의 아지도-개질된 단백질의 양에서의 무시할만한 차이가 E-S 및 PBS 그룹들 사이에서 관측되었다 (도 7, 패널 (b)). 그에 반해서, 표지 선택성이 없는 Ac4ManAz는 간, 비장, 폐, 및 신장 조직에서 발현된 아지도기의 상당한 양으로 정상 조직에서 비-특이적 표지화를 나타내었다 (도 7, 패널 b). 이들 실험은 Ac4ManAz와 비교하여 E-S 생체내의 우수한 암-선택적 표지화 능력을 입증하였다. 별도의 연구에서, DBCO-Cy5는 아지도-당 주사 이후 14시간에서 i.v. 주사하였고, 그것의 체내분포를 모니터링하였다. DBCO-Cy5의 48 h p.i. 시점에서, E-S 그룹에서의 종양은 PBS 그룹에서의 종양보다 상당히 향상된 Cy5 유지를 나타내었다 (도 7, 패널 c). E-S 그룹에서의 얻은 종양의 이미지화는 PBS 그룹과 비교하여 1.52-배의 Cy5 형광 강도를 나타내었고, 한편 간, 비장, 심장, 폐, 및 신장에서의 Cy5 유지는 상당한 변화가 없었다 (도 7, 패널 c 및 d). Ac4ManAz 그룹과 비교하여, E-S 그룹에서의 DBCO-Cy5는 종양에서의 개선된 축적을 나타내었다. 이들 실험은 E-S가 생체내에서 LS174T 종양을 선택적으로 표지화할 수 있고, 발현된 아지도기는 클릭 화학을 통해 DBCO-Cy5의 종양 축적을 상당하게 향상시킬 수 있음을 입증하였다.
본 발명자는 그 다음 클릭 반응을 통한 E-S 매개된 종양 표지화 및 차후의 종양 표적화 효과의 잠재성을 더 잘 이해하기 위한 일환으로 생체내 E-S의 표지화 동력학을 연구하였다. 방사선표지화된 E-S의 약동학 연구는 24 h p.i. 시점에서 종양 조직에서 유지된 4.96% ID/g의 방사선표지화된 E-S와 함께 i.v. 주사 이후 그것의 급속 신장 청소능을 나타내었다. E-S의 생체내 표지 동력학을 연구하기 위해, E-S는 LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스에 i.v. 투여되었고, 종양을 채취하였고, DBCO-Cy5을 사용하여 발현된 아지도기의 검출을 위해 상이한 시간 (8 h, 24 h, 및 48 h) p.i.에서 절단하였다. 8 h p.i.에서 수집된 종양 조직 절편은 E-S 처리 없이 대조군 그룹과 비교하여 세포막 상에서 상당히 향상된 DBCO-Cy5 신호를 나타내었고, 이는 E-S가 아지도기를 갖는 종양 세포를 성공적으로 표지화하였음을 시사한다 (도 7, 패널 e 및 f). 종양 세포에서의 대사 표지화 과정에 대해 더 많은 시간 (24 h 또는 48 h)이 허용되면, 발현되는 아지드의 양은 상당하게 증가되었다. 짐작컨대, E-S의 빠른 표지화 동력학 및 제한된 종양 축적의 종합적 결과로서 24 h 그룹과 48시간 그룹 종양 조직 절 사이의 세포 표면 아지드의 양에서의 유의미한 차이가 관측되지 않았음은 주목할 만한 것이다. 본 발명자들은 그 다음 더 많은 E-S 주사가 종양 면적에서의 아지도기의 증가된 양을 초래할지 여부를 연구하였다. 2번의 E-S 주사를 받은 마우스로부터의 종양 조직 절편은 세포 표면 상에 DBCO-Cy5의 상당히 향상된 부착을 나타내었고, 이는 세포 표면 아지드의 증가된 양을 시사한다 (도 7, 패널 g). E-S 3회의 i.v. 주사는 종양 세포에 의한 아지도기의 대사적 발현을 추가로 개선하였다. 이들 결과는 24시간의 간격으로 복수회의 E-S 주사는 종양 조직에서 발현된 아지도기의 양을 계속하여 증가시킬 수 있었음을 나타내었다.
생체내의 E-S 매개된 암-선택적 표지화:
(1) 조직의 웨스턴 블랏 분석. LS174T 종양 모델을 HBSS/매트리겔 (1/1, v/v) 중의 LS174T 결장암 세포 (1.5 백만)의 피하 주사에 의해 6 주령 무흉선 누드 마우스에서 확립하였다. 종양이 5-6 mm로 성장되는 경우, E-S (60 mg/kg)을 3일 동안 1일 1회 i.v. 주사하였다. Ac4ManAz (40 mg/kg, PBS 중의 10% DMSO) 또는 PBS가 i.v. 투여된 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 마지막 주사 이후 24시간 시점에, 종양 및 주요 기관을 채취하였고, 세포용해 버퍼 (2 mL)로 수송하고, 균질화시켰다. 용해물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰고, 불용성 잔류물을 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리에 의해 제거하였다. 총 가용성 단백질 농도를 BCA 검정에 의해 결정하였고, 각각의 그룹에 대해 5 mg/mL로 조정하였다. 나머지 절차는 웨스턴 블랏 분석에 대해 상기 언급된 일반 절차와 동일하였다. 생체내 E-S의 암-선택적 표지화 능력을 이해하기 위해, 모든 3개의 그룹에서의 종양 조직 및 건강한 조직에서의 아지도-표지된 단백질 밴드를 시각화하였고, 비교하였다.
(2) DBCO-Cy5의 생체내 및 생체외 체내분포. 별도의 연구에서, 종양이 5-6 mm까지 성장되는 경우, E-S (60 mg/kg)을 3일 동안 1일 1회로 i.v. 주사하였다. Ac4ManAz (40 mg/kg) 및 PBS가 i.v. 주사된 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 마지막 주사후 24시간 시점에, BCO-Cy5 (10 mg/kg)을 i.v. 주사하였고, 그것의 체내분포를 Bruker 생체내 Xtreme 이미지화 시스템을 사용하여 생체내 형광 이미지화를 통해 모니터링하였다. 종양 및 기관을 DBCO-Cy5의 48 h p.i. 시점에서 마우스로부터 얻었다. 생체외 이미지를 Bruker 생체내 Xtreme 이미지화 시스템을 사용하여 유사하게 얻었다. 선택된 ROI에서의 형광 강도를 Bruker 이미지화 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 모든 값을 평균±표준 편차 (n = 3)로서 나타내었다.
생체내 E-S의 종양 표지 동력학. 피하 LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스에 E-S (60 mg/kg)를 i.v. 주사하였다. E-S 주사를 받지 않은 마우스를 대조군으로서 사용하였다. E-S의 상이한 시간 (8, 24, 및 48 h) p.i,에서, 종양을 채취하였고, O.C.T. 화합물 중에서 냉동시켰고, 8 ㎛의 두께로 절단하였다. 종양 조직 절편을 2시간 동안 5% BSA와 함께 인큐베이션시켰고, 그 다음 30분 동안 DBCO-Cy5 (20 μM)로 표지화하였다. PBS로의 세정 이후, DAPI (2 ㎍/mL) 및 CellMask 오렌지색 원형질막 염색제 (1 ㎍/mL)을 첨가하여 세포 핵 및 막을 각각 염색시켰다. 종양 조직 절편을 공초점 레이저 스캐닝 현미경 하에서 이미지화하였다. 이미지화 파라미터를 이미지화된 모든 샘플에 대해 동일하게 유지하였다. 데이터 분석을 ZEN 2011 소프트웨어로 수행하였다. 각각의 이미지의 평균 Cy5 형광 강도를 추출하였고, 20개의 이미지에 대해 평균화하여 각각의 조직 절편의 평균 Cy5 형광 강도를 얻었고, 이것을 이후 20개의 조직 절편에 대해 평균화하여 각각의 종양의 평균 Cy5 형광 강도를 얻었다.
