KR20150138377A - 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 및 용도 - Google Patents

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베고나-마리아 에체베리아 베이스테귀
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하비에르 칼보
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어소시에이션 센트로 드 인베스티가시온 코페라티바 엔 바이오머티리얼스
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Abstract

동위 원소로 표지된 글리칸 및 그의 합성 및 글리칸 혼합물을 질량 분광법으로 분석할 때 내부 표준물로서의 사용이 기재된다. 본원에 기재된 합성 방법은 편리하게는 천연 샘플에서 글리칸의 정성적 및 정량적인 확인에 사용하기 위한 해비(heavy) 글리칸 라이브러리를 용이하게 제조하는데 사용될 수 있다.

Description

동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 및 용도{Synthesis and use of isotopically-labelled glycans}
본 발명은 올리고당류 및 다당류의 이소토폴로그(isotopologue)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 및 글리칸 혼합물의 질량 분광법에 의한 분석시 표준물로의 이의 용도에 관한 것이다.
글리코실화는 진핵생물체에서 가장 보편적인 번역후 단백질 변형 중 하나이다. 모든 포유류의 단백질 중 절반 이상이 이의 생존 중 어느 시점에서 글리코실화되고 사실상 모든 막 및 분비되는 단백질이 글리코실화되는 것으로 예상된다. 글리코실화는 비-템플릿(template)-유도 과정이며 고등 유기체에서 복잡한 과정에 필요한 높은 수준의 다양성을 도입하는 것으로 여겨진다. 주요한 거대분자 상호작용에 참여하는 것에 더해, 글리칸은 단백질 폴딩, 교환(trafficking), 및 안정에 기여하는 것으로 나타났다.
N-글리칸은 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)의 일부인 아스파리긴 잔기를 통해 단백질 골격(backbone)과 연결되어 있다. N-글리칸은 말단 당 잔기에 따라 복합, 높은 만노스, 혼성 N-글리칸으로 분류된다. 이러한 분류는 대부분의 N-글리칸이 공유하는 공통의 오당류 모티프를 기반으로 한다. O-글리칸은 세린 또는 트레오닌 잔기를 통해서 단백질에 연결된다. 많은 O-글리칸 코어 구조물이 있으며, 코어 1, 코어 2, 코어 3, 및 코어 4가 가장 흔하다.
많은 질병은 글리코실화 및/또는 글리칸의 인식 중 획득한 변환를 포함하는 것으로 알려져 있다. 일 예로써, 변경된 글리코실화는 암 세포의 보편적인 특징이고 일부 글리칸 구조물은 종양 및 종양 진행의 마커로 잘 알려져있다. 그 결과로, 단백질 글리코실화 및 글리칸 조성물에 관한 광범위한 분석 방법은 과학계에게 흥미가 있다.
대부분의 글리콜-프로파일링(glycol-profiling) 방법에서, 글리칸은 히드라진 분해 또는 특정 펩티드 글리코시다제(예를 들어, PNGase F) 처리를 통해 제거된다. 질량 분광법은 낮은 농도에서의 높은 민감도 때문에, 생성된 복합 혼합물을 분석하는데 자주 사용된다. 그러나, 특정 분석 물의 신호 강도는 특히 분석물의 물리적 특성(이온화 가능성, 단편화 경향, 등.)에 좌우되어, 임의의 상대적 정량화, 및 어떤 경우 심지어 확인까지도 매우 어렵게 만든다.
2개의 샘플에 공통인 글리칸의 확인 및 이의 상대적 정량화는 동위 원소 태그(tag)를 삽입하기 위해 글리칸 혼합물을 유도체화함으로써 용이해질 수 있다. 상기 2개의 샘플은 라이트(light) 및 해비(heavy) 형태의 표지 시약으로 표지된 후 질량 분광법으로 분석하기 전에 혼합된다. 당단백질로부터 분리된 글리칸 혼합물에 동위 원소 태그를 삽입하기 위한 유도체화는 페르메틸화(permethylation) 기법 또는 글리칸 환원성 동위 원소 표지를 이용하여 달성될 수 있는데, 이때 상기 태그는 환원성 아미노화로 도입된다 (Atwood, 2007; Bowman, 2007, 2010; Botelho, 2008; Hitchcock, 2006; Hsu, 2006; Kang, 2007; Lawrence, 2008; Ridlova, 2008; Yuan, 2005; Zhang, 2003)
환원성 아미노화는 전형적으로 글리칸의 환원성 말단에서 일어나고 동위 원소로 표지된 아닐린, 아미노피리딘 또는 안트라닐산을 이용할 수 있다. 예를 들어, Xia 등 (2009)은 인간과 마우스의 혈청으로부터 방출된 글리칸 혼합물에서의 차이를 비교하기 위해 동위 원소로 표지된 아닐린의 사용을 입증하였다. 글리칸은 PNGase F에 의해 방출된 후, 생성된 혼합물은 12C6-아닐린 또는 13C6-아닐린을 사용한 환원성 아미노화에 의해 별도로 유도체화된다. 마우스 혈청으로부터의 글리칸의 12C6-아닐린-유도체화된 혼합물 및 인간 혈청으로부터의 글리칸의 13C6-아닐린으로 유도체화된 혼합물의 등몰 배합물을 분석함으로, 상기 저자들은 6 Da의 질량 차로 분리된 쌍을 이룬 질량 피크를 확인하고 양 쪽 샘플에 공통인 글리칸에 대한 그럴 듯한 구조를 정할 수 있었다고 보고하였다. 상기 저자들은 이들 피크들의 상대적 강도의 비교로 다른 샘플과 비교하여 하나의 샘플에 존재하는 특정한 공통된 글리칸의 양을 측정할 수 있었다고 보고하였다.
그러나, 이러한 방법들은 단지 반-정량적인 결과를 제공한다. 또한, 상기 결과는 태깅 과정의 재현 가능성 및 부반응, 산화적 분해 및 (수용액에서 특정한 조건 때문에 일어날 수 있는) "필링 반응(peeling reaction)" 으로 초래되는 문제에 의해 영향을 받을 수 있고, 중요한 작용기가 상기 유도체화 단계 동안 손실될 수 있다.
동위 원소 태그는 프로테오믹스에서도 사용되고 있다. Breidenbach 등 (2012)은 필터 보조된 (aided) 샘플 제조 방법론으로 동위 원소로 표지된 GlcNAc를 효모 N-글리칸에 대사적으로 삽입하는 방법을 입증하였다. 이브롬화물 동위 원소 삼중 패턴을 모방하기 위해 천연 동위 원소물 GlcNAc, 13C2-GlcNAc 및 13C4 15N1-GlcNAc를 1:2:1 비로 포함하는 GlcNAc 이소믹스(isomix)가 사용되었다. 상기 이소믹스를 포함하는 생성된 글리콜 접합체는 FASP 분해 및 EndoH 탈글리코실화를 거치고 글리코시드 확인을 용이하게 하기 위해 자동화된 동위 원소 엔벨로프(envelope) 패턴 검색으로 (LC-MS/MS 실험에서) 분석되었다. 상기 방법은 저자가 샘플 중의 다른 이온들의 상대적 강도에 관계 없이 당펩티드 이온에 단편화 우선순위를 둘 수 있게 한다.
방출된 글리칸 혼합물의 함량을 신속하고 용이하게 분석하는 개선된 방법, 특히 상기 기재된 종래 기술의 단점을 겪지 않는 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 질량 분광법에서 표준물로 사용되는 개별 글리칸 및 당접합체의 안정한 이소토폴로그가 복합 혼합물의 정성적 및 정량적 분석에 유용성을 가질 수 있다는 발명자의 통찰에 기초한다. 특히, 본 발명은 당업계에 공지된 동위 원소적 글리칸-태깅 공정과 연관된 재현 가능성 및 작용 정보의 손실 문제를 해결하는데, 이때 글리칸 혼합물은 단백질로부터 제거되는 동안 또는 제거된 후에 태그를 삽입하기 위해서 유도체화된다. 본 발명자는 동위 원소로 표지된 글리칸을 합성하여 생성하고, 분석물 샘플에 도핑(doped)하여 질량 분광법으로 분석하는 방법을 제공한다. 이들 방법은(상기 샘플과 연관된) 남아있는 질량 분광 피크와 연관된 상기 질량 분광 엔벨로프(들)의 비교를 통해 분석물 샘플에서 공지된 구조의 글리칸 확인을 허용한다.
또한, 본 발명은 공지된 존재비의 상기 표준물의 첨가를 통해 절대치로 샘플 중의 특정한 글리칸의 정량화를 허용하는데, 이는 반-정량적 데이터만 제공하는 당업계에 공지된 방법에 비해 상당한 이점을 나타낸다. 본 발명은 질량 분광법으로 복합 글리칸 혼합물의 정성적 및 정량적 분석에 사용을 위한 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물[소위 "태그된(tagged) 표준물"]의 라이브러리(library)를 제공한다. 추가로 복합 글리칸 혼합물의 조성물을 정성적 및/또는 정량적으로 분석하는데 이들 표준물을 사용하는 방법이 제공된다. 이들 분석 방법은 특정 장애 및 질병 상태 및 기타 생물학적 과정과 연관된 글리칸 마커(marker)의 확인에 유용성을 가질 수 있다.
광범위하게, 본 발명은 적어도 2개의 당 단위를 포함하는 글리칸을 동위 원소로 표지된 아실화제로 처리하여 글리칸 구조물에 동위 원소 표지를 삽입하는 것을 포함하는, 동위 원소로 표지된 글리칸(당접합체를 포함)의 합성 방법을 포함한다.
이러한 동위 원소로 표지된 올리고당류는 효소적 유도체화 단계, 즉, 하나 이상의 효소-촉매화 단계에 의한 다양화(diversification )를 거쳐 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물의 라이브러리를 합성하는데 사용될 수 있는, 올리고당류 코어 구조물이다. 이는 상기 특정 글리칸의 정성적(및 정량적) 검출을 위한 방법에 상당한 이점을 나타낸다.
따라서, 제1양태에서, 본 발명은 상기 동위 원소로 표지된 올리고당류의 합성 방법에 대한 것으로써, 상기 방법은 하나 이상의 보호기로 임의로 보호된 올리고당류를 동위 원소로 표지된 아실화제로 아실화시키는 단계를 포함한다.
제1양태에서, 본 발명은 질량 분광법의 내부 표준물로서 사용하기 위한 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 방법을 제공하며, 상기 방법은
하나 이상의 보호기로 임의로 보호된 올리고당류 코어 구조물을 동위 원소로 표지된 아실화기로 아실화하여 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물을 수득하는 단계; 및
생성된 동위 원소로 표지된 올리고당류를 효소적으로 유도체화하여 동위 원소로 표지된 글리칸을 수득하는 단계를 포함한다.
효소적 유도체화는(본원에서는 또한 효소적 다양화로도 지칭될 수 있다) 본원에 기재되는 올리고당류를 효소-촉매화 반응시키는 것을 지칭한다. 적합한 효소적 유도체화/다양화 반응은 하기 단계를 포함한다:
- 신장 단계: 전형적으로 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 적합한 당 공여체와의 축합반응을 통해 추가의 당 단위(들)을 올리고당류에 첨가. 신장 단계는 상기 올리고당류의 말단, 또는 중간 당 단위에서 일어날 수 있다.
- 절단 단계: 상기 올리고당류의 말단으로부터 당 단위(들)을 제거. 이는 전형적으로 하이드롤라제를 사용하는 가수 분해 반응을 통해 진행된다.
- 에피머화(Epimerisation) 단계: 분자 중의 스테레오센터 (stereocentre)의 전체적인 또는 부분적인 전도. 이는 전형적으로 에피머라제에 의해 촉매화된다.
- 글리코실전달단계(글리코실 전달 반응): 공여체로부터 수용체로의 당 단위의 전달; 즉, 하나의 올리고당류는 당 단위를 상실하고, 즉 절단되고, 다른 올리고당류는 당 단위를 수득한다(즉, 신장된다). 이러한 반응은 합성 효소 또는 글리코시드 전달 효소에 의해 촉매화된다.
- 번역후 변형(Post-translation modification) 단계: 기타 작용기는 효소적 유도체화 과정에서 삽입될 수 있다. 일반적인 번역후 변형은 당업계에 공지되어 있고, 제한 없이, 인산화, 황산화 및 아실화를 포함할 수 있다.
전형적으로, 이러한 효소-촉매화 유도체화 단계는 화학-선택적이다. 본 발명의 상기 제1양태는 본원에 기재된 바와 같이, 상대적으로 작은 "코어" 올리고당류로부터 시작하여, 질량 분광법의 내부 표준물로 사용되는 방대한 수의 동위 원소로 표지된 글리칸 구조물을 용이하게 생성하는 방법을 제공한다는 것을 알 수 있을 것이다.
일부 실시 형태에서, 상기 효소적 유도체화 단계는 말단 당 단위를 제거하는 효소적 가수 분해 단계를 포함한다. 이는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 합성된 2-안테나(biantennary) 7당류 N-글리칸 코어로부터 유도된 비대칭성 표준물로의 접근을 허용한다.
일부 실시 형태에서, 상기 효소적 유도체화 단계는 생성된 글리칸을 글리코실트랜스퍼라제 및 적합한 당 공여체를 이용하여 효소적으로 신장하는 단계를 포함한다. 적합한 효소적 신장 방법은 당업계에 공지되어 있고(Blixt, 2006; Ruiz, 2001; Serna, 2010, Zou, 2011) 하기에 추가로 기재된다. 적합한 당 공여체는 단-, 올리고-, 또는 다-당류일 수 있다. 일부 실시 형태에서 효소적 신장 단계는 한 번 이상 반복된다. 상기 효소적 신장 단계가 반복되는 실시 형태에서, 바람직하게는, 각 단계에서 당 공여체는 적합한 단당류 당 공여체이다.
일부 실시 형태에서, 상기 효소적 신장 단계에서 당 공여체는 동위 원소로 표지된다. 상기 효소적 신장 단계가 반복되는 실시 형태에서, 효소적 신장 단계의 당 공여체는 상기 당 공여체가 다른 어느 효소적 신장 단계에서 동위 원소로 표지되었는지와 무관하게 독립적으로 동위 원소로 표지된다. 상기 당 공여체는 임의의 적합한 위치의 임의의 적합한 동위 원소 형태의 원자로 동위 원소 표지될 수 있다. 이러한 방식으로, 추가의 동위 원소로 표지된 단당류 단위는 동위 원소로 표지된 올리고당류에 삽입될 수 있다. 이는 MS-MS 방법으로 수득된 단편화 패턴을 이용하는 글리칸 분석 및 하기에 기재되는 바와 같이 정확한 정량적 분석을 돕기 위해 특정 글리칸 구조물에 대해 상이한 이소토폴로그를 생성하는데 유용성을 가질 수 있다.
상기 효소적 유도체화 단계는 단일의 효소-촉매화 단계, 또는 하나 이상의 효소-촉매화 단계를 차례로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 효소적 유도체화 단계는 단일의 가수분해 또는 신장 단계이거나 원하는 글리칸 구조물을 생성하기 위해 하나 이상의 가수분해 및/또는 신장 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어는 차례로 신장되거나 절단되고 다음으로 (차례로) 신장된다. 동위 원소로 표지된 올리고당류는 또한 다른 위치에서 신장되고 다음으로 절단될 수 있다. 상기 단계들의 순서를 다르게하는 것은 사용되는 효소의 특이성을 적합하게 하는데 바람직할 수 있다. 대표적인 비-제한적인 예가 본원에 제공된다.
본원에서 기재된 바와 같이, 상기 용어 올리고당류는 적어도 2개의 당(단당류 단위)을 포함하는 당류 중합체와 관련된다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 이당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 3당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 4당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 5당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 6당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 7당류이다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고당류는 더 높은 올리고머(oligomer)이다. 상기 올리고당류는 선형 또는 분지형일 수 있다 [또한 안테나(antennary)라고도 함].
상기 올리고당류는 하나 이상의 히드록실 또는 아미노기를 포함할 수 있고, 각각은 보호기로 독립적으로 보호될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유리 히드록실 및/또는 아미노기는 보호되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 존재하는 일부 또는 모든 히드록실이기는 보호된다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 보호되는 제1 및/또는 제2아미노기가 존재한다.
히드록실 및 아미노기에 적합한 보호기는 당업계에 공지되어 있다. 순수하게 예로써, 및 제한 없이, 본 발명에 사용하기에 적합한 보호기는 하기에 논의된다. 일부 실시 형태에서, 보호기는 올리고당류의 목적한 위치에서 선택적인 탈보호(deprotection) 및 화학적 조작을 용이하게 하기 위해 서로에게 직교하는 것으로 선택된다.
바람직하게는, 상기 올리고당류는 적어도 하나의 유리 -NH2기를 포함하고, 상기 유리 -NH2기에서 아실화가 일어난다. 하나 이상의 유리 -NH2기가 존재하는 경우, 아실화는 각각의 유리 -NH2기에서 일어날 수 있다.
본 발명자들은 반-보호 코어 모티프가 화학선택적 효소적 유도체화를 위한 적합한 기질임을 밝혔다. 또한, 상기 보호기의 존재는 특별한 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 벤질기는 HPLC 분석 및 정제 동안 피크 검출 용 발색단(chromophore)으로서 작용할 수 있고, 예를 들어, 이성질체 글리칸에 대한 상이한 산물의 분리를 도울 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 일부 방법에서, 상기 동위 원소로 표지된 코어 올리고당류는 효소적 유도체화 단계 동안 부분적으로 보호된다. 적합하게도, 상기 보호기는 하나 이상의 히드록실기에 존재하는 임의로 치환된 벤질기, 바람직하게는 -CH2Ph기이다.
예를 들어, 본원에 기재된 상기 방법은 동위 원소로 표지되고 부분적으로 보호된 올리고당류에서의 적어도 하나의 효소적 유도체화 후, 탈보호 단계를 포함할 수 있다. 추가의 효소적 유도체화 단계(들)이 뒤에 이어질 수 있다. 예를 들어, 상기 부분적으로 보호되는 올리고당류는 부분적으로 벤질화될 수 있다. 적합하게도, 상기 올리고당류가 하나 이상의 벤질기를 가질 때, 상기 탈보호 단계는 수소화일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 올리고당류는 이당류 모티프를 포함하고, 이당류 모티프는 제1단당류 단위와 제2단당류 단위를 포함하며, 적어도 하나의 제1단당류 단위 및/또는 2단당류 단위는 아미노기를 포함하고 아미노기(들)에서 아실화가 일어난다. 올리고당류가 2개 이상의 단당류 단위를 포함하는 일부 실시 형태에서, 이당류 모티프는 당류 쇄(chain)의 말단에 위치할 수 있으며, 상기 말단은 환원성 또는 비-환원성일 수 있다. 올리고당류가 4개 이상의 단당류 단위를 포함하는 일부 실시 형태에서, 이당류 모티프는 당류 쇄의 말단 또는 중간에 위치할 수 있다.
아미노기를 포함하는 단당류는 바람직하게는 아미노 당 단당류이다. 광범위하게, 적어도 하나의 -NH2기를 갖는 임의의 아미노 당 단당류는 본 발명의 제1양태의 방법에서 적어도 하나의 제1단당류 단위 및/또는 제2단당류 단위로 적합할 수 있다. 적합한 아미노 당의 예는 헥소스아민과 그의 유도체를 포함하지만, 이에 특이적되지는 않는다. 적합한 아미노 당 단당류의 예는 글루코스아민(GlcN), 갈락토스아민(GalN), 만노스아민(ManN), 프럭토스아민(FruN), 푸코스아민(FucN), 무람산(Mur), 뉴라민산(Neu), 다우노스아민 (daunosamine), 및 퍼로스아민(perosamine)을 포함하지만, 이에 특이적되지는 않는다.
다른 아미노 당 유도체도 본 발명의 용도에 적합할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 제1단당류 단위 및/또는 2단당류는 N-아세틸 아미노 당의 데스-아세틸 유도체이다. 상기 열거된 것에 더해 적합한 예는, 예를 들어, 데스-아세틸 아스파틸-글루코스아민을 포함한다. 단당류 단위는 또한 추가로 치환되고, 예를 들어, 글리코시드의 한 부분을 포함할 수 있다.
제2단당류 단위는 제2아미노 당, N-아세틸 아미노 당, 또는 다른 당 단위일 수 있다. 예를 들어, 제한을 위한 것이 아니라, 제2단당류 단위는 헥토스 또는 펜토스 또는 그의 아미노 당일 수 있고, 추가로, 예를 들어, 지방산 쇄로 치환될 수 있다. (예를 들어, 제2단당류 단위는 지질 A일 수 있다)
올리고당류가 이당류 모티프를 포함하는 일부 실시 형태에서, 제1단당류 단위는 GlcN, GalN, ManN, FruN, FucN, Mur, 또는 Neu 중에서 선택되고;
제2단당류 단위는 Glc, Gal, Man, Rha, Fru, Fuc, GlcN, GalN, ManN, FruN, FucN, Mur, Neu, GlcNAc, GalNAc, ManNAc, FruNAc, FucNAc, MurNAc, NeuNAc, 시알산, 또는 이노시톨 중에서 선택된다.
제1단당류 당 및 제2단당류 당 단위는 환원 말단부터 비-환원 말단으로 순서대로 배열될 수 있으며, 제1단당류 단위에 이어 제2단당류 단위가 배열되거나, 제2단당류 단위에 이어 제1단당류가 배열된다.
일 실시 형태에서는 제1단당류 - 제2단당류 순서이다.
