KR20230135370A - 정량질량분석법을 위한 엔도글리코시다제의 트랜스글리코실화와 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린에 의한 당단백질의 동위원소 표지법 - Google Patents

정량질량분석법을 위한 엔도글리코시다제의 트랜스글리코실화와 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린에 의한 당단백질의 동위원소 표지법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당단백질의 효소적 동위원소 표지법에 의한 정량 질량분석법에 관한 것으로, 구체적으로 동위원소로 표지되어 새로운 질량값을 갖는 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린 및 엔도글리코시다제의 활성을 이용한 트랜스글리코실화 반응을 통해 글리코펩타이드의 비교정량이 가능한 질량분석법에 관한 것이다.

Description

정량질량분석법을 위한 엔도글리코시다제의 트랜스글리코실화와 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린에 의한 당단백질의 동위원소 표지법{METHOD OF ISOTOPE LABELING OF GLYCOPROTEINS BY TRANSGLYCOSYLATION OF ENDOGLYCOSIDASE AND ISOTOPICALLY LABELED AMINOSUGAR OXAZOLINE FOR QUANTITATIVE MASS SPECTROMETRY}
본 발명은 당단백질의 효소적 동위원소 표지법에 의한 정량 질량분석법에 관한 것으로, 구체적으로 동위원소로 표지되어 새로운 질량값을 갖는 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린 및 엔도글리코시다제의 활성을 이용한 트랜스글리코실화 반응을 통해 글리코펩타이드의 비교정량이 가능한 질량분석법에 관한 것이다.
많은 단백질은 번역 후 변형(post-translational modification, PTMs) 과정을 통해 단백질의 3차원적 구조 변형(conformational change)을 일으켜 기능적 변화를 유도하여 다양한 생명현상을 나타내는 중요한 과정을 거친다. 가장 중요한 PTM 중 하나인 글리코실화(glycosylation)는 당단백질(glycoprotein)을 합성하는 중요한 생합성 과정이며 진핵세포의 50% 이상 단백질에서 발견되는, 단백질 구조의 특정한 잔기에 탄수화물(carbohydrate)이 공유결합되는 변형이다. 그 중, N-연결 글리코실화는 단백질의 아스파라진(Asn, N) 잔기의 질소에 당을 연결하는 과정으로 -Asn-Ser/Thr- 형태의 공통서열(consensus sequence)에서 주로 일어나는 효소적 글리코실화 반응이다.
당단백질의 기능과 세포생명현상에서 다양한 단백질의 글리코실화가 암, 면역 등의 질병과 깊은 관련이 있다는 것이 밝혀지며 당단백질의 정성적·정량적 분석의 중요성이 대두되어 왔다. 특히 상태가 다른 세포에서 발생한 글리코실화 정도에 대한 최초의 연구는 1969년 정상 및 비정상 섬유세포에서 추출된 단백질로부터 수행되었으며, 이후 암과 글리코실화의 연관성이 연이어 밝혀지면서 급격한 주목을 받기 시작했다. 질병상태의 유기체에서 발생하는 글리코실화 정도는 정상상태의 것과 다르며 질병의 종류마다 특이적인 패턴의 글리칸(glycan)을 가지는 당단백질을 구성하므로, 비정상적인 글리칸을 가지는 당단백질의 발현을 분석하는 것은 질병에 대한 신속하고 고감도의 진단이 가능한 바이오마커(biomarker)로 활용되고 있다.