생체내 용량 - 의존적 E-S 매개된 종양 표지화. 피하 LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스(그룹당 n=3)에 상이한 시점 (1, 2, 또는 3회 주사)에서 24 h 간격으로 E-S (60 mg/kg)를 i.v. 투여하였다. E-S 주사를 받지 않은 마우스를 대조군으로서 사용하였다. E-S의 마지막 주사후 24시간 시점에, 종양을 채취하였고, O.C.T. 화합물에서 냉동시키고, 8 ㎛의 두께로 절단하였다. 종양 조직 절편을 염색시키고, 이미지화하고, 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다.
실시예 9. 클릭 화학 반응을 통한 항암제의 전달
E-S가 아지도기를 갖는 암 세포를 생체내에서 선택적으로 표지화할 수 있고, 발현된 아지도기는 클릭 반응을 통해 잘 유지됨을 입증한 이후에, 본 발명자는 그 다음 E-S 전처리가 소분자 DBCO-약물 콘주게이트의 향상된 항암 효능을 야기할 수 있는지를 조사하였다. 카텝신 B-절단가능 링커를 가진 DBCO-독소루비신 콘주게이트 (DBCO-Val-Cit-DOXO (D-D))를 합성하였다 (도 8, 패널 a). 링커는 카텝신 B-절단가능 디펩타이드 (val-cit), 효소 분해 과정에서 입체 장애를 감소시키기 위한 자기-희생 p-아미노벤질카보메이트 (PABC) 링커, 및 수용성을 개선하기 위한 짧은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 세그먼트로 구성되었다. 합성된 D-D는 활성화된 카텝신 B의 존재 하에 유리 DOXO의 급속 방출을 진행하면서도 생리적 조건 하에 우수한 안정성을 나타내었다. LS174T 세포에 대한 D-D의 시험관내 항암 활성을 MTT 검정을 통해 연구하였고, 이는 2.5 μ의 IC50 값을 나타내었다. 3일 동안 E-S로 전처리된 LS174T 세포는 특정 양의 인큐베이션 시간 (30 min, 1 h, 및 42 h) 내에 대조군 세포와 비교하여 클릭 반응을 통해 D-D의 상당히 향상된 세포 흡수를 나타내었다. 아지도-개질된 암 세포에 의한 공유결합된 DBCO-카고의 세포 운명을 모델 화합물로서 형광 DBCO-Cy5를 사용하여 조사하였고, 이는 그것의 낮은 수동적인 세포 흡수를 장점으로 한다. 1시간 동안 DBCO-Cy5와 인큐베이션하고, 미결합된 DBCO-Cy5를 세정한 이후, E-S 전처리된 LS174T 세포를 형광 현미경 하에서 모니터링하였다. E-S 전처리를 하지 않은 대조군 세포에서의 무시할만한 Cy5 신호는 DBCO-Cy5의 수동적인 흡수를 배제한 것이었다. DBCO-Cy5는 세포 표면 (세포막 염색제와 중첩)에 우선 공유결합되고, 서서히 인큐베이션 시간에 걸쳐 서서히 리소좀 (리소트래커(lysotracker))를 방출하였다. 세포가 12시간 동안 추가로 인큐베이션되는 경우에 세포막 상의 DBCO-Cy5는 완전하게 사라진 것으로 관측되었다. 공유결합된 D-D가 세포 리소좀에서 카텝신-B의 존재 하에 약물을 방출할 수 있을 것으로 구상될 수 있다. 유리 DOXO와 비교하여, 또한 D-D는 상당히 장기적인 혈액 순환을 나타내었다. 그 다음, 본 발명자는 E-S 전처리가 향상된 종양 유지 및 D-D의 축적을 초래하고, 이에 따라 증가된 치료 효능을 부여할 것인지 여부를 연구하였다. 피하 LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스에 3일 (0, 1 및 2일차) 동안 1일 1회 E-S 또는 PBS를 i.v. 투여하였고, 3일차에 약물 D-D를 i.v. 투여하였다. 48 h p.i. 시점에 종양 및 주요 기관을 채취하였다. 조직에서의 유지된 약물의 정량화는 PBS로 처리된 대조군과 비교하여 E-S로 처리된 마우스에서 1.46-배 종양 축적을 나타내고 있고, 한편 간, 비장, 폐, 심장, 및 신장에서의 D-D 축적의 유의미한 변화는 관측되지 않았다 (도 8, 패널 (b)). E-S/D-D로 처리된 종양은 33.5±4.2%의 세포자멸사 지수를 나타내었고, 이는 D-D만으로 처리된 종양의 것 (18.3± 4.0%)보다 상당하게 더 높았다 (도 8, 패널 (c)). 음성 대조군으로 E-Sor PBS로 처리된 종양은 각각 더 낮은 세포자멸사 지수, 1.5 ± 0.6% 또는 1.7 ± 0.5%를 나타내었다 (도 8, 패널 (c)). 이들 실험은 E-S 매개된 암-선택적 표지화가 D-D의 급성 항종양 효능 및 종양 축적을 상당하게 개선할 수 있음을 확인하였다.
E-S 표지화에 의해 매개된 D-D의 향상된 종양 축적이 개선된 항종양 활성을 부여하는 방식을 추가로 이해하기 위해, 장기적인 기간에 걸쳐 종양 부피를 모니터링함으로써 별도의 효능 연구를 수행하였다. LS174T 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다 E-S+D-D, D-D, E-S, 및 PBS. PBS 및 E-S 그룹와 비교되는 바와 같이, E-S+D-D 그룹은 더 큰 종양 성장 억제를 발휘하였다 (도 8, 패널 d). D-D와 비교하여, 또한 E-S+D-D는 종양 성장률을 상당하게 감소시켰다 (도 8, 패널 d). E-S+D-D는 PBS 그룹과 비교하여 86.0%까지 마우스의 생존 시간을 개선하였고, 이는 D-D의 것(17.1%) 보다 상당하게 더 크다 (도 8, 패널 e). E-S+D-D는 함께 클릭 화학을 통한 약물의 향상된 종양 축적의 결과로서 D-D 단독보다 매우 크게 개선된 항암 효능을 발휘하였다.
전이암은 종래의 암 요법 예컨대 수술, 방사선 요법, 및 화학요법적 요법을 피할 수 있기 때문에 암 환자의 사망의 주요 원인이 되고 있다. 항체-기반 요법을 포함하는 부상하는 암 표적화된 요법은 전이암을 치료하는데 큰 잠재성을 나타내었다. 기본적인 결장 종양 모델에서 E-S/D-D의 탁월한 암 표적화 효과를 입증한 이후에, 본 발명자는 E-S 및 D-D의 조합된 표적 요법이 4T1 폐 전이암의 성장을 억제하는데 효과적인지 여부를 조사하였다. 효능 연구 이전에, 시험관내 4T1 암 세포의 E-S 매개된 화학 표지화를 연구하였다. 기대한 바와 같이, E-S는 클릭 반응을 통해 D-D의 세포 흡수를 상당하게 개선할 수 있는 시험관내 아지도기를 갖는 루시퍼라아제-조작된 4T1 암 세포를 효율적으로 표지화할 수 있었다. 4T1 전이암은 0일차에 루시퍼라아제-조작된 4T1 세포의 i.v. 주사에 의해 BALB/c 마우스에서 확립하였다. 3일 동안 (1, 2, 및 3일차) 1일 1회 E-S로 처리한 이후에, 마우스에 4일차로부터 시작하여 D-D 또는 유리 DOXO (또한 Dox로서 표지화됨)을 투여하여 전이 억제에 있어서의 그것의 효능을 조사하였다. 시간에 걸쳐 PBS 그룹 마우스의 생물발광 신호가 강해지는 것은 폐 조직에서의 4T1 전이의 증식을 확인시켰다 (도 9, 패널 (b)). 모든 약물 처리 그룹은 PBS 및 DCL-AAM 그룹과 비교하여 상당하게 감소된 생물발광 신호 및 종양 결절수를 나타내었다 (도 9, 패널 (b)). D-D기와 비교하면, E-S + D-D 그룹 마우스는 감소된 생물발광 신호 (도 9, 패널 b 및 c), 종양 결절의 더 작은 양 (47.9 ±7.1% 대 67.4±13.5%) (도 9, 패널 d), 및 종양 표면적의 감소된 백분율 (18.2 ± 8.3% 대 38.2±10.4%) (도 9, 패널 e 및 f)에 의해 입증되는 바와 같이 상당하게 감소된 폐 전이를 나타내었다. E-S + D-D에 대해 유사한 폐 전이 중증도를 유발하였지만, Doxo는 마우스 조직, 특히 골수 및 비장에서 더 큰 독성을 발휘하였다 (도 9, 패널 g). 클릭 화학을 통한 D-D의 향상된 종양 축적 및 암 조직과 정상 조직 간의 카텝신 B 활성 차이에 의해 부여되는 그것의 암-우선적인 약물 방출의 총괄적 결과로서 E-S + D-D는 함께 크게 감소된 독성으로 최상의 항암 효능을 발휘하였다.
