CN108780072A

CN108780072A - 带电质量标记系统

Info

Publication number: CN108780072A
Application number: CN201780018381.8A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·格雷厄姆·库克斯; Z·贝尔德; M·普吉亚; A·霍勒巴赫; S·艾尔顿
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: US20190128897A1; BR112018015034A2; KR20180102654A; EP3405783A1; US11061035B2; JP2021167820A; CN113970589A; EP4012416A1; KR102641264B1; JP2019510204A; CN108780072B; CA3012121C; CA3012121A1; WO2017127670A1; JP7305709B2; JP6902036B2; EP3405783A4; EP3405783B1; US20210293826A1

Abstract

本发明大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。在某些方面，本发明提供带电质量标记组合物，其包括亲和试剂以及与亲和试剂结合的质量标记前体。质量标记前体包括标记结合单元和质量标记。标记结合单元可逆地将质量标记与亲和试剂结合。质量标记包括电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。

Description

带电质量标记系统

相关申请

本申请要求2016年1月22日提交的美国临时专利申请序列号62/286,115的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。

背景技术

已经开发了一些测定法，其重点在于从体液中分析稀有分子(例如蛋白质，核酸等)是否存在异常，从而导致某些病况如癌症的早期诊断。然而，在典型的体液样品中，大多数稀有分子被降解，并且相对于样品中分子的总量，任何含有所关注的异常的改变的稀有分子以少量(例如，小于1％)存在。这导致无法检测到少量异常稀有分子。

已经开发了亲和力测定法、核酸测定法和细胞分析测定法用于检测样品中的稀有分子。每个都有一些缺点。例如，通过常规亲和力测定法无法检测到每毫升1至50,000个拷贝(飞摩尔(fM)或更低)的稀有分子，常规亲和力测定法需要远远超过稀有分子数量的分子拷贝数。免疫测定法受抗体的亲和力结合常数的限制，所述亲和力结合常数通常不高于10^-12(1pM)。由于解离速率为10^-13，所以免疫测定法需要至少100倍的抗体过量，并且抗体蛋白的溶解度限制了反应的完成。

针对核酸，先前已经采用基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、数字PCR、定量PCR)来试图检测这些异常。然而，由于扩增反应的随机性质，所以通常忽略样品中少量存在的分子群。事实上，如果稀有核酸在前几轮扩增中没有被扩增，那么稀有物种将越来越不可能被检测到。

在稀有分子被细胞结合或包含在细胞内的情况下，采用细胞分析技术，需要分离包含稀有分子的靶细胞。包含稀有分子的那些细胞通常仅代表分析中的一小部分样品。因此，即使在检测这些细胞内的稀有分子之前，也需要具有高分离效率和细胞回收率的方法。纯化后，可以通过常规扫描显微镜将稀有细胞分析至单细胞水平。然而，即使扫描和分析自动化，对于每个待扫描的样品，显微镜方法可能需要24小时或更长时间。另外，所有具有多个图像的稀有细胞必须由病理学家目测检查以确定测量的蛋白质量的显著性。

已经尝试使用质谱法(MS)进行稀有事件检测。但是，出现了一些问题。例如，不能将所关注的标记与样品干扰(矩阵重叠)分开。由于临床样品中的背景而导致的更高检测极限(皮摩尔(pM)增加至纳摩尔(nM))是一个问题。由于小于1微升(jal)的样品被低效捕获用于电离并且从复杂样品例如血液中低效地分离，因此无法使用小的nL样品体积。此外，由于与相同质量的其它离子竞争电离或由于特定基质组分的存在而抑制电离，所以MS通常不能检测到某些质量。这些问题通常会由于假阳性和/或假阴性结果而导致问题。

为了解决这些问题，已经开发了依赖于使用与样品中的稀有分子结合的质量标记的技术。该方法允许质谱法用于稀有事件检测，因为使用质量标记克服了与直接检测样品中的稀有分子相关的上述问题。