일 실시 형태에서는 제2단당류 - 제1단당류 순서이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 올리고당류의 이당류 모티프의 제1 및 2단당류 단위는 N- 및 O-글리칸 코어 및 그의 데스 -아세틸 형태와 연관된 단당류 단위 중에서 선택된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 제1단당류 단위는 글루코스아민 또는 갈락토스아민이고 제2단당류 단위는 만노스, 갈락토오스, 글루코스아민, 갈락토스아민, N-아세틸-글루코스아민, N-아세틸-갈락토스아민 중에서 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1단당류 단위는 글루코스아민이고 제2단당류 단위는 만노스, 갈락토오스, 글루코스아민, 갈락토스아민, N-아세틸-글루코스아민, 또는 N-아세틸-갈락토스아민, 바람직하게는 만노스 또는 글루코스아민 중에서 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1단당류 단위는 갈락토스아민이고 제2단당류 단위는 만노스, 갈락토오스, 글루코스아민, 갈락토스아민, N-아세틸-글루코스아민, 또는 N-아세틸-갈락토스아민, 바람직하게는 만노스 또는 글루코스아민 중에서 선택된다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하기 중에서 선택된 모티프를 포함하는 올리고당류를 동위 원소로 표지된 아실화제와 반응시키는 것을 포함한다:
GlcN-GlcN
Gal-GalN
GalN-GlcN
또한 단당류 단위는 환원성 및/또는 비-환원성 말단에 존재할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 모티프:
Man-GlcN-GlcN
를 포함하는 올리고당류를 동위 원소로 표지된 아실화제와 반응시키는 것을 포함한다. 또한 단당류 단위는 환원성 및/또는 비-환원성 말단에 존재할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 모티프:
Man-GlcN-GlcN
를 포함하는 올리고당류를 동위 원소로 표지된 아세틸화제와 반응시켜 Ac*가 동위 원소로 표지된 아세틸기인 모티프:
Man-GlcNAc*-GlcNAc*
를 포함하는 올리고당류를 수득한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 화학식 (A)의 올리고당류를 화학식 (B)의 올리고당류를 형성하기 적합한 조건 하에서 동위 원소로 표지된 아세틸화제와 반응시키는 것을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서:
각각의 R1은 독립적으로 H 또는 보호기이고;
R2는 독립적으로 H 또는 보호기이며;
각각의 R3은 독립적으로 H, 보호기, 또는 (Sac)m 이고, 여기서 각각의 Sac는 단당류 단위이고 m은 1 내지 50의 수이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 화학식 (C)의 올리고당류를 화학식 (D)의 올리고당류를 형성하기 적합한 조건 하에서 동위 원소로 표지된 아세틸화제와 반응시키는 것을 포함한다:
Figure pct00002
상기 식에서,
각각의 R1은 독립적으로 H 또는 보호기이고;
R2는 독립적으로 H 또는 보호기이며;
각각의 R3은 독립적으로 H, 보호기, 또는 (Sac)m 이고, 여기서 각각의 Sac는 단당류 단위이고 m은 1 내지 50의 수이다.
상기 정의된 바와 같이, 일부 실시 형태에서, 각각의 R1, R2 및 R3는 독립적으로 보호기일 수 있다. 보호기는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 R3가 보호기인 경우, 각각의 R3는 임의의 다른 보호기와 같거나 다를 수 있다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 R3는 (Sac)m 이며, 여기서 m은 1 내지 50의 수이다. 하나 초과의 R3가 (Sac)m 인 일부 실시 형태에서, 각각의 (Sac)m 는 분자 내의 임의의 다른 (Sac)m 들과 같거나 다를 수 있다.
일부 실시 형태에서, m은 1 내지 20의 수이다.
일부 실시 형태에서, m은 1 내지 10의 수이다.
일부 실시 형태에서, m은 1 내지 5의 수이다.
일부 실시 형태에서, m은 1 또는 2이다.
일부 실시 형태에서, R2는 H이다. 일부 실시 형태에서, 각각의 R3 는 H이다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 각각의 R1은 벤질이고, R2 는 H, 및 각각의 R3 는 H이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
화학식 (I)의 올리고당류를 일반식 (II)의 당 공여체로 글리코실화 하여 화학식 (III)의 올리고당류를 수득하는 단계:
Figure pct00003
(상기 식에서 각각의 P1, P2, P3, P4, 및 P5는 독립적으로 보호기이고, 또는 임의로 P4 및 P5는 함께 아세틸기를 생성한다)
(Sac)n-Sac-LG (II)
(상기 식에서 각각의 Sac는 단당류 단위이고, n은 0내지 50의 수이며, -LG는 적합한 이탈기로 프라이밍(primed) 공여체-당의 비-글리코실화된 아노머 위치를 나타낸다)
Figure pct00004
P4를 제거하여 히드록실기를 드러내고 생성된 히드록실기를 화학식 (II)의 당 공여체로 글리코실화시키는 단계;
각각의 P3 기를 제거하여 유리 아미노기를 드러내고 각각의 생성된 유리 아미노기를 동위 원소로 표지된 아세틸화제로 아세틸화시키는 단계.
일부 실시 형태에서는, n은 0내지 20의 수이다.
일부 실시 형태에서는, n은 0내지 10의 수이다.
일부 실시 형태에서는, n은 0내지 5의 수이다.
일부 실시 형태에서는, n은 0 또는 1이다.
적합한 당 공여체는 당업계에 공지되어 있고, 제한 없이, 글리코실 할로겐화물, 예를 들어, 글리코실 플루오르화물 및 브롬화물; 글리코실 인산염, 글리코실 트리할로아세티미데이트, n-펜티닐 글리코시드 (및 더욱 일반적으로, 적합한 헤미아세탈, 오소에스테르 및 1-산소-치환 글리코실 공여체) 및 티오-글리코시드를 포함할 수 있다. 당 공여체의 반응성은 존재하는 임의의 보호기의 성질에 따라 달라질 수 있다. 당 공여체는 (예를 들어, 아세틸기의 보호로) 디스암(disarmed)될 수 있고, (예를 들어, 벤질기의 보호로) 암(armed)될 수 있으며, (예를 들어, 부피가 큰 실릴기의 보호로) 슈퍼-암(super-armed)될 수 있다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 당 공여체 이탈기는 트리할로아세티미데이트기, 바람직하게는, 트리플루오로아세티미데이트기, 이를 테면, 예를 들어 하기:
Figure pct00005
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단당류 단위 A의 C2-위치를 글리코실화시켜서 2-안테나 글리칸을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단당류 단위 A의 C4-위치를 글리코실화시키는 단계를 포함한다. C4-위치의 글리코실화는 C2-위치의 글리코실화를 따라 일어나 3-안테나 글리칸을 수득하거나, 또는 이전에 C2-위치의 글리코실화 단계 없이 일어나서 2-안테나 글리칸을 수득할 수 있다. 상기 방법이 단당류 단위 A의 C2-위치 및 C4-위치 모두에서의 글리코실화를 포함하는 실시 형태에서는, 글리코실화 단계가 어느 순서로든 일어날 수 있다.
화학-선택적 글리코실화는 효소적으로-촉매화되고/되거나 선택적 보호 및/또는 보호기 전략으로 용이하게 될 수 있다.
바람직하게는, 효소적 유도체화에 사용되는 올리고당류 코어는 3 내지 9개의 단당류 단위를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 아실 할로겐화물 또는 적합한 카르복실산의 무수물일 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 동위 원소로 표지된 아세트산 무수물, 바람직하게는 (13CH3 13C=O)2, (13CH3C=O)2, (CH3 13C=O)2, (CD3C=O)2, (13CD3 13C=O)2, (13CD3C=O)2, 또는 (CD3 13C=O)2 이다. 일부 실시 형태에서는, 동위 원소로 표지된 아실화제는 (13CH3 13C=O)2 이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는, 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3, -(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3, -(C=17O)CH3, -(13C=17O)CH3, -(C=17O)13CH3, -(13C=17O)13CH3, -(C=18O)CH3, -(13C=18O)CH3, -(C=18O)13CH3, -(13C=18O)13CH3 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는, 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3, -(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3, -(C=17O)CH3, 또는 -(C=18O)CH3 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는, 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3 또는 -(13C=O)CD3중에서 선택된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는, 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, 또는 -(13C=O)CH3중에서 선택된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는, 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3 이다.
일부 실시 형태에서, 제1양태에 따른 방법은 동위 원소로 표지된 올리고당류의 아세틸-헥소스아민 단위의 유리 아노머 위치에 옥사졸린을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 생성된 동위 원소로 표지된 글리칸 옥사졸린은 동위 원소로 표지된 당접합체를 제조하는데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1양태에 따른 방법은 펩티드, 지질 또는 단백질을 글리코실화시켜, 동위 원소로 표지된 올리고당류를 포함하는 동위 원소로 표지된 당펩티드, 펩티도글리칸, 당지질, 당단백을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 제1양태에 따른 방법으로 수득할 수 있는 동위 원소로 표지된 올리고당류 또는 당접합체를 제공한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 하기 중에서 선택되는 모티프를 포함하는 글리칸을 제공한다:
Figure pct00006
상기 식에서, 각각의 Ac*는 동위 원소로 표지된다. 본원에서 사용되는 용어 글리칸은 유리 형태 또는 당접합체의 탄수화물 부분의 형성을 하는 임의의 당류를 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 상기 글리칸은 모티프:
Figure pct00007
를 포함하고, 여기서 각각의 Ac*는 동위 원소로 표지된다.
일부 실시 형태에서, 각각의 Ac*는 존재하는 경우, -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3, -(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3, -(C=17O)CH3, 또는 -(C=18O)CH3 중에서 선택된다.
일부 실시 형태에서, 상기 글리칸은 하나 이상의 추가의 단당류 단위들을 포함하고, 각각의 추가의 단당류는, 존재하는 경우, 독립적으로 동위 원소로 표지될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 추가의 단당류 단위의 수는 10 초과이다.
일부 실시 형태에서, 추가의 단당류 단위의 수는 30 초과이다.
일부 실시 형태에서, 추가의 단당류 단위의 수는 50 초과이다.
일부 실시 형태에서, 추가의 단당류 단위의 수는 100 초과이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 글리칸을 제공한다:
Figure pct00008
.
이 구조는 효소적 유도체화가 다양한 동위 원소로 표지된 N-글리칸을 제공하기에 특별히 적합한 코어 올리고당류 기질이다.
각각의 Ac*가 -(13C=O)13CH3 일 때, 상기 구조는 본원에서 13 C 8 -G0으로 언급된다. 본원에 기재된 바와 같이, 반-보호된 코어 올리고당류를 기질로서 효소적 유도체화 반응에 사용하는 것에 이점이 있을 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, GlcNAc*-GlcNAc* 환원성 말단의 5개의 히드록실 모이어티(moiety)가 임의로 치환된 벤질기를 갖는다. 각각의 Ac*가 -(13C=O)13CH3 이고 이들 5개의 히드록실 각각이 PhCH2- 모이어티를 가질 때, 상기 구조는 본원에서 13 C 8 -G0( Bn 5 )으로 언급된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 동위 원소 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 샘플에 추가하여 도핑된(doped) 샘플을 수득하는 단계, 및 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하는 단계를 포함하여, 샘플에서 글리칸을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 글리칸은 본 발명에 따른 및/ 또는 본원에 기재된대로 수득된 동위 원소로 표지된 글리칸이다.
바람직하게는, 태그된 표준물은, 샘플에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸의 이소토폴로그인 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그된 표준물은 하나 초과의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 초과의 태그된 표준물은 샘플에 첨가되어 도핑된 샘플을 수득할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 초과의 동위 원소로 표지된 글리칸은 첨가되어 샘플 중 다수의 글리칸의 동시 확인을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 방법의 종래 기술에 대비한 이점은, 태그를 삽입하기 위한 샘플 중의 글리칸 태깅이 필요하지 않아서, 태깅 과정의 재현가능성과 부반응의 문제를 방지할 수 있다는 것이다. 추가로, 당업계에 공지된 방법에 존재할 수 있는 실험적 가변성의 근원은, 동위 원소로 표지된 글리칸(들)(태그된 표준물) 및 분석물(들)이 같은 실험에서 분석되고 동일한 과정으로 처리됨으로써, 상쇄된다. 각각의 동위 원소로 표지된 글리칸은 상응하는 분석물과 같은 효율로 이온화하지만, 그의 고정된 질량 증분으로 쉽게 확인된다. 일부 실시 형태에서, 태그된 표준물은 미리 결정된 질량 분광 스펙트럼을 가지며, 이는 동위 원소로 표지된 글리칸과 연관된 이온 피크가 쉽게 확인될 수 있게 함으로써 도핑된 샘플 중의 분석을 도울 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 글리칸 및 동위 원소로 표지된 글리칸과 연관된 이온 피크의 상대적 강도를 비교함으로써 샘플 중의 글리칸의 함량이 정량화될 수 있도록, 동위 원소로 표지된 글리칸의 공지된 존재비가 샘플에 첨가된다. 글리칸 함량의 정량화와 관련된 추가의 세부점이 하기에 제공된다. 따라서, 동위 원소로 표지된 글리칸의 공지된 존재비의 첨가를 통해, 심지어 복합 생체액(biofluid)에서도 분석물이 절대치로 정량화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 하나 초과의 글리칸이 첨가되어, 샘플 중 다수의 글리칸의 동시 확인과 정량화를 용이하게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은
(i) 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
(ii) 상기 태그된 표준물을 샘플에 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
(iii) 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크들을 수득하는 단계;
(iv) 태그된 표준물과 연관된 이온 피크들의 정체(identity) 및 강도를 도핑된 샘플 중의 스펙트럼 내의 추가된 이온 피크들과 비교하는 단계
를 포함한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 태그된 표준물은 샘플 중의 의심되는 글리칸 함량과 상응하도록 선택된다. 예를 들어, 제한하지 않는 방식으로, 샘플이 3종의 글리칸을 포함하는 것으로 의심되면, 이들 3종 글리칸의 이소토폴로그를 포함하는 태그된 표준물이 선택된다.
글리칸(들)은 도핑된 샘플을 분석하기 전에 유도체화될 수 있다. 유도체화 단계는, 예를 들어, 과메틸화 또는 시알산 잔기의 유도체화(존재하는 경우)를 포함할 수 있고, 클린-업(clean-up) 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유도체화는 시암산 또는 다른 말단 당 단위를 제거하기 위한 글리코시다제 처리를 포함한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 질량 분광법은 MALDI-ToF, 직접 주입 ESI-ToF 또는 LC-MS이고, 탠덤(tandem) 질량 분광법에 의한 단편화(간혹 MS-MS로 불림)를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 분석물 확인을 용이하게 하고, 복합 혼합물의 동중(isobaric) 분석물이 구별되게 한다. 단편화는, 예를 들어, 충돌 유도 해리 (CID), 전자 포획 해리 (ECD), 전자 전달 해리 (ETD), 적외선 다광자 해리 (IRMPD), 흑체 적외선 방사성 해리 (BIRD), 전자-분리 해리 (EDD) 또는 표면-유도 해리 (SID), 또는 임의의 다른 적합한 방법으로 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 복합 생체액이고, 샘플 중의 글리칸은, 예를 들어, 재조합 당단백 또는 항체로부터 방출된 글리칸일 수 있다. 샘플 중의 글리칸은 의학적 질병 또는 장애 또는 생물학적 과정과 연관되는 바이오마커일 수 있으며, 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 의학적 질병 또는 장애 또는 생물학적 과정의 지표로서 하나 이상의 글리칸의 존재 또는 양을 연관시키는 것을 추가로 포함한다. 제한 없이, 의학적 질병 또는 장애는 암, 심혈관계 질환, 염증성 피부병, 진성 당뇨병, 위장관 질환, 간 질환, 빈혈, 면역학적 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염을 포함하는 관절염, 감염 질환, 신장병, 신경계 질환, 폐 질환 또는 글리코실화의 선천성 장애 중에서 선택될 수 있다.
이러한 방법은 시험관에서 수행될 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 글리칸과 연관된 질병을 가진 것으로 의심되는 환자를 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 글리칸을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계;
(ii) 질병과 연관된 글리칸에 상응하는, 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
(iii) 샘플에 상기 태그된 표준물을 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
(iv) 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크를 수득하는 단계;
(v) 태그된 표준물과 연관된 이온 피크의 정체(identity)및 강도를 도핑된 샘플 중의 스펙트럼 내의 추가의 이온 피크와 비교하는 단계;
(vi) 상기 글리칸의 존재로 질병 또는 장애의 진단을 지원하는 단계
를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 진단 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 동위 원소로 표지된 글리칸을 제공하며, 상기 방법은
(i) 환자로부터 질병 또는 장애와 연관된 글리칸을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계;
(ii) 질병 또는 장애와 연관된 글리칸에 상응하는, 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
(iii) 샘플에 상기 태그된 표준물을 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
(iv) 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크를 수득하는 단계;
(v) 태그된 표준물과 연관된 이온 피크의 정체 및 강도를 도핑된 샘플 중의 스펙트럼 내의 추가의 이온 피크와 비교하여, 샘플내의 하나 이상의 글리칸의 존재를 확인하고, 및 임의로 정량화하는 단계;
(vi) 하나 이상의 글리칸의 존재로 질병 또는 장애를 진단하는 단계
를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 진단 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 동위 원소로 표지된 글리칸을 제공하며, 상기 방법은
(i) 질병 또는 장애와 연관된 글리칸에 상응하는 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
(iii) 태그된 표준물을 환자에게서 체취된 샘플에 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
(iv) 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크들을 수득하는 단계;
(v) 태그된 표준물과 연관된 이온 피크들의 정체 및 강도를 도핑된 샘플 중의 스펙트럼 내의 추가된 이온 피크들과 비교하여, 샘플내의 하나 이상의 글리칸의 존재를 확인하고, 및 임의로 정량화하는 단계;
(vi) 하나 이상의 글리칸의 존재로 질병 또는 장애를 진단하는 단계
를 포함한다.
환자에게서 체취하는 샘플은 당업계에 공지된 방법으로 체취될 수 있다. 적합하게는, 환자로부터 수득된 생물학적 물질 내의 글리칸(들)은 단백질 골격에 접합될 수 있으므로, 환자로부터 생물학적 물질을 수득하고 단백질 골격으로부터 효소적 또는 화학적 (히드라진 분해) 처리를 통해 글리칸을 떼어냄으로써 샘플이 수득될 수 있다. 적절하게는, 생성된 물질은 정제될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 샘플에서 글리칸을 확인하기 위한 키트(kit)를 제공하며, 상기 키트는
(a) 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물; 및
(b) 글리칸을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 태그된 표준물로 도핑하여 도핑된 샘플을 수득하고 상기 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하기 위한 지침을 포함한다.
임의로, 키트는, 태그된 표준물과 연관된 이온 피크의 용이한 확인을 통해 샘플 중 분석물의 확인을 용이하게 할 수 있는, 태그된 표준물에 대한 질량 분광측정 데이터를 포함한다.
상기 지침은 태그된 표준물과 연관된 이온 피크와 질량 스펙트럼 내의 추가된 이온 피크를 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 태그된 표준물은 특정한 질병, 장애 또는 생물학적 과정과 연관된 배합물로 공지된 동위 원소로 표지된 글리칸의 혼합물이다.
본 발명의 실시 형태가 첨부된 도면으로 참조하여 예시적으로 제한 없이 기재될 것이다. 그러나 본 발명의 다양한 추가적인 양태 및 실시 형태가 본 기재에 비추어 당업계의 기술자에게 분명할 것이다.
본원에서 사용되기로는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 없이 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각에 대한 특정한 기재로 사용된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각이 개별적으로 본원에 나열되는 것처럼 각각에 대한 특정한 기재로 사용된다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 내용의 기재사항 및 정의는 발명의 임의의 특정한 양태 또는 실시 형태로 제한되지 않으며, 기재된 모든 양태 및 실시 형태에 동일하게 적용된다.
도 1. 동위 원소로 표지된 글리칸 및 상응하는 분석물과 연관된 이온 피크를 보여주는 도핑된 샘플 중의 질량 스펙트럼의 대표적인 부분. 피크는 샘플 중 태그된 표준물의 동위 원소로 표지된 글리칸 및 상응하는 분석물 글리칸과 연관된 이온 피크의 측정된 강도를 보여준다.
도 2. 동위 원소로 표지된 N-글리칸을 제공하는 효소적 신장 단계의 가능한 조합의 도식도.
도 3. 각각의 아세틸기가 13C2-동위 원소로 표지될 때, 동위 원소로 표지된 [(2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스의 합성.
도 4. 각각의 아세틸기가 13C2-동위 원소로 표지될 때, 동위 원소로 표지된 3-안테나 [(2-아세타미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-α-D-만노피라노실]-(1→6)-[디-(2-아세타미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-(1→4)-α-D-만노피라노실]-(1→3)-b-D- 만노피라노실 -(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-b-D-글루코피라노실-(14)-2-아세타미도-1,3,6-트리-O-벤질-2-데옥시-b-D- 글루코피라노시드의 합성.
도 5. 화학-효소적 합성으로 수득된 글리칸: 13C8-G0의 효소적 절단.
도 6. 화학-효소적 합성으로 수득된 글리칸: 13C6-MGn3의 푸코실화.