DBCO -Val- Cit - DOXO (D-D)의 합성 경로
Figure pct00041
DBCO - PEG 1k - NHS의 합성. DBCO-NHS (0.11 mmol, 44 mg) 및 NH2-PEG1k-COOH (0.1 mmol, 100 mg)을 무수 DMF (1.5 mL)에 용해시키고, 그 다음 트리메틸아민 (0.11 mmol, 11 mg)의 첨가를 후속하였다. 혼합물을 24시간 동안 45℃에서 교반하였다. DMF 중의 DCC (0.12 mmol, 25 mg) 및 NHS (0.12 mmol, 14 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 45℃에서 추가로 교반하였다. 침전물을 여과 제거하였고, 여과물을 1k의 분획 분자량으로 초원심분리시켰다 (2회 반복). 잔류 용액을 DCM로 희석시켰고, 수집하고, 농축시켜 밝은 황색 고형물을 산출하였다 (70% 수율).
DBCO -Val- Cit - DOXO (D-D)의 합성. 독소루비신 하이드로클로라이드 (0.05 mmol, 29 mg) 및 Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (0.05 mmol, 38 mg)을 무수 DMF (1 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민 (0.06 mmol, 6 mg)을 첨가하였고, 혼합물을 질소 분위기 하에 40℃에서 교반하였다. HPLC 측정은 12시간 이후 Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP의 완전하 소비를 나타내었고, 이 시점에서 디이소프로필에틸아민 (100 μL)을 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물의 색상은 즉시 짙게 변하였다. 12시간 이후, HPLC 프로파일에서 피크 이동으로 확인된 바와 같이 Fmoc 기의 절단이 완료되었다. DMF (100 μL) 중의 DBCO-PEG1k-NHS (0.05 mmol, 65 mg)를 첨가하였고, 혼합물을 추가의 24시간 동안 40℃에서 교반하였다. 반응 용액을 농축시키고, 디에틸 에테르에 침전시켜 적색 고형물을 산출하였다. 디에틸 에테르로 2회 세정한 이후, 고형물을 메탄올에 재용해시키고, 48시간 동안 메탄올에 대해 투석하고, (1k 분획 분자량)으로 정제시켜 소분자를 제거하였다. 잔류 용액을 수집하고 농축시켜 적색 고형물을 산출하였다 (65% 수율).
D-D의 카텝신 B-유도된 분해. 소 비장 카텝신 B의 모액을 동결건조된 고체 (2.1 mg)을 1 mL의 25 mM 아세트산나트륨/1 mM EDTA 완충액 (pH = 5.0)에 대해 용해시킴으로써 제조하였다. 15 ㎕의 모액을 30 mM DTT/15 mM EDTA (30 μL)의 용액을 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 얼음 상에서 활성화시켰다. 활성화된 카텝신 B를 이후 2 mL의 아세트산나트륨/EDTA 완충액 (pH 5.0)로 희석시켰다. 메탄올 (10 mM, 10 μL) 중의 D-D를 활성화된 효소 용액에 첨가하였고, 혼합물을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 20 μL 분취액의 혼합물을 선택된 시험에서 취하였고, HPLC 측정을 위해 600 μL로 희석시켰다.
D-D 및 유리 DOXO의 MTT 연구. LS174T 세포를 4k 세포/웰의 초기 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였고, 24시간 동안 부착시켰고, 유리 DOXO 또는 다양한 DOXO 농도의 D-D로 72시간 동안 37℃에서 처리하였다. PBS로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. MTT 검정을 표준 절차에 따라 수행하였다.
E-S 처리된 LS174T 세포에서의 D-D의 흡수. LS174T 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였고, 3일 동안 E-S (50 μM)과 함께 인큐베이션시켰다. E-S 전처리하지 않은 세포를 대조군으로서 사용하였다. 오래된 배지를 제거하고, PBS로 3회 세정한 이후에, OptiMEM 중의 D-D (20 μM)를 상이한 시점에서 (유세포측정 분석을 위한 샘플 제조하기 이전 4 h, 2 h, 1 h, 및 30 min 시험) 첨가하였다. OptiMEM을 무색 트립신으로 탈착시키고, 유세포측정 분석을 위해 4% PFA가 첨가된 튜브로 유동시켜 전달하였다.
시험관내 DBCO - Cy5 또는 D-D의 흡수 기전. LS174T 세포를 커버 글라스 바닥을 가진 조직 배양 접시 상에 시딩하였고, 3일 동안 E-S (50 μM)와 함께 인큐베이션시켰다. PBS로의 복수회의 세정 이후, 새로운 배지 중의 리소트래커 그린을 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, DBCO-Cy5를 첨가하였고, 세포를 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. Hoechst 33342 (10 ㎍/mL) 및 CellMask 오렌지 원형질막 염색제 (1 ㎍/mL)을 염색제 세포 핵 및 세포막에 각각 10분 동안 첨가하였다. 배지를 제거하고, PBS로 세정한 후, 세포를 37℃에서 추가로 인큐베이션시켰다. 상이한 시점에서 (1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 및 24 h), 세포를 형광 현미경 하에 이미지화하여 DBCO-Cy5의 흡수를 모니터링하였다. E-S 전처리하지 않은 세포를 대조군으로서 사용하였다. D-D 처리된 세포의 생존 세포 이미지화를 위해, CellMask 심홍색 원형질막 염색제를 사용하여 세포막을 염색하였고, D-D의 형광 신호에 대한 간섭을 회피하기 위해 리소좀을 염색하지 않았다.
D-D 및 유리 DOXO의 약동학 연구. 그것의 순환 반감기를 평가하기 위해, D-D (DOXO 당량으로의 5 mg/kg) 또는 유리 DOXO (5 mg/kg)을 꼬리 정맥을 통해 암컷 무흉선 누드 마우스 (n=3)로 i.v. 주사하였다. 선택된 시점 (10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 및 24 h 주사후), 혈액을 안와정맥동으로부터 수집하였다. 수집된 혈액 샘플 (25 μL)을 메탄올/H2O (1/1, v/v, 75 μL)의 혼합물로 희석시켰고, 10분 동안 와류혼합시켰다. 12000 rpm으로 10분 동안 원심분리시킨 후, 상청액을 형광 측정을 위해 흑색 96-웰 플레이트로 수송시켰다. D-D 또는 유리 DOXO의 구배 농도를 표준 곡선의 결정을 위해 사용하였다. D-D 또는 유리 DOXO의 혈장 농도를 ㎍/mL으로 계산하였다.