然而，质量标记仍然存在问题，其限制了质谱法用于稀有分子检测的全部潜力。例如，目前的MS标记通常利用通过可逆二硫键与亲和剂结合的肽。然而，肽倾向于在质谱仪中容易地交换质子并且通常具有低电离效率。另外，用于从二硫键释放肽的化学物质，例如TCEP和DTT，可能抑制来自质量标记的质谱中的信号强度。虽然强酸例如TFA可以提高电离效率，但它们防止TCEP和DTT裂解二硫键，因此需要单独的液体来通过喷雾电离释放和电离质量标记。

因此，质量标记技术的应用仍然存在问题；即，质量标记例如肽不具有理想的电离效率，当前质量标记可能不会碎裂成可与背景噪声分离的可预测质量，并且质量标记不容易从亲和试剂上裂解下来。

发明内容

本发明大体上涉及带电质量标记组合物，其设计成与样品的背景质量分析分离并且高效电离。本发明的组合物包括亲和试剂和与亲和试剂结合的质量标记前体。由于亲和试剂的特异性，每个MS标记可以对应于来自样品的一种或多种靶标稀有分子。多级MS(也称为MSⁿ、CID)可用于检测样品中不同的稀有分子群。将结合的亲和剂暴露于物质以化学释放MS标记用于MS分析，从而确定每种不同MS标记的存在和/或量。每种不同MS标记的存在和/或量与样品中每种不同稀有分子群的存在和/或量有关。

质量标记前体包括标记结合单元和质量标记。标记结合单元可逆地将质量标记与亲和试剂结合。标记结合单元的可逆结合允许从亲和剂中容易且可靠地裂解MS标记。质量标记包括电荷单元(例如，预带电的(离子官能团)，例如季铵(季胺)基团，或类似的锍或鏻阳离子，或吡啶鎓或咪唑鎓)。这种电荷单元是离子型，因此在MS中很容易观察为气相离子。质量标记还包括质量标记单元，其在质谱中具有预定义的质荷比值。质量标记可以由于电离时的碎裂产生至少一个独特的质量碎片，并且经过MS/MS成为与背景分离的至少一个可预测的m/z。因为质量标记产生了与背景分离的可预测的m/z，所以通过质谱法可以容易地检测特征质量标记。

许多不同类型的亲和试剂可用于本发明的组合物中。在某些实施例中，亲和试剂包括特异性结合对的至少一个成员。亲和试剂可以是非颗粒状或颗粒状的，并且与质谱(MS)标记前体连接，从中可以释放包含MS标记的实体。在某些实施例中，质量标记单元和电荷单元通过一个或多个在电离时抗断裂的键彼此结合。通常，标记结合单元包括可逆键，例如缩醛或缩酮键。

电荷单元包括一个或多个化学部分，其被布置成在电离时具有电荷。例如，电荷单元可包括一个或多个选自由式I-VII组成的组的化学部分：

在某些实施例中，至少一个X是季铵阳离子或季鏻阳离子，其任选被至少一个R取代。所述R可以选自由氢、烷基或芳香族有机衍生物组成的组。在其它实施例中，电荷单元是选自由以下组成的组的化学部分：肉碱、咪唑鎓、吡啶鎓、四乙胺、苯甲烃铵胺、烷基苯乙铵胺、三苯基鏻阳离子以及三烷基(2,3-二羟基丙基)。

质量标记单元可包括化学部分的排列，其在电离时产生一个或多个碎片。在这些实施例中，一个或多个碎片中的至少一个在质谱中具有预定义的质荷比值。在某些实施例中，质量标记或质量标记的一个或多个碎片的质谱中的预定义质荷比值不同于质谱中的背景质荷比值。

本发明的其它方面包括用于检测样品中的靶标分析物的方法。这些方法可以包括将带电质量标记组合物引入包含靶标分析物的样品，其中带电质量标记组合物包含亲和试剂；和与亲和试剂结合的质量标记前体，其中质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，标记结合单元将质量标记可逆地结合到亲和试剂，并且其中质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。所述方法然后包括培育样品和带电质量标记组合物，使得带电质量标记组合物通过带电质量标记组合物的亲和试剂和靶标分析物之间的相互作用结合靶标分析物。然后通过破坏标记结合单元的一个或多个键从亲和试剂释放质量标记。质量标记被电离并且在质谱仪中检测电离的质量标记和/或其碎片，从而检测样品中的靶标分析物。本发明的方法还可包括定量电离的质量标记和/或其碎片，从而定量样品中的靶标分析物。

