CN101426926A - 用于质谱法检测的底物和内标 - Google Patents

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Abstract

本发明的名称是用于质谱法检测的底物和内标。提供发明的底物，其包括式A－B1－B2－B3的底物化合物：其中A是糖部分；B1是使部分A和底物的剩余结构连接的连接部分；B2含有永久带电元素例如季铵基团，以便为质谱分析增加质子亲和力和离子化效率；和B3具有赋予靶酶特异性的不同碳长度。也提供的是检测溶酶体缺陷症的方法，这通过将样品与发明的底物连同内标接触来完成，所述内标是被该底物的靶酶切割的产物的同位素标记类似物。

Description

用于质谱法检测的底物和内标
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2006年3月13日提交的美国临时专利申请序列号60/781,855的优先权，其被引入本文作为参考。
发明领域
[0002]本发明涉及分析试剂和基于质谱法的方法，所述方法使用这些试剂来同时量化样品中的蛋白质。更具体而言，本发明涉及使用质谱法量化溶酶体酶活性的多元分析和试剂。
发明背景
[0003]溶酶体贮积病是一组遗传病症，其特征为身体内特定酶的缺乏，这导致身体不能分解代谢物质。作为一个实例，法布里病是每40,000人之一人中可见的溶酶体贮积病。其是由于α-半乳糖苷酶的缺乏，然后这导致身体不能分解被称为球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂质。第二个实例是高歇病，由于不能分解被称为葡糖神经酰胺(也称为葡糖脑苷脂)的脂物质(fatty substance)或脂质(lipids)引起的溶酶体贮积病。患有高歇病的个体不能制造葡糖脑苷脂酶，一种分解这些脂质所需要的酶。然后，这些脂质聚集在肝、脾和骨髓的细胞内。第三个实例是蓬珀病，由于被需要用来分解某些被称为糖原的糖的酶——酸性α-葡糖苷酶——的缺乏引起的溶酶体贮积病。当酶——酸性α-葡糖苷酶——缺少时，糖原在身体内的多种组织和器官中聚集。
[0004]这些疾病大部分是儿科疾病。在大多数患者中，患者在出生时是正常的，在过后的一些时间里渐进地开始神经学上恶化。在一些患者中，该疾病在成年期表现。临床表型取决于生化缺陷的类型和严重性。这些溶酶体缺陷症的一些例如蓬珀病和克腊比病，主要表现在婴儿期。因此，已经正在努力开发在临床症状开始前检测这些病症的方法，以便可以开始治疗介入。
[0005]在过去的十年内，检测代谢性疾病的实验室已经将串联质谱法引入其新生儿筛查计划。串联质谱法在临床继续得到流行，因为该技术允许在单一样品中分析多种代谢物。例如，该技术已被作为检测在新生儿中遗传代谢性疾病的常规临床实践，在该技术中使用干血斑样品(Schulze A等，Pediatrics 2003；111：1399-406)。尽管溶酶体酶活性可使用串联质谱法量化(Gelb MH等，Clinical Chemistry 50：10，1785-1796，2004)，但是发表的分析方法不容易适用于临床情况，这是因为麻烦的过程和苛刻的分析成分例如氯仿。
[0006]因此，继续需要改进用于检测溶酶体缺陷症的方法和组合物。
发明概述
[0007]根据本发明的实施方式，提供使用质谱法检测酶反应的改进的组合物和方法。
[0008]发明的底物(substrate)具有A—(B1—B2—B3)的通式，其中A是单糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；B2是
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其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；杂原子C6-C20芳基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；在每一情况中，R2独立为H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基；在每一情况中，X独立为不存在、氧、硫或氮；在每一情况中，R3独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；n是0和30之间的整数，包括0和30；在每一情况中，R4独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20链烯基；杂原子C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环。
[0009]提供发明的方法，其包括用含有发明的底物和发明的内标的分析溶液温育样品，并且对所形成的样品进行质谱法分析。本发明的方法消除了现有技术使用洗涤剂、使用者不友好溶剂如氯仿和液-液和液-固相提取步骤的需要。因此，本发明的方法比现有技术方法所花时间更少。
附图简述
[0010]图1是用于检测溶酶体贮积病的示例性底物结构。
[0011]图2是使用本发明底物的一般酶反应方案。