피하 LS174T 결장 종양에 대한 E-S/D-D의 급속 효능 연구. LS174T 종양을 두 옆구리로의 HBSS/매트리겔 (1/1, v/v, 50 μL) 중의 LS174T 결장암 세포 (1.5 백만개의 세포)의 피하 주사를 통해 6 주령 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립시켰다. 종양이 ~50 mm3에 도달되는 경우, 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다 (그룹 1: E-S/D-D; 그룹 2: D-D; 3족: E-S; 4족: PBS; n = 3). 그룹 1 및 3의 경우, E-S (60 mg/kg)을 3 일 (0, 1, 및 2일차) 동안 1일 1회 i.v. 주사하였다. 나머지 2개의 그룹에서의 마우스를 대조군으로서 PBS를 i.v. 주사하였다. E-S의 마지막 주시 후 24시간 시점에서, D-D (DOXO 당량으로 10 mg/kg) 또는 PBS를 i.v. 주사하였다. 주사 후 48시간 시점에서, 종양을 채취하고 이등분하였다. 절반의 종양을 O.C.T. 화합물과 함께 냉동시켰고, 8 ㎛의 두께로 절단하였고, 말단 디옥시뉴클레오티딜전달효소 dUTP 닉 말단 표지 (TUNEL) 검정을 통해 세포자멸사에 대해 분석하였다. 종양의 다른 절반 및 기관을 계량하고, 균질화하고, 용해시켰다. 산성화된 이소프로판올의 첨가 이후, 혼합물을 와류혼합시켰고, -20℃에서 밤새 냉동시켰다. 원심 분리한 후, 상청액을 조직 중의 유지된 DOXO의 정량화를 위해 HPLC에 주입하였다. 데이터는 %I.D./g로 나타내었다.
피하 LS174T 종양에 대한 E-S/D-D의 장기 종양 감소 효능. LS174T 종양을 두 옆구리로의 LS174T 세포 (HBSS/매트리겔 (1/1, v/v, 50 μL) 중의 1.5Х106 세포)의 피하 주사를 통해 6 주령 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립시켰다. 종양이 ~50 mm3에 도달되는 경우, 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다 (그룹 1: E-S/D-D; 그룹 2: D-D; 3족: E-S; 4족: PBS; n = 5-6). 그룹 1 및 3의 경우, E-S (60 mg/kg)을 0, 1, 및 2일차에 i.v. 주사하였다. 다른 2개의 그룹에서의 마우스는 대조군으로서 PBS를 i.v. 주사하였다. D-D (Dox 당량으로의 12 mg/kg) 또는 PBS를 3, 7, 및 11일차에 i.v. 주사하였다. 마우스의 체중 및 종양 부피를 격일로 측정하였다. 종양 부피를 식 (길이)Х(폭)2/2을 사용하여 계산하였고, 장축 직경을 길이로 간주하고, 단축 직경을 폭으로 간주하였다. 종양 부피가 (예정된 종점으로서) 2000 mm3에 도달되거나 또는 동물이 빈사되거나 또는 체중 감소가 최초 중량의 20%를 넘는 경우에, 동물을 사멸시켰다. 동물이 종양 부피 또는 치료 관련 사망으로 인해 연구로부터 제외되는 경우, 동물에 대해 기록된 최종 종양 부피를 사용하여 차후 시점에서 평균 종양 부피를 계산하였다. 각각의 동물의 종점 (TTE)까지의 시간을 그것의 종양 부피가 예정된 종점에 도달되는 경우의 일수로 정의하였다. 치료 관련 사망으로서 분류된 동물을 사망일과 동일한 TTE 값에 할당하였다. 치료 효능을 대조군 (PBS) 그룹과 비교되는 치료 그룹에서의 중앙 TTE에서의 증가로의 정의되는 하기 식의 종양 성장 지연 (TGD)으로 결정하였다: TGD = TTE(T)－TTE(C), 이는 일수로서 또는 대조군 그룹의 중앙 TTE의 백분율로서 표현된다: %TGD = 100%Х(TTE(T)－TTE(C))/TTE(C).
MB- MDA 유방암 모델
MDA-MB-231 세포의 E-S 매개된 시험관내 표지화. MDA-MB-231 유방암 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버 슬립 상에 시딩하였다. 50 μM의 최종 농도로 E-S를 첨가하였고, 그 다음 TSA (1 μM) 또는 Z-FY-CHO (50 μM)의 첨가를 후속하였다. PBS 또는 E-S 만을 처리한 세포를 대조군으로서 사용하였다. 72-h 인큐베이션 이후, 배지를 제거하였고, 공초점 이미지화 및 IN 세포 분석기 측정을 위한 세포 샘플을 상기 언급된 절차에 따라 제조하였다.
E-S 표지된 MDA-MB-231 세포에서의 D-D 흡수. 세포를 1 × 104 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였고, 3일 동안 E-S (50 μM) 또는 PBS와 함께 인큐베이션시켰다. PBS로의 세정 이후, 세포를 상이한 시간 (30 min, 1 h, 2 h, 및 4 h) 동안 D-D (20 μM)와 함께 인큐베이션시켰고, 용해시켰고, D-D의 형광 강도에 대해 플레이트 리더 상에서 측정하였다. 형광 측정 이후, 각 웰에서의 단백질 농도를 BCA 검정을 통해 결정하였다. 최종 데이터는 D-Dper 밀리그램 단백질의 형광 강도를 나타내었다.
MDA-MB-231 세포에 대한 D-D 및 유리 DOXO의 MTT 검정. MDA-MB-231 유방암 세포를 4k 세포/웰의 초기 밀도에서 96-웰 플레이트에 시딩하였고, 12시간 동안 부착시켰고, 72시간 동안 37℃에서 다양한 DOXO 농도의 D-D 또는 유리 DOXO로 처리하였다. PBS로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. MTT 검정을 표준 절차에 따라 수행하였다.
피하 MDA-MB-231 유방종양에 대한 E-S+D-D의 장기간 종양 감소 효능. MDA-MB-231 종양을 두 옆구리로의 MDA-MB-231 세포 (HBSS/매트리겔 (50 μL, 1/1, v/v) 중의 1.5 × 106 세포)의 피하 주사에 의해 6 주령 암컷무흉선 누드 마우스에서 확립하였다. 종양이 ~50 mm3에 도달되는 경우에, 마우스를 4개의 그룹으로 무작위적으로 나누었다 (그룹 1: E-S+D-D; 그룹 2: D-D; 3족: E-S; 4족: PBS; n = 5). E-S (60 mg/kg)을 연속 3일 동안 (0, 1, 및 2일차) 그룹 1 및 그룹 3 마우스에 대해 i.v. 주사하였다. D-D (Doxo 당량으로의 12 mg/kg)을 3, 7, 및 11일차에 i.v. 주사하였다. 각각의 마우스의 종양 부피 및 체중을 매 4일마다 측정하였다. 종양 부피의 종점을 1500 mm3로 설정하였다. 데이터 분석은 LS174T 종양에 대한 상기 언급된 장기간 효능과 동일하였다.
4T1 전이암 모델