本发明的方法可以与各种类型的样品一起使用，例如生物样品、环境样品、农业样品等。在某些实施例中，靶标分析物是靶标生物分子。通常，靶标生物分子的存在指示疾病，例如癌症。

本文描述的其它实例涉及通过质谱法(MS)检测疑似含有一种或多种不同稀有分子和非稀有分子群的样品中的一种或多种不同靶标稀有分子群的方法。用亲和剂检测到一种或多种不同靶标稀有分子群的浓度超过非稀有分子的浓度，所述亲和剂包含针对存在的稀有分子群之一的靶标稀有分子群的特异性结合配偶体。亲和试剂可以是非颗粒状或颗粒状的并且与质量标记前体连接，所述质量标记前体在暴露于含有试剂的液体后释放质量标记，所述试剂促进标记前体内的质量标记和标记结合单元之间的键断裂。对四级质量标记进行MS分析以确定每种不同的四级质量标记的存在和/或量。四级质量标记的存在和/或量与样品中靶标稀有分子的存在和/或量有关。

本文描述的另一个实例涉及通过质谱法(MS)检测疑似含有一种或多种不同稀有分子和非稀有分子群的样品中的一种或多种不同靶标稀有分子群的方法。通过将与质量标记前体连接的亲和试剂与靶标稀有分子结合，检测到一种或多种不同靶标稀有分子群的浓度超过非稀有分子的浓度。在亲和试剂结合稀有分子后，将质量标记用释放试剂化学释放，并进行MS分析以确定四级质量标记的存在和/或量，因此确定稀有分子。质量标记的存在和/或量与样品中靶标稀有分子的存在和/或量直接相关。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的图示。稀有分子/细胞与亲和试剂结合，所述亲和试剂可以是颗粒状或非颗粒状的。亲和试剂又用标记结合单元功能化，所述标记结合单元促进与质量标记的可逆缀合。质量标记和标记结合单元构成质量标记前体。质量标记由电荷单元(其带有形式电荷，例如季铵、锍或鏻盐)和可变质量单元构成，所述可变质量单元是形式中性的并且是变化的以产生在质谱中以预定义的m/z值出现的质量标记。

图2是电荷单元，其中至少一个X是N-R部分(例如季铵阳离子)，或其中至少一个X是季鏻阳离子，其中X＝P-R，其中R可以是氢、烷基或芳香族有机衍生物例如甲基、苄基或苯基。

图3嵌图A-D显示由Y表示的可变质量单元，其包含至少一个原子，例如CH、CH₂、O、N、S、P或质量低于3kDA的分子，例如嵌图B和嵌图D中所示的苯基。作为质量标记的组成部分的可变质量单元Y和电荷单元如嵌图A和嵌图B所示通过缩醛或缩酮键连接至由R₁表示的亲和试剂或稀有分子，或如嵌图C和嵌图D所示通过亚胺键连接。

图4是L-肉碱。

图5显示具有咪唑鎓(m/z 217)和吡啶鎓(m/z 214)结构作为电荷单元的质量标记以及由MS/MS得到的它们各自的产物离子。在这种情况下，可变质量单元由分子中不直接连接到预带电原子的所有其它原子构成。质量标记在进行MS/MS时会产生独特的碎片离子。对于咪唑鎓质量标记，在产物离子MS/MS谱中在m/z 83处可观察到独特的碎片。对于吡啶鎓质量标记，在产物离子MS/MS谱中在m/z 80处可观察到独特的碎片离子。

图6显示由R表示的亲和试剂或原始分子如何通过缩醛或缩酮键与四级质量标记通过二醇与质量结构Y上的醛反应而连接。首先通过β-羟基-γ-丁内酯的反应形成酰胺键，将二醇附接到亲和试剂或稀有分子的胺。