[0012]图3是本发明底物和现有技术底物之间的主要结构差异。
[0013]图4是与现有技术底物相比，本发明底物给予的检测灵敏性增加的机制。
[0014]图5是采用双重标记本发明底物检测酶活性的可选方法。
[0015]图6是使用质谱法检测酶反应的发明方法，其与现有参照方法相比具有优势。
[0016]图7是根据本发明以及相应空白(blank)的针对法布里病的底物样品的串联质谱。
[0017]图8是涉及用于蓬珀病的GAA的本发明底物的串联质谱，针对患病样品、健康样品或空白。
[0018]图9是表明在12个来自健康新生儿对象的样品和3个来自蓬珀病阳性的新生儿对象的样品中有差别的GAA活性的散点图。
[0019]图10是一个实例，其中，通过使用含有两种类型的底物和内标的分析溶液处理样品，本发明底物和内标被用于多元方法(multiplex)中。
[0020]图11是洗涤剂对本发明的内标的灵敏性的影响。
[0021]图12是在存在或不存在洗涤剂以及相应空白的情况下针对蓬珀病的本发明底物样品的有差别的串联质谱。
优选实施方式详述
[0022]本发明具有作为用于检测溶酶体贮积病的分析试剂的效用。通过应用容易溶解在适于质谱法分析的溶液中的底物和内标，检测与溶酶体贮积病相关的异常酶活性是更可行的而且较不麻烦的。
[0023]本发明涉及溶酶体酶靶向的底物，所述溶酶体酶包括：酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、酸性β-葡糖脑苷脂酶(ABG)、半乳糖脑苷脂α-半乳糖苷酶(GALC)、酸性α-葡糖苷酶(GAA)。这些酶对底物的作用被用来在样品中测量相应的异常酶活性，因此这些底物被用来检测下列溶酶体贮积病：法布里病(GLA)、高歇病(ABG)、克腊比病(GALC)和蓬珀病(GAA)。
[0024]发明的底物具有A—(B1—B2—B3)的通式，其中A是单糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；B2是
Figure A200780014149D00091
其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；杂原子C6-C20芳基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；在每一情况中，R2独立为H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基；在每一情况中，X独立为不存在、氧、硫或氮；在每一情况中，R3独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；n是0和30之间的整数，包括0和30；在每一情况中，R4独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20链烯基；杂原子C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环。
[0025]部分通过糖部分A例如A为单糖或二糖中的结构变化，提供底物对特定溶酶体酶的特异性。示例性的糖部分包括用于检测蓬珀病的α-D-葡萄糖；用于检测高歇病的β-D-葡萄糖；用于检测法布里病的α-D-半乳糖；和用于检测克腊比病的β-D-半乳糖。此外，底物的特异性也通过B3的脂肪酰基团内的碳长度和饱和程度的变化来赋予。B3的示例性化学结构包括特异性用于检测蓬珀病的十二碳脂肪酰基团；特异性用于检测高歇病的十四碳脂肪酰基团；特异性用于检测法布里病的十六碳脂肪酰基团；和特异性用于检测克腊比病的十八碳脂肪酰基团。
[0026]B1是连接部分，其行使将糖部分A与底物的其余结构结合的功能。B1也作为糖部分A与底物的其余结构之间的间隔区行使功能，以便对靶酶提供灵活的接近。
[0027]季铵基团是B2的关键成分。该基团携带永久电荷，在大多数情况下，为正电荷。在酶反应后，由于位于B2上的季铵基团的存在，B1-B2-B3的切割产物带有期望的质子亲和力和离子化效率(ionizationefficiency)。这种特性在串联质谱法分析中导致高信号，并且在所有的分析中导致更少的限制。另外，永久电荷使本发明底物更溶于含水缓冲液中，以便避免对于使用非常非极性溶剂如氯仿的需要。与现有技术底物相比，根据本发明的底物更加亲水，并且更少需要或者不需要洗涤剂。这是优点，因为像使用氯仿一样，使用洗涤剂要求麻烦的清洁步骤，包括劳动强度大的液-液和液-固相提取步骤。
[0028]底物的终端结构上为B3基团。如上所述，通过赋予碳链不同的碳长度和/或饱和度，结构上调整B3以提供对各种酶的特异性。因此，非常相似的底物被合成，它们的分子量发生质谱法分析可区分的变化。
[0029]因此，如在本发明预想的，可合成具有四种不同糖的底物，每一个对特定溶酶体酶具有特异性，并且每一个的亚基团(subgroup)B3具有轻微不同的链长。因此，在底物被用于多元分析——其中两种或多种在同一样品中或者在微量滴定板的相同管或孔中进行分析的情况下，质量上的变化允许通过质谱法鉴别四种底物的每一个和相应的酶产物。因此，该组合物考虑单一合成方案(single synthesis scheme)。在现有技术中，每一底物要求独特的合成途径。具有两种或更多种这些底物的共同合成途径，可意味着生产环境明显节约，这是由于较短和较不复杂的生产过程和应用共同的原料。