4T1 세포의 E-S 매개된 시험관내 표지화. 루시퍼라아제-조작된 4T1 유방암 세포를 40 k/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 내의 커버 슬립 상에 시딩하였다. 50 μM의 최종 농도로 E-S를 첨가하였고, 그 다음 TSA (1 μM) 또는 Z-FY-CHO (50 μM)의 첨가를 후속하였다. PBS 또는 E-S만으로만 처리된 4T1 세포를 대조군으로서 사용하였다. 72-h 인큐베이션 이후, 배지를 제거하였고, 세포를 공초점 현미경 및 유세포측정에 의해 분석하였다.
E-S 표지된 4T1 세포의 D-D 흡수. 루시퍼라아제-조작된 4T1 세포를 96-웰 흑색 플레이트에 시딩하였고, 3일 동안 E-S (50 μM)와 함께 인큐베이션시켰다. E-S 전처리하지 않은 세포를 대조군으로서 사용하였다. 배지의 제거 및 3회의 PBS로의 세정 이후, OptiMEM 중의 D-D (20 μM)를 상이한 시점에서 (샘플 제조 이전 4 h, 2 h, 1 h, 및 30 min 시점) 첨가하였다. OptiMEMD를 이후 제거하였고, 세포를 PBS로 2회 세정하였다. 100 ㎕의 세포용해 버퍼를 이후 각 웰에 첨가하였고, 각 웰에서의 내재화된 D-D의 형광 강도를 플레이트-판독기 상에서 측정하였다. 형광 측정 이후, 각 웰에서의 단백질 농도를 BCA 검정을 통해 결정하였다. 최종 데이터는 밀리그램 단백질당 D-D의 형광 강도 (D-D 흡수/mg 단백질)를 나타내었다.
4T1 세포에 대한 D-D 및 유리 DOXO의 MTT 검정. 루시퍼라아제-조작된 4T1 세포를 4k 세포/웰의 초기 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였고, 12시간 동안 부착시켰고, 72시간 동안 37℃에서 다양한 DOXO 농도의 D-D 또는 유리 DOXO로 처리하였다. PBS로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. MTT 검정을 표준 절차에 따라 수행하였다.
Balb/c 마우스에서의 4T1 전이암에 대한 항암 효능 연구. 4T1 전이암 모델을 루시퍼라아제-조작된 4T1 세포 (200 μL HBSS 중의 1 × 105 세포)의 꼬리 정맥 주사에 의해 0일차에 6-주령 BALB/c 마우스에 확립시켰다. 마우스를 이후 5개의 그룹으로 무작위로 나누었다 (그룹 1: E-S+D-D; 그룹 2: D-D; 3족: Dox; 4족: E-S; 그룹 5: PBS; n = 7-8). E-S (60 mg/kg)을 3일 동안 (1, 2, 및 3일차) 1일 1회 i.v. 주사하였다. D-D(Doxo 당량으로의 12 mg/kg) 또는 Doxo (7.5 mg/kg, 최대 내성 용량)을 4, 8, 및 12일차에 i.v. 주사하였다. 각각의 마우스의 체중 및 음식 섭취를 격일로 측정하였다. 폐 전이를 5일차에 시작하여 매4일 마다 Bruker 생체내 Xtreme 이미지화 시스템을 사용하는 BALB/c 마우스의 생물발광 이미지화를 통해 모니터링하였다. 이미지화 이전에 3분 시점에 D-루시페린 칼륨염 (150 mg/kg)을 복강내로 주사하였다. 생물발광 영상 데이터를 Bruker 이미지화 소프트웨어를 사용하여 처리되었다. 13일차의 마지막 이미지화 이후, 모든 마우스를 마취 하에 희생시켰다. 각각의 동물의 폐 및 심장을 전체적으로 절제하고, 계량하고, 폐가 팽창될 때까지 기관에 10% 포르말린을 주사하였다. 폐 상의 종양 결정 (그룹당 n=7-8)을 해부용 현미경 하에 계수하였다. 각각의 폐엽을 포르말린으로 고정한 이후 분리하였다. 모든 폐 조직을 파라핀-포매시키고, 4 ㎛의 두께로 절단하였고, H&E로 염색시켰다. 모든 폐 절편을 이후 스캐닝하여 분석하였다. 종양 및 폐의 표면적을 측정하여 총 폐 표면적에 대한 종양 표면적의 백분율 (A종양/A총)을 계산하였다.
E-S+D-D 및 유리 DOXO의 독성 평가. 간, 심장, 신장, 비장, 뇌, 흉골 및 척수 (자궁경부 흉부 및 요추)을 포르말린에 고정시켰고, 파라핀-포매시켰고, 4 ㎛의 두께로 절단하였고, H&E로 염색시켰다. 조직을 보드-인증 병리학자에 의해 분석되어 치료 매개 독성을 조사하였다. 이들 분석을 보드-인증 병리학자에 의해 수행하였다.
통계적인 분석. 통계적인 분석을 사후 피셔 LSD 시험 (OriginPro 8.5)과 함께 변동의 원-웨이 분석 (ANOVA)에 의해 수행하였고, P-값 < 0.05은 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다. 그 결과는 0.01 < *P ≤ 0.05에서 상당하고, 0.001 < **P ≤ 0.01에 매우 상당한 것으로, ***P ≤ 0.001에서 극도로 상당한 것으로 간주되었다. 샘플 크기를 시험관내 세포 실험에 대해 n=3-6으로, 생체내 체내분포 및 이미지화 연구에 대해 n=3-4로, 이종이식 종양 연구에 대해 n=5-6로, 전이성 종양 연구에 대해 n=7-8로 실험적으로 고정하였다.
실시예 10. TNBC 모델에서의 동물 데이터.
에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 및 Her2의 제한된 발현을 특징으로 하는 삼중-음성 유방암은 유방암에 대한 복수개의 종래의 항체 요법이 효과가 없었다. 본 발명자는 아지드를 갖는 삼중-음성 MDA-MB-231 유방암 세포의 E-S 매개된 표지화가 DBCO-약물 콘주게이트 (예를 들면, D-D)의 항암 효능 및 종양 축적을 개선할 것인지 조사하는데 관심을 가졌다. 시험관내에서 MDA-MB-231 유방암 세포의 E-S의 표지화 능력을 우선 평가하였다. 3일 동안 E-S 및 1시간 동안 DBCO-Cy5와 함께 인큐베이션시킨 후, 세포막 상의 강한 Cy5 형광이 관측되었고 (도 10, 패널 a), 이는 아지도기의 성공적인 발현을 나타낸다. TSA 및 Z-FY-CHO 모두는 E-S의 표지화 효율을 상당하게 감소시켰고 (도 10, 패널 b), 이는 MDA-MB-231 유방암 세포에서의 E-S 대사 표지화의 HDAC/CTSL 유도된 재활성화를 입증하였다. E-S 전처리는 시험관내에서 특정 양의 인큐베이션 시간 (30 min, 1 h, 및 2 h) 내에 D-D의 흡수를 향상시킬 수 있었다 (도 10, 패널 d). 본 발명자는 이후 MDA-MB-231 종양 세포의 E-S 매개된 표지화가 D-D의 축적 및 항종양 효능을 개선할 것이지 여부를 조사하였다. 피하 MDA-MB-231 원발성 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: E-S+D-D, D-D, E-S, 및 PBS. E-S를 0, 1, 및 2일 차에 i.v. 투여하였다. D-D는 3, 7, 및 11일차에 i.v. 투여하였다 (도 11, 패널 a). PBS 그룹과 비교하여, E-S 그룹은 항종양 효과에 대한 E-S만의 영향을 배제하고 종양 성장률에서의 무시할만한 차이를 나타내었다 (도 11, 패널 b). 약물 처리 그룹 모두는 PBS 그룹과 비교하여 62 및 29.0의 각각의 중앙 TTE 값과 함께 상당하게 감소된 종양 성장률를 나타내었다 (도 11, 패널 b, c, 및 d). D-D 그룹과 비교하여, E-S+D-D 그룹은 짐작컨대 E-S 매개된 종양 표지화 및 D-D의 개선된 종양 축적 및 유지의 결과로서 24일 정도로 초기에 상당히 더 작은 종양 크기와 함께 더 나은 항종양 효능을 나타내었다 (도 11, 패널 b, c, 및 d).
인용된 참조문헌
Figure pct00042