정의
동위 원소로 표지됨
본원에 사용된 바와 같이, 동위원소 표지, 동위 원소로 표지된 및 기타 유사한 용어는 당업계에서 이해되는 바 대로 사용된다. 특정하게, 동위 원소로 표지된 화합물은, 공지된 위치의 적어도 하나의 원소가 그 원소에 대해 자연-발생적으로 가장 풍부한 동위 원소 이외의 동위 원소로 강화된 화합물이다. 예를 들어, 메탄은 13C-동위 원소로 표지될 수 있고, 13CH4 의 구조를 가지거나 중수소로 표지될 수 있다. 중수소로 표지된 메탄은 메탄과 연관된 4개의 수소 원자 위치 중 하나 이상이 2H (D)로 강화된 화합물을 가리킬 수 있다. 일반적인 중수소로 표지된 메탄 구조는 CDH3 및 CD4를 포함한다.
동위 원소로의 표지는 천연 양 이상으로 동위 원소를 강화시키는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 강화된 위치의 동위 원소 순도는 50%이상이다. 예를 들어, 13C-동위 원소로 표지된 메탄에서, 이는 50% 이상의 개별 분자가 13C원자를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 실시 형태에서, 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 바람직하게는 80% 이상이다. 더욱 바람직하게는 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 90% 이상이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 95% 이상이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 97% 이상이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 98% 이상이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 강화된 위치(들)에서 동위 원소 순도는 99% 이상이다.
아실기
본원에 사용된 바와 같이, 아실기는 카르복실산으로부터 히드록실기를 제거하여 유도되는 작용기이다. 일반적인 아실기는 포르밀 (메타노일), 아세틸 (에타노일), 프로피오닐 (프로파노일), 벤조일, 및 아크릴로일 (프로페노일)을 포함한다. 생물학적으로 관련된 기타 아실기는, 다음으로 제한되지 않으며, 히드록시에타노일 (글라이콜릴)및 C4-18-지방산에서 유도된 아실기 (예를 들어, 부타노일, 헥사노일, 옥타노일, 데카노일, 등) 및 히드록실화된 지방산을 포함한다.
아실화는 아실화제를 사용하여 화합물에 아실기를 첨가하는 과정이다. 본 발명과 관련하여, 아실화는 친핵성 작용기, 예를 들어, 아미노기 또는 히드록실기에서 일어난다. 하나 초과의 친핵성기가 존재할 때, 아실화되는 순서는 친핵성도 및 입체 인자에 따라 결정된다. 일반적인 아실화제는 아실 염화물 및 아실 무수물을 포함한다.
동위 원소로 표지된 아실화기는, 본원에 정의된 바와 같이, 공지된 위치의 적어도 하나의 원자가 상기 원자와 관련하여 자연-발생되는 가장 풍부한 동위 원소 이외의 동위 원소로 강화된 기이다. 예는, 다음으로 제한됨이 없이, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 벤조일 및 아크릴로일기의 12C, 13C, 14C, 16O, 18O, H 및 D를 포함한다. 기타 동위 원소로 표지된 아실기도 또한 본 발명에 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 동위 원소로 표지된 히드록시에타노일기(이를 테면, 예를 들어, 1-13C1- 또는 13C2-히드록시에타노일)가 N-글리코일뉴라민산 단위를 포함하는 글리칸의 이소토폴로그는 제공하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 지방산으로부터 유도된 동위 원소로 표지된 아실기도, 예를 들어, 지질 A의 이소토폴로그를 제공하는데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실기는 동위 원소로 표지된 아세틸기이다. 바람직한 동위 원소로 표지된 아세틸기 Ac*는
-(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3,
-(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3,
-(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3,
-(C=17O)CH3, 또는 -(C=18O)CH3를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아세틸기 Ac*는 -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, 또는 -(13C=O)CH3 중에서 선택된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에서 동위 원소로 표지된 아세틸기 Ac*는 -(13C=O)13CH3이다.
본원에서 사용된 바와 같이 아실화제는 당업계에서 이해되는 바와 같이 아실기를 제공하는 화학적 시약으로 사용된다. 비록 다른 아실화제 및 방법이 당업계의 숙련된 기술자에게 분명하지만 아실화제와 방법이 일반적으로 사용되는 아실화제는 아실 염화물 및 카르복실산 무수물을 포함하며, 예를 들어 카르복시와 적합한 결합 시약 간의 반응 산물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 아실 염화물이다. 적합한 아실 염화물은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 당업계에 공지된 방법으로, 예를 들어, 상응하는 카르복실산을 티오닐 염화물 또는 옥살릴 염화물로 처리하여 수득될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 카르복실산의 무수물이며, 바람직하게는 아세트산의 무수물이다. 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 (13CH3 13C=O)2, (13CH3C=O)2, (CH3 13C=O)2, (CD3C=O)2, (13CD3 13C=O)2, (13CD3C=O)2, 또는 (CD3 13C=O)2 중에서 선택된다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 아실화제는 (13CH3 13C=O)2이다.
일부 실시 형태에서, 14C-아실화제, 바람직하게는 14C-표지된 아세트산 무수물이 사용될 수 있다. 14C 로 표지된 생성된 글리칸은 방사선 사진 촬영을 이용하는 글리칸 정량화에 표준물로서 이점을 가질수 있다.
보호기
본원에 사용된 바와 같이, 보호기는 후속 반응 동안 화학-선택성을 수득하고 후속 반응 동안 원치 않는 분해 또는 부반응을 방지하기 위해 작용기의 화학적 변형을 통해 분자에 도입되는 모이어티를 나타낸다. 보호기는 마스킹된 또는 마스킹하는기 또는 차단된 또는 차단하는기를 나타낼 수 있다. 반응성 작용기를 보호함으로써, 보호기에 영향을 주지 않으면서 다른 비보호 반응성 작용기를 수반하는 반응이 수행될 수 있고; 대부분 후속 단계에서, 분자의 나머지 부분에 상당한 영향을 주지 않으면서, 보호기는 제거될 수 있다. 예를 들어, 'Protective Groups in Organic Synthesis' (T. Green and P. Wuts, Wiley, 1999)를 참고한다.
보호기의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 다음의 예는 제한을 위해서가 아니라 예시를 위해 제공된다.
예를 들어, 히드록시기는 에테르 (-OR) 또는 에스테르 (-OC(=O)R), 예를 들어, t-부틸 에테르; 메톡시메틸 (MOM) 또는 메톡시에톡시메틸 (MEM) 에테르; 벤질 (Bn), 벤즈히드릴 (디페닐메틸), 또는 트리틸 (트리페닐메틸) 에테르; 트리메틸실릴 또는 t-부틸디메틸실릴 에테르; 또는 아세틸 에스테르 (-OC(=O)CH3, -OAc) 또는 벤조일 에스테르 (-OC(=O)Ph, Bz)로 보호될 수 있다.
예를 들어, 알데히드 또는 케톤기는 각각 아세탈 또는 케탈로 보호될 수 있으며, 이때 카르보닐기(>C=O)는 예를 들어, 일차 알코올과의 반응에 의해 디에테르(>C(OR)2)로 변환된다. 티오-아세탈 및 티오-케탈 또한 당업계에 공지되어있다.
예를 들어, 다가의 모이어티는 아세탈기로 보호될 수 있으며, 이때 예를 들어 서로 인접한 탄소 원자상의 2개의 히드록실기는 (HO-CR2CR2-OH; 종종 글리콜기로 불림) 알데히드 또는 케톤과 반응하여 하기와 같이 -O-CR2-O- 연결을 포함하는 고리를 형성한다.
Figure pct00009
아세탈은 전형적으로 탈수 조건[예를 들어, 딘-스타크(Dean-Stark) 조건 하 또는 속슬렛 추출기를 사용하여] 하에서 산촉매를 사용하여 형성되며 산촉매 및 과량의 물, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 제거될 수 있다.
예를 들어, 아미노기는 아미드 또는 우레탄, 예를 들어, 메틸 아미드 (-NHCO-CH3); 벤질옥시 아미드 (-NHCO-OCH2C6H5, -NH-Cbz); t-부톡시 아미드 (-NHCO-OC(CH3)3, -NH-Boc); 2-바이페닐-2-프로폭시 아미드 (-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5, -NH-Bpoc), 9-플루오레닐메톡시 아미드 (-NH-Fmoc), 6-니트로베라트릴옥시 아미드 (-NH-Nvoc), 2-트리메틸실릴에틸옥시 아미드 (-NH-Teoc), 2,2,2-트리클로로에틸옥시 아미드 (-NH-Troc), 알릴옥시 아미드 (-NH-Alloc), 2(-페닐설포닐)에틸옥시 아미드 (-NH-Psec); 또는, 적합한 경우, N-옥사이드 (>NO-) 또는 아지드로서 보호될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 헥소스아민 당 공여체 내의 아민 작용기는 프탈이미드, TRoc, 트리클로로아세틸, 디메틸아세틸기에 의해 보호된다. 이는 글리코시드 결합의 β-선택적 형성을 용이하게 하고, 이러한 반응들에서 원치 않는 옥사졸린 형성을 방지한다. 일부 실시 형태에서, 아민 작용기는 α-글리코시드 결합의 입체 선택적 형성을 용이하게 할 수 있는 아지드로 보호될 수 있다.
예를 들어, 카르복실산기는 에스테르며, 예를 들어, C1-7 알킬 에스테르 (예를 들어, 메틸 에스테르; t-부틸 에스테르); C1-7 할로알킬 에스테르 (예를 들어, C1-7 트리할로알킬 에스테르); 트리C1 -7 알킬실릴-C1-7 알킬 에스테르; 또는 C5-20 아릴-C1-7 알킬 에스테르 (예를 들어, 벤질 에스테르; 니트로벤질 에스테르); 또는 아미드, 예를 들어, 메틸 아미드로 보호될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 올리고당류 및 올리고당류-포함 구조물을 조립하기 위해 직교(orthogonal) 보호기 전략을 사용한다. 직교 보호는 당업계에 공지된 전략이며, 분자 중의 다른 위치의 반응기에 영향을 미치는 반응 조건들의 전용 세트를 이용하여 분자에서 하나 이상의 작용기를 탈보호할 수 있도록 다수의 보호기의 신중한 선택을 포함한다. 예를 들어, 사용되는 추가의 보호기는 수소화 조건 (예를 들어, 벤질 에테르)을 사용하여 제거될 수 있는 한편, 사용되는 하나의 보호기는 산불안정할 수 있고(예를 들어, 아세탈), 사용되는 다른 보호기는 베이스불안정할 수 있다(예를 들어, FMOC기). 본원에 기재된 바와 같이, 구조물 내의 다수의 위치에 각각 독립적으로 보호기가 있을 때, 상기 보호기는 같거나 다를 수 있다. 상이한 보호기는 서로 직교하고, 그 결과 다른 보호기의 존재 하에서 하나의 보호기의 선택적 탈보호를 통한 화학-선택적 반응을 용이하게 할 수 있다. 단지 예로써, 하기 모티프
Figure pct00010
를 포함하는 올리고당류 (여기서 각각의 R3는 독립적으로 보호기이다)에서, 각각의 R3는 동일한 타입의 보호기일 수 있고, 또는 각각의 R3는 독립적으로 임의의 다른 R3기와 같거나 다를 수 있다. 직교하는 R3 보호기를 사용함으로써, C2, C3, C4 또는 C6에서 선택적 탈보호 및 반응이 일어날 수 있다.
동위 원소 희석을 이용한 농도 계산
본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 의해 제공된 동위 원소로 표지된 글리칸은 샘플 중의 관심 분석물, 예를 들어, 천연 글리칸의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 적합한 샘플은 단백질, 천연 당접합체, 및 재조합 단백질 생성 산물로부터 방출된 글리칸을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일부 방법에서, 적어도 하나의 글리칸을 포함하는 것으로 의심되는 샘플은, 예를 들어, 히드라진 분해 또는 펩티드 글리코시다아제를 이용한 효소적 절단으로 단백질로부터 방출된 후에 수득된다. 상기 샘플에, 공지된 존재비의 "태그된 표준물"을 첨가하여 도핑된 샘플을 수득한다. 태그된 표준물은 공지된 농도의 적어도 하나의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하고, 일부 실시 형태에서는 모든 성분들에 대해 공지된 농도를 갖는 동위 원소로 표지된 글리칸의 혼합물을 포함한다.
이어서 도핑된 샘플은 스펙트럼을 수득하기 위해 질량 분광법으로 분석된다. 임의로, 분석과 수득 동안, 선택된 이온의 단편화에 대한 정보가 수득될 수 있다. 상기 단편화 분석은 관심 글리칸의 전체적 구조 및 존재하는 결합의 상대적 및 절대적 약함을 모두 결정하는데 도움을 줄 수 있다. 이것은 동위 원소로 표지된 단당류 단위가 동위 원소로 표지된 글리칸의 올리고당류 서열의 하나 이상의 미리 정해진 위치에, 예를 들어, 본원에 기재된 대로 화학-효소적 방법을 이용하여, 도입되는 본 발명의 방법 및 실시 형태에 특별한 관련성이 있다.
이어서 수득된 스펙트럼의 이온 피크가 할당되고(고정된 질량 증분으로 확인가능함) 태그된 표준물과 연관되어 있다고 알려진 이온 피크와 비교를 통해 정량화될 수 있다.
예를 들어, [(2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스를 모티프로 가지는 특정 천연 N-글리칸은, 7당류 모티프 중의 아세틸기가 각각 13C2-동위 원소로 표지된 이소토폴로그를 포함하는 태그된 표준물(이는 본원에 기재된 대로 수득될 수 있다) 을 사용하여 확인될 수 있다. 이는 천연 N-글리칸에 비교하여 질량이 8 Da 증가된, 그러나 상응하는 연관된 질량 분광법 이온 엔벨로프(envelope)(도 1에 도시됨)를 갖는 동위 원소로 표지된 N-글리칸을 초래한다.
또한, 분석물 글리칸의 양은 이온 피크 강도 비교를 통해 정량화 될 수 있으며, 이로써 분석물 글리칸의 양이 정량화 되도록 한다(각각의 이소토폴로그의 피크 강도는 샘플 중 양에 비례한다). 동위 원소로 표지된 글리칸이 상응하는 분석물 글리칸과 같은 효율로 이온화되므로, 상대적 강도는 그들의 상대적 농도에 비례한다(수학식 1). 상기 방법은 또한 다수의 글리칸을 포함하는 복합 혼합물 중의 분석물을 양과 상대적인 존재도(abundance)의 관점에서, 정량화한다. (수학식 2, 3 및 4) 본 발명의 방법과 이러한 수학식들을 사용함으로써 복합 혼합물 중의 분석물이 정량화될 수 있다. 수학식 1 내지 4의 사용은 본 발명의 방법에 일반적으로 적용가능하며 수학식 1 내지 4가 제한 없이 상기 예시적 방법을 참조하여 설명되는 것이 이해될 것이다. 간단히 하기 위해, "라이트(light)"는 동위 원소로 표지되지 않은 글리칸을 나타내고 "해비(heavy)"는 상응하는 더 높은 분자량의 동위 원소로 표지된 글리칸을 나타낸다.
Figure pct00011
"라이트" 이소토폴로그 i의 피크 강도
Figure pct00012
"해비" 이소토폴로그 j의 피크 강도
Figure pct00013
"라이트" 이소토폴로그 i의 양
Figure pct00014
"해비" 이소토폴로그 j의 양
Figure pct00015
샘플 중 "라이트" 글리칸 i의 총량
Figure pct00016
샘플 중 "해비" 글리칸 j의 총량
Figure pct00017
동위 원소로 표지되지 않은 분석물 글리칸 중의 "라이트" 이소토폴로그 i의 상대적인 존재도
Figure pct00018
동위 원소로 표지된 샘플 중 "해비" 이소토폴로그 j의 상대적인 존재도
[수학식1]
Figure pct00019
[수학식 2]
Figure pct00020
[수학식 3]
Figure pct00021
[수학식 4]
Figure pct00022
상기 수학식이 상응하는 "해비" 이소토폴로그 표준물과 비교로 샘플 중의 글리칸에 대한 합리적인 정량화를 제공하지만, 특정 피크가 포화 농도에서 검출되는 복합 혼합물과 스펙트럼에 대해서는 더욱 상세한 방법이 바람직할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 만일 표준물의 가장 풍부한 피크가 포화되었다면, 그 피크를 상기 수학식에 단순 사용하는 것은 부정확한 정량화를 제공할 수 있다. 상기 문제를 해결하기 위해, 동위 원소 희석 분석에 대한 상세한 설명이 하기에 제공된다(샘플중의 글리칸 농도 계산을 위한 내부 표준물 이소토폴로그의 선형성과 선택 연구). 상기 방법은 함수를 추정하기 위해 상이한 "해비" 이소토폴로그와 연관된 이온 피크를 사용한다. 상기 함수는 정량화되야 하는 피크의 피크 강도를 상기 피크와 연관된 이소토폴로그의 양과 관련시켜서 이러한 잠재적인 부정확성을 경감시키는데 사용될 수 있다. 다시 한번, 이하는 설명을 위해 제한 없이 제공된다.
I. 선형성 결정
샘플에 첨가된 소정의 글리칸 (m T *)에 대한 "해비" 이소토폴로그의 총량과 "해비" 이소토폴로그 각각의 구성요소의 상응하는 상대적인 존재도 (X j *)을 알 때, 수학식 3을 사용하여 샘플 중의 각각의 "해비" 이소토폴로그의 양 (m j *)을 계산하는 것이 가능하다. 이것은, 예를 들어, 상이하게 동위 원소로 표지된 아세틸기를 갖는 상이한 합성 “해비” 이소토폴로그, 및/또는 소정의 "해비" 글리칸의 동위 원소 엔벨로프와 연관된 다양한 피크를 설명할 수 있다. 적합하게는, 동위 원소 엔벨로프와 연관된 다양한 피크가 사용된다. 이러한 동위 원소 엔벨로프의 이론적인 존재비는 분자의 실험식에 주어지는 경우 확률로서 계산되는, 다양한 동위 원소의 공지된 천연적 존재비로부터 유도될 수 있다.
동위 원소로 표지된 표준물 중의 글리칸에 대한 이러한 상이한 "해비" 이소토폴로그에 대해 수득된 이온 피크 강도 (I j *) 및 그의 상대적인 존재비 (m j *)을 이용해, 피크 강도와 글리칸 양을 연관시키는 함수가 선형 회귀법으로 계산될 수 있다(I 는 m의 함수):
[수학식 5]:
Figure pct00023
(여기서, 최소제곱법 맞춤(minimum least squares fit)으로 계산한 계수 b 및 a는, 각각, 기울기 및 절편에 상응한다) (수학식 6 및 7)
[수학식 6]:
Figure pct00024
[수학식 7]:
Figure pct00025
결정자 R 2 의 계수는 또한 계산되고 핏팅 품질(fitting quality)의 척도로 사용될 수 있다. 만일 R 2 가 소정의 값보다 낮다면, 예를 들어, R 2 가 0.99보다 낮으면, 가장 풍부한 "해비" 이소토폴로그에 상응하는 측정점은 폐기될 수 있고 함수와 R 2 는 선형 회귀법으로 다시 계산된다. 이런 과정은 R 2 에 대해 정의된 모든 선형성 조건이 맞을 때까지 반복될 수 있다. 이런 반복적인 과정은 함수의 정확성을 향상시킨다.
일단 적합한 R 2 를 갖는 함수가 수득되면, 정의된 선형성 범위가 최대 및 최소 피크 강도 및 상응하는 글리칸 이소토폴로그 양 값의 제한 범위이다. 이러한 선형 범위안의 모든 피크는 매우 정확한 정량화를 허용하는 충분한 품질로 여겨질 수 있다.
II. 샘플에서 동위 원소로 표지되지 않은 글리칸의 양의 계산
기재되는 바와 같이, 선형 함수는 태그된 표준물 "해비" 글리칸 이소토폴로그 혼합물의 공지된 특성을 이용하여 수득될 수 있다. 이러한 "해비" 글리칸은 이전에 확립된 선형 범위 안의, 적합한 최소 신호 대 잡음 비, 예를 들어, 5 초과의 피크 강도를 제공해야 한다.
이런 방법으로, 상기 기준을 만족시키는 (최대 및 최소 피크 강도 내의) 개별 "라이트" 글리칸 이소토폴로그의 양 (mi)은 상기 기재된 방법으로 수득된 함수로부터 계산되고 상기 기재된 선형 회귀 반복 향상법으로 향상될 수 있다.
[수학식 8]:
Figure pct00026
"라이트" 글리칸 자체는 그의 모 질량 분광 피크 (예를 들어, 13C 의 천연 존재비)와 연관된 동위 원소 엔벨로프를 가지기 때문에, 분석물 글리칸의 더욱 정확한 총량 분석은 상기 "정확한 질량"의 이소토폴로그의 이론적인 천연 존재비 (Xi) (이는 존재하는 동위 원소의 통계적 확률을 사용하여 쉽게 이론적으로 계산될 수 있다)를 이용해 이를 보정한다.
따라서, "라이트"의 이소토폴로그의 양 (m i )이 계산되고, 상기 이소토폴로그의 상대적인 존재도 (X i )을 알면, 샘플 중의 분석물 글리칸 (m T )이 계산될 수 있다.