[0030]对于检测蓬珀病，示例性糖部分是α-D-葡萄糖，并且示例性B1-B2-B3部分是4-氨基苯基-肉碱基(cartnitinyl)-烷基链，其中B3的长度为10-20个碳，优选长度为12个碳。对于检测高歇病，示例性糖部分是β-D-葡萄糖，并且示例性B1-B2-B3部分是4-氨基苯基-肉碱基-烷基，其中B3的长度为10-20个碳，优选长度为14个碳。对于检测法布里病，示例性糖部分是α-D-半乳糖，并且示例性B1-B2-B3部分是4-氨基苯基-肉碱基-烷基，其中B3的长度为10-20个碳，优选长度为16个碳。对于检测克腊比病，示例性糖部分是β-D-半乳糖，并且示例性B部分是4-氨基苯基-肉碱基-烷基，其中B3的长度为10-20个碳，优选长度为18个碳。
[0031]本发明也涉及内标，其被设计用来测量在酶反应后，从本发明底物切割的具有通式B1-B2-B3的产物的量。内标结构上与切割产物相同，只是由于包括同位素标记在内的修饰步骤，内标的质量与电荷之比(m/z)与切割产物不同。因此，本发明的内标是稳定的同位素标记的切割产物的类似物，其中一个或多个原子被相应的原子的同位素取代，以便产生质量的变化。这类标记的实例是用2D取代B3酰基上的1H。结果，具有取代的2D的“较重的”内标分子在质谱法谱结果上显示与切割产物通常显示的不同m/z。质量的变化被用来在质谱法实验中识别切割产物与内标。这是可能的，因为已知浓度的内标被加入到分析溶液中。
[0032]在一个具体的实施方式中，本发明底物的B1亚基团是取代的氨基苯基。
[0033]在另一个具体的实施方式中，结合的B2-B3亚基团是具有带正电季铵部分的酰基肉碱，并且其酰基尾的碳长度为12到18。
[0034]在另一个具体的实施方式中，用氘标记内标以引起从相应切割产物的3到9道尔顿的质量变化。
[0035]在另一个具体的实施方式中，特异性用于检测克腊比病的本发明底物的基团A为β-D-半乳糖、基团B1为甲基、基团B2为具有季铵末端的酰胺基以及基团B3为具有12到20个碳长度的链烯醇。
[0036]在又一个具体的实施方式中，特异性用于检测高歇病的本发明底物的基团A为β-D-葡萄糖、基团B1为甲基、基团B2为具有季铵末端的酰胺基以及基团B3为具有12到20个碳长度的链烯醇。
[0037]本发明也涉及测量样品内靶向溶酶体酶的活性的方法。该样品包括血清、血浆、全血、尿、唾液或其它生物流体或组织溶胞产物的样品。该样品在滤纸基质上沉积并干燥。然后，切除一部分的滤纸样品，并将其沉积在化验管或微量滴定板孔中，向其中加入分析溶液。分析溶液包括含水缓冲液、底物和内标，以及需要的蛋白酶抑制剂如用于竞争性糖苷酶的抑制剂。然后，将样品混合物在30至41摄氏度的特定温度下温育30分钟至8小时范围的确定时间。温育完成后，通过加入用于沉淀酶的溶液来中止酶反应。示例性的溶液类型包括醇、乙腈或稀释的三氟乙酸。将部分温育混合物转移到新的分析容器中，向该容器中加入净溶液如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈。本领域普通技术人员选择其它类型的净溶液，以与串联质谱法分析相容。用等分净溶液这样稀释的检测样品减少内生竞争性物质的量，以便相对增加串联质谱法分析的灵敏性。将稀释的样品直接而没有进一步修饰地注入串联质谱仪，这通过手动进行或者在自动取样器和液体处理装置的帮助下自动进行。将串联质谱仪设定为同时检测加入的底物、相应的所形成的酶产物和相应的内标。这样的检测通过母离子扫描、母体离子扫描或多反应监控扫描来实现。将串联质谱仪设定为检测一种或多种底物、产物和相应的内标。观察的产物和相应内标的相对丰度(abundance)被用来测量相应的酶活性。
[0038]当从新生儿患者和儿童患者中筛查血液时，通常使用干血斑形式的样品。对于这些患者对象，收集血液，并且保存在滤纸上的是可容易收集和容易储存的实验室样品。在用分析溶液温育前，可以洗脱滤纸上的样品。洗脱的步骤是从干滤纸将蛋白质释放入含有水基缓冲液如磷酸盐缓冲盐水和蛋白酶抑制剂的水溶液中。蛋白酶抑制剂可以例如包括下列的一种或多种：终浓度50到400μg/ml的AEBSF盐酸盐、终浓度0.2到25mg/ml的EDTA二钠脱水物(EDTA disodium dehydrate)、终浓度0.5到1μg/ml的亮抑酶肽半硫酸盐和终浓度0.5到1μg/ml的抑胃酶肽A。洗脱可以进行20到60分钟的时间，这取决于使用的样品的大小，并且可以使用立式或卧式振动促进。然后，将液体洗提物手动地或通过自动化液体控制仪器转移到管或微量滴定板。
[0039]从干血样品溶解的总蛋白通过方法例如比色二辛可宁酸(bicinchoninic acid，2，2′-联喹啉-4，4′-二羧酸)(BCA)分析法来量化。采用这种方法，使用浓度为2、1、0.5、0.2和0.05mg/ml的牛血清白蛋白作为标准，产生蛋白标准曲线。用1ml的混合BCA试剂稀释样品，旋转混合，并且在37℃下温育60分钟。使样品冷却至室温，并且对照水空白进行分析。在聚苯乙烯刮匙(curette)中，通过监控562nm下的吸光度来分析样品。平均的患者吸光度值经由线性回归被空白修正并且与标准对比。