Claims (68)

  1. 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노실 모이어티;
    트리거에 의해 절단되는된 트리거-반응성 모이어티; 및
    상기 만노피라노실 모이어티 및 상기 트리거-반응성 모이어티에 공유결합되는 자기-희생 링커
    를 포함하는 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트리거는 세포성 과산화물인, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트리거-반응성 모이어티는 붕산기, 디알킬 보로네이트기, 디아릴 보로네이트기, 디(아르알킬)보로네이트기, 보롤란기, 또는 디옥사보롤란기를 포함하는, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포성 과산화물에 의한 상기 트리거-반응성 모이어티의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하는, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 트리거는 저산소증인, 화합물.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 트리거-반응성 모이어티는 2-니트로이미다졸 모이어티 또는 아조기, 예컨대 아조벤젠을 포함하는, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 저산소 조건 하에서의 상기 트리거-반응성 모이어티의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하는, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 트리거는 설프하이드릴- 또는 티올레이트-함유 화합물, 예컨대 글루타티온인, 화합물.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 트리거-반응성 모이어티는 이황화 결합을 포함하는, 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 설프하이드릴- 또는 티올레이트-함유 화합물에 의한 상기 이황화 결합의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하는, 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 트리거는 NAD(P)H 탈수소효소 (퀴논 1) (NQO1)인, 화합물.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서, 상기 트리거-반응성 모이어티는 임의로 치환된 프로피온산 또는 프로피온산 아미드 모이어티에 공유결합된 임의로 치환된 퀴논을 포함하는, 화합물.
  13. 제12항에 있어서, NAD(P)H 탈수소효소 (퀴논 1) (NQO1)에 의한 상기 임의로 치환된 프로피온산 또는 프로피온산 아미드 모이어티에 공유결합된 임의로 치환된 퀴논의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하는, 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 트리거는 카텝신 효소인, 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 트리거-반응성 모이어티는 카텝신 효소에 의해 절단되는된 아미드 결합을 포함하는 올리고펩타이드 서열 또는 아미노산인, 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아미드 결합을 포함하는 올리고펩타이드 서열 또는 아미노산은 Phe-Lys, Val-Lys, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg(NO2), Phe-Arg(Ts)을 포함하는, 화합물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 치환된 라이신 아미드인, 화합물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카텝신 효소에 의한 아미드 결합의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 임의로 치환된 N-((아지도)아실) 2-아미노-2-데옥시-D-만노피라노시드를 방출하는, 화합물.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카텝신 효소는 카텝신 L인, 화합물.
  20. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (I) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00043

    식 중, 상기 R1은 H 또는 트리((C1-C6)알킬)실릴을 나타내고;
    상기 R2는 각 경우에 대해 독립적으로 H 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 R3 및 R4는 각 경우에 대해 독립적으로 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 A1은 자기-희생 링커를 나타내고; 그리고
    상기 m은 1, 2, 또는 3이다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 R1은 H를 나타내는, 화합물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 R2는 각 경우에서 독립적으로, H 또는 -C(O)CH3를 나타내는, 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 모든 경우의 상기 R2는 동일한, 화합물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3 및 R4는 H인, 화합물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m은 1인, 화합물.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 식 중, 상기 A1은 기 -X1-Y1-을 나타내고;
    상기 X1은 결합 또는 -C(O)2-를 나타내고;
    상기 Y1은 결합 또는 임의로 치환된 -((C1)알킬렌)-아릴렌- 또는 -((C1)알킬렌)-헤테로아릴렌-을 나타내고;
    X1 및 Y1은 둘 모두 결합을 나타내지 않는 것인, 화합물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Y1은 임의로 치환된 -((C1)알킬렌)-아릴렌-을 나타내는, 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00044

    식 중, 상기 R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
    상기 R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
    상기 q는 1 또는 2이다.
  29. 제28항에 있어서, 상기 R7은 H인, 화합물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는
    Figure pct00045
    인, 화합물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는
    Figure pct00046
    인, 화합물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 R7은 H인, 화합물.
  33. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는 하기로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00047

    식 중, 상기 R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
    상기 n은 1 또는 2이다.
  34. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (II) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00048

    식 중, R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
    상기 q는 1 또는 2이다.
  35. 제34항에 있어서, 하기 화학식 (II') 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00049
  36. 제34항에 있어서, 상기 R7은 H인, 화합물.
  37. 하기 화학식 (III) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00050

    식 중, 상기 K는 임의로 치환된 사이클로알키닐, 헤테로사이클로알키닐, 또는 알키닐 모이어티를 나타내고;
    상기 Pol은 폴리머 모이어티를 나타내고;
    상기 Pep는 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열을 나타내고;
    상기 A2 는 자기-희생 링커를 나타내고;
    상기 D는 파마코포어를 나타내고
    여기서, 폴리머 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 이미드이고; 아미노산 또는 올리고펩타이드 서열은 (i) 상대적인 건강한 세포에 비해 악성 세포에서 과발현되는 또는 (ii) 상대적인 건강한 세포에서 발현되지 않는 악성 세포에서 발현되는 효소에 의해 절단되는 아미드 결합을 포함한다.
  38. 제37항에 있어서, 상기 효소에 의한 아미드 결합의 절단시, 상기 자기-희생 링커는 분해되고, 이로써 파마코포어를 방출하는, 화합물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 효소는 카텝신 효소인, 화합물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 카텝신 효소는 카텝신 B인, 화합물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Pep는 임의로 치환된 Val-Cit를 나타내는, 화합물.
  42. 제37항에 있어서, 하기 화학식 (IV)으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00051

    식 중, 상기 R1, R2, 및 R3는 각 경우에서 독립적으로, H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타낸다.
  43. 제42항에 있어서, 상기 R1, R2, 및 R3는 H인, 화합물.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K는 임의로 치환된 헤테로사이클로알키닐 또는 사이클로알키닐을 포함하는, 화합물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 K는 임의로 치환된 디벤조사이클로옥틴 모이어티를 포함하는, 화합물.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Pol는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 모이어티를 나타내는, 화합물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 Pol은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜의 10 내지 30개의 반복 단위를 나타내는, 화합물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 Pol은 폴리에틸렌 글리콜의 10 내지 30개의 반복 단위를 나타내는, 화합물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 Pol은 폴리에틸렌 글리콜의 15 내지 25개의 반복 단위를 나타내는, 화합물.
  50. 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 A2는 기 -Y2-X2-를 나타내고;
    상기 X2는 결합 또는 -C(O)2-을 나타내고;
    상기 Y2는 결합 또는 임의로 치환된 -아릴렌-((C1)알킬렌)- 또는 -헤테로아릴렌-((C1)알킬렌)-을 나타내고;
    상기 X2 및 Y2는 둘 모두 결합을 나타내지 않는 것인, 화합물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Y2는 임의로 치환된 -아릴렌-((C1)알킬렌)-을 나타내는, 화합물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00052

    식 중, 상기 R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
    상기 R7은 H, 할로, -C(O)2H, (C1-C6)알콕시, 디((C1-C6)알킬)아미노, -NO2, -O(CH2CH2O)qCH3를 나타내고;
    상기 q는 1 또는 2이다.
  53. 제52항에 있어서, 상기 R7은 H인, 화합물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는
    Figure pct00053
    인, 화합물.
  55. 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기-희생 링커는 하기로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00054

    식 중, 상기 R5는 H, 트리((C1-C6)알킬)실릴, 또는 -C(O)((C1-C6)알킬)을 나타내고;
    상기 R6는 H, (C1-C6)알킬, 또는 헤테로사이클로알킬을 나타내고;
    상기 n는 1 또는 2이다.
  56. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파마코포어는 진경제, 마취제, 항-염증제 예컨대 비스테로이드 항-염증성 (NSAID) 제제, 항암 치료제, 칼슘 채널 차단제, 항생제, 면역억제제, 항바이러스제, 항-증식성 제제, 항미생물제, 신경-성장 유도제, 또는 평활근 이완제인, 화합물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 파마코포어는 항암 치료제인, 화합물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 항암 치료제는 악티노마이신-D, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 벨락토신 A, 바이칼루타마이드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부세렐린, 부설판, 캄포테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르필조밉, 카무스틴, 클로르암부실, 클로로퀸, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데메톡시비리딘, 덱사메타손, 디클로로아세테이트, 디엔스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에폭소마이신, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에버롤리무스, 엑세메스탄, 펠루타미드 B, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 젬시타빈, 게니스테인, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론, 이리노테칸, 익사베필론, 레날리도마이드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 로니다민, 마리조밉, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메트포르민, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모노메틸 아우리스타틴, 닐루타마이드, 노코다졸, 옥트레오타이드, 오무랄라이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔미드로네이트, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페리포신, 플리카마이신, 포말리도마이드, 포르피머, 프레드니손, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 소라페닙, 스트렙토조신, 수니티닙, 수라민, 타목시펜, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 티타노센 이염화물, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, MG-132, PSI, CEP-18770, MLN-2238, MLN-9708, NC-005, YU-101, LU-005, YU-102, NC-001, LU-001, NC-022, PR-957 (LMP7), CPSI (β5), 10 LMP2-sp-ek, BODIPY-NC-001, 아지도-NC-002, ONX-0912, PS-519, 125I-NIP-L3VS, NC-005-VS, 또는 MV151인, 화합물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항암 치료제는 독소루비신인, 화합물.
  60. 제37항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 파마코포어를 나타내는, 화합물:
    Figure pct00055

    Figure pct00056

    Figure pct00057

    Figure pct00058

    Figure pct00059

    Figure pct00060
  61. 제37항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 파마코포어를 나타내는, 화합물:
    Figure pct00061

    Figure pct00062

    Figure pct00063
  62. 제37항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는, 화합물:
    Figure pct00064

    식 중, j는 10-30의 정수이다.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물.
  64. 암 세포의 표면 상의 아지도당의 발현 방법으로서,
    암 세포를 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키고, 이로써 암 세포의 표면 상에 아지도당을 발현시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  65. 포유동물의 악성 조직에서의 아지도당의 발현 방법으로서,
    악성 조직을 가진 포유동물에 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  66. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
  67. 제41항에 있어서, 치료적 유효량의 제37항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  68. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 제37항 내지 제62항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
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