[수학식 9]:
Figure pct00027
따라서, 일부 실시 형태에서, 샘플 중의 분석물 글리칸의 함량을 정량적으로 결정하는 방법은 다수의 상기 분석물 글리칸에 대한 "해비" 이소토폴로그를 포함하는 태그된 표준물을 사용할 수 있고, 상기 방법은
(i) 각각의 "해비" 이소토폴로그 (I j *)와 연관된 이온 피크의 상대적 강도를 상기 표준물 (m j *) 내의 공지된 존재비의 글리칸과 서로 연관시켜 m j 의 선형 함수로서의 I j 를 수득하는 단계;
(ii) 임의로 상기 연관성에 대한 결정자 R 2 의 계수를 계산하고 R 2 의 값이 예정된 값보다 큰 경우 가장 많은 이온 피크를 디스카운트하는 단계;
(iii) 임의로 단계 (ii)를 한 번 이상 반복하는 단계;
(iv) 상기 함수를 사용하여 분석물 글리칸의 "라이트" 이소토폴로그의 양을 계산하는 단계;
(v) 임의로 분석물 글리칸의 "라이트" 이소토폴로그의 총량을 사용하여 존재하는 분석물 글리칸의 총량을 결정하는 단계를 포함한다.
적합하게는, R 2 값은 0.99보다 크거나 같을 수 있다.
또한, 본 발명은 샘플 중의 "라이트" 이소토폴로그를 확인하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은, 복수의 상응하는 "해비" 이소토폴로그 (동위 원소로 표지됨)를 포함하는 태그된 표준물의 공지된 존재비을 첨가하는 것을 포함한다.
상기 정량화는
(a) 각각의 해비 이소토폴로그 (I j *)와 연관된 이온 피크의 상대적 강도를 상기 표준물 (m j *) 내의 공지된 존재비의 이소토폴로그와 서로 연관시켜 m j 의 선형 함수로서의 I j 를 수득하는 단계;
(b) 임의로 상기 연관성에 대한 결정자 R 2 의 계수를 계산하고 R 2 의 값이 예정된 값보다 큰 경우 가장 많은 이온 피크를 디스카운트하는 단계;
(c) 임의로 단계 (ii)를 한 번 이상 반복하는 단계;
(d) 상기 함수를 사용하여 분석물 샘플 중의 "라이트(light)" 이소토폴로그의 양을 계산하는 단계;
(e) 임의로 "라이트" 이소토폴로그의 총량을 사용하여 존재하는 분석물 글리칸의 총량을 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 동위 원소로 표지된 형태의 임의의 적합한 분자에게 적용될 수 있으며, 상기 방법이 본원에 기재된 글리칸 표준물에 적합하지만 반드시 글리칸 분자에게만 제한되지는 않는다는 점이 인식될 것이다.
단편화
질량 분광 실험 동안 분자 단편 이온의 생성 및 분석은 구조 결정에서 상당한 유용성이 있다. 그러한 단편 이온을 생성하고 검출하는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 제한 됨이 없이, 충돌 유도 해리 (CID) 및 탠덤(tandem) 질량 분광법(달리 또한 MS/MS 및 MS2로 불림)을 포함한다. 이러한 단편의 분석과 정량화는 부분 또는 전체 구조의 결정을 도울 수 있고, 동일한 개념의 분자량을 갖는 다른 분자의 존재하에 소정의 분자를 검출하는데 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 분야와 관련하여, 단편 분석은 또한 분석물의 더 약한 결합 연결을 확인하고 동중 구조물을 구별하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 단당류 단위는, 예를 들어, 본원에 기재된 효소적 신장 방법을 사용하여 글리칸 구조물에 화학-효소적으로 삽입된다. 단편화 패턴의 생성을 위한 이들 글리칸의 사용은 질량 분광 기술을 사용하여 동중 글리칸 구조물을 구별하는데 특별한 가치가 있다. 이는 진단 단편의 확인 및/또는 지정 및/또는 특정 이성질체의 가장 약한 연결의 결정을 통해 달성될 수 있다.
당 약어
본원에 사용된 당류 약어는 당업계에서 일반적으로 이해되는 것이 사용되었다. 접미사 "N"은 상응하는 아미노 당을 지칭하며, " NAc "는 상응하는 N-아세틸 아미노 당을 지칭한다.
Glc - 글루코오스
Gal - 갈락토오스
Man - 만노스
Rha - 람노오스
Fru - 프룩토오스
Fuc - 푸코오스
Mur - 무람산
Neu - 뉴라민산
Kdo - 케토-데옥시옥투로소네이트
글리칸
상기 용어 글리칸은 유리 형태 또는 당단백, 프로테오글리칸, 또는 당지질 같은 당접합체의 탄수화물 부분을 형성하는, 임의의 당류(단-, 올리고- 또는 다당류)를 나타내는데 사용할 수 있다. 글리칸은 사실상 모든 생물학적 구조물 및 과정에 연관되는 중요한 분자이다. 구성 단당류는 핵 또는 아미노산에 비해 훨씬 큰 조합의 다양성을 생성하고, 추가의 다양성이 글리칸의 공유결합 변형으로부터 일어난다. 따라서 소정의 유기체의 총 글리칸 레퍼토리 (글리콤)는 게놈 또는 프로테옴에 비해 훨씬 더 복잡하고 역동적이다.
단당류 사이의 연결은 α- 또는 β- 형태일 수 있으며, 사슬은 선형 또는 분지형일 수 있고, 글리칸 변형은 아세틸화 및 황산화를 포함할 수 있다. 당단백은 N 또는 O 연결을 통해 폴리펩티드에 공유결합적으로 부착된 하나 이상의 글리칸을 운반한다.
O-글리칸은 세린 또는 트레오닌 잔기의 히드록실기에 연결되어 있다. N-글리칸은 측쇄 질소(N)를 통해 아스파라긴 잔기에 연결된 당 쇄이다. 이들은 α1-3 및 α1-6연결에 의해 중심 만노스에 개별적으로 연결되고, 이어서 β1-4연결에 의해 2개의 β1-4-연결된 GlcNAc 잔기로 이루어진 키토비오스 코어에 연결되는 2개의 만노스 잔기의 공통의 5당류 영역을 공유한다. 5당류의 추가의 과정에 기초하여, N-글리칸은 3개의 주요 범주로 나누어진다: (i) 하이-만노스 (high-mannose) (ii) 복합 (iii) 혼성 타입.
하이-만노스 N-글리칸은 키토비오스 코어에 부착된 치환되지 않은 만노스 잔기(전형적으로 5내지9)만을 가진다. 혼성 N-글리칸은 치환되지 않은 말단 만노스 잔기 및 GlcNAc를 포함하는 만노스 잔기를 포함하며, 이는 추가의 단당류가 추가될 수 있는 "안테나"를 개시한다. 복합 N-글리칸은 α3 및 α6 만노스 부위모두에 추가된 GlcNAc 잔기를 가지며, 추가-5당류 만노스 잔기를 갖지 않고, 2-, 3- 및 4-안테나 형태로 발견된다.
프로테오글리칸은 자일로오스로 끝나는 코어 부위를 통해 세린 잔기의 히드록실기에 부착된 하나 이상의 글리코사미노글리칸 (GAG) 쇄를 가진다. 가장 중요한 당지질은 글리코스핑고리피트이며, 이는 글루코오스 또는 갈락토오스를 통해 장쇄 아미노 알코올 스핑고신 및 지방산으로 구성된 세라미드 지질 모이어티의 말단 히드록실기에 연결된 글리칸으로 구성되어 있다.
글리칸 결합 단백질
글리칸의 많은 특정 생물학적 역할은 인식을 통해 글리칸 결합 단백질 (GBP)에 의해 매개된다. GBP는 렉틴, 글리코사미노글리칸 결합 단백질 및 글리칸-특이적 항체를 포함한다. 렉틴은 종종 탄수화물 인식 도메인을 통해 글리칸 쇄의 말단 영역에 결합한다. 낮은 결합 친화성으로, 생물학적으로 관련된 상호작용에 다가의 CRD-글리칸 상호작용이 종종 요구된다.
글리칸 처리
글리칸은 주로, 단당류 모이어티를 글리칸 쇄로 조립하는 글리코실트랜스퍼라제 효소에 의해 합성된다. 글리코실트랜스퍼라제 효소는 일반적으로 단순한 뉴클레오티드 당 공여체(예를 들어, UDP-Gal, GDP-Fuc 또는 CMP-Sia)의 를 수용체 기질로의 전달을 촉매하는 특성을 가진다.
당접합체 생합성은 당류를 폴리펩티드 측쇄 또는 스핑고리피트 베이스에 부착하는 글리코실트랜스퍼라제 효소에 의해 개시된다. 예를 들어, N-글리칸의 경우, 올리고사카릴트랜스퍼라제가 글리칸 Glc3Man9GlcNAc2을 아스파라긴 측쇄로 전달한다.
대다수의 글리코실트랜스퍼라제는 글리칸 쇄를 신장한다. 선형 또는 분지형 쇄는, 종종 별개의 글리코실트랜스퍼라제에 의해 순차적인 글리코실화로 만들어진다. 즉, 하나의 효소에 의한 글리코실화 산물은 또 다른 효소에 대한 선호하는 기질을 생성한다. 글리코실트랜스퍼라제의 예는 갈락토오스-1-인산염 우리딜트랜스퍼라제 (GalT), N-아세틸갈라토사미닐-트랜스퍼라제 (GalNAcT), 푸코오실 트랜스퍼라제 (FuT) 및 시알릴트랜스퍼라제 (SialT, 이는, 각각, 갈락토오스, N-아세틸글루코스아민, 푸코오스 및 시알산 잔기의 추가를 촉매한다, 를 포함한다.
글리코시다아제는 단당류 모이어티를 제거하여 이후에 글리코실-트랜스퍼라제에 의해 처리되는 중간체를 형성하는 글리칸 처리 효소이다. 이러한 처리 타입은 N-글리칸의 생합성에 특히 중요하며; Glc3Man9GlcNAc2에 대한 글리코시다아제 효소의 작용은 궁극적으로 상기 기재된 하이-만노스, 복합 및 혼성 타입 N-글리칸으로의 처리에 필요한 중간체의 형성을 허용한다.
동위 원소로 표지된 글리칸의 화학- 효소적 합성
미생물 자원의 탐구에서의 발전 및 포유류 효소의 향상된 생산은 글리칸 합성을 위한 효율적인 도구로서의 글리코실트랜스퍼라제의 사용을 확립해왔다(Blixt, 2006; Ruiz, 2001; Serna, 2010, Zou, 2011). 부위- 및 입체-특이적 트랜스퍼라제 효소 및 당 공여체 구성 블럭을 적절한 순서로 사용함으로써 순차적인 효소적 신장을 통해서 조립될 수 있다. 유사하게, 예를 들어, 2-안테나 7당류 18 13 C 8 G0 ( Bn 5 ) 로부터 유도된 비대칭성 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물의 제조를 용이하게 하게 하기 위해, 먼저 코어 모티프를 절단하는 것이 바람직 할 수 있다. 이러한 절단은 효소적 가수분해로 달성될 수 있다.
따라서, 질량 분광법의 표준물로의 사용을 위한 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성을 위한 본원에 기재된 방법은 효소적 유도체화 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 방법은 본원에 기재된 바와 같이 동위 원소로 표지된 올리고당류에 대해 적합한 하이드롤라제를 사용하여 동위 원소로 표지된 올리고당류를 절단하는 것을 포함한다. 즉, 본 발명은 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 모티프로부터 하나 이상의 당 단위의 효소적 절단을 위한 방법을 포함할 수 있다.
생성된 절단된 올리고당류는 이후에 자체적으로 효소적 신장단계를 진행하여 하나 이상의 추가의 당 단위를 삽입한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 적합한 당 공여체와 함께 적합한 트랜스퍼라제는 순차적으로 단계적 방식으로 동위 원소로 표지된 글리칸을 조립하는데 사용될 수 있다. 트랜스퍼라제는 재조합 글리코실트랜스퍼라제, 트랜스글리코시다아제, 엔도글리코시다아제 또는 돌연변이된 글리코시다이제일 수 있다. 생성된 글리칸은 본원에 기재된 본 발명의 방법에 유용성을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 효소적 신장 단계(들)은 본원에 기재되는 동위 원소로 표지된 모티프를 포함하는 올리고당류 (코어 올리고당류, 코어 모티프 및 동위 원소로 표지된 개시 올리고당류로 다양하게 불리울 수 있다)에서 일어날 수 있다. 즉, 본 발명의 일부 실시 형태에서, 동위 원소로 표지된 개시 올리고당류는 화학선택적으로 신장되어 추가의 당 단위를 삽입하고, 그럼으로써 질량 분광법에의 사용을 위한 추가의 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물을 제공한다.
각각의 신장 단계에서 사용되는 당 공여체는 임의로 동위 원소로 표지될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 처음으로 동위 원소로 표지된 모티프만이 생성된 글리칸에서 동위 원소로 표지된다. 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 동위 원소로 표지된 당 단위는 효소적 신장 단계(들) 동안 삽입된다. 상기에서 논의된 것처럼, 특정 위치에의 특정 동위 원소로 표지된 당 단위의 삽입은 질량 분광법에서의 단편화 패턴의 분석에서 유용성을 가진다.
대안적으로, 효소적 신장은 동위 원소로 표지되지 않은 모티프에서 일어난다. 대신, 하나 이상의 동위 원소로 표지된 당 단위는 효소적 신장 단계(들) 동안 삽입되어 본원에 기재된 바와 같이 샘플 중의 글리칸을 확인하는 방법에 적합하게 사용될 수 있는 동위 원소로 표지된 글리칸을 제공한다.
화학효소적 신장 단계는 여러 번 반복될 수 있다. 예를 들어, 단당류 당 공여체를 사용함으로써, 화학-효소적 신장의 20사이클은 추가적인 20개의 단당류 단위를 도입할 수 있다. 추가의 단위가 안테나의 말단에 삽입되거나, 또는 코어 올리고당류의 하나의 당 단위에 삽입될 수 있음이 인식될 것이다.
일부 실시 형태에서, 화학 효소적 신장 단계는 이당류 또는 올리고당류이고/이거나 지질, 펩티드 또는 단백질에 접합된 당 공여체를 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 효소적 유도체화 단계는 하나 이상의 에피머화 단계, 트랜스글리코실화 단계, 또는 번역후 변형 단계를 포함한다. 이러한 단계는 신장 또는 절단에 추가될 수 있다.
도 2는 다양한 글리칸 및 글리칸 혼합물을 조립하기 위한 방법의 사용을 나타낸다. 임의의 당 단위는 동위 원소로 표지된다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 개시 7당류 [(2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스]의 각각의 아세틸기는 동위 원소로 표지된다. 이러한 동위 원소로 표지된 개시 물질의 화학적 합성은 하기 기재된다. 이러한 동위 원소로 표지된 개시 코어 올리고당류는 본원에서 13 C 8 -G0로 언급된다.
도 2는 상기 개시 7당류 13 C 8 -G0로 시작하는 일련의 순서를 보여준다. 재조합 코어 α1,6 푸코실트랜스퍼라제를 사용한 인큐베이션은 코어 푸코실화된 구조물 A를 제공하며, 이는 추가로 갈락토실화 (패널 C) 및 시알화 (패널 D)될 수 있다. UDP-갈락토오스 존재 하에 소 우유 갈락토실트랜스퍼라제를 사용한 개시 7당류의 직접 갈락토실화는 단일-갈락토실화 이성질체 및 완전히 갈락토실화된 N-글리칸 (패널 E) 모두를 이용한다. 재조합 α2,6 시알릴T를 사용한 추가 처리는 패널 F의 화합물을 제공한다. 이등분하는 GlcNAc 잔기는 재조합 GnTIII (화합물 B)에 의해 도입될수 있다. 상기 산물의 갈락토실화는 이후에 패널 G의 이등분 화합물로 이어지고, 뒤이은 시알화는 패널 H의 화합물을 제공한다. 이등분하는 화합물 A의 α-1,6 푸코실화는 이등분하고 코어 푸코실화된 글리칸 I으로 이어지며, 이는 패널 J로 갈락토실화될 수 있고 궁극적으로 시알화되어 화합물 (패널 K)을 제공한다.
합성으로 제공된 동위 원소로 표지된 코어 올리고당류는 효소적 유도체화 단계 동안 보호될 수 있다 (즉, 하나 이상의 보호기를 가질 수 있다). 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 13C8-G0 는 13C8-벤질 [(2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드, 본원에서는 13C8-G0(Bn5)로 언급된다]를 통해 얻어질 수 있다. 상기 벤질화된 7당류는 자체적으로, 효소적 유도체화 단계(들)을 위한 동위 원소로 표지된 코어 모티프로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 반-보호된 코어 모티프는 화학선택적 효소적 신장을 위한 적합한 기질이 될 수 있고 보호기의 존재는, 예를 들어, HPLC 분석 및 정제 동안 피크 검출를 위한 발색단으로 작용 및 상이한 산물, 예를 들어, 이성질체 글리칸의 분리를 도움으로써 특별한 이점을 가질 수 있다.
다른 비-인간, 예를 들어, 식물 또는 기생충 특이적 글리칸이 유사한 방식으로 평가되고, 상기 기재된 바와 같이 동위 원소로 표지된 모티프를 사용하여 시작함으로써 질량 분광 실험에서 쉽게 검출가능한 고정된 질량 증분을 갖는 동위 원소로 표지된 화합물로서 수득될 수 있음이 인식될 것이다. 마찬가지로, 안테나의 수, 분지 패턴 및 코오 변형의 체계적인 변환를 갖는 더욱 고도로 분지된 복합, 혼성 및 하이 만노스 타입 글리칸을 포함하는 더욱 큰 라이브러리(library) N-글리칸 화학합성 제조가 바람직하게는 동위 원소로 표지되고 본 발명의 방법을 사용함으로 수득될 수 있는 매우 감소된 수의 코어 구조물로부터 시작하여 수득될 수 있다. 이러한 코어 구조물에 기반한 라이브러리는 진핵 생물의 당단백에서 발견되는 N-글리칸 및 재조합 당단백상의 가장 일반적인 글리칸 구조물의 구조적인 변환를 반영한다.
다음의 논의는 본원에서 13C8-G0로 언급되는 7당류 N-글리칸 코어의 변형에 관한 것이다. 이는 예시로서 제시되고 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 다른 글리칸 코어도 동일하게 예상될 수 있다.
부분적으로 탈보호되는 13C-표지된 N-글리칸 13 C 8 -G0( Bn 5 ) (13)은 비대칭성 N-글리칸 구조물의 제조 및 단리을 위한 전구물로 평가되었다. 펜타-벤질화 글리칸의 소수성 및 UV 흡광도를 이용하여, 본 발명자들은 코어 N-글리칸 구조물 내의 이러한 5 벤질기의 존재가 부분적인 효소적 신장 후에 상이한 글리칸 및 심지어 이성질체 구조물의 크로마토그래피 분리를 용이하게 한다는 것을 발견하였다.
소 우유 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 사용한 기질의 부분적 갈락토실화를 조절하기 위한 일련의 실험이 수행되었으며, 반-보호되는 N-글리칸 13 C 8 -G0( Bn 5 )이 효소에 적합한 기질인 것뿐 아니라 모두 13C-표지된 G0-G1-G2 구조물의 혼합물을 수득하는 것의 가능성을 보였다. C18 컬럼을 이용한 역상의 UPLC-MS에 의한 상기 혼합물의 분석은 상이한 화합물 및 또한 단일-갈락토실화된 N-글리칸 13 C 8 -G1( Bn 5 )의 2개의 이성질체의 분리를 허용하고, 또한 UV-검출기를 사용하여 그의 상대적인 조성을 정량화한다. 13 C 8 -G0( Bn 5 )의 효소적 변환 동안의 적합한 조건의 사용으로 단일-갈락토실화된 2-안테나 N-글리칸 13 C 8 -G1( Bn 5 )을 그의 2개의 상의한 이성질체 3-LacNAc 및 6-LacNAc의 형태로 45% 초과로 산출했다.
MALDI 분석 및 NMR 분석으로 확인되는 바와 같이 밀리그램 규모의 반제조-HPLC에 의한 2개의 단일-갈락토실화된 이성질체 각각의 정제가 달성되었다. 가수소 분해에 의한 코어의 완전한 탈보호는 N-글리칸 정량화 분석에 사용되는 2개의 이성질체적 13C-표지된 표준물 13 C 8 -G13 및 13 C 8 -G16을 제공했다. MALDI-Tof MS로 확인된 바와 같이, 이성질체 13 C 8 -G1 6 는 또한 상기 표준물 13 C 8 - G1 6 F 의 제조를 위해 효소적으로 푸코실화될 수 있었다.
질량 분광법의 표준물로의 사용을 위한 이성질체적 비대칭성 동위 원소로 표지된 N-글리칸을 수득하기 위한 또다른 전략은 이-갈락토실화된 13 C 8 -G2( Bn 5 ) 화합물에 대한 아스페르길러스 오리재( Aspergillus oryzae ) 로부터의 β-갈락토시다아제의 사용을 포함했다 (표1). 글리칸의 상이한 분포가 상기 변환 동안 관찰되었으며, 여기서 발명자는 2개의 이성질체적 단일-갈락토실화된 구조물에 대한 하이드롤라제의 상이한 활성을 결정할 수 있었다. 효소의 이러한 상이한 특이성은 약50%의 수율의 하나의 단일-갈락토실화된 화합물 및 비-갈락토실화된 화합물 13 C 8 -G0(Bn 5 )중 하나만을 제공했다.
Figure pct00028
동일한 전략이, 2-안테나 구조물로부터 유도된 2개의 단일-시일화된 및 이-시알화된 글리칸을 제공하기 위해, 이. 콜라이에 발현된 파스투렐라 멀토시다(Pasteurella multocida )로부터의 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 이용하여 이-갈락토실화된 13 C 8 -G2( Bn 5 )로부터 다양한 13C-표지된 시알화된 표준물의 제조에 이용되었다. 상기 반-보호된 화합물의 혼합물은 UPLC-MS에 의해 분리되있으며, 이는 발명자가 그의 상대적 조성을 결정하는 것을 허용했다 (표 2).
Figure pct00029
상기 반응은 또한 부분적으로 갈락토실화된 기존에 수득된 화합물 G0/G1/G2의 혼합물에도 적용되었다. 상기 혼합물의 부분적인 α-2,3-시알화는, UPLC-MS에 의해 분리될 수 있는 9개의 구조물 [ 13 C 8 -G0( Bn 5 ) 및 13 C 8 -G2( Bn 5 ), 단일-갈락토실화된 화합물 13 C 8 -G1(Bn 5 )의 2개의 이성질체, 단일-시알화된 화합물 13 C 8 - G1A1(Bn 5 )의 2개의 이성질체, 단일-시알화된 화합물 13 C 8 - G2A1 ( Bn 5 ) 의 2개의 이성질체 및 두번-시알화된 2-안테나 구조물 13 C 8 - G2A2 ( Bn 5 )]의 혼합물을 산출했다. 따라서 상기 전략은 정제와 탈보호 후에 5개의 새로운 시알화된 13C-표지된 N-글리칸을 수득하는데 사용될 수 있다.
이어서 상응하는 시알화된 표준물을 수득하기 위해 시알화 반응이 mg 규모로 수행되었다. 기존에 제조된 반보호되는 13 C 8 - G1 3 Bn 5 가 시알화된 화합물 13 C 8 - G1 3 Bn 5 을 수득하기 위해 피 멀토시다 (P multocida ) 의 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 사용하여 시알화되었다. 상기 반응은 완전하지 않지만 시알화된 화합물은 반제조-HPLC에 의해 단리될 수 있었다. 또한, mg 규모의 13 C 8 -G2( Bn 5 )의 시알화는 반제조-HPLC에 의해 분리될 수 있는 시알화된 표준물 13 C 8 - G2A1 3 ( Bn 5 ), 13 C 8 - G2A1 6 ( Bn 5 ) 및 13 C 8 - G2A2(Bn 5 )의 혼합물을 제공했다.
재조합 CHO 세포에서 발현된 인간 α-2,6-시알릴-트랜스퍼라제를 사용한 13 C 8 -G2( Bn 5 )의 시알화 반응은 또한 상응하는 단일- 및 이-시알화된 구조물을 수득하기 위해서 조절되었다. 부분적으로 보호되는 13 C 8 -G2( Bn 5 ) 및 단지 1당량의 시알산 공여체를 사용한 반응은 단일-시알화 화합물을 26%의 수율로 산출했다. 대조적으로, 공여체의 과잉 사용은 이-시알화된 화합물을 유일한 산물로 제공했다. 단일- 및 이-시알화된 2개의 화합물 모두 UPLC-MS로 분리될 수 있었다. 상기 반응은 또한 부분적 갈락토실화에 의해 기존에 수득된 G0/G1/G2 혼합물에 대해서도 수행되었다. α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 사용한 이전에 결과와 유사하게 3개의 갈락토실화된 화합물을 포함한 혼합물의 부분적 시알화는 4개의 새로운 13C-표지된 2,6-시알화된 N-글리칸을 제공했고, 이는 UPLC-MS로 분리될 수 있었다. 상기 혼합물의 상대적인 조성 측정하여, 이-2,6-시알화된 2-안테나 N-글리칸 13 C 8 - G2S2 ( Bn 5 ), 각각의 이성질체 형태의 단일-2,6-시알화된 화합물 13 C 8 - G1S1 ( Bn 5 ) 및 다른 단일-시알화된 화합물 13 C 8 -G2S1(Bn 5 )을 확인하였다 (표 3).
Figure pct00030
코어 올리고당류 13 C 8 -G0( Bn 5 )는 또한 2-안테나 구조물로부터 유도되고 단지 하나의 말단 GlcNAc만을 가지는 다른 비대칭성 글리칸 표준물을 제조하기 위해 변형될 수 있다. 이들 절단된 단일-안테나 구조물은 13 C 8 -G0( Bn 5 ) 중의 말단 글루코스아민의 효소적 가수분해로 수득될 수 있다. 개시 분자 중의 존재하는 벤질기는 효소적 가수 분해 후에 다시 생성된 구조물의 정제에서 돕는다. 이러한 목적으로, 코나 발리아 엔시포르미스 ( Conavalia ensiformis ) 의 N-아세틸 글루코스아미니다아제가 부분적으로 보호되는 기질 13 C 8 -G0( Bn 5 )에 대해 사용된다. 반응의 최적화는 본 발명자가 개시 물질인 단일-안테나 구조물 2개의 이성질체 [각각 13 C 6 - MGn 3 ( Bn 5 ) 및 13 C 6 -MGn 6 (Bn 5 )] 및 이중 가수 분해의 산물 13 C 4 - Man3(Bn 5 )의 혼합물을 수득하게 한다. 글루코스아미니다아제가 13C-표지된 GlcNAc 모이어티를 제거함으로, 생성된 글리칸은 상이한 수준의 표지를 가지며, 6개의 13C 원자 및 본래의 8개의 원자 대신 4개의 13C 원자를 갖는 트리만노스 글리칸을 갖는 2개의 이성질체의 단일-안테나 구조물을 수득한다.
가수 분해 반응은 3 mg의 13 C 8 -G0( Bn 5 )를 사용하여 확대되었다. 상기 혼합물은 반제조 HPLC로 분리될 수 있었고 3개의 새로운 화합물이 mg 규모로 단리되었다. 이러한 화합물은 가수분해된 벤질기가 제거되어 상응하는 13C-표지된 글리칸 13 C 6 - MGn 3 , 13 C 6 -MGn 6 및 13 C 4 - Man3을 제공하였다 (도 5). 또한, 13 C 6 - MGn 3 의 효소적 푸코실화는 표준물 13 C 6 - MGn 3 F를 정량적으로 산출하였다 (도 6).
이전에 기재되었던 바와 같이, 부분적으로 벤질화된 화합물은 효소적 반응으로 유도체화될 수 있다. 이러한 부분적 보호는 상응하는 반응이 하나 초과의 산물을 제공할 때, 예를 들어, 부분적 갈락토실화에서, 이러한 부분적 보호가 생성된 혼합물을 HPLC 로 분리하는 것을 가능하게 하므로, 특히 유용하다.
3-안테나 N-글리칸 22는 갈락토실화될 수 있는 3개의 상이한 위치를 가진다. 부분적 갈락토실화는 7개의 새로운 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물을 단일 반응에서 생성한다: 완전히 갈락토실화된 N-글리칸 (G3), 2개의 갈락토오스 잔기를 가진 3개의 화합물 (G2a, G2b, G2c) 및 단일 갈락토오스 잔기를 가진 3개의 화합물 (G1a, G1b, G1c).
임의의 옥사졸린 형성
본 발명의 일부 실시 형태에서, 합성 방법은 추가로 올리고당류의 아세틸-헥소스아민 단위의 유리 아노머 위치에서 옥사졸린을 형성하는 단계를 포함한다.
Figure pct00031
합성 단계를 위한 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, CDI, DCC, EDC 및 DMC와 같은 연결 시약의 사용; 또는 적합한 루이스산 시약의 사용을 포함한다. 클로로포름아미듐-타입(chloroformamidium-type) 시약 및 산 배합물을 포함한 다른 탈수 시약 또는 조건이 또한 사용될 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.
생성된 동위 원소로 표지된 글리칸 옥사졸린은 이어서 동위 원소로 표지된 당접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Rising, 2008를 참고한다). 바람직한 당접합체는 당단백, 글리코형, 당펩티트, 펩티도글리칸, 당지질, 글리코시드 및 지다당류를 포함한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 합성 방법은 모티프 중의 각각의 아세틸기가 동위 원소로 표지된 모티프 [(2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스를 포함하는 글리칸을 포함한다. 상기 글리칸은 추가의 안테나 당 단위를 포함한다. 상기 글리칸의 유리 아노머 위치에서 옥사졸린 형성은 천연 당접합체에 비해 적어도 8 Da의 고정된 질량 증분을 갖는 당접합체 이소토폴로그의 제조를 가능하게 한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 어떠한 추가의 안테나 당 단위도 동위 원소로 표지되어 있지 않고, 생성된 동위 원소로 표지된 당접합체는 천연 당접합체에 비해 8 Da의 고정된 질량 증분을 갖는다.
질병 및 장애에서의 글리칸 마커 (marker)
글리칸의 생합성은 글리코실트랜스퍼라제를 수반하는 수많은 고도의-경쟁적과정에 의존한다. 그 결과로, 글리코실화는 생화학적 환경의 특성에 고도로 민감하고 글리코실화 및 글리코실화에서의 변환는 많은 질병 및 장애와 관련되어 왔다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 소위 글리칸 마커(질병 또는 장애와 연관된 것으로 공지된 특정 글리칸 구조)의 편리한 확인 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서 본 발명은 복합 혼합물 중의 단일 글리칸 마커의 확인과 정량화를 제공하며, 다른 실시 형태에서는 하나 이상의 질병 또는 장애와 연관된 많은 글리칸 마커가 단일 실험에서 확인되고 정량화된다.
특정 질병 또는 장애와 연관된 글리칸 마커의 특징적 조합을의 확인하는 것을 지원하기 위해서, 일부 바람직한 실시 형태에서 태그된 표준물은 질병 또는 장애와 연관었다고 공지된, 배합물의, 임의로 적합하게 비례하는 양으로, 동위 원소로 표지된 이소토폴로그를 포함하는 혼합물이다. 이런 방법으로, 미리-혼합된, 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물은 특정한 글리칸 특징의 존재를 결정하기위한 일 발명의 방법, 및 그에 따른 그러한 특징과 연관된 질병 및 장애의 진단 방법을 위한 상기 발명의 방법에 사용될 수 있다.
하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 적합한 태그된 표준물이 사용되는 질병 및 장애는 다음을 포함한다:
심혈관계 질환, 예를 들어, 뇌졸중, 심근 경색, 저혈량성 뇌졸중, 아테롬성 동맥 경화증;
염증성 피부병;
진성 당뇨병;
궤양성 대장염을 포함하는 위장관 질환;
간 질환 및 질병
빈혈;
면역학적 질환 또는 장애, 예를 들어, 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군;
자가면역 질환;
류마티스성 관절염을 포함하는 관절염;
감염 질환;
신장병;
알츠하이머병을 포함하는 신경계 질환;
폐 질환; 및
글리코실화의 선천성 장애.
상기 목록은 제한의 방법으로 제공되지 않았으며 본원에 기재된 방법은 질병 또는 장애와 연관되었다고 공지된 임의의 글리칸 바이오마커(biomarker)의 검출, 확인, 및/또는 정량화와 관련성이 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 생물 약제학적 글리콜-프로파일링(glycol-profiling )에 관한 많은 유용한 응용을 제공하는 것으로 인식될 것이다. 하기의 예시적 예는 이소토폴로그 및 본원에 기재된 방법이 적용될 수 있는 다양한 용도를 예시하기 위해 제시된다.
● 소정의 산물에 대한 정량적인 단일 글리칸 핑거프린트를 통한 생성 배치 및 생성 부위의 신속한 확인. 이는 원본으로 패키지된 바이오시밀러(biosimilar)를 확인하고 배치 원본 및 정체를 추적하는데 도움이 된다.
● 공지된 이펙터 기능 (Fc 수용체에 대한 Fc 부분의 결합에 영향을 줌) 또는 순환의 반감기에 대해 중요한 효과를 갖는 mAb 글리칸의 정확하고 정량적인 검출. 이들은 코어 푸코오스를 갖는 글리칸, 말단 갈락토오스, 말단 시알산 및 하이 만노스 글리칸을 포함한다 (마지막 항목은, 예를 들어, 순환으로부터 약물의 제거를 초래하는 대식세포의 만노스 수용체와 우선적으로 관련을 맺게 될 것이다).
● 클론 선택, 공정 개발, IND 파일링을 통한 배치 방출 같은 생물약제학 산업에서 고속 대량 적용시, 전반적인 신속하고 정량적인 글리칸 프로파일링, 및 단당류 조성, 분지 수준, 시알화, 푸코오스 함량 등.
● 이들 단당류의 손실 또는 이동을 정량화하고 모니터링하며 이들 잔기의 손실을 방지하기 위한 수득 파라미터를 최적화하기 위해 MALDI-Tof MS에 의한 글리칸 프로파일링 시 푸코실화되고 시알화된 글리칸 표준물 또는 임의의 다른 불안정한 글리칸의 내부 표준 물질로서의 특정한 이용.
● 클론 선택 및 공정 개발시 바이오시밀러 생산자를 안내하기 위해 원조 치료 mAb 또는 당단백의 정확한 글리칸 조성을 갖는 키트의 생산.
● 관련된 글리코실화 효험 실험을 돕고 마지막 경우로서 특정 글리코형의 효능을 측정하기 위해 혼합물 중의 글리코형의 절대치 정량화를 위한 내부 표준물의 사용.
실시예
다음의 예들은 당업계의 보통의 기술을 가진 기술자에게 본 발명을 실행하기 위한 완전한 내용 및 묘사를 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위함이 아니다.
N- 글리칸 7당류 코어의 합성
다음의 합성은 도 3에 도시된 상응하는 화학적 구조물에 대하여 번호가 매겨진다.
벤질 4-O-아세틸-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (2).
무수 DCM 중의 분자체를 사용한 벤질 알코올 용액 (54μL, 0.525 mmol, 1.5 eq) 및 1 (250 mg, 0.350 mmol, Serna S., Kardak B., Reichardt N., Martin-Lomas M., Tetrahedron Asymmetry, 2009, 20, 851-856에 따라 합성됨)을 45분간 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0°C로 냉각시키고 TMSOTf (6　μL, 0.035 mmol, 0.1 eq)을 첨가하였다. 1시간 후에, 트리에틸아민으로 반응을 종료시키고, 셀라이트의 플러그(plug)를 통해서 여과시킨 후, 농축시켰다. 조(crude) 잔류물을 섬광 크로마토그래피(헥산: EtOAc이 9:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (198 mg, 90%).
Rf 0.39 (톨루엔:EtOAc 9:1); [α]D 20=+9.2 (c=0.5, CHCl3); 1H　NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.48 (m, 4H, Phth), 7.40-7.27 (m, 5H, Ph), 7.13-6.96 (m, 7H, Ph), 6.95-6.85 (m, 3H, Ph), 5.19-5.09 (m, 2H, H-1, H-4), 4.81 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.61-4.54 (m, 3H, CH2 Bn), 4.50 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.42 (dd, J = 10.7, 8.9 Hz, 1H, H-3), 4.34-4.27 (m, 2H, H-2, CH2 Bn), 3.75 (dt, J = 9.7, 4.6 Hz, 1H, H-5), 3.68-3.60 (m, 2H, h-6), 1.94 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:169.8, 138.1, 137.9, 137.1, 133.9, 131.7, 128.5, 128.3, 128.2, 128.0, 127.9, 127.8, 127.8, 127.8, 127.5, 123.4, 123.4, 97.3(C-1), 73.9, 73.8, 73.6, 72.6, 71.0, 69.9, 55.6, 21.0; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C37H35NO8Na: 644.2260 [M+Na]+, 실측치 644.2294.
벤질 3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (3).
MeOH:CH2Cl2 (2:1)중의 2 (608 mg, 0.978 mmol)의 용액에 (6 mL) NaOMe 0.25 M 을 첨가하였다 (300 μL, 20%). 1시간 동안 교반한 후에, pH 7까지 산성 이온 교환 수지를 첨가하였다. 용액을 여과시키고, 농축시킨 후 섬광 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (430 mg, 76%).
Rf (헥산:EtOAc); [α]D 20=+9.4 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.50 (m, 4H, Phth), 7.42-7.29 (m, 5H, Ph), 7.13-7.01 (m, 7H, Ph), 6.98-6.89 (m, 3H, Ph), 5.20-5.12 (m, 1H, H-1), 4.79 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.73 (d, J = 12.2 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.67 (d, J = 11.9 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.61 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.52 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.48 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.29-4.19 (m, 2H, H-2, H-3), 3.90-3.78 (m, 3H, H-6, H-6, H-4), 3.65 (dt, J = 9.7, 4.9 Hz, 1H, H-5), 2.96 (br s, 1H, OH); 13C NMR (CDCl3) δ:168.1, 167.8, 138.3, 137.8, 137.2, 133.8, 131.7, 128.6, 128.2, 128.0, 128.0, 127.9, 127.7, 127.7, 127.5, 123.4, 123.3, 97.5(C-1), 78.7, 74.4, 73.9, 73.7, 70.9, 70.8, 55.5; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C35H33NO7Na: 602.2155 [M+Na]+, 실측치 602.2128.
벤질 2-O-아세틸-4,6-O-벤질이덴-3-O-(2-나프틸메틸)-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (5).
무수 CH2Cl2중의 3Å 분자체를 사용한 1 (400 mg, 0.69 mmol) 및 4 (905 mg, 0.83 mmol, 1.2 eq, Serna S., Kardak B., Reichardt N., Martin-Lomas M., Tetrahedron Asymmetry, 2009, 20, 851-856에 따라 합성됨)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 TMSOTf (12 μL, 0.07mmol, 10%)를 실온에서 첨가하고 TLC 가 개시 물질의 완전한 전환을 보일 때까지 반응물을 교반하였다 (1h). 트리메틸아민을 첨가하여 반응을 종료시키고 (20 μL), 셀라이트의 플러그를 통해서 여과시키고, 농축시켰다. 조 잔류물은 섬광 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (750 mg, 73%).
Rf 0.17 (헥산:EtOAc 3:1); [α]D 20=-4.9 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.91-7.58 (m, 10H), 7.57-7.28 (m, 12H), 7.23-7.13 (m, 4H), 7.12-6.87 (m, 13H), 6.81-6.68 (m, 3H), 5.53 (s, 1H, CHPh), 5.51 (dd, J = 3.3, 1.3 Hz, 1H, H-2C), 5.27 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-1B), 4.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1A), 4.88 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.83 (d, J = 12.8 Hz, 2H, 2 x CH 2 Bn), 4.7-4.67 (m, 3H, 2 x CH 2 Bn, H-1C ), 4.57-4.47 (m, 4H, 2 x CH 2 Bn), 4.42 (d, J = 12.1 Hz, 1H, 1 x CH 2 Bn), 4.40-4.35 (m, 2H, 2 x CH 2 Bn), 4.29 (dd, J = 10.7, 8.5 Hz, 1H, H-3B), 4.25-4.08 (m, 6H, H2A, H2B, H-4A, H-4B, H-3A, H-6Ca), 3.90 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4C), 3.68-3.59 (m, 2H, H-6Ba, H-6Bb), 3.59-3.50 (m, 3H, H-6C-b, H-6Aa, H-3C), 3.43 (dd, J = 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.30 (ddd, J = 9.9, 3.9, 1.7 Hz, 1H, H-5A), 3.23 (dt, J = 9.9, 2.2 Hz, 1H, H-5B), 3.13 (td, J = 9.7, 4.9 Hz, 1H, H-5C), 2.22 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.3, 168.6, 167.7, 167.6, 138.7, 138.7, 138.5, 137.9, 137.6, 137.3, 135.4, 134.1, 133.9, 133.5, 133.4, 133.1, 131.9, 131.8, 131.5, 129.1, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.8, 127.7, 127.7, 127.6, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 126.3, 126.1, 126.0, 125.5, 123.8, 123.2, 101.7, 99.4(C-1C), 97.2(C-1A), 97.1(C-1B), 79.0, 77.9, 77.0, 76.6, 75.9, 75.8, 74.7, 74.6, 74.4, 74.3, 73.2, 72.9, 71.6, 70.6, 69.2, 68.5, 68.3, 67.9, 67.0, 56.6, 55.8, 21.2; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C89H82N2O19Na: 1506.5443 [M+Na]+, 실측치 1506.5481.
벤질 2-O-아세틸-4,6-O-벤질이덴-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (6).
CH2Cl2:MeOH (4:1)중의 5 (300mg, 0.202 mmol)의 용액 (1.2 mL)에, DDQ (138 mg, 0.606 mmol, 3 eq)를 첨가하였다. 2시간 후에, 혼합물을 EtOA로 희석시키고 포화된 NaHCO3, 물 및 소금물로 세척하였다. 용액을 농축시키고 섬광 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (176 mg, 65%).