[0040]在具有或不具有如上述首先溶解的情况下，干血样品在分析溶液中温育。特别地，分析溶液是水基的。分析溶液含有适当的缓冲液如磷酸盐缓冲盐水、适当的蛋白酶抑制剂如竞争糖苷酶的蛋白酶抑制剂、底物——其用同位素进行标记、和内标——其用不同的同位素进行标记。蛋白酶抑制剂包括下列的一种或多种：糖苷酶抑制剂、终浓度50到400μg/ml的AEBSF盐酸盐、终浓度0.2到25mg/ml的EDTA二钠脱水物、终浓度0.5到1μg/ml的亮抑酶肽和终浓度0.5到1μg/ml的抑胃酶肽A。在温育期间，底物和内标均被感兴趣的酶从干血样品切割以形成各自的产物。
[0041]在一个方面，通过加入纯的醇、乙腈或稀释的三氟乙酸来终止温育反应。从酶反应形成的产物是相当极性的，这主要是由于内在(built-in)的带正电荷部分例如季铵阳离子，因此，不需要使用非极性溶剂如氯仿来终止酶促反应和保持产物于溶液中。由于MS/MS系统的复杂性，最终经历MS/MS系统的蛋白质需要处于不“有害于”MS/MS系统的溶剂中。例如，这些溶解不应该是洗涤剂基的，也不应该含有腐蚀剂如氯仿。优选纯的乙醇或纯的甲醇，这仅仅因为其在机械干燥过程中容易蒸发。在氮气流中温和加热该板或氮气或者加热两者，使用特别设计用于该目的的干燥器，干燥包含于液体提取物中的有机溶剂。
[0042]对于待被检测的每个酶，一组特异性底物和内标被包含在分析溶液中。分析溶液被设计为对于特定酶的检测是独特的和特异性的；可选地，其被如此设计以对于同时检测多种酶是适合的和通用的。在单独的管、小瓶中或者用多孔滤板如96-孔或386-孔滤板，实行温育。
[0043]滤纸上样品的所需大小和因此可有效用于检测的干血的所需量随待被检测的酶的数目而变化。实际上，对于单一酶的分析，通常使用的滤纸上干血斑样品的大小为1-3mm。当待被分析的酶在样品中具有相对低的存在时，这种类型的样品是特别有用的，因为在单一分析物分析的情况中，不需要多种酶提取。可选地，相对高表达水平和/或酶活性的酶从更大尺寸的一个样品中同时分析出。例如，含有干血斑的3-10mm的滤纸被水解，并且被用作多种酶检测的统一的样品来源。
[0044]任选地，将酯化步骤加入到温育步骤以衍生检测样品。更长且更高的温度条件与较冷的、较短的衍生条件相比倾向产生更强烈的酰基肉碱水解。通过应用干燥氮除去衍生试剂，停止反应。在适合MS/MS分析的类型的液体基质中，重构衍生的样品。使用电雾化离子化的通用方法需要挥发性的部分有机基溶剂，该溶剂任选地轻微酸化。通常使用的溶剂是相等的乙腈和水的混合物。另外，甲酸可以以小百分比加入，以酸化溶剂和增强离子化。
[0045]用于感兴趣的选定蛋白的底物是天然或合成源的。感兴趣蛋白由与疾病状态或先天缺陷相关的酶或者为医学目的而被常规分析的酶构成。感兴趣的酶底物包括酸性α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡糖脑苷脂酶、酸性半乳糖脑苷脂α-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶和酸性α-葡糖苷酶。
[0046]通式A-B1-B2-B3的发明组合物在溶剂例如纯的甲醇或纯的乙醇中是亲水性的。A是单糖或二糖。B1是连接臂，B2含有永久带正电的季铵阳离子，B3是长的碳尾(carbon tail)。A部分的类型或B1-B2-B3部分中烷基链的长度根据检测的靶酶而不同。设计连接臂B1以便赋予相对亲水的特性。特别地，连接臂B1具有氢酚(hydrophenol)结构。B1-B2-B3部分全部是亲水性的，以确保底物良好的溶解性，并且它具有碱性基团例如永久带正电的季铵阳离子，其被ESI有效地质子化，并且因此确保通过质谱法灵敏检测。
[0047]在一个实施方式中，本发明提供式A—B1—B2—B3的试剂，其中A是单糖或二糖，并且优选地为乙醛糖或己酮糖；B1是酚、硝基酚或苯酯如苯甲酸苯酯；B2含有从这样的结构延伸的侧链季铵阳离子，在单独缩合到B1或还与B3尾缩合之前该结构是肉碱，
Figure A200780014149D00151
(AV29285L 800，ARVI Co.Ltd.，Yerevan，Armenia)，
(Pubchem号3833216)，
(Pubchem号786970，CAS 25518-46-1)，或
Figure A200780014149D00154
(Chembank 1271)
A是单糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；B2是
Figure A200780014149D00155