이러한 단백질은 당단백질과 같이 다양한 PTMs를 겪으며 구조가 복잡할 뿐만 아니라, 유기체에 대한 복잡한 생리학적 정보를 함유하고 있기 때문에 고감도의 강력한 분석 기술이 요구된다. 이런 이유로 다양한 생화학적 분석법 중 질량분석법(mass spectrometry, MS)은 단백질과 같은 생체 고분자에 대해 가장 유용하고, 독보적인 분석기법이 되었다. 하지만 복잡한 생체시료의 정량적 당단백질의 분석에서는 매트릭스(matrix)의 구성이 복잡하고 다양한 글리칸을 가진 당단백질의 표준물 합성이 어렵기 때문에 외부표준물의 사용이 제한된다. 이러한 문제로 질량분석법의 정량법으로 동위원소 표지법이 적용되어 내부표준물 또는 비교정량분석에 응용되고 있다. 정량적 질량분석법에 의한 단백질의 다양한 동위원소 표지법이 생명체의 대사경로를 이용하는 생체내(in vivo) 전략과 화학적, 효소적 표지법의 생체외(in vitro) 전략으로 개발되었다.
생체내 동위원소 표지전략은 동위원소원(isotope source)으로 동위원소 함유 단량체를 모델 생물에 공급하여 대사경로를 통해 단백질을 포함하는 생체 고분자에 동위원소를 함입시키는 대사적(metaboilc) 전략이다. 반면, 생체외 표지전략은 생명체를 사용하지 않는 전략으로서, 화학반응을 통해 안정한 동위원소를 분석물 분자에 공유결합시키는 화학적(chemical) 표지법과 생체 촉매인 효소를 이용하는 효소적(enzymetical) 표지법으로 나뉠 수 있다. 이 중 효소적 표지법은 효소-기질 특이성을 통해 복잡한 혼합물 속의 특정한 형태의 목표 물질만을 선택적으로 동위원소로 표지할 수 있어 유용하게 이용될 수 있다.
한편 글리코믹스는 당단백질의 글리칸을 연구하는 학문으로, 현재 바이오시밀러와 같은 의학분야 연구에 가장 핵심적인 연구분야이다. 글리코믹스에서 진행되고 있는 연구분야는 당단백질의 발현에 따른 글리칸의 구조와 생합성에 대해, 글리칸이 어떻게 정량적으로 변하는 지를 결정하는 것으로, 글리칸의 정량적인 변화는 많은 질병의 진단과 연관되어 있기 때문에 글리칸의 정량 분석에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
지금까지 개발된 글리칸의 비교정량 질량분석법은 13C아이오도메테인(13CH3I) 퍼메틸화 표지법, QUIBL(Quantification by Isobaric Labeling) 및 IDAWG(Isotopic Detection of Aminosugars With Glutamine)와 같은 기술로 생물학적으로 다른 조건을 가지는 시료의 비교 분석에 이용되고 있다. 그러나 글리칸 구조의 변이에 의해 발생하는 글리칸의 미소이질성(microheterogeneity)에 의하여 특정 글리칸을 분리하고 규명하는 어려움이 있으며, 이에 고감도 및 고출력 분석 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이렇게 당단백질의 글리칸에 대한 다양한 동위원소 표지법이 개발되고 있는 반면, 당단백질과 같이 당을 포함한 단백질에 대한 동위원소표지법의 개발은 기존의 단백질 동위원소표지법을 적용하며 당단백질에 대한 동위원소표지법은 기술적으로 제한된 것이 사실이다.
이에 본 발명자는 정량적 질량분석법을 위하여 효소적으로 당단백질에 동위원소를 표지하는 새로운 당단백질 동위원소 표지법의 기술을 제안하고자 한다. 이를 위하여 본 발명자는 당단백질에 아미노당(aminosugar) 옥사졸린(Oxazoline)을 트랜스글리코실화(transglycosylation) 시키는 엔도글리코시다제(Endoglycosidase)의 활성을 이용하여, 당단백질에 동위원소를 표지하는 새로운 기술을 발명하였다. 즉, 동위원소 표지 당단백질과 비표지 당단백질 사이의 질량 차이와 존재비를 통해 상대 정량이 가능한 질량분석법을 개발하였다.
이에, 본 발명의 목적은 동위원소로 표지된 아미노당을 이용하여 새로운 질량값을 갖는 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린화를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아미노 단당류에서 아미노당 옥사졸린의 합성법을 이용하여 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 획득법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동위원소로 표지된 아미노당 옥사졸린을 이용하여 동위원소 표지 글리코펩타이드 합성을 통한 비교정량 질량분석 방법에 관한 것이다.
본 발명은 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 합성에 관한 것으로, 구체적으로는 동위원소로 표지되어 새로운 질량값 210.17 m/z을 갖는 아미노당 옥사졸린과 엔도글리코시다제(Endoglycosidase)의 트랜스글리코실화 활성을 이용하여, 동위원소 표지 글리코펩타이드의 합성을 통해 글리코펩타이드의 비교정량이 가능한 질량분석법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 당단백질의 효소적 동위원소 표지법에 의한 정량 질량분석법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 정상 아미노당 옥사졸린; 및 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린;을 포함하는 아미노당 옥사졸린 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 아미노당 옥사졸린 조성물은 동위원소 표지로 인하여, 정상 아미노당 옥사졸린의 질량값 204.17 m/z이 동위원소로 표지된 옥사졸린의 질량값 210.17 m/z으로 변화된 아미노당 옥사졸린 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 옥사졸린(Oxazoline)의 분자식은 C3H5NO이고, 분자량은 71.1이며 헤테로고리 화합물일 수 있다. 옥사졸린의 구조이성질체는 이중 결합의 위치에 따라 3가지가 가능할 수 있으며, 그 중 일반적인 형태는 2-옥사졸린일 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노당은 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine, GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine, GalNAc), 및 N-아세틸만노사민(N-Acetylmannosaminem, ManNAc)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있으며, 예를 들어, N-아세틸글루코사민일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 아미노당의 옥사졸린화는 당단백질의 정량적 질량분석법에 활용하기 위하여，동위원소 표지 아미노당을 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린으로 합성하는 것일　수　있다.
본 발명에 있어서 동위원소는 13C, 15N, D 및 18O 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 13C일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량값은 정상 아미노당 옥사졸린의 질량값인 204.17 m/z에서 210.17 m/z로 증가한 것일 수 있으나, 다양한 동위원소 및 아미노당을 조합할 수 있으므로 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의　질량값은 210.17 m/z인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노당 옥사졸린은 아미노당 및 옥사졸린을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량값은 210.17 m/z로, 자연에 존재하지 않는 새로운 질량을 가지는 물질이며, 질량스펙트럼의 방해를 피할 수 있으므로 글리칸　또는　당펩타이드에　효소에　의한　동위원소 표지　물질로 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노당 옥사졸린 조성물의 용도는 N-연결 글리칸의 비교정량용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 정상 아미노당 옥사졸린의 질량값은 204.17 m/z인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량값은 210.17 m/z인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 아미노당 옥사졸린의 제조 방법에 관한 것이다:
아미노당, CDMBI(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride) 및 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 혼합한 혼합물을 준비하는 혼합 및 반응 단계; 및
혼합물로부터 아미노당 옥사졸린을 정제하는 정제 단계.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계는 아미노당, CDMBI(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride) 및 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 혼합 및 반응시킨 혼합물을 준비하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 아미노당은 동위원소 비표지 아미노당 및 동위원소 표지 아미노당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 동위원소 비표지 아미노당 및 동위원소 표지 아미노당 모두일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 아미노당 옥사졸린의 제조 방법을 이용하면 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 합성할 수 있고, 이를 정제함으로써 글리코펩타이드의 비교정량 질량분석에 활용 가능한 아미노당 옥사졸린 조성물을 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계에 대하여, 아미노당 및 CDMBI의 당량비는 1.0:2.0 내지 1.0:4.0, 1.0:2.0 내지 1.0:3.5, 1.0:2.0 내지 1.0:3.0, 1.0:2.5 내지 1.0:4.0, 1.0:2.5 내지 1.0:3.5, 1.0:2.5 내지 1.0:3.0 또는 1.0:3.0일 수 있으며, 예를 들어, 1.0:3.0일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계에 대하여, 아미노당 및 트리에틸아민의 당량비는 1.0:6.0 내지 1.0:9.0, 1.0:6.0 내지 1.0:8.5, 1.0:6.0 내지 8.0, 1.0:6.0 내지 7.5, 1.0:6.5 내지 9.0, 1.0:6.5 내지 8.5, 1.0:6.5 내지 8.0, 1.0:6.5 내지 7.5, 1.0:7.0 내지 9.0, 1.0:7.0 내지 8.5, 1.0:7.0 내지 8.0, 1.0:7.0 내지 7.5 또는 1.0:7.5일 수 있으며, 예를 들어, 1.0:7.5일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계는 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 110분 이상 또는 120분 이상 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계는 혼합물을 교반함으로써 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 혼합 및 반응 단계는 50 ℃ 미만, 40 ℃ 미만, 30 ℃ 미만, 20 ℃ 미만 또는 10 ℃ 미만에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 동위원소는 13C, 15N, D 및 18O 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 13C일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 다양한 동위원소로 표지된 아미노당을 이용하면 다양한 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서 정제 단계는 질량값이 222.08 m/z에서 204.17 m/z로 변화한 정상 아미노당 옥사졸린, 및 질량값이 228.08 m/z에서 210.17 m/z로 변화한 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 포함하는 혼합물로부터, 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 분리하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정제 단계는 C-18 추출 카트리지(C-18 cartridge column)를 이용하여 고체상 추출(solid-phase extraction)을 통해 정제되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 당단백질의 동위원소 표지 비교정량 질량분석 방법에 관한 것이다:
정상 아미노당 옥사졸린 및 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 포함하는 아미노당 옥사졸린 조성물을 준비하는 준비 단계;
분석 대상 펩타이드, 아미노당 옥사졸린 조성물 및 효소를 혼합한 혼합물에서 효소를 반응시키는 효소 반응 단계; 및
효소 반응이 완료된 혼합물로부터, 정상 아미노당2-펩타이드의 제1질량스펙트럼 및 동위원소 표지 아미노당2-펩타이드의 제2질량스펙트럼을 얻고 이를 비교정량하는 비교정량 단계.
본 발명에 있어서 준비 단계는 질량값이 204.17 m/z인 정상 아미노당 옥사졸린, 및 동위원소로 표지되어 질량값이 210.17 m/z인 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 포함하는 아미노당 옥사졸린 조성물을 준비하는 것일 수 있다.
본 발명의 아미노당 옥사졸린 조성물은 2종의 아미노당 옥사졸린을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 정상 아미노당 옥사졸린은 동위원소를 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 정상 아미노당 옥사졸린의 질량값은 204.17 m/z일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량값은 210.17 m/z일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 효소 반응 단계는 분석 대상 펩타이드와 정상 아미노당 옥사졸린, 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린 및 효소를 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 분석 대상 펩타이드는 당단백질 또는 당펩타이드일 수 있다.
본 발명에 있어서 분석 대상 펩타이드는 진핵 세포 유래의 당단백질을 트랜스글리코실화 반응시킨 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어 "당단백질" 은, 당과 단백질로 되어 있는 일군의 화학물질의 총칭이며 복합 탄수화물로 되어 있는 당 부분과 단백질이 공유결합으로 결합하고 있다. 더욱 상세하게는 단백질과 단당류, 올리고당, 또는 다당류가 결합된 것을 당단백질(glycoprotein)이라 한다. 이러한 당단백질은 글리코실화(glycosylation)에 의한 생물학적 시스템에서 가장 많은 단백질로 세포-세포 인식, 세포 속 이동, 면역 및 염증과 같은 생물학적 기능면에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 당단백질은 합성되고 있는 단백질에 글리칸이 부가됨으로써 만들어지며, 글리칸이 부가되는 방식에 따라 N-연결 글리코실화와 O-연결 글리코실화로 나뉠 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 글리칸은 N-연결 글리칸일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어 "글리코시드전이 반응"은 일반적으로 글리코실기(G)와 아글리콘(R)으로 이루어지는 배당체, RG가 별개의 물질(A)에 글리코실기를 전이시켜 AG를 만드는 반응이다. 그 예로, RG+A →R+AG 를 말하며, 트랜스 글리코실화 반응이라고도 한다. 이는 글리칸의 사슬을 개조하기에 유용한 기법으로 다양한 구조의 글리칸을 수용체와 함께 효소 반응으로 변형시킬 수 있다. 구체적으로 N-글리코실화는 Asn-X-Ser/Thr 아미노산 서열의 아스파라긴(Asn)에 글리칸이 부가되는 과정이다. 이러한 과정은 진핵 세포의 적절한 단백질 접힘에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서 효소는 트랜스글리코실화 반응을 통해 당펩타이드에 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 결합시키는 엔도글리코시다제(endoglycosidase, Endo-M)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비교정량 단계는 정상 아미노당2-펩타이드의 제1질량스펙트럼 및 동위원소 표지 아미노당2-펩타이드의 제2질량 스펙트럼을 얻고 비교정량하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 아미노당2-펩타이드는 GlcNAc2-펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 정상 아미노당 옥사졸린 및 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량 차이는 6 Da일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비교정량은 질량스펙트럼을 측정한 후, 각 질량스펙트럼의 피크 면적(peak area)을 계산하여 상대 정량하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 엔도글리코시다제(endoglycosidase, Endo-M)의 트랜스글리코실화(transglycosilation)에 의한 효소적 동위원소 표지 반응으로 매개 공여체인 정상 12C6-GlcNAc 옥사졸린과 동위원소 표지 13C6-GlcNAc 옥사졸린의 안정적인 합성 및 정제 방법을 확립함으로써, 정량적 질량분석법을 위한 당단백질의 효소적 동위원소 표지법을 통해 당단백질의 정량적 정보를 제공할 수 있어 당단백질의 다양한 생명 현상에 대한 연구를 이끌 수 있을 것으로 사료된다.
또한, 본 발명에 따른 질량분석법은 대사적 동위원소 표지법과 다르게 생명체를 필요로 하지 않아 그 과정이 까다롭지 않으며, 급진적 반응조건을 필요로 하는 화학적 동위원소 표지법과 다르게 생체조건을 사용하고 선택성이 있어, 대사적 동위원소 표지법 및 화학적 동위원소 표지법 각각의 장점만을 가지는 신속하고 경제적이면서도 정확성이 우수한 질량분석법이다.
도 1은 본 발명의 엔도글리코시다제(endoglycosidase, Endo-M)의 트랜스글리코실화 반응과 정상 GlcNAc 옥사졸린 및 동위원소 13C6이 표지된 GlcNAc 옥사졸린에 의한 글리코펩타이드의 비교정량 질량분석법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따라 동위원소 표지 GlcNAc을 이용한 GlcNAc 옥사졸린의 합성 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따라 정상 GlcNAc과 동위원소 표지 13C6-GlcNAc의 1:1 혼합물에서, 정상 GlcNAc 옥사졸린과 동위원소 표지 GlcNAc 옥사졸린의 질량스펙트럼 차이를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따라 GlcNAc-펩타이드와 새롭게 합성된 GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 시알릴화 글리코펩타이드(sialylated glycopeptide, SGP)를 본 발명의 일 실험예에 따른 GLISO(glycopeptide labeling with isotopic sugar oxazoline) 표지 전략법에 의해 합성한 정상 GlcNAc2-펩타이드와 동위원소 표지 GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼 차이를 나타낸 것이다. (여기서, (a)는 정상 GlcNAc2-펩타이드, (b)는 동위원소 표지 GlcNAc2-펩타이드, (c)는 각각의 GlcNAc2-펩타이드가 1:1로 혼합된 질량스펙트럼과 Heavy/Light 면적비 값을 나타낸 것임)
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따라 MS/MS 질량스펙트럼의 해석을 통하여, Endo-M에 의한 GlcNAc2-펩타이드 합성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 GLISO 전략에 의해, SGP의 혼합시료 (a) 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 (=Light:Heavy)에 대하여 얻어진 합성 GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼과 (b) 질량스펙트럼의 피크면적에 대하여 Heavy/Light의 계산 면적비율(calculated ratio) 대 이론적 면적비율(theoretical ratio)의 검정곡선을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. Endo-M의 트랜스글리코실화 반응을 위한 GlcNAc 옥사졸린의 합성
본 발명의 트랜스글리코실화 반응과 정상 GlcNAc 옥사졸린 및 동위원소 표지 13C6-GlcNAc 옥사졸린에 의한 글리코펩타이드의 비교정량 질량분석법에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.
Endo-M(endo-βENGase)은 글리코펩타이드의 N-연결 글리칸의 N,N´-diacetylchitobiose core 사이의 β연결을 분해하여 글리코펩타이드에 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine) 하나를 남기는 글리코시드(glycoside) 가수분해효소이다. 실험예 1에서 Endo-M은 시중에 판매 중인 것을 이용하였다.
Endo-M의 트랜스글리코실화(transglycosylation) 반응을 전략으로 활용하려면, 먼저 정상 12C6-GlcNAc 또는 동위원소 표지 13C6-GlcNAc을 옥사졸린화하는 과정(oxazolination)이 필요하다. 이에, GlcNAc의 옥사졸린 합성 메카니즘을 도 2에 나타내었으며, 특히 정상 GlcNAc 옥사졸린과 동위원소 표지 13C6-GlcNAc 옥사졸린의 합성을 개별적으로 수행하고 정제하였으며, 이를 글리코실 공여체로 활용하였다.
반응에 필요한 GlcNAc의 옥사졸린화 반응은 GlcNAc을 기준으로 3 당량의 CDMBI(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride)와 7.5 당량의 TEA(triethylamine, 트리에틸아민)를 첨가한 혼합 수용액을 얼음 위에서 60분간 교반하며 수행되었다. 반응 후 생성된 각각의 12C6-GlcNAc 옥사졸린과 13C6-GlcNAc 옥사졸린은 C-18 추출 카트리지(C-18 cartridge column)를 이용하여 정제하였다.
GlcNAc과 옥사졸린의 합성은 탈수반응(dehydration)이기 때문에 최종적으로 약 18 Da의 질량 감소를 보이며, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 12C6-GlcNAc 피크 222.08 Da 및 13C6--GlcNAc 피크 228.08 Da에서, 12C6-GlcNAc 옥사졸린은 204.17 Da, 13C6-GlcNAc 옥사졸린은 210.17 Da의 피크를 나타냈다.
실험예 2. Endo-M 및 GlcNAc-옥사졸린을 이용한 시알릴화 글리코펩타이드의 동위원소 표지 글리코펩타이드 합성
Endo-M은 글리코펩타이드의 글리칸을 가수분해하는 단계에서 절단된 글리칸의 환원성 말단에 중간체인 옥사졸린을 형성하는 특성이 있고, 이를 통해 트랜스글리코실화 반응을 진행한다. 따라서 Endo-M의 활성 부위에서, 옥사졸린 형태의 환원성 말단을 가지는 N-아세틸 아미노당(글리코실 공여체)을 아미노당의 구조(configuration)에 부합하는 비환원성 말단(글리코실 수용체)에 결합시키는 트랜스글리코실화 반응이 가능하다.
이를 이용하여, N-연결 글리코펩타이드에서 글리칸의 환원성 말단 GlcNAc 하나를 펩타이드에 남긴 글리칸 분리와 동시에, 공여체로 작용하는 아미노당 옥사졸린이 새롭게 형성된 수용체인 GlcNAc-펩타이드의 비환원성 말단에 결합하는 트랜스글리코실화 반응을 통해 GlcNAc2-펩타이드를 합성할 수 있다.
이를 GLISO 표지 전략으로 명명하고 실험적 증명을 위해 N-연결 글리코펩타이드인 시알릴화 글리코펩타이드(sialylated glycopeptide, SGP)를 표준모델로 하고, 정상 12C6-GlcNAc 옥사졸린 또는 동위원소 표지 13C6-GlcNAc 옥사졸린을 글리코실 공여체로 하여 글리코펩타이드에 동위원소 표지를 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 시알릴화 글리코펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 나타내었다.
Endo-M의 경우 pH 6.0, 표지온도 37 ℃에서 최적활성을 나타냄을 고려하여, 이러한 pH 및 온도 조건에서 동위원소 표지 반응을 진행하였다. 또한 효소반응 5분마다 볼텍스-퀵 스핀(vortex-quick spin)을 통해 시료 내 모든 펩타이드가 반응할 수 있도록 하였다.
서열번호 서열목록 비고
1 KVANKT 6 aa
도 4에서 확인할 수 있듯이, 시알릴화 글리코펩타이드(SGP)는 엔도글리코시다제(Endo-M)에 의해, 하나의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 남기고 글리칸이 분리된 GlcNAc-펩타이드의 질량스펙트럼을 432.24 Da에서, GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼을 533.78 Da 에서 나타내고 있다. 즉, GlcNAc-옥사졸린에 의해 트랜스글리코실화하여 새로운 GlcNAc2-펩타이드의 합성을 나타내는 질량스펙트럼을 획득함으로써, 도 1의 이론적 반응이 실질적으로 가능함을 실험적으로 증명하였다.
실험예 3. 정상 GlcNAc 2 -펩타이드 및 동위원소 표지 GlcNAc 2 -펩타이드의 생성을 통한 비교정량 질량분석
동위원소 표지 반응은 30℃의 pH 6.0 완충 용액에서 1시간 동안 수행되었고, 시알릴화 글리코펩타이드를 기준으로 하여 3 당량의 정상 또는 동위원소가 표지된 13C6-GlcNAc-옥사졸린을 첨가하여 수행하였다. 12C6-GlcNAc(정상)과 13C6-GlcNAc(동위원소 표지)이 각각 결합된 SGP의 새로운 글리코펩타이드인 GlcNAc2-펩타이드를 정제 후, 개별 또는 1:1 혼합하여 질량스펙트럼을 획득한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 (a)는 정상 GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼이고, 도 5의 (b)는 동위원소 표지 GlcNAc2-펩타이드의 질량스펙트럼이며, 도 5의 (c)는 양 GlcNAc2-펩타이드를 1:1 혼합한 경우의 질량스펙트럼이다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 시알릴화 글리코펩타이드의 아미노산 서열에서 4번째 아미노산 잔기인 아스파라진(asparagine, N)에 붙은 N-연결 GlcNAc에 정상 GlcNAc 옥사졸린이 결합하여 GlcNAc2-펩타이드(m/z=533.7850, z=2)를 얻었고, 13C6-GlcNAc 옥사졸린이 결합한 동위원소 표지 GlcNAc2-펩타이드(m/z=536.7950, z=2)를 얻었다.
이들은 +2가의 정상 GlcNAc2-펩타이드에 대하여 3.0 Da의 질량 차이를 보여주고 있다. 또한 도 5의 (c)에서 확인할 수 있듯이, 정상(Light)과 동위원소 표지(Heavy) GlcNAc2-펩타이드 1:1 혼합물에 대한 질량스펙트럼의 피크 면적 비율(Heavy/Light)은 1.014±0.088로 나타나 우수한 비교정량성을 보여주고 있다.
도 6은 SGP와 GlcNAc 옥사졸린이 Endo-M에 의해 새롭게 합성된 정상 GlcNAc2-펩타이드와 동위원소 표지 GlcNAc2-펩타이드의 MS/MS 질량스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 6으로부터, GlcNAc 옥사졸린이 GlcNAc-펩타이드의 비환원성 말단의 GlcNAc에 결합된 것을 확인할 수 있었다.
아울러, GLISO 표지전략의 정량분석에 대한 검증을 위하여 SGP의 혼합 비율에 따라 새롭게 합성된 정상(Light)과 동위원소 표지(Heavy) GlcNAc2-펩타이드의 혼합비에 따라 얻어지는 질량스펙트럼과 면적비율에 따른 검정곡선을 도 7에 나타내었다.
도 7에 각 혼합시료의 스펙트럼에서 얻어진 Light와 Heavy의 피크면적 비율을 통해 계산된 Heavy/Light 비율을, 이론적 비율에 대한 실험적 비율로 나타내었고, 이로부터 확인할 수 있듯이, 검정선의 선형측정범위에 대한 기울기는 0.9922로서 1.0에 가까워 높은 정확도를 보여주었으며, 상관계수(R2)의 값은 0.9998로 직선성 또한 우수하였다.
<110> CHANGWON NATIONAL UNIVERSITY Industry Academy Cooperation Corps <120> METHOD OF ISOTOPE LABELING OF GLYCOPROTEINS BY TRANSGLYCOSYLATION OF ENDOGLYCOSIDASE AND ISOTOPICALLY LABELED AMINOSUGAR OXAZOLINE FOR QUANTITATIVE MASS SPECTROMETRY <130> PN210514 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sialylated glycopeptide, SGP <400> 1 Lys Val Ala Asn Lys Thr 1 5

Claims (13)

  1. 정상 아미노당 옥사졸린; 및
    동위원소 표지 아미노당 옥사졸린;을 포함하는 아미노당 옥사졸린 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 아미노당은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine, GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine, GalNAc), 및 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine, ManNAc)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것인, 아미노당 옥사졸린 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 동위원소는 13C, 15N, D 및 18O 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 아미노당 옥사졸린 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노당 옥사졸린 조성물의 용도는 N-연결 글리칸의 비교정량인 것인, 아미노당 옥사졸린 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 정상 아미노당 옥사졸린의 질량값은 204.17 m/z이고,
    상기 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량값은 210.17 m/z인 것인, 아미노당 옥사졸린 조성물.
  6. 다음의 단계를 포함하는 아미노당 옥사졸린의 제조 방법:
    아미노당, CDMBI(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride) 및 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 혼합한 혼합물을 준비하는 혼합 및 반응 단계; 및
    혼합물로부터 아미노당 옥사졸린을 정제하는 정제 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 정제 단계는 C-18 추출 카트리지(c-18 cartridge column)를 이용하여 고체상 추출(solid-phase extraction)을 통해 정제되는 것인, 아미노당 옥사졸린의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 아미노당 및 CDMBI의 당량비는 1.0:2.0 내지 1.0:4.0인 것인, 아미노당 옥사졸린의 제조 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 아미노당 및 트리에틸아민의 당량비는 1.0:6.0 내지 1.0:9.0인 것인, 아미노당 옥사졸린의 제조 방법.
  10. 다음의 단계를 포함하는 동위원소 표지 비교정량 질량분석 방법:
    정상 아미노당 옥사졸린 및 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 포함하는 아미노당 옥사졸린 조성물을 준비하는 준비 단계;
    분석 대상 펩타이드, 아미노당 옥사졸린 조성물 및 효소를 혼합한 혼합물에서 효소를 반응시키는 효소 반응 단계; 및
    효소 반응이 완료된 혼합물로부터, 정상 아미노당2-펩타이드의 제1질량스펙트럼 및 동위원소 표지 아미노당2-펩타이드의 제2질량스펙트럼을 얻고 이를 비교정량하는 비교정량 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 효소는 트랜스글리코실화 반응을 통해 당펩타이드에 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린을 결합시키는 엔도글리코시다제(endoglycosidase, Endo-M)인 것인, 비교정량 질량분석 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 정상 아미노당 옥사졸린 및 상기 동위원소 표지 아미노당 옥사졸린의 질량 차이는 6 Da인 것인, 비교정량 질량분석 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 비교정량 단계는 질량스펙트럼을 측정한 후, 피크 면적(peak area)을 계산하여 상대 정량함으로써 수행되는 것인, 비교정량 질량분석 방법.
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