Rf 0.37 (헥산:EtOAc 3:2); [α]D 20= -4.6 (c=1, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.94-7.57 (m, 8H, Phth), 7.50-7.27 (m, 15H, Ph), 7.11-6.88 (m, 12H, Ph), 6.82-6.68 (m, 3H, Ph), 5.47 (s, 1H, CHPh), 5.31 (dd, J = 3.1, 1.2 Hz, 1H, H-2C), 5.26 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-1B), 4.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1A), 4.85 (t, J = 12.4 Hz, 2H, CH2Ph), 4.76 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-1C), 4.70 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2Ph 아노머), 4.62 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH2Ph), 4.50 (d, J = 13.3 Hz, 3H, CH2Ph), 4.47 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH2Ph), 4.41 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH2Ph 아노머), 4.37 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2Ph), 4.30-4.23 (m, 1H, H-3B), 4.23-4.08 (m, 6H, H-2B, H-4A, H-2A, H-4B, H-3A, H-6Ca), 3.75-3.67 (m, 2H, H-4C, H-3C), 3.63 (dd, J = 7.2, 2.3 Hz, 2H, H-6Ba, H-ABb), 3.59-3.50 (m, 2H, H-6Cb, H-6Aa), 3.43 (dd, J = 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.33-3.27 (m, 1H, H-5A), 3.23-3.18 (m, 1H, H-5B), 3.15 (dd, J = 15.0, 8.2 Hz, 1H, H-5C), 2.20 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.6, 168.5, 167.7, 138.7, 138.4, 138.0, 137.3, 137.1, 134.1, 133.9, 133.5, 131.8, 131.5, 129.3, 128.6, 128.4, 128.4, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.7, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 126.3, 123.7, 123.2, 102.1, 99.3(C-1C), 97.2(C-1A), 97.0(C-1B), 79.1, 78.6, 76.6, 75.7, 74.6, 74.6, 74.4, 74.4, 73.3, 72.9, 71.4, 70.5, 69.9, 68.5, 68.3, 67.8, 66.7, 56.6, 55.8, 21.1; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C78H74N2O19Na: 1365.4784 [M+Na]+, 실측치 1365.4840.
벤질 (3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→2)-3,4,6-트리-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-(1→3)-2-O-아세틸-4,6-O-벤질이덴-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (8).
무수 CH2Cl2 중의 분자체를 사용한 6 (100 mg, 0.074 mmol) 및 7 (80 mg, 0.089 mmol, 1.2eq, Unverzagt, C.; Eller, S.; Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem . Eur . J. 2007, 14, 1304-1311에 따라 합성됨)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC 가 개시 물질의 완전한 전환을 보일 때까지 상기 혼합물에 TMSOTf (1.6 μL, 0.007mmol, 10%)을 첨가하고 교반하였다 (1h). 트리메틸아민(20 μL)을 첨가하여 반응을 종료시키고, 셀라이트의 플러그를 통해서 여과시키고, 여과액을 농축시켰다. 조 잔류물은 섬광 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (116 mg, 76%).
Rf 0.13 (헥산:EtOAc 1:1); [α]D 20=-15.8 (c=0.5, CHCl3);1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.95-7.51 (m, 16H), 7.51-7.27 (m, 11H), 7.08-6.89 (m, 12H), 6.84-6.68 (m, 3H), 5.48-5.40 (m, 2H, H-3E, CHPh), 5.23 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1B), 5.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H-2C), 5.02 (t, J = 10.2 Hz, 1H, H-4D), 4.99-4.89 (m, 3H, H-4D, H-1A, H-1D), 4.89-4.77 (m, 4H, H-1E, 2 x CH 2Ph, H-3D), 4.68 (d, J = 12.2 Hz, 2H, CH 2Ph 아노머, CH 2Ph), 4.54-4.46 (m, 4H, 3x CH 2Ph, H-1C), 4.41-4.30 (m, 3H, CH 2Ph 아노머, 2 x CH 2Ph), 4.28-4.05 (m, 8H, H-2E, H-3B, H-4A, H-2B, H-2A, H-3A, H-4B, H-6Ca), 4.00 (dd, J = 3.0, 1.7 Hz, 1H, H-2D), 3.93 (dd, J = 12.3, 3.3 Hz, 1H, H-6Ea), 3.83 (dt, J = 9.8, 3.7 Hz, 1H, H-5D), 3.73 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4C), 3.70-3.62 (m, 4H, H-6Eb, H-6Da, H-6Db, H-6Ba), 3.60-3.51 (m, 3H, H-6Bb, H-6Aa, H-3C), 3.48 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H-6Cb), 3.38 (dd, J = 11.1, 3.6 Hz, 1H, H-6Ab), 3.29 (dd, J = 9.8, 3.1 Hz, 1H, H-5A), 3.15 (dd, J = 9.9, 2.1 Hz, 1H, H-5B), 3.00 (td, J = 9.7, 5.0 Hz, 1H, H-5C), 2.15 (s, 4H, CH3 Ac, H-5E), 2.05 (d, J = 5.8 Hz, 6H, CH3 Ac), 1.99 (d, J = 11.5 Hz, 5H, CH3 Ac), 1.86 (d, J = 4.8 Hz, 6H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.6, 170.6, 170.5, 170.2, 170.1, 169.5, 169.2, 167.7, 167.6, 138.8, 138.7, 138.5, 137.9, 137.4, 137.3, 134.3, 134.1, 133.9, 133.5, 131.8, 131.8, 131.5, 130.2, 129.0, 128.8, 128.6, 128.3, 128.1, 128.1, 127.9, 127.7, 127.6, 127.6, 127.6, 127.3, 127.0, 126.9, 123.8, 123.7, 123.2, 102.4, 98.5 (C-1C), 98.0 (C-1D), 97.2 (C-1A, C-1B), 95.8 (C-1E), 78.8, 78.3, 76.7, 76.5, 75.9, 75.3, 74.6, 74.5, 74.4, 74.3, 73.5, 72.9, 71.2, 70.6, 70.6, 70.5, 69.4, 68.9, 68.6, 68.5, 68.3, 67.5, 66.2, 65.5, 62.9, 61.1, 56.6, 55.8, 54.1, 20.9, 20.7, 20.6, 20.6; HRMS (ESI): m/z: 이론치: C110H109N3O36Na: 2070.6689 [M+Na]+, 실측치 2070.6689.
벤질 (3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→2)-3,4,6-트리-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-(1→3)2-O-아세틸-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도- β-D- 글루코피라노시드 (9).
0°C 에서 CH2Cl2 (1mL)중의 8 (100 mg, 0.046 mmol)의 용액에, 에탄티올 (17 μL, 0.244 mmol, 5 eq) 및 보론트리플루오라이드 디에틸에테레이트 (1 μL, 20%)를 첨가하였다. 2시간 후, 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 농축시키고 섬광 크로마토그래피로 정제하여 (헥산:EtOAc, 3:1) 표제 화합물을 수득하였다 (75 mg, 83%).
Rf 0.1 (헥산:EtOAc 1:2); [α]D20=-3.9 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.94 - 7.41 (m, 12H, Phth), 7.35-7.22 (m, 10H, Phth, Ph), 7.16 (m, 1H, Ph), 7.07-6.93 (m, 12H, Ph), 6.74 (m, 3H, Ph), 5.72 (dd, J = 10.7, 9.1 Hz, 1H, H-3E), 5.36 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1E), 5.25 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-1B), 5.18-5.10 (m, 3H, H-4D, H-4E, H-2C), 4.96-4.91 (m, 2H, H-1D, H-1A), 4.91-4.81 (m, 3H, 2 x CH2 Bn, H-3D), 4.68 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2Ph), 4.60 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH2Ph), 4.54 (s, 1H, H-1D), 4.53-4.46 (m, 3H, 3 x CH2 Bn), 4.43-4.34 (m, 4H, 3 x CH2 Bn, H-2E), 4.29 (dd, J = 12.3, 4.8 Hz, 1H, H-6E), 4.27-4.13 (m, 5H, H-2B, H-3B, H-4A, H-2D, H-2A), 4.13-4.06 (m, 3H, H-6E, H-3A, H-4B), 3.85-3.77 (m, 4H, H-5E, H-5D, H-6Da, H-6Db), 3.75 (t, J = 9.5 Hz, 1H, H-4C), 3.68 (dd, J = 11.8, 3.4 Hz, 1H, H-6Ca), 3.62 (dd, J = 11.6, 1.7 Hz, 1H, H-6Ba), 3.57-3.50 (m, 3H, H-6Aa,H-6Bb, H-6Cb), 3.42 (dd, J = 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.34 (dd, J = 9.4, 3.5 Hz, 1H, H-3C), 3.31-3.26 (m, 1H, H-5A), 3.22-3.16 (m, 1H, H-5B), 2.98 (dt, J = 8.9, 4.1 Hz, 1H, H-5C), 2.11 (2 x s, J = 1.3 Hz, 6H, 2 x CH3 Ac), 2.06-2.00 (3 x s, 9H, 3 x CH3 Ac), 1.98 (s, 3H, CH3 Ac), 1.86 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.9, 170.8, 170.7, 170.3, 170.2, 169.5, 169.5, 168.6, 167.7, 138.7, 138.5, 138.4, 137.8, 137.3, 134.5, 133.5, 131.8, 131.4, 128.7, 128.4, 128.3, 128.2, 128.2, 128.1, 127.9, 127.6, 127.6, 127.5, 127.4, 126.9, 123.8, 123.7, 123.3, 123.2, 98.4(C-1D), 97.7(C-1C), 97.2(C-1E), 97.2(C-1A), 97.1(C-1B), 77.6, 77.5, 76.7, 75.4, 74.6, 74.6, 74.5, 74.5, 74.4, 73.4, 72.9, 72.0, 70.7, 70.6, 70.5, 69.9, 69.1, 69.0, 68.5, 68.2, 65.5, 62.5, 62.1, 62.1, 56.5, 55.8, 54.4, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7, 20.7, 20.5; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C103H105N3O36Na: 1982.6376 [M+Na]+, 실측치 1982.6331.
벤질 [(3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→2)-3,4,6-트리-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[(3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→2)-3,4,6-트리-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-(1→3)]-2-O-아세틸-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (11).
무수 CH2Cl2 (6 mL)중의 분자체를 사용한 9 (45 mg, 0.023 mmol) 및 10 (30 mg, 0.034 mmol, 1.2eq, Unverzagt, C.; Eller, S.; Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem . Eur . J. 2007, 14, 1304-1311에 따라 합성됨)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 -40°C로 냉각시키고, TMSOTf (1 μL, 0.007mmol, 25%)를 첨가하여 TLC 가 개시 물질의 완전한 전환을 보일 때까지 반응을 교반하였다 (1h). 트리메틸아민을 첨가하여 반응을 종료시키고 (5 μL), 셀라이트의 플러그를 통해서 여과시킨 후, 농축시켰다. 조 잔류물은 섬광 크로마토그래피 및 조제용(preparative) 플레이트로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. (45 mg, 74%).
Rf 0.28 (헥산:아세톤 1:1); [α]D 20=-2.8 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88-7.55 (m, 15H, Phth), 7.40 (m, J = 7.1 Hz, 1H Phth), 7.33-7.20 (m, 9H, Ph), 7.14 (m, J = 5.3, 2.8 Hz, 1H, Ph), 7.06-6.97 (m, 3H, Ph), 6.98-6.88 (m, 6H, Ph), 6.84 (m, J = 7.3 Hz, 2H, Ph), 6.81-6.67 (m, 4H, Ph), 5.69 (dd, J = 10.8, 9.1 Hz, 1H, H-1E), 5.61 (dd, J = 10.8, 9.2 Hz, 1H, H-1E'), 5.40 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1E), 5.22-5.14 (m, 4H, H-4D, H-4E, H-1B, H-1E'), 5.14-5.05 (m, 3H, H-4D', H-2C, H-4E'), 4.94 (dd, J = 10.2, 3.4 Hz, 1H, H-3D'), 4.90-4.86 (m, 2H, H-1D, H-1A), 4.83 (dd, J = 10.2, 3.2 Hz, 1H, H-3D), 4.78 (d, J = 12.9 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.72 (d, J = 12.7 Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.68-4.60 (m, 2H, CH 2 Bn), 4.53 (s, 1H, H-1C), 4.52-4.36 (m, 7H, 5 x CH 2 Bn, H-2E, H-1D'), 4.36-4.25 (m, 4H, H-2E',H-6aE CH 2 Bn 아노머, H-4D), 4.23-4.14 (m, 3H, H-3B, H-4A, H-6aE'), 4.14-4.00 (m, 6H, H-2A, H-2B, H-2D', H-3A, H-4B, H-6bE), 3.90-3.83 (m, 2H, H-5E, H-6aD), 3.84-3.70 (m, 7H, H-6bE', H-4C, H-5D, H-6bD, H-6aD', H-6bD', H-6aC), 3.67 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-5D), 3.62-3.45 (m, 3H, H-6aB, H-6bB, H-6aA), 3.36-3.27 (m, 4H, H-6BA, H-6BC, H-3C, H-5E'), 3.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-5A), 3.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H, H-5B), 3.10 (dt, J = 8.4, 3.9 Hz, 1H, H-5C), 2.13 (s, 3H, CH3 Ac), 2.09 (s, 3H, CH3 Ac), 2.02 (3 x s, 9H, 3 x CH3 Ac), 2.01-1.97 (m, 15H, 5 x CH3 Ac), 1.93 (s, 3H, CH3 Ac), 1.85 (d, J = 2.3 Hz, 6H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:171.0, 170.9, 170.8, 170.8, 170.7, 170.4, 170.3, 170.2, 169.5, 169.4, 168.3, 167.7, 167.5, 138.8, 138.7, 138.4, 138.0, 137.2, 134.5, 134.1, 133.8, 133.5, 131.8, 131.7, 131.5, 131.4, 128.7, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 128.0, 127.9, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 123.7, 123.7, 123.6, 123.2, 99.0(C-1D), 98.1(C-1C), 97.8(C-1D'), 97.2(C-1E), 97.2, 97.1, 97.0,(C-1A, C-1B, C-1E') 78.2, 78.1, 76.7, 75.8, 74.5, 74.4, 74.4, 74.3, 73.3, 73.2, 72.8, 71.8, 71.7, 70.7, 70.6, 70.5, 70.4, 70.0, 69.3, 69.1, 68.9, 68.5, 68.1, 68.1, 67.3, 65.7, 65.4, 62.5, 62.4, 61.8, 61.6, 56.5, 55.7, 54.5, 20.9, 20.9, 20.8, 20.7, 20.7, 20.5; HRMS (ESI): m/z: 계산치: C135H140N4O53Na: 2687.8275 [M+Na]+, 실측치 2687.8379.
벤질 [(2-아미노-2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D- 만노피라노실 ) -(1→6)]-[2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아미노-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아미노-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (12).
MeOH:CH2Cl2 (2:1)중의 7당류 11 (32 mg, 12 μmol)의 용액에, NaOMe (30μL, 0.5M, 1.25 eq)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, MeOH (400μL) 및 에틸렌디아민 (300μL)을 첨가하고 혼합물은 마이크로웨이브에서 30분 동안 120°C에서 3 사이클동안 가열하였다. 혼합물을 톨루엔과 에탄올을 이용하여 건조농축시켰다. 조 잔류물은 세파덱스(Sephadex) LH-2 컬럼 (MeOH:DCM 2:1)으로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (17 mg, 83%).
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 7.52 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph), 7.46-7.25 (m, 21, Ph), 7.21 (dd, J = 4.7, 2.0 Hz, 2H, Ph), 5.22 (dd, J = 6.8, 4.8 Hz, 2H, CH2Bn, H-1 Man), 5.17 (d, J = 11.5 Hz, 1H, CH2Bn), 4.98 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-1 Man ), 4.70-4.56 (m, 5H, 4 CH 2Bn, H-1 Man), 4.50 (s, 2H, CH2Bn), 4.47 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.39 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.25-4.12 (m, 3H), 4.08 (t, J = 9.2 Hz, 1H, H-4 GlcN), 4.02-3.96 (m, 1H, H-6 Glc), 3.96-3.76 (m, 12H), 3.76-3.61 (m, 10H), 3.58 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 3.48-3.42 (m, 1H), 3.41-3.32 (m, 5H), 3.31-3.19 (m, 4H), 2.83 (td, J = 10.7, 8.1 Hz, 2H, H-2 GlcN), 2.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-2, GlcN), 2.67 (dd, J = 9.7, 8.0 Hz, 1H, H-2 GlcN); HSQC 실험으로부터의 13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 128.48, 127.90, 127.93, 127.38, 127.89, 100.48, 74.34, 74.41, 97.67, 70.66, 74.24, 72.70, 99.85, 70.73, 74.33, 72.71, 72.90, 101.50, 101.71, 101.96, 101.48, 77.11, 74.70, 70.40, 76.35, 77.63, 70.20, 66.17, 61.22, 73.63, 70.36, 66.15, 68.17, 61.02, 68.29, 66.25, 60.84, 67.52, 72.89, 68.48, 75.01, 82.05, 82.63, 82.33, 76.99, 70.04, 75.54, 75.27, 76.85, 56.82, 56.18, 56.16, 56.22.
벤질 [(2- 아세타미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D- 만노피라노실 ) -(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 ( 13 C 8 ) 13 ( 13 C 8 -G0( Bn 5 )).
0°C 의 무수 MeOH 중의 7당류 12 (100 mg, 62.5 μmol)의 용액 (2 mL)에, 아세트산 무수물 13C4 (42 μL, 444 μmol) 및 NaOMe 0.5M (0.8 mL)을 첨가하였다. 2시간 후에 0℃에서 혼합물을 농축시키고 HPLC 세파덱스 LH-20 (MeOH)으로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (80 mg, 72%). 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 7.40 - 7.21 (m, 22H, arom), 7.21 - 7.14 (m, 3H, arom), 5.07 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-1D), 4.99 (dd, J = 16.3, 12.0 Hz, 2H, 2 CH 2Bn), 4.82 (d, J = 12.5 Hz, 1H, CH 2Bn), 4.79 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1D'), 4.75 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH 2Bn), 4.70 - 4.66 (m, 2H, H-1C, H-1B), 4.66 - 4.54 (m, 4H, CH 2Bn), 4.46 (dd, J = 13.9, 8.2 Hz, 4H, H-1A, H-1E, 2 CH 2Bn), 4.31 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1E), 4.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H, H-2C), 4.08 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 1H, H-2D), 3.99 (t, J = 8.5 Hz, 2H, H-4A, H-4B), 3.96 - 3.86 (m, 3H, H-2A, H-6Ca, H-6Da), 3.86 - 3.75 (m, 9H, H-6Ea, H-2B, H-4C, H-6Aa, H-6Ab, H-3D, H-3D', H-2D', H-5D), 3.75 - 3.53 (m, 14H, H-6E'a,H-6E'b, H-6Eb, H-6D'a, H-6Ba, H-3B, H-2E', H-2E, H-6Db, H-6D'b, H-6Cb, H-6Bb, H-5D', H-3A), 3.53 - 3.41 (m, 6H, H-4D', H-4D, H-5A, H-3E, H-3E', H-3C), 3.37 - 3.24 (m, 4H, H-4E', H-4E, H-5B, H-5E), 3.20 - 3.13 (m, 2H, H-3E', H-5C), 2.11 (t, J = 5.7 Hz, 3H, Ac), 1.95 (dd, J = 18.2, 6.1 Hz, 3H, Ac), 1.88 - 1.83 (m, 3H, Ac), 1.70 (dd, J = 18.1, 5.9 Hz, 3H, Ac); HSQC 실험으로부터의 13C NMR (126 MHz, MeOD): 127.9, 127.8, 127.7,127.4, 100.5(C-1E'), 100.1(C-1A,C-1B,C-1C,C-1E), 99.6(C-1D), 97.2(C-1D'), 81.5, 80.8, 80.4, 77.6, 77.1, 76.6, 76.1, 75.9, 74.9, 74.9, 74.0, 73.9, 73.8, 73.5, 73.1, 73.0, 72.9, 70.5, 70.3, 70.3, 70.2, 70.2, 68.5, 68.4, 67.8, 65.8, , 61.9, 61.7, 61.5, 61.0, 55.8, 55.8, 54.5, 22.1, 22.1, 21.6.
[(2- 아세타미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D- 만노피라노실 )-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스 ( 13 C 8 ) (14) ( 13 C 8 -G0( Bn 5 )).
7당류 13 (13 mg, 7.3μmol)을 MeOH 1 mL에 용해시키고 10%Pd/C 카트리지(cartridge) 및 용매로서 MeOH를 유속 1mL/min으로 사용하고, 50°C에서 완전한 수소 조건으로 수소 발생기를 통과시켰다. 생성된 혼합물을 농축시키고, 물에 재용해시키고 흑연 카트리지에서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (7 mg, 72%).
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.20 (d, J = 2.5 Hz, 0.6H, H-1A α- GlcNAc), 5.13 (d, J = 1.8 Hz, 1H,H-1D α-1,3-Man), 4.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1D' α-1,6-Man), 4.71 (d, J = 8.0 Hz, 0.4H, H-1A β- GlcNAc), 4.62 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H, H-1B β-GlcNAc), 4.57 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-1E β- GlcNAc, H-1E' β- GlcNAc), 4.26 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-2C), 4.20 (dd, J = 3.4, 1.6 Hz, 1H, H-2D), 4.12 (dd, J = 3.4, 1.7 Hz, 1H, H-2D'), 4.04-3.85 (m, 10H), 3.85-3.39 (m, 30H), 2.25-2.13 (m, 6H, 2Ac), 1.98-1.88 (m, 6H, 2Ac). 13C NMR (126 MHz, D2O) δ 101.4(C-1B β- GlcNAc), 100.4(C-1C β-1,4-Man), 99.6(C-1D α-1,3- Man,C-1E β- GlcNAc,C-1E' β- GlcNAc), 97.0(C-1D' α-1,6-Man), 94.8(C-1A β-GlcNAc), 90.4(C-1A α- GlcNAc), 80.4, 79.6, 79.5, 79.2, 76.4, 76.3, 75.8, 75.8, 74.6, 74.4, 74.3, 73.5, 73.4, 73.3, 72.8, 72.5, 72.0, 70.2, 70.0, 69.9, 69.6, 69.4, 69.4, 69.2, 67.3, 67.3, 65.8, 65.7, 61.7, 61.6, 60.6, 60.1, 60.0, 59.9, 56.1, 55.3, 54.9, 53.6; HRMS (ESI): m/z 계산치: C42 13C8H84N4O36Na: 1347.5031 [M+Na]+, 실측치 1347.5131.
3-안테나 복합 N- 글리칸 코어의 합성
하기의 합성은 도 4에 도시된 상응하는 화학적 구조물에 관하여 번호가 매겨진다.
벤질 [디-(O-3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-(1→4)-3,6-디-O-아세틸-α-D-만노피라노실]-(1→3)-2-O-아세틸-4,6-O-벤질이덴-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (18).
무수 DCM 중의 분자체를 사용한 수용체 7 (0.18g, 0.13mmol) 및 공여체 17 (0.21g, 0.16mmol, 1.2eq)의 용액 (2mL)을, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TMSOTf (2μL, 13μmol, 10%)를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 교반하였다. Et3N (25μL)를 첨가하여 반응을 종료시키고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과시킨 후 여과액을 농축시켰다. 조 잔류물은 섬광 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc 2:3)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (0.27g, 82%). [α]20 D: - 24.0 (c 1.05, CH3Cl). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90-7.65 (m, 17H, H-arom), 7.54 (m, 2H, H-arom), 7.42-7.26 (m, 13H, H-arom), 7.06-6.96 (m, 11H, H-arom), 6.79 (m, 3H, H-arom), 5.76 (dd, J =9.0, 10.7Hz, 1H, H-3E'), 5.44 (m, 3H, H-1E', H-3E, CHPh), 5.27 (d, J =7.8Hz, 1H, H-1A), 5.18 (m, 2H, H-2C, H-4E'), 4.96 (d, J = 8.5Hz, 1H, H-1B), 4.83 (m, 6H, H-4E, 2xCH 2 Bn, H-3D, H-1D, H-1E), 4.71, 4.65 (d, J =12.0Hz, 1H, CH 2 Bn), 4.52 (m, 4H, H-1C, 3xCH 2 Bn), 4.39 (m, 3H, 3xCH 2 Bn), 4.29-4.07 (m, 13H, H-2E', 2xH-6E', H-2A, H-2B, H-3A, H-3B, H-4A, H-4B, H-6Ca, H-5E', H-2E, H-6Da), 3.98 (m, 3H, H-5D, H-6Ea, H-2D), 3.82 (t, J =10.3Hz, 1H, H-4D), 3.73 (t, J =8.5Hz, 1H, H-4C), 3.75-3.39 (m, 8H, 2xH-6A, H-6Eb, 2xH-6B, H-3C, H-6Cb, H-6Db), 3.32 (m, 1H, H-5B), 3.19 (m, 1H, H-5A), 2.99 (m, 1H, H-5C), 2.26, 2.12 (s, 3H, CH 3 Ac), 2.08 (m, 1H, H-5E), 2.04, 2.03, 2.02, 1.84, 1.83, 1.72, 1.54 (s, 3H, CH 3 Ac). 13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.8, 170.5, 170.4, 170.2, 170.1, 170.0, 169.5, 169.2, 167.3 138.7, 138.6, 138.4, 137.8, 137.3, 137.2 , 134.3, 134.0, 133.5, 131.7, 131.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.0, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4, 127.2, 126.9, 126.8, 123.8, 123.4, 102.3, 98.1 (C-1C), 97.6 (C-1D), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.8 (C-1E), 94.8 (C-1E'), 78.8, 77.8, 76.6, 75.9, 75.1, 74.5, 74.3, 74.2, 73.3, 72.8, 72.7, 71.8, 71.0, 70.8, 70.5, 70.4, 68.6, 68.5, 68.4, 68.1, 67.4, 66.0, 63.6, 61.6, 61.1, 56.5, 55.7, 54.8, 54.0, 20.9, 20.7, 20.6, 20.4, 20.2.
벤질 [디-(O-3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-(1→4)-3,6-디-O-아세틸-α-D-만노피라노실]-(1→3)-2-O-아세틸-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (19).
EtSH (31μL, 0.25mmol, 5eq) 및 BF3·OEt2 (2μL, 10μmol, 20%)을 0℃ 에서 DCM 중의 6당류 18 (0.14g, 0.05mmol) (2mL)용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 완전한 전환까지 교반하였다 (2 hour). 이어서 Et3N으로 반응을 종료시키고, 농축시킨 후 섬광 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc 1:3)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (0.12g, 88%).
[α]20 D: +1.9 (c 0.93, CDCl3). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90-7.66 (m, 15H, H-arom), 7.32-7.24 (m, 12H, H-arom), 7.17 (m, 1H, H-arom), 7.02-6.98 (m, 10H, H-arom), 6.76 (m, 3H, H-arom), 5.78 (dd, J = 9.1, 10.7Hz, 1H, H-3E), 5.73 (m, dd, J = 9.1, 10.8Hz, 1H, H-3E'), 5.48 (d, J =7.8Hz, 1H, H-1E'), 5.27 (m, 2H, H-1E, H-1A), 5.22 (t, J =9.8Hz, 1H, H-4E'), 5.15 (d, J =3.4Hz, 1H, H-2C), 5.10 (t, J =9.7Hz, 1H, H-4E), 5.05 (dd, J =3.0, 8.5Hz, 1H, H-3D), 4.96 (d, 1H, J =8.2Hz, H-1B), 4.86 (m, 3H, CH 2 Bn, H-1D), 4.70 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.58 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.52 (m, 4H, H-1C, 3xCH 2 Bn), 4.45 (m, 1H, H-6E'a), 4.39 (m, 3H, 3xCH2 Bn), 4.34-4.04 (m, 15H, H-2E, H-2E', 2xH-6E, H-6E'b, H-2A, H-2B, H-3A, H-3B, H-4A, H-4B, H-2D, H-5E', H-6Da, H-4D), 3.82 (m, 1H, H-5E), 3.78 (m, 1H, H-5D), 3.69 (m, 2H, H-4C, H-6Ca), 3.62-3.48 (m, 5H, H-6Aa, H-6Ba, H-6Cb, H-6Ab, H-6Db), 3.44 (dd, J =3.9, 11.3Hz, 1H, H-6Bb), 3.31 (m, 2H, H-5B, H-3C), 3.20 (m, 1H, H-5A), 2.94 (m, 1H, H-5C), 2.19, 2.15, 2.11, 2.07, 2.04, 2.02, 1.88, 1.85 (s, 3H, CH 3 Ac). 13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.7, 170.2, 170.1, 170.0, 169.5, 167.6, 138.6, 138.5, 138.3, 137.8, 137.2, 134.4, 134.3, 131.6, 131.3, 128.6, 128.2, 128.1, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5, 127.4, 127.3, 127.2, 126.8, 123.7, 123.1, 98.1 (C-1D), 97.4 (C1E, C-1C), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.9 (C-1E'), 77.2, 76.5, 75.9, 75.3, 75.2, 74.5, 74.4, 74.3, 73.1, 72.8, 71.8, 71.3, 70.7, 70.5, 70.4, 68.9, 68.8, 68.5, 68.3, 68.1, 67.1, 62.7, 62.0, 61.1, 56.5, 55.7, 54.8, 54.4, 20.8, 20.7, 20.6, 20.4.
벤질 [디-(O-3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-(1→4)-3,6-디-O-아세틸-α-D-만노피라노실]-(1→3)-[ O -3,4,6-트리- O -아세틸-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→2)-3,4,6-트리- O -아세틸-α-D-만노피라노실]-(1→6)-2-O-아세틸-β-D-만노피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노실-(1→4)-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-2-프탈이미도-β-D-글루코피라노시드 (20).
무수 DCM 중의 수용체 19 (75mg, 0.03mmol), 공여체 11 (41mg, 0.05mmol, 1.5eq, Unverzagt, C.; Eller, S.; Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem . Eur . J. 2007, 14, 1304-1311에 따라 합성됨) 및 분자체의 현탁액을 (9.8mL) 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 -40℃ 로 냉각시키고 TfOH (1μL, 0.01μmol, 33%) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃ 에서 공여체가 사라질 때까지 교반하였다 (1h). 이어서, 반응을 Et3N 으로 종료시키고, 셀라이트 플러그로 여과시킨 후 농축시켰다. 잔류물은 섬광 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (60mg, 62%).
[α]20 D: +2.1 (c 0.53, CH3Cl). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.88-7.61 (m, 19H, H-arom), 7.30-7.23 (m, 11H, H-arom), 7.18, 7.04 (m, 1H, H-arom), 7.01-6.93 (m, 7H, H-arom), 6.85, 6.75 (m, 3H, H-arom), 5.79 (dd, J =9.0, 10.7Hz, 1H, H-3E'), 5.70 (m, 2H, H-3E, H-3E''), 5.45 (d, J =8.2Hz, 1H, H-1E'), 5.33 (d, J =8.4Hz, 1H, H-1E), 5.24-5.09 (m, 7H, H-1E'', H-1A, H-4E', H-4D', H-2C, H-4E, H-4E''), 4.98 (m, 2H, H-3D, H-3D'), 4.94 (d, J =8.5Hz, 1H, H-1B), 4.83 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.78 (d, J =1.8Hz, 1H, H-1D), 4.71 (m, 2H, 2xCH 2 Bn), 4.59 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.51-3.98 (m, 27H, H-1C, 6xCH 2 Bn, 2XH-6E', H-1D', H-2E'', H-2E, 2xH-6E, H-2E', H-6E''a, H-2D, H-2D', H-2B, H-3B, H-4B, H-2A, H-3A, H-4A, H-5E', H-6Da, H-4D), 3.87 (m, 2H, H-6E''b, H-5E), 3.81-3.69 (m, 6H, H-5D, H-6D'a, H-4C, H-6Ca, H6Db, H5D'), 3.59-3.45 (m, 5H, 2xH-6Aa, H-6Ba, H-6D'b, H-5E''), 3.39 (dd, J =4.0, 11.5Hz, 1H, H-6Bb), 3.33 (dd, J =5.0, 10.3Hz, 1H, H-6Cb), 3.26 (m, 2H, H-5B, H-3C), 3.17 (m, 1H, H-5A), 3.01 (m, 1H H-5C), 2.15, 2.09, 2.09, 2.05, 2.04, 2.01, 2.01, 2.00, 1.95, 1.89, 1.88, 1.87, 1.85, 1.85 (s, 3H, CH 3 Ac). 13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.8, 170.7, 170.6, 170.5, 170.3, 170.2, 170.1, 170.0, 169.9, 169.4, 169.3, 169.2, 167.6, 167.4, 138.8, 138.6, 138.3, 138.0, 137.2, 134.3, 133.4, 131.7, 131.3, 128.5, 128.2, 128.1, 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.4, 127.2, 126.8, 123.7, 123.5, 123.0, 98.6 (C-1D), 97.7 (C-1C, C-1D'), 97.3 (C-1E), 97.2 (C-1E''), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.9 (C-1E'), 77.7, 76.5, 75.8, 75.0, 74.5, 74.3, 73.0, 72.8, 72.4, 71.7, 71.2, 70.7, 70.6, 70.4, 70.2, 70.0, 69.6, 69.0, 68.9, 68.8, 68.6, 68.3, 68.1, 65.5, 62.7, 62.4, 61.9, 61.7, 61.5, 61.2, 56.5, 55.7, 54.9, 54.4, 20.7, 20.6, 20.5, 20.4, 20.3.
[(2- 아세타미도 -β-D- 글루코피라노실 )-(1→2)-α-D- 만노피라노실 ]-(1→6)-[디-(2-아세타미도-β-D-글루코피라노실)-(1→2)-(1→4)-α-D-만노피라노실]-(1→3)-b-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-3,6-디-O-벤질-2-데옥시-b-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-1,3,6-트리-O-벤질-2-데옥시-b-D-글루코피라노시드 ( 13 C 10 ) (22).
MeOH:DCM (2:1)중의 화합물 20 (43mg, 14.1μmol)의 용액 (300:150μL)에, NaOMe (42μL, 21.2μL, 1.5eq)를 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, MeOH (300μL) 및 에틸렌디아민 (300μL)을 첨가하여 혼합물을 마이크로웨이브에서 30분, 120 ℃의 3사이클동안 가열하였다. 톨루엔 및 에탄올을 사용하여 혼합물을 건조농축시켰다. 조 잔류물을 세파덱스 LH-20 컬럼 (MeOH)으로 정제하여 화합물 21을 수득하였다. 화합물 21을 0℃ 에서 MeOH (200μL)에 용해하고 아세트산 무수물 13C4 을 첨가하였다. 2시간 후에, EtOH을 첨가하여 혼합물을 농축시키고 세파덱스 LH-20 컬럼 (MeOH)으로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (11mg, 40%, 2 단계).
1H NMR (500 MHz, MeOD): 7.41-7.27 (m, 22H, H-arom), 7.19 (m, 3H, H-arom), 5.03 (m, 3H, H-1D, 2xCH 2 Bn), 4.85 (d, J= 12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.80 (d, J= 1.9Hz, 1H, H-1D'), 4.77 (d, J= 12.0Hz, 1H, 1xCH 2 Bn), 4.68-4.57 (m, 6H, H-1C, H-1B, 4xCH 2 Bn), 5.50 (m, 2H, H-1E'', H-1A), 4.46 (s, 2H, 2xCH 2 Bn), 4.43 (d, J =8.3Hz, 1H, H-1E), 4.32 (d, J= 8.3Hz, 1H, H-1E'), 4.13 (m, 1H, H-2D), 4.08 (m, 2H, H-3D, H-2C), 4.02 (m, 2H, H-4A, H-4B), 3.95-3.58 (m, 30H, H-2A, 2xH-6C, 2xH-6E, 2xH-6E'', 2xH-6E', 2xH-6D, 2xH-6D', H-5D, H-2D', H-2B, H-4C, H-3D', 2xH-6B, 2xH-6A, H-2E, H-4D, H-3B, H-2B, H-3A, H-2E', H-5D', H-4D'), 3.52-3.43 (m, 5H, H-5A, H-3E, H-3E', H-3E'', H-3C), 3.36 (m, 3H, H-5E'', H-4E', H-4E''), 3.33 (m, 2H, H-5B, H-4E), 3.26 (m, 1H, H-5E), 3.18 (m, 2H, H-5C, H-5E'), 2.14 (m, 4.5H, 13CH 3 Ac), 1.97 (dd, J= 6.4, 17.8Hz, 3H, 13CH 3 Ac), 1.89 (m, 4.5H, 13CH 3 Ac), 1.72 (dd, J = 6.4, 17.8Hz, 3H, 13CH 3 Ac). 13C NMR (126 MHz, MeOD, HSQC): 128.2-126.6, 101.6 (C-1E''), 100.5 (C-1E, C-1E''), 100.2 (C-1A), 100.0 (C-1C, C-1B), 99.6 (C-1D), 97.1 (C-1D'), 82.0, 81.0, 80.4, 78.1, 77.7, 76.5, 75.6, 75.2, 74.7, 73.9, 73.1, 72.2, 70.3, 68.3, 67.6, 65.8, 61.2, 55.7, 54.6, 22.3 (13CH3).
효소적 신장
[β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)- 2- 아세타미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[ β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)- 2- 아세타미도 -2- 데옥 시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스 (15).
770 μL 헤페스(Hepes) 완충제 (50mM, pH=7.4)중의 14 (2.126 mg, 1.6 μmol), 우리딘 5'-디포스포-α-D-갈락토오스 이나트륨 염 UDP-Gal (2.280 mg, 3.74 μmol, 2.4 eq), 소 혈청 알부민 BSA (1 mg), 200 mU 의 소 우유 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 2.4.4.22, 9.2 U의 알칼리의 포스파타아제 3.1.3.1. 및 MnCl2 (10 mM)의 용액(1 mL)을 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 혼합물을 95 °C에서 5분 동안 가열하여 효소를 침전시켰다. 원심 분리 후에, 상청액을 흑연 카트리지를 통해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (2.09, 78%).
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.12 (d, J = 2.7 Hz, 0.6H, H-1α- GlcNAc), 5.05 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-1α-1,6-Man), 4.66-4.59 (m, 0.4H, H-1β- GlcNAc), 4.53 (dd, J = 15.9, 7.9 Hz, 3H, H-1β- GlcNAc), 4.40 (dd, J = 7.8, 3.1 Hz, 2H, H-1β-Gal), 4.18 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 4.08-4.00 (m, 1H), 3.95-3.36 (m, 60H), 2.17-2.04 (m, 6H, Ac), 1.93-1.78 (m, 6H, Ac). HSQC 실험으로부터 선택된 13C NMR 피크 (126 MHz, D2O) δ = 102.9 (C-1β -Gal), 101.3 (H-1β - GlcNAc), 100.4 (C-1β -Man), 99.6(C-1α -1,3-Man), 99.5(C-1β-GlcNAc), 97.1(C-1α-1,6-Man), 94.8 (C-1β-GlcNAc), 90.4 (C-1α-GlcNAc).
[(2- 아세타미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D- 만노피라노실 )-(1→6)]-[2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-[α-L-푸코피라노실-(1→6)]-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스 (16).
770 μL MES 완충제 (80mM, pH=6.5)중의 14 (3.030, mg, 2.28 μmol), 구아노신 5'-디포스포-β-L-푸코오스 이나트륨 염 GDP-Fuc (1.760 mg, 2.77 μmol, 1.2 eq), 소 혈청 알부민 BSA (1 mg), 코어 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (50μL, 0.66mg/mL) 및 MnCl2 (20 mM)의 용액 (1　mL)을 실온에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 효소를 침전시키기 위해 생성된 혼합물을 95 °C에서 5분 동안 가열하였다. 원심 분리 후에 상청액을 흑연 카트리지로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (2.73 mg, 82%).
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.11 (d, J = 3.2 Hz, 0.6H, H-1α- GlcNAc), 5.04 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.88-4.79 (m, 2H, H-1α-1,6-Man, H-1α- Fuc), 4.64-4.55 (m, 0.4H+1H, H-1β- GlcNAc ), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-1β- GlcNAc), 4.18 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 4.09-3.98 (m, 2H), 3.98-3.75 (m, 11H), 3.75-3.31 (m, 33H), 2.25-2.04 (m, 6H, Ac), 1.95-1.78 (m, 6H, Ac), 1.14 (dd, J = 6.6, 4.8 Hz, 3H, CH3 Fuc). HSQC 실험으로부터 선택된 13C NMR (126 MHz, D2O) δ = 101.0 (C-1β- GlcNAc), 100.3 (C-1βMan), 99.6 (C-1β- GlcNAc), 99.5 (C-1α-1,3-Man), 99.5 (C-1α- Fuc), 97.0(C-1α-1,6-Man), 94.8 (C-1β-GlcNAc) , 90.4 (C-1α-GlcNAc, 15.4 (CH3 Fuc).
[β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-2- 아세타미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 -(1→2)-α-D-만노피라노실)-(1→6)]-[β-D-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노실-(1→3)]-β-D-만노피라노실-(1→4)-2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실-(1→4)-[α-L-푸코피라노실-(1→6)]-2-아세타미도-2-데옥시-α,β-D-글루코피라노오스 (17).
450 μL의 Hepes 완충제 (50mM, pH=7.4)중의 16 (1.836 mg, 1.6 μmol), 우리딘 5'-디포스포-α-D-갈락토오스 이나트륨 염 UDP-Gal (2.210 mg, 3.62 μmol, 2.9 eq), 소 혈청 알부민 BSA (1 mg), 200 mU 의 소 우유 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 2.4.4.22, 9.2 U 의 알칼리의 포스파타아제 3.1.3.1. 및 MnCl2 (10 mM)의 용액 (0.5 mL)을 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 혼합물을 효소를 침전시키기 위해 95 °C에서 5분 동안 가열하였다. 원심 분리 후에 상청액을 흑연 카트리지로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (1.80 mg, 80%).
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.11 (d, J = 3.1 Hz, 0.6H, H-1α- GlcNAc), 5.05 (d, J　=　1.5 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.85 (s, 1H, H-1α-1,6-Man), 4.82 (t, J = 3.7 Hz, 1H, H-1α- Fuc), 4.62 (d, J = 7.9 Hz, 0.4H, H-1β- GlcNAc), 4.59 (d, J　= 7.7 Hz, 1H, H-1β- GlcNAc), 4.51 (d, J = 7.7 Hz, 2H, H-1β- GlcNAc), 4.40 (dd, J = 7.8, 2.7 Hz, 2H, H-1β-Gal), 4.18 (s, 1H), 4.12 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.08-4.00 (m, 2H), 3.97-3.39 (m, 54H), 2.18-2.07 (m, 6H), 1.92-1.81 (m, 6H, Ac), 1.14 (dd, J = 6.6, 5.0 Hz, 3H, CH3 Fuc). HSQC 실험으로부터 선택된 13C NMR 피크 (126 MHz, D2O) δ = 102.9 (H-1β -Gal), 101.0 (H-1β - GlcNAc ), 100.4 (H-1β -Man), 99.5 (H-1β - GlcNAc ), 99.5 (H-1α-1,3-Man), 99.3 (H-1α - Fuc), 96.8 (H-1α -1,6-Man), 94.8 (H-1β - GlcNAc), 90.4 (C-1α - GlcNAc), 15.5 (CH3, Fuc).
비대칭성 단일- 글리코실화된 글리칸 표준물의 제조
13 C 8 -G0( Bn 5 ) 의 갈락토실화
부분적으로 탈보호된 13 C 8 -G0( Bn 5 ) 표준물 13 (1.1 mg)을 MnCl2 2mM 및 BSA을 포함하는 pH 7.4의 HEPES 완충제 50mM 중의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (200 mU) 및 우리딘 이인산염 갈락토오즈 (UDP-Gal, 1.25 당량)으로 처리하였다. 37 °C 에서 1시간의 반응 후, 95°C에서 5분 동안 가열함으로 단백질 분획을 침전시켜 여과로 제거하였다. 상기 용액을 직접적으로 UPLC-MS에 의해 분석한 결과, 13 C 8 -G1 6 ( Bn 5 ) 및 13 C 8 -G1 3 (Bn 5 )으로 각각 23% 및 26% 전환되었다. 상기 반응은 10 mg 의 13 C 8 -G0( Bn 5 )를 수용체로 사용하여 확장될 수 있었다.
10 mg 의 13 C 8 -G0( Bn 5 )의 효소적 신장으로부터 단백질 침전 후에 반응 미정제물을 증발시키고 이어서 상이한 화합물을 역상 물/ACN의 C18 반-제조 컬럼에서 HPLC로 정제하여 화합물 13 C 8 -G1 3 ( Bn 5 ) (2.4 mg), 13 C 8 -G1 6 ( Bn 5 ) (2.2 mg) 및 13 C 8 -G2( Bn 5 ) (2.0 mg)을 순수한 형태로 수득하였다(여기서 G13 및 G16은 각각 단일-갈락토실화된 화합물이고 G2는 이-갈락토실화된 화합물이다).
MeOH 중에서 2개의 이성질체 단일-갈락토실화된 화합물을 10% Pd/C 카트리지를 갖는 H-큐브 유속 반응기에서 1기압의 H2 기체를 사용하여 가수소분해 하에 순수한 형태의 13C-표지된 N-글리칸 13 C 8 -G1 3 (1.2 mg) 및 13 C 8 -G1 6 (1.1 mg)를 수득하였다.
13 C 8 -G1 6 의 푸코실화
화합물 13 C 8 -G1 6 (1.1 mg)를 pH 6.5의 MgCl2 2mM을 포함하는 MES 완충제 50 mM 중의 코어 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 및 구아노신 이인산염 푸코오스 (GDP-Fuc, 1.10 당량)로 처리하였다. 30 °C 에서 18시간의 반응 후, 95°C에서 5분 동안 가열함으로 단백질 분획을 침전시켜 여과로 제거하였다. 글리칸 13 C 8 - G1 6 F를 흑연화 탄소 카트리지로 정제하였다.
13 C 8 -G0( Bn 5 ) 의 갈락토실화
부분적으로 탈보호된 13 C 8 -G0( Bn 5 ) 표준물(20 μg)을 pH 7.4의 MnCl2 2mM 및 BSA을 포함하는 HEPES 완충제 50mM 중의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (200 mU) 및 우리딘 이인산염 갈락토오즈 (UDP-Gal, 6.0 당량)로 처리하였다. 37 °C 에서 1시간의 반응 후, 95°C에서 5분 동안 가열함으로 단백질 분획을 침전시켜 여과로 제거하였다. 상기 용액을 직접적으로 UPLC-MS에 의해 분석한 결과, 13 C 8 -G2( Bn 5 )로 완전히 전환되었다.
이-갈락토실화된 화합물 13C8-G2(Bn5) (20 ug)를 에서 18시간 동안 30 °C로 pH 4.5의 인산염/구연산염 완충제 50 mM 중의 에이. 오리재(A. oryzae ) (15 mU) 의 β-1,4-갈락토시다아제로 처리하였으며, 반응을 MeOH (20 μL)의 첨가로 종료시켰다. 상기 용액을 직접적으로 UPLC-MS 에 의해 분석한 결과 단일-갈락토실화된 화합물 13 C 8 -G1 6 (Bn 5 ) 및 13 C 8 -G1 3 (Bn 5 )로의 각각 10% 및 46% 전환되었다.
비대칭성 α-2,3- 시알화된 글리칸 표준물의 제조
13 C 8 -G2( Bn 5 ) 의 시알화
반응을 이전에 제조된 이-갈락토실화된-2-안테나 13 C 8 -G2( Bn 5 ) (10　nmol)로부터 분석적인 규모로 수행하였다. 상기 화합물을 MgCl2 20 mM을 포함하는 pH 8.0의 Tris.HCl 완충제 100 mM 중의 피 멀토시다(P multocida)의 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 10 mU 및 시티딘 단당류 N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuNAc, 4 당량)으로 37°C에서 30분 동안　처리하였다. 상기 반응을 MeOH (20　μL)로 종료시켰다. 상기 용액을 UPLC-MS에 의해 직접적으로 분석한 결과 (3- 및 6-단일-시알화된 산물에 상응하는) 2개의 이성질체 피크로 분리되는 단일-시알화된 화합물 13 C 8 - G2A1(Bn 5 )로 46% 및 이-시알화된 화합물 13 C 8 -G2A2(Bn 5 )로 32% 전환되었다.
상기 반응을 이전에 제조된 이-갈락토실화된 2-안테나 13 C 8 -G2( Bn 5 )에서 제조 규모로 수행하였다. 500μL의 Tris·HCl 완충제 (1M, pH=8)중의 13 C 8 - G2Bn 5 (1.0mg, 0.48μmol), 시티딘 -5'-1인산염-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염 CMP-NeuAc (0.72mg, 0.96μmol, 2eq), 파스투렐라 멀토시다 ( Pasteurella multocida )로부터의 100mU 의 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 2.4.99.4 및 MgCl2 (100mM)의 용액 (100μL)을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. MeOH (500μL)을 생성된 혼합물에 추가하여 효소를 침전시켰다. 원심 분리 후, 상청액을 역상 물/ACN의 C18 반제조 컬럼의 HPLC로 정제하여 3개의 신규의 동위 원소로 표지된 글리칸 표준물[2개의 13 C 8 -G2A1(Bn 5 ) 화합물 및 13 C 8 -G2A2(Bn 5 )]을 수득하였다.
13 C 8 - G1A1 3 Bn 5 의 합성
500μL의 Tris·HCl 완충제 (1M, pH=8)중의 13 C 8 -G1 3 ( Bn 5 ) (1.0mg, 0.52μmol), 시티딘 -5'-1인산염-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염 CMP-NeuAc (0.78mg, 1.04μmol, 2eq), 100mU 의 파스투렐라 멀토시다 ( Pasteurella multocida )로부터의 100mU 의 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 2.4.99.4 및 MgCl2 (100mM)의 용액 (100μL)을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. MeOH (500μL)을 생성된 혼합물에 추가하여 효소를 침전시켰다. 원심 분리 후, 상청액을 역상 물/ACN의 C18 반제조 컬럼의 HPLC로 정제하여 화합물 13 C 8 - G1A1 3 ( Bn 5 ) (0.68 mg, 59% 수율)을 수득하였다.
α-2,6- 실릴화된 글리칸 표준물의 제조
반응을 이전에 제조된 두 번-갈락토실화된 2-안테나 13 C 8 -G2( Bn 5 ) (5　nmol)로부터 분석 규모로 수행하였다. 상기 화합물을 2 mM의 MnCl2를 포함하는 pH 6.1의 카코딜염산 50 mM 완충제 중의 0.25 mU 의 인간 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 및 시티딘 1인산염 N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuNAc, 1-4 당량)으로 37°C에서 2-4 시간동안 처리하였다. 반응을 MeOH (20 μL)의 첨가로 종료시켰다. 상기 용액을 UPLC-MS에 의해 직접적으로 분석한 결과를 표 3에 제시하였다.
절단된 N - 글리칸 표준물의 제조
13 C 8 -G0( Bn 5 ) (3mg)을 pH 4.5의 아세트산 암모늄 완충제 50 mM 중의 코나발리 아 엔시포르미스 ( Conavalia ensiformis )로부터의 100 mU 의 N-아세틸 글루코사미니다아제로 실온에서 6시간 동안 처리하였다. 반응을 MeOH (20 μL)를 첨가하여 종료시켰다. 상기 용액을 UPLC-MS에 의해 직접적으로 분석한 결과, 13 C 6 - MGn 3 ( Bn 5 ), 13 C 6 -MGn 6 (Bn 5 ) 및 13 C 4 - Man3(Bn 5 )으로 각각 20 %, 26% 및 25% 전환되었다. 반제조 HPLC 정제 후에, 순수한 화합물 13 C 6 - MGn 3 ( Bn 5 ) (2.2 mg), 13 C 6 - MGn 6 ( Bn 5 ) (2.0 mg) 및 13 C 4 -Man3(Bn 5 ) (1.7 mg)을 수득하였다.
3개의 단리된 화합물을 10% Pd/C 카트리지를 갖는 H-큐브 흐름 반응기에서 1 기압의 H2기체를 사용하여 MeOH 에서 가수소분해 하에 순수한 형태의 13C-표지된 N-글리칸 13 C 6 - MGn 3 (1.2　mg) 및 13 C 6 - MGn 6 (1.1 mg) 및 13 C 4 - Man3 (0.7 mg)를 수득하였다.
13 C 6 - MGn 3 의 푸코실화
화합물 13 C 6 - MGn 3 (1.2 mg)을 MgCl2 2mM을 포함하는 pH 6.5의 MES 완충제 50 mM 중의 was treated with 코어 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 및 구아노신 2인산염 푸코오스 (GDP-Fuc, 1.10 당량)로 처리하였다. 30 °C 에서 18시간의 반응 후에 단백질 분획을 95°C에서 5분 동안 가열함으로 침전시켜 제거하였다. 글리칸 13 C 6 - MGn 3 F을 흑연화 탄소 카트리지로 정제하였다.
부분적으로-보호된 3-안테나 코어 22 의 갈락토실화
300μL의 HEPES 완충제 (50mM, pH=7.4)중의 3-안테나 22 (120μg, 0.06μmol), 우리딘 5'-인산염-α-D-갈락토오스 2나트륨 염 UDP-Gal (55μg, 0.09μmol, 1.5eq), 24mU 의 소 우유 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 2.4.4.22 및 MnCl2 (10mM) 의 용액 (24μL)을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 혼합물을 95℃ 에서 5분간 가열하여 효소를 침전시켰다. 원심 분리 후에, 상청액을 UPLC-MS에 의해 직접적으로 분석하였다. 비-갈락토실화된 개시 물질에 더해 7개의 가능한 갈락토실화된 산물을 모두 검출하였다 (삼, 3개 모두 이 및 3개 모두 단일).
참고문헌:
정보 공개 진술서의 부분으로 제출된 참고문헌을 포함하여 본원에 참조되거나 본 출원에 제출된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 전체가 참고문헌으로 삽입된다.
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Claims (41)

  1. 질량 분광법의 내부 표준물로서 사용하기 위한 동위 원소로 표지된 글리칸의 합성 방법으로서,
    하나 이상의 보호기들에 의해 임의로 보호된 올리고당류 코어 구조물을 동위 원소로 표지된 아실화제로 아실화시켜 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물을 수득하는 단계; 및
    생성된 동위 원소로 표지된 올리고당류를 효소적으로 유도체화하여 상기 동위 원소로 표지된 글리칸을 수득하는 단계를 포함하는, 방법
  2. 제1항에 있어서, 효소적 유도체화가 효소적 가수분해 단계를 포함하여 말단 당 단위를 제거하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소적 유도체화가 글리코실트랜스퍼라제 및 적절한 당 공여체를 사용한 효소적 신장 단계를 포함하고, 임의로 상기 효소적 신장 단계는 그 자체가 동위 원소로 표지된 당 단위를 삽입하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물이 효소적 유도체화 동안 하나 이상의 보호기들로 보호되는, 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물이 하나 이상의 임의로 치환된 벤질기로 보호되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고당류 코어 구조물이 제1단당류 단위 및 제2단당류 단위를 포함하는 이당류 모티프를 포함하고, 상기 제1단당류 단위 및/또는 제2단당류 단위 중 하나 이상이 아미노기를 포함하고, 아실화가 아미노기(들)에서 일어나는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고당류 코어 구조물이 제1단당류 단위 및 제2단당류 단위를 포함하는 이당류 모티프를 포함하고,
    상기 제1단당류 단위는 GlcN, GalN, ManN, FruN, FucN, Mur, 또는 Neu 중에서 선택되고; 상기 제2단당류 단위는 Glc, Gal, Man, Rha, Fru, Fuc, GlcN, GalN, ManN, FruN, FucN, Mur, Neu, GlcNAc, GalNAc, ManNAc, FruNAc, FucNAc, MurNAc, NeuNAc, 시알산, 또는 이노시톨 중에서 선택되며;
    상기 제1단당류 당 및 제2당류 당 단위들이
    제1단당류 - 제2단당류, 또는
    제2단당류 - 제1단당류의 순서로 연결되는, 방법
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이
    GlcN-GlcN
    Gal-GalN
    GalN-GlcN
    중에서 선택된 모티프를 포함하는 올리고당류 코어 구조물을 동위 원소로 표지된 아실화제와 반응시키는 것을 포함하는, 방법
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 모티프: Man-GlcN-GlcN
    를 포함하는 올리고당류 코어 구조물을 동위 원소로 표지된 아실화제와 반응시켜 Ac*가 동위 원소로 표지된 아세틸기인 모티프: Man-GlcNAc*-GlcNAc*
    를 포함하는 올리고당류를 수득하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 화학식(A)의 올리고당류를 화학식(B)의 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물을 생성하기 적합한 조건하에서 동위 원소로 표지된 아세틸화제와 반응하시키는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00032

    상기 식에서,
    각각의 R1은 독립적으로 H 또는 보호기이고;
    R2는 독립적으로 H 또는 보호기이며;
    각각의 R3은 독립적으로 H, 보호기, 또는 (Sac)m 이고, 여기서 각각의 Sac는 단당류 단위이고 m은 1내지 5의 수이다.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 화학식(C)의 올리고당류를 화학식(D)의 동위 원소로 표지된 올리고당류 코어 구조물을 생성하기 적합한 조건하에서 동위 원소로 표지된 아세틸화제와 반응시키는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00033

    상기 식에서,
    각각의 R1은 독립적으로 H 또는 보호기이고;
    R2는 독립적으로 H 또는 보호기이며;
    각각의 R3은 독립적으로 H, 보호기, 또는 (Sac)m 이고, 여기서 각각의 Sac는 단당류 단위이고 m은 1 내지 5의 수이다.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, R2가 H인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1 이 벤질이고, R2 가 H이며, 및 각각의 R3가 H인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 동위 원소로 표지된 아실화제가 동위 원소로 표지된 아세트산 무수물인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 동위 원소로 표지된 아세틸화제가 (13CH3 13C=O)2, (13CH3C=O)2, (CH3 13C=O)2, (CD3C=O)2, (13CD3 13C=O)2, (13CD3C=O)2 또는 (CD3 13C=O)2 중에서 선택되는, 방법.
  16. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Ac*가 -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3, -(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3, -(C=17O)CH3, 또는 -(C=18O)CH3 중에서 선택되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 동위 원소로 표지된 올리고당류의 아세틸-헥소스아민 단위의 유리 아노머 위치에 옥사졸린을 형성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 펩티드, 지질 또는 단백질을 글리코실화시켜 동위 원소로 표지된 올리고당류를 포함하는, 동위 원소로 표지된 당펩티드, 펩티도글리칸, 당지질, 당단백을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득할 수 있는 동위 원소로 표지된 올리고당류 또는 당접합체.
  20. 하기 중에서 선택되는 모티프를 포함하는 글리칸:
    Figure pct00034

    상기 식에서, 각각의 Ac*는 동위 원소로 표지된다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 모티프가 Man-GlcNAc*-GlcNAc*이고, 여기서 각각의 Ac*가 동위 원소로 표지되는, 글리칸.
  22. 제21항에 있어서, 상기 글리칸이 모티프:
    Figure pct00035
    를
    포함하고, 여기서 각각의 Ac*가 동위 원소로 표지되는, 글리칸.
  23. 제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Ac*가 -(13C=O)13CH3, -(C=O)13CH3, -(13C=O)CH3, -(C=O)CD3, -(13C=O)13CD3, -(C=O)13CD3, -(13C=O)CD3, -(14C=O)14CH3, -(C=O)14CH3, -(14C=O)CH3, -(C=17O)CH3, -(13C=17O)CH3, -(C=17O)13CH3, -(13C=17O)13CH3, -(C=18O)CH3, -(13C=18O)CH3, -(C=18O)13CH3, -(13C=18O)13CH3 중에서 선택되는, 글리칸.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리칸이 하나 이상의 추가의 단당류 단위들을 포함하는, 글리칸.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 동위 원소 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 샘플에 첨가하여 도핑된(doped) 샘플을 수득하는 단계, 및 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석는 단계를 포함하여, 샘플 중의 글리칸을 확인하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 공지된 양의 동위 원소로 표지된 글리칸을 샘플에 첨가함으로써 분석물 글리칸과 연관된 이온 피크 및 동위 원소로 표지된 글리칸과 연관된 이온 피크의 상대적인 강도 비교에 의해 샘플 중의 글리칸을 정량화하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
    (ii) 상기 태그된 표준물을 샘플에 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
    (iii) 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크들을 수득하는 단계;
    (iv) 태그된 표준물과 연관된 이온 피크들의 정체(identity) 및 강도를 도핑된 샘플의 스펙트럼 내의 추가의 이온 피크들과 비교하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 태그된 표준물이 분석물 글리칸에 대한 다수의 동위 원소로 표지된 "해비" 이소토폴로그 (isotopologue)를 포함하고, 상기 방법의 단계 (iv)가
    (a) 각각의 해비 이소토폴로그와 연관된 이온 피크의 상대적 강도 (I j *)를 상기 표준물 내의 글리칸의 공지된 존재비 (m j *)와 서로 연관시켜 m j 의 선형 함수로서 I j 를 수득하는 단계;
    (b) 임의로 상기 연관성에 대한 결정자 R 2 의 계수를 계산하고 R 2 의 값이 예정된 값보다 큰 경우 가장 많은 이온 피크를 디스카운트하는 단계;
    (c) 임의로 단계 (ii)를 한 번 이상 반복하는 단계;
    (d) 상기 함수를 사용하여 분석물 글리칸의 "라이트(light)" 이소토폴로그의 양을 계산하는 단계;
    (e) 임의로 분석물 글리칸의 "라이트" 이소토폴로그의 총량을 사용하여 존재하는 분석물 글리칸의 총량을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법이 도핑된 샘플을 분석하기 전에 상기 글리칸(들)을 유도체화하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분광법이 MALDI-ToF, 직접 주입 ESI-ToF 또는 LC-MS인, 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 질량 분광법으로 분석 중 탠덤(tandem) 질량 분광법에 의한 단편화(fragmentation)를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 중의 글리칸이 재조합 당단백 또는 항체로부터 방출된 글리칸인, 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 중의 글리칸이 의학적 질병 또는 장애 또는 생물학적 과정과 연관되는 바이오마커인, 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 의학적 질병 또는 장애 또는 생물학적 과정의 지표로서 하나 이상의 상기 글리칸의 존재 또는 양을 연관시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 의학적 질병 또는 장애가 암, 심혈관계 질환, 염증성 피부병, 진성 당뇨병, 위장관질환, 간 질환, 빈혈, 면역학적 질환 또는 장애, 자가면역질환, 류마티스성 관절염을 포함하는 관절염, 감염 질환병, 신장병, 신경계 질환, 폐 질환 또는 글리코실화의 선천성 장애 중에서 선택되는, 방법.
  36. 하기 단계를 포함하는 진단 방법에 사용하기 위한, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 동위 원소로 표지된 글리칸:
    (i) 환자로부터 질병 또는 장애와 연관된 글리칸을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계;
    (ii) 상기 질병 또는 장애와 연관된 글리칸에 상응하는, 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물을 선택하는 단계;
    (iii) 상기 샘플에 상기 태그된 표준물을 첨가하여 도핑된 샘플을 수득하는 단계;
    (iv) 상기 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하여 이온 피크를 수득하는 단계;
    (v) 상기 태그된 표준물과 연관된 이온 피크의 정체와 강도를 상기 도핑된 샘플의 스펙트럼 내의 추가의 이온 피크와 비교하여, 샘플 중의 하나 이상의 글리칸의 존재를 확인하고, 및 임의로 정량화하는 단계;
    (vi) 상기 하나 이상의 글리칸의 존재로 질병 또는 장애를 진단하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 상기 의학적 질병 또는 장애가 암, 심혈관계 질환, 염증성 피부병, 진성 당뇨병, 위장관 질환, 간 질환, 빈혈, 면역학적 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염을 포함하는 관절염, 감염 질환, 신장병, 신경계 질환, 폐 질환 또는 글리코실화의 선천성 장애 중에서 선택되는, 이의 방법에 사용하기 위한, 글리칸.
  38. (a) 하나 이상의 동위 원소로 표지된 글리칸을 포함하는 태그된 표준물; 및
    (b) 글리칸을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 태그된 표준물로 도핑하여 도핑된 샘플을 수득하고 상기 도핑된 샘플을 질량 분광법으로 분석하기 위한 지침을 포함하는, 샘플 중의 글리칸을 확인하기 위한 키트.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 설명이 상기 태그된 표준물에 대한 질량 분광측정 데이터를 포함하는, 키트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 지침이 상기 태그된 표준물과 연관된 이온 피크를 질량 스펙트럼 내의 추가의 이온 피크를 비교하는 단계를 포함하는, 키트.
  41. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 동위 원소로 표지된 글리칸의 제38항, 제39항 또는 제40항 중 어느 한 항에 따른 키트에서의 용도.
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