其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；杂原子C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；在每一情况中，R2独立为H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；在每一情况中，X独立为不存在、氧、硫或氮；在每一情况中，R3独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；n是0和30之间的整数，包括0和30；在每一情况中，R4独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20链烯基；杂原子C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环。
[0048]图1示出用于检测溶酶体贮积病的示例性底物结构。该结构由葡萄糖或半乳糖形式的糖(A)和脂肪族基团B构成。基团B进一步由硝基苯基形式的连接臂(B1)、肉碱基的B2亚基团和具有碳长度范围为12、14、16或18的烷基形式的B3亚基团。位于B2亚基团上的季铵阳离子提供免于需要进一步离子化的离子，该离子化在别的情况下是质谱法检测需要的。
[0049]图2表明使用本发明底物的一般酶反应。在特异性亲和结合和酶反应后，底物被切割成两个基团，糖部分A和脂肪族基团B。基团B由硝基苯基、肉碱基和长链烷基部分构成。然后，这两个基团都用MS/MS分析。内标也同时进行MS/MS分析。内标是同位素标记的B的类似物，其中用氘取代甲基基团上的氢原子(一个或多个)。
[0050]图3阐明本发明底物和本领域已知的现有技术参照底物之间的主要结构差异。主要在长链酰基部分存在差异，其中与现有技术底物相比，本发明底物中存在的永久带正电的季铵阳离子为了下游质谱法分析的目的，使其本身成为“现成的”离子。因此，不需要进一步的离子化，并且因此没有信号强度的损失。此外，与现有技术底物相比，本发明底物化学非极性更小。因此，溶解本发明底物的溶剂既不须是极端非极性的，也不需要加入洗涤剂。极端非极性溶剂例如氯仿不是使用者友好的，并且不被推荐用于ESI-MS/MS。洗涤剂的应用也降低了质谱仪的功能性，因为洗涤剂非常快速地污染质谱仪的内部部件，以致引起性能明显降低。当使用这样的试剂时，在样品进行MS/MS分析之前，需要增加额外的步骤来除去这些试剂。为了回收待被分析的产物，现有技术在液-液提取步骤中，使用氯仿或乙酸乙酯。为了除去洗涤剂，现有技术使用固相提取。因此，尽管可能在临床实验室中改变这些过程，但是如果不是不可行的，现有技术底物使它们的应用极端麻烦。
[0051]图4阐明本发明底物和现有技术底物之间的结构差异。在亲和识别和酶反应之后，部分本发明底物——被称为“酶产物”，被切割。不像从现有技术底物制造的产物，本发明的酶产物具有固有的“现成的”离子(下半部分图)——其是永久带正电的。被引入质谱仪的任何分析物必须被赋予作为待检测的离子。影响灵敏性的最重要因素之一是离子化效率，即暴露于离子源后，分析物离子化的容易程度。暴露于离子源后，分子彼此竞争质子。具有高质子亲和力的分子对于质子结合的竞争更有效，并且被更有效地离子化。在已经拥有了永久正电荷的本发明分子的情况中，分子被质子化；结果是，本发明的酶产物发出更大数量级的信号强度。
[0052]图5示出使用根据本发明的发明方法测量酶表达和活性的过程中的差异。发明方法允许同时测量底物水平的减少和产物水平的增加。这相比于仅仅测量酶反应产物的本领域其它方法是有利的。因此，发明方法提供更高的灵敏性和特异性。对于本发明底物，A部分和B部分都用第一信号标记物标记。示例性信号标记物是同位素标记。对于用于底物的发明的内标，A部分和B部分都用与第一信号标记物不同的第二信号标记物标记。信号标记物第一号和信号标记物第二号每一个独立地是下列之一：碳-12、碳-13、氕、氘、碘-131、氮-15、磷-31、氦-3和铀-238。
[0053]图6阐述示例性的发明方法，其中下部分图表描述使用质谱法检测酶反应，与在该图上部示出的现有技术参照方法相比，该方法具有优势。与现有技术方法相比，发明的方法消除了应用非极性底物和它们的相对内标固有的许多步骤。更具体而言，发明的方法不再需要用于清除非极性溶剂和/或洗涤剂的步骤——包含它们对质谱仪器是有害的。这些步骤包括通过液-液提取步骤除去氯仿，通过硅胶分离步骤除去洗涤剂，和固相提取(SPE)方法的步骤。这些额外的步骤也增加了添加到下游分析的统计误差。因为根据本发明的底物相对于现有技术非极性更低，所以更小非极性的溶剂例如纯的甲醇或纯的乙醇在本文是有效的。
[0054]任选地，A部分和B1-B2-B3部分每一个均用信号标记物标记。信号标记物位于包括C、H、P、N或S的一个或多个原子上。信号标记物包括但不限于荧光标记物和同位素标记物。在同位素标记的情况下，底物结构中的至少一个原子用稳定的同位素取代。例如，用D取代氢，或者用13C取代12C。
[0055]当通过结合针对各自酶的多种底物而同时检测一种以上疾病时，底物不但在赋予酶特异性的糖部分类型上不同，也在B3尾部分的长度上不同。在使用MS/MS作为检测工具时，这是特别重要的，因为具有相应的有差别的质量指数(mass index)的有差别的本发明底物分子与被检测的不同酶相应。
[0056]使用内标测量样品中蛋白质的绝对数量的量(absolutequantitative amounts)。内标被同位素标记，以量化酶反应的亲和标记产物。内标与通过酶对亲和标记的酶底物作用产生的标记的酶产物化学上相同，但是内标携带同位素标记——其可以包括D、13C、15N、17O、18O或34S，这样允许通过MS技术独立检测同位素标记的类似物。内标与从消化亲和标记蛋白产生的相应的亲和标记肽化学上基本相同，除了它们被不同地同位素标记，以使它们被MS技术独立检测。内标被不同地标记在其糖部分A和连接部分B1-B2-B3上。使用质谱法，提供同时的测量，以便底物信号的减小和产物A以及B1-B2-B3的增加被同时记录。这种设计增加分析的灵敏性和特异性。
[0057]应用通用底物混合缓冲液提取每个患者的单一干血样品，随后分配入多个分析反应中，对于自动和高产量筛选是有优势的，因为其避免需要从同一干血样品获得数个样品穿孔(sample punch)。这也减少滤纸上的血液不均匀分布引起的变化。应用通用底物混合缓冲液也减少滤纸上血液不均匀分布引起的变化。提取效率可以随着被分析的不同酶而变化。特别地，选择发明的通用底物混合缓冲液的组合物以确保酶的最高性能，这使得所有酶的最低特异活性被检测到。
[0058]任选地，包括底物、切割产物和内标的所有试剂被反相HPLC纯化至均匀，并且被高磁场ESI-MS表征。分析成分例如酶底物、分析产物和内标被通过介质处理以便除去过量的缓冲液成分。除去缓冲液成分特别适合用于串联质谱法，因为认为分析物的电雾化离子化被过量缓冲液成分的存在所抑制。
[0059]就使用根据本发明的底物试剂和ESI-MS测定酶所描述的方法可以被广泛应用。多种技术可被扩展以在单一反应中同时检测许多或多种酶，这排除了多个分析的需要，有助于证实罕见疾病的诊断。当评估通过特定生物化学通路的化学通量的级别或者用于监控生物化学信号传导通路时，该方法可被用来同时测量多种酶。因为使用的ESI-MS检测的高灵敏性——每个分析仅需要亚微克量的底物试剂，在低-克规模上数百种底物试剂的合成变得实际和经济。因为大多数酶活性位点暴露于溶剂，所以将亲和标记的连接子结合到大多数酶底物而同时保持酶活性是可能的。
实施例
实施例1
[0060]对于每种样品，将3mm直径的圆片从滤纸上的干血区域打孔入微量离心管或96-孔微量滴定板的孔中。然后，将该血圆片(blood disk)用含有终浓度为3mmol/L的针对法布里病的底物和终浓度为0.05mmol/L的内标的分析溶液直接温育。对于该分析溶液，也加入终浓度0.5mol/L的乙酸钠缓冲液。含有血圆片的分析混合物在37℃下、在恒温空气摇床中的轨道摇动(150rpm)下温育15到24小时。在温育时期后，将等分的纯甲醇(没有使用氯仿)加入到每个管或孔中，以终止酶反应。在进入质谱仪之前，该温育的反应混合物被除去溶剂并且借助真空干燥器干燥彻底(dry down)。对于质谱法分析，电喷雾源以正模式(positivemode)操作，离子以母离子和中性损失扫描模式(parent-ion andneutral-loss scan mode)检测。通过使用注射器驱动，流动注入通过熔融硅石毛细管，将干燥的样品以3μl/min的流速引入。从产物与内标的离子丰度比率减去空白值，计算酶产物的量。
[0061]如在图7中所示，内标在m/z为494.5处被检测；针对法布里病的底物的酶产物在m/z为491.5处被检测，在水空白中为最小量(上图)，在存在干血样品下(下图)为显著量。
实施例2
[0062]使用针对蓬珀病的底物的酶反应和随后的质谱法分析用在实施例1中详细说明的方法实行。
[0063]图8示出如此实施例，其中使用α-D-葡萄糖作为糖部分，合成本发明底物，例如在图1中描述的那些，因此对溶酶体酶GAA(蓬珀病)具有特异性。选择对于该具体实施例的烷基链含10个碳，并且因此在底物的合成中使用癸酰基-肉碱。相似地，使用癸酰基-肉碱合成相应的内标，在肉碱基部分的3个甲基中的一个上将3个氢取代为氘。使用这种底物和内标，来自两个新生儿——一个健康的个体和另一个证实为蓬珀病阳性的个体的干血斑样品被用如图5中描述的本发明方法处理。另外，不含有血液的空白滤纸样品按照与干血斑相同的步骤进行处理。含有缓冲液、底物、抑制剂和内标的相同的分析溶液被用于所有三个样品。因此，所有样品接受相同浓度的试剂。在Waters Quattro MicroESI-triple四极串联质谱仪上，使用176的母离子扫描，分析最终的样品溶液。在光谱中示出的主峰是与完整底物、内标和相应的酶产物相应的。因为所有的样品用同样浓度的试剂处理，产物和内标之间的相对丰度表明了样品之间的相对酶活性。
[0064]这些谱清楚表明，在健康的个体中有丰富的GAA活性，因为根据产物的丰度相对于内标的丰度，底物转化为产物是非常明显的。与之相反，相应于蓬珀病阳性新生儿的样品显示可忽略不计的GAA酶活性，因为没有明显的底物向产物的转化。在蓬珀病阳性新生儿的谱中明显的对应于产物的小峰被描述为背景。对处理空白样品所形成的谱的检查也显示对应于产物的小峰。在这种情况中，由于该样品中不存在血，明显的是样品处理引起底物低程度的非酶水解。在蓬珀病和空白的谱中的产物/内标峰的相对丰度的比较表明，在蓬珀病阳性样品中的小的产物峰主要是由于非酶水解。有小量的非酶底物水解的事实并不令人吃惊，因为糖苷键是相当不稳定的。然而，从该实施例明显可见，在与健康个体中产物转化的量相比，非酶底物水解的程度是可以忽略不计的。因此，这种背景不应该对该方法有任何限制。这些谱清楚表明本发明底物的效用，因为它们明显表明其是临床特异性的、灵敏的并且稳定的。进一步，这些试剂保留它们的效用，同时允许显著简化的分析。
实施例3
[0065]图9示出处理12个来自健康新生儿的和3个来自蓬珀病阳性的新生儿的干血斑样品的结果。使用的试剂和方法与图6中描述的那些相同。因为以已知浓度引入内标，所以通过将产物和内标的相对丰度和内标的浓度相关联，量化酶活性是可能的。该图示出对于15个研究的对象以微摩尔/小时/升的血液单位表示的确定的酶活性的散点图。从该图，明显可见，在健康新生儿的GAA活性和受侵袭的新生儿的活性之间存在明显不同。三个蓬珀病患者记录的活性与那些健康的个体相比忽略不计。注意，如在图6中所描述的，非酶水解产生小程度的背景。这里提供的数据没有对背景修正。健康和患病之间的差异仍然是显著的。
实施例4
[0066]图10示出如此实施例，其中通过使用含有两种类型的底物和内标的分析溶液处理样品，在图1中描述的本发明底物和内标被用于多元方法中。在底物靶向蓬珀病和其它克腊比病时，使用的方法与在图8中描述的方法相同，唯一的差别在于现在分析两种酶的底物。蓬珀病底物是用癸酰基-肉碱制备的图1的底物，克腊比病底物是用四癸酰基-肉碱(tetredecanoyl-carnitine)制备的图1的底物。在该实施例中使用的样品是来自健康新生儿的干血斑样品。另外，不含血液的空白溶液样品按照相同的过程处理。与在图8中描述的单一酶分析相比，在图10的谱中示出的主峰与加入到溶液中的完整的两个底物、加入到溶液中的两个内标和两个相应的酶产物相应。
[0067]在该实施例中，可见两种或多种酶的活性可同时检测，同时保持足够好的灵敏性。该实施例通过提供对该方法的附加简化进一步表明本发明的效用，因为其可能巩固样品制备。
实施例5
[0068]图11示出洗涤剂对本发明的内标的灵敏性的影响。这些数据被用来例证洗涤剂对分析的总体灵敏性的影响。尽管在质谱法分析之前内标已经带电的事实，离子抑制可仍旧在它们的灵敏性中起作用。已知洗涤剂引起重要的离子抑制。在这种情况中，具有和不具有洗涤剂的净溶液(纯甲醇)中的内标的灵敏性得以显示。另外，在具有和不具有洗涤剂的、含有提取的干血斑的溶液中内标的灵敏性也被显示。在该实施例中，含有α-和β-葡萄糖和半乳糖的数种烷基链长度的内标被溶解在净溶液中，或者溶解在分析溶液中，使用这些溶液，如图8和10中描述的提取和处理干血斑。在该实施例中，等分的每种溶液类型不含洗涤剂，另一种溶液含有洗涤剂。因此，在这些成对样品中，唯一的差异是存在或不存在洗涤剂。通过串联质谱法分析该成对样品。在每一样品中，内标的信号强度被记录并被用来产生平均相对灵敏性。该图示出使用和不使用洗涤剂处理的样品的归一化的平均强度。明显地，洗涤剂引起离子抑制，这通过含有洗涤剂的样品中的较低强度可见。该图也表明洗涤剂的影响在含有复合基质如血液的样品中显著得多，因此更加需要在串联质谱法分析中避免使用这类物质。
实施例7
[0069]图12示出如此实施例，其中分析洗涤剂对酶活性的影响。在该实施例中，含有α-D-葡萄糖和16-碳脂肪酸链的本发明的底物(图1)被用来根据图6中描述的过程处理干血斑。为了检测洗涤剂的影响，同一患者的平行样品根据上述方法在具有和不具有洗涤剂情况下进行制备。图11表明洗涤剂降低分析的灵敏性。然而，问题是洗涤剂是否对酶活性有影响。在图12中示出的谱明确表明洗涤剂的确对评估的酶活性具有影响。在这种情况下，分析溶液中缺乏洗涤剂增强酶活性的速率，如对于在没有洗涤剂的情况下处理的样品，与相应的内标相比产物丰度更多升高所表明的。通过表明通过减小离子抑制和增强靶酶的活性，不但方法可以被简化，而且在这样进行时增强了分析的灵敏性，该实施例进一步再次证实本发明的效用。
[0070]在说明书中提到的专利文献和出版物表明本发明涉及领域的普通技术人员的水平。这些文献和出版物被引入本文作为参考，引入程度如同每一独立文献或出版物被明确和单独引入本文作为参考的程度。
[0071]前述说明书是说明本发明的具体实施方式，但是不意欲限制其实践。所附权利要求书包括其所有的等同物意图限定本发明的范围。

Claims (23)

1.用于酶的质谱分析的底物，具有下式：
A—(B1—B2—B3)      (I)
其中A是单糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；B2是
Figure A200780014149C00021
其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；杂原子C6-C20芳基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；在每一情况中，R2独立为H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基；在每一情况中，X独立为不存在、氧、硫或氮；在每一情况中，R3独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；n是0和30之间的整数，包括0和30；在每一情况中，R4独立为不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20链烯基；杂原子C6-C20芳基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环。
2.权利要求1所述的底物，其中A和(B1—B2—B3)由于所述酶的作用分开。
3.权利要求1所述的底物，其中A是乙醛糖或己酮糖。
4.权利要求1所述的底物，其中A是D-葡萄糖或D-半乳糖。
5.权利要求1所述的底物，其中B1是具有从环延伸的取代基的C6芳基。
6.权利要求1所述的底物，其中B1是苯基、硝基苯基或苯酯。
7.权利要求6所述的底物，其中B2是肉碱基。
8.权利要求7所述的底物，其中B3是具有以羰基存在的O的取代基的C2-C20烷基。
9.权利要求1所述的底物，其中A和(B1—B2—B3)部分每一个包括元素的稳定二级流行同位素。
10.权利要求9所述的底物，其中在每一情况中，所述稳定二级流行同位素选自2D、13C、15N、17O、18O、31P和34S。
11.用于酶的质谱分析的方法，包括：
将所述酶与根据权利要求1的式IA—(B1—B2—B3)的所述底物接触，以在酶反应后产生具有切割产物分子量的式(B1—B2—B3)的切割产物；
提供所述底物的式(B1—B2—B3)’的内标，其中(B1—B2—B3)’具有与所述切割产物分子量不同的分子量的至少一种稳定二级流行同位素，并且(B1—B2—B3)’的B1、B2和B3如在根据权利要求1的式I中所详述；和
使用质谱分析，量化所述切割产物和所述内标之间的质量/电荷比。
12.权利要求11所述的方法，其中所述酶选自酸性α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂α-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶和酸性α-葡糖苷酶。
13.权利要求11所述的方法，其中所述(B1—B2—B3)的切割产物与所述(B1—B2—B3)’的内标结构上相同。
14.一种商业包装，其包括根据权利要求1的式IA—(B1—B2—B3)的底物作为活性成分；具有与(B1—B2—B3)不同的稳定二级流行同位素分子量的(B1—B2—B3)’的内标；和用于通过质谱分析检测样品中的酶活性的说明。
15.用于酶的质谱分析的方法，包括：
用同位素标记物L1标记根据权利要求1的式IA—(B1—B2—B3)的底物，以形成第一底物L1(A)—L1(B1—B2—B3)；
用同位素标记物L2标记根据权利要求1的式IA—(B1—B2—B3)的试剂，以形成第二底物L2(A)—L2(B1—B2—B3)，其中所述同位素标记物L2不同于所述同位素标记物L1；
在容器中使所述第一底物L1(A)—L1(B1—B2—B3)和所述第二底物L2(A)—L2(B1—B2—B3)与所述酶结合，其中所述第一底物L1(A)—L1(B1—B2—B3)被所述酶切割形成L1A和L1(B1—B2—B3)，其中所述第二底物L2(A)—L2(B1—B2—B3)被所述酶切割形成L2A和L2(B1—B2—B3)；和
量化所述第一底物L1(A)—L1(B1—B2—B3)和所述第二底物L2(A)—L2(B1—B2—B3)的减少，和所述L1A、L1(B1—B2—B3)、L2A和L2(B1—B2—B3)的增加。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述容器是检测试管、检测小瓶或多孔微量培养板。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述测量通过质谱法完成。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶选自酸性α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂α-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶和酸性α-葡糖苷酶。
19.一种使用根据权利要求1所述的底物检测在从个体收集的样品中的第一种溶酶体贮积病的方法。
20.根据权利要求19所述的方法，进一步包括同时检测第二种溶酶体贮积病。
21.检测溶酶体贮积病的方法，基本上如本文关于所附实施例的任何一个所描述。
22.用于克腊比病的质谱检测的底物，其具有根据权利要求1的式A—(B1—B2—B3)，其中基团A为β-D-半乳糖、B1为甲基、B2为具有季铵末端的酰胺基和B3为具有12到20个碳长度的链烯醇。
23.用于高歇病的质谱检测的底物，其具有根据权利要求1的式A—(B1—B2—B3)，其中基团A为β-D-半乳糖、B1为甲基、B2为具有季铵末端的酰胺基和B3为具有12到20个碳长度的链烯醇。
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