图7使用校准曲线显示释放到释放溶液中的质量标记的浓度。将样品(三角形)稀释四个数量级。在稀释两个数量级后，分析释放前的最终洗涤的上清液(正方形)。

图8显示衍生自N-取代的咪唑的较高质量类似物的质量标记。在这些情况下，电荷单元仍然是季氮，但可变质量单元已经变化以产生具有不同质量的质量标记。

图9描述用于预测质谱仪中肽质量标记的碎裂的方法。

图10是示出微型质谱仪中的各种组件及其布置的图片。

具体实施方式

当进行MS/MS时，质量标记产生至少一个独特的碎片。这种碎裂是可预测的并且产生至少一种可以与背景光谱分析分离的质量。质量标记离子可以通过周围环境中的电离事件产生(图1)。在质谱仪的真空中检测质量标记及其产物离子(图1)。质量标记(例如，四级质量标记)可以通过标记结合单元(例如，缩醛或缩酮键)附接到亲和试剂或稀有分子，并用于检测稀有分子的方法。

一些实例涉及通过质谱法(MS)检测疑似含有一种或多种不同稀有分子和非稀有分子群的样品中的一种或多种不同靶标稀有分子群的方法。通过将本发明的组合物结合到样品中的靶标稀有分子，可以检测到一种或多种不同的靶标稀有分子群的浓度超过非稀有分子的浓度。可以在稀有分子和质量标记前体之间以非颗粒或颗粒结合进行附接，在暴露于含有改变剂的液体后，从稀有分子中释放出质量标记。可对经处理的样品进行MS分析以确定或定量四级质量标记的存在和/或量。质量标记的存在和/或量可以与样品中靶标稀有分子的存在和/或量有关。

术语“亲和试剂”是指特异性结合对的成员。实例包括免疫对，例如抗原-抗体或半抗原-抗体，生物素-抗生物素蛋白对，激素-激素受体，酶-底物，核酸双链体，IgG-蛋白质A，蛋白质-核苷酸对和多核苷酸对，例如DNA-DNA、DNA-RNA。例如，核酸(例如，多核苷酸)可以是与靶标核酸互补的“亲和试剂”。多核苷酸是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。具有亲和力的组合物可包括用于扩增和捕获的粒子，其可以是有机或无机、磁性或非磁性材料的实体。

在某些实施例中，亲和试剂是核酸。在某些实施例中，靶标稀有核酸的序列可以通过参考文献确定。例如，导致遗传物质丢失引起癌症的突变及其在基因内的位置是本领域已知的。参见例如Hesketh,The Oncogene Facts Book,Academic Press Limited(1995)。知道突变和突变的位置，本领域技术人员可以容易地设计核酸亲和试剂，其将结合样品中的稀有核酸序列。

或者，可以获得来自受试者的样品并测序，以确定样品中稀有核酸的序列。通常，从受试者获得样品。可以任何临床上可接受的方式获得样品，并且通过本领域已知的方法从样品中提取核酸。通常，可以通过多种技术从生物样品中提取核酸，例如Maniatis等人描述的那些技术(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,第280-281页,1982)，其内容通过引用整体并入本文。

一旦获得，核酸分子通过本领域已知的任何方法测序，例如整体测序或单分子测序。一种进行测序的常规方法是通过链终止和凝胶分离，如Sanger等人,Proc Natl AcadSci USA,74(12):546367(1977)所述。另一种常规测序方法涉及核酸片段的化学降解。参见Maxam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,74:560564(1977)。最后，已经开发了基于杂交测序的方法。参见例如Drmanac等人,(Nature Biotech.,16:54 58,1998)。每篇参考文献的内容通过引用整体并入本文。

在某些实施例中，通过Sanger测序技术进行测序。经典的Sanger测序涉及单链DNA模板、DNA引物、DNA聚合酶、放射性或荧光标记的核苷酸以及终止DNA链延伸的修饰核苷酸。如果标记未附接到双脱氧核苷酸终止子(例如，标记的引物)，或者是单色标记(例如，放射性同位素)，那么将DNA样品分成四个单独的测序反应，其含有四种标准脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)和DNA聚合酶。向每个反应中仅添加四种双脱氧核苷酸中的一种(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)。这些双脱氧核苷酸是链终止核苷酸，缺少在DNA链延伸期间在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键所需的3'-OH基团。然而，如果每个双脱氧核苷酸携带不同的标记(例如，4种不同的荧光染料)，那么所有测序反应可以一起进行而无需单独的反应。

将双脱氧核苷酸掺入新生的(即延伸的)DNA链中终止DNA链延伸，产生不同长度的嵌套DNA片段组。将新合成和标记的DNA片段变性，并使用凝胶电泳在变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶上通过大小分离，所述变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶能够解析链长的单碱基差异。如果四个DNA合成反应中的每一个都用相同的单色标记物(例如放射性同位素)标记，那么它们在凝胶中四个单独的相邻泳道之一中分离，其中凝胶中的每个泳道根据各反应中使用的双脱氧核苷酸命名，即凝胶泳道A、T、G、C。如果使用四种不同的标记，那么反应可以在凝胶上的单个泳道中组合。然后通过放射自显影或荧光观察DNA条带，并且可以直接从X射线胶片或凝胶图像读取DNA序列。

根据在反应中加入的双脱氧核苷酸鉴定末端核苷酸碱基，产生该条带或其相应的直接标记。然后使用凝胶中不同条带的相对位置来读取(从最短到最长)所示的DNA序列。Sanger测序过程可以使用DNA测序仪自动化，例如可从PerkinElmer、Beckman Coulter、Life Technologies等商购的那些DNA测序仪。

在其它实施例中，核酸的测序通过利用合成技术的单分子测序来完成。单分子测序例如在Lapidus等人(美国专利号7,169,560)、Quake等人(美国专利号6,818,395)、Harris(美国专利号7,282,337)、Quake等人(美国专利申请号2002/0164629)和Braslavsky等人,PNAS(USA),100:3960-3964(2003)中显示，这些参考文献中每一篇的内容通过引用整体并入本文。简而言之，单链核酸(例如DNA或cDNA)与附接到流动池表面的寡核苷酸杂交。寡核苷酸可以共价附接到表面上，或者可以采用本领域普通技术人员已知的除共价连接之外的各种附接。此外，附接可以是间接的，例如通过直接或间接附接到表面的聚合酶。表面可以是平坦的或其它的，和/或可以是多孔的或无孔的，或者是普通技术人员已知的适于附接的任何其它类型的表面。然后通过以单分子解析对聚合酶介导的掺入生长链表面寡核苷酸的荧光标记的核苷酸的添加进行成像来对核酸进行测序。

其它单分子测序技术涉及检测焦磷酸，因为它从单核苷酸掺入DNA的新生链中被切割，如Rothberg等人(美国专利号7,335,762、7,264,929、7,244,559和7,211,390)和Leamon等人(美国专利号7,323,305)所示，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在其它实施例中，使用靶向重测序。重测序例如在Harris(美国专利申请号2008/0233575、2009/0075252和2009/0197257)中示出，其各自的内容通过引用整体并入本文。简而言之，在测序之前选择靶标的特定区段(例如通过PCR、微阵列或MIPS)。将设计成与该特定区段杂交的引物引入，并形成引物/模板双链体。在足以对引物进行模板依赖性核苷酸添加的条件下，将引物/模板双链体暴露于聚合酶和至少一种可检测标记的核苷酸。确定标记的核苷酸的掺入，以及在与掺入的核苷酸相对的位置处与模板上的核苷酸互补的核苷酸的身份。

在聚合反应之后，可以从双链体中去除引物。可以通过任何合适的方法去除引物，例如通过升高表面或衬底的温度以使双链体解链，或通过改变缓冲条件以使双链体不稳定，或其组合。用于使模板/引物双链体解链的方法是本领域熟知的，并且描述于例如Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第3版增刊,J.Sambrook和D.W.Russell,ColdSpring Harbor Press(2001)的第10章中，其教导通过引用并入本文。

去除引物后，可以将模板暴露于能够与模板杂交的第二引物。在一个实施例中，第二引物能够与第一引物杂交于模板的相同区(在本文中也称为第一区)，以形成模板/引物双链体。然后重复聚合反应，从而重新测序至少一部分模板。

如果样品中的核酸被降解或者只能从样品中获得最少量的核酸，那么可以对核酸进行PCR以获得足够量的核酸用于测序(参见例如Mullis等人的美国专利号4,683,195，其内容通过引用整体并入本文)。

一旦稀有核酸的序列已知，就可以使用本领域常规的核酸合成技术合成核酸亲和试剂。合成寡核苷酸的方法是本领域已知的。参见例如Sambrook等人(DNA microarray:AMolecular Cloning Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,2003)或Maniatis等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982)，其各自的内容通过引用整体并入本文。用于合成寡核苷酸的合适方法也描述于Caruthers(Science230:281-285,1985)中，其内容通过引用并入本文。寡核苷酸也可以从商业来源获得，例如Operon Technologies、Amersham Pharmacia Biotech、Sigma和Life Technologies。寡核苷酸可具有相同的解链温度。寡核苷酸的长度可以在5'端或3'端延长或缩短以产生具有所需解链温度的寡核苷酸。而且，可以设计每个寡核苷酸的退火位置，使得核酸亲和试剂的序列和长度产生所需解链温度。用于确定小于25个碱基对的核酸亲和试剂的解链温度的最简单的方程式是华莱士规则(Wallace Rule)(Td＝2(A+T)+4(G+C))。计算机程序也可用于设计寡核苷酸，包括但不限于Array Designer软件(Arrayit Inc.)、用于遗传分析的寡核苷酸探针序列设计软件(Olympus Optical Co.)、NetPrimer和来自Hitachi SoftwareEngineering的DNAsis。每个探针的TM(解链温度)使用软件程序计算，例如可从InvitrogenCorp.获得的Oligo Design。

在其它实施例中，亲和试剂可以是抗体。抗体结合的抗原可以从公开的文献中确定。在Harlow等人(Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory,第93-117页,1988)中描述了抗体产生的通用方法，包括在选择用于产生抗血清的动物时要考虑的标准。例如，通过施用有效产生免疫应答的量的免疫原使适当大小的动物免疫，例如山羊、狗、绵羊、小鼠或骆驼。示例性方案如下。根据动物的大小，给动物注射再悬浮于佐剂(例如弗氏完全佐剂)中的100毫克抗原，随后根据动物的大小，在三周后皮下注射100微克至100毫克免疫原与佐剂(例如弗氏不完全佐剂)。每两周用佐剂(例如弗氏不完全佐剂)进行额外的皮下或腹膜内注射，直到达到动物血液中合适的抗体滴度。示例性滴度包括至少约1:5000的滴度或1:100,000或更高的滴度，即具有可检测活性的稀释度。例如，通过在含有蛋白质G树脂或靶标特异性亲和树脂的柱上进行亲和纯化来纯化抗体。

人淋巴细胞的体外免疫技术用于产生单克隆抗体。用于人淋巴细胞体外免疫的技术是本领域技术人员熟知的。参见例如Inai等人,Histochemistry,99(5):335 362,1993年5月；Mulder等人,Hum.Immunol.,36(3):186 192,1993；Harada等人,J.Oral Pathol.Med.,22(4):145 152,1993；Stauber等人,J.Immunol.Methods,161(2):157 168,1993；和Venkateswaran等人,Hybridoma,11(6)729 739,1992。这些技术可用于产生抗原反应性单克隆抗体，包括抗原特异性IgG和IgM单克隆抗体。

在某些实施例中，缀合物部分是适体。如本文所用，“适体”和“核酸配体”可互换使用，是指对靶分子(例如蛋白质)具有特异性结合亲和力的核酸。与所有核酸一样，特定核酸配体可以通过核苷酸(A、U、T、C和G)的线性序列来描述，通常为15-40个核苷酸长。可以工程改造核酸配体以编码已知与特定疾病的存在或不存在相关的靶蛋白的互补序列。

在溶液中，核苷酸链形成分子内相互作用，将分子折叠成复杂的三维形状。核酸配体的形状允许其紧密结合其靶分子的表面。除了显示出显著的特异性外，核酸配体通常以非常高的亲和力结合它们的靶标，例如，大多数抗蛋白质核酸配体具有皮摩尔至低纳摩尔范围的平衡解离常数。

用于本发明组合物中的适体取决于靶标组织。可以通过本领域已知的任何方法发现核酸配体。在一个实施例中，使用称为SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)的体外选择过程发现核酸配体。参见例如Gold等人(美国专利号5,270,163和5,475,096)，其各自的内容通过引用整体并入本文。SELEX是一种迭代过程，用于从大量核酸库中鉴定选定分子靶标的核酸配体。该过程依赖于标准分子生物学技术，使用多轮选择、分配和扩增核酸配体来分辨对靶分子具有最高亲和力的核酸配体。SELEX方法包括鉴定含有修饰核苷酸的高亲和力核酸配体，其赋予配体改善的特性，例如改善的体内稳定性或改善的递送特性。这类修饰的实例包括核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。对基本SELEX方法进行了许多改进，其中任何一种方法都可用于发现用于本发明方法的核酸配体。

“稀有分子”是指当与样品中非稀有分子的量相比时，以相对较小的量存在于样品中的分子。在一些实例中，稀有分子以疑似含有稀有分子的样品中总分子群的约10^-8重量％至约10^-2重量％的量存在。稀有分子可以是但不限于无细胞循环分子或在稀有细胞中发现的分子，例如恶性细胞如恶性肿瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环上皮细胞；间充质细胞；胎儿细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；干细胞；有核红细胞(正成红细胞或成红细胞)；和未成熟的粒细胞。例如在PCT/US2016/053610中进一步描述了稀有分子，其内容通过引用整体并入本文。

非稀有分子是当与样品中稀有分子的量相比时，以相对较大的量存在的那些分子。在一些实例中，非稀有分子是疑似含有非稀有分子和稀有分子的样品中总分子群中稀有分子的量的至少约10倍，或至少约10²倍，或至少约10³倍，或至少约10⁴倍，或至少约10⁵倍，或至少约10⁶倍，或至少约10⁷倍，或至少约10⁸倍。非稀有分子可以是无细胞循环非稀有分子或在非稀有细胞中发现的非稀有分子，非稀有细胞例如但不限于白细胞、血小板和红细胞。

例如，术语“稀有分子”可包括但不限于抗原、蛋白质、肽、激素、维生素、过敏原、自身免疫抗原、碳水化合物、脂质、糖蛋白、辅因子、抗体、酶、酶底物、代谢物、核酸、抗体、有机胺、脂肪酸、碳水化合物、环状烃、脂肪烃、芳香烃、有机羧酸、有机胺、神经胺、脑苷脂、类固醇、前列腺素、碳水化合物、核苷和治疗药物，以及其它生物分子。例如，包括用于疾病的医学诊断的生物分子，其包括但不限于用于检测癌症、心脏损伤、心血管疾病、神经疾病、止血、胎儿母体评估、生育力、骨骼状态、激素水平、维生素、过敏、自身免疫疾病、高血压、肾病、糖尿病、肝病、传染病的生物标志物和其它可用于疾病的医学诊断的生物分子。生物标志物例如可以来自细胞，例如细菌、病毒、真菌和原生动物；恶性细胞，例如恶性肿瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环肿瘤细胞；循环癌症干细胞；循环癌间充质细胞；循环上皮细胞；胎儿细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；和干细胞。

例如，稀有细胞的靶标稀有分子包括但不限于癌细胞类型生物标志物、癌蛋白和癌基因、化学抗性生物标志物、转移潜能生物标志物和细胞分型标志物。例如，作为说明而非限制，癌细胞类型生物标志物包括细胞角蛋白(CK)(CK1、CK2、CK3、CK4、CKS、CK6、CK7、CK8和CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19和CK2)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和波形蛋白。例如，由于突变而具有可能治疗相关性的癌蛋白和癌基因包括但不限于WAF、BAX-1、PDGF、JAGGED 1、NOTCH、VEGF、VEGHR、CA1X、MIB1、MDM、PR、ER、SELS、SEMI、PI3K、AKT2、TWIST1、EML-4、DRAFF、C-MET、ABL1、EGFR、GNAS、MLH1、RET、MEK1、AKT1、ERBB2、HER2、HNF1A、MPL、SMAD4、ALK、ERBB4、HRAS、NOTCH 1、SMARCB1、APC、FBXW7、IDH1、NPM1、SMO、ATM、FGFR1、JAK2、NRAS、SRC、BRAF、FGFR2、JAK3、RA、STK11、CDH1、FGFR3、KDR、PIK3CA、TP53、CDKN2A、FLT3、KIT、PTEN、VHL、CSF1R、GNA11、KRAS、PTPN11、DDR2、CTNNB1、GNAQ、MET、RBI、AKT1、BRAF、DDR2、MEK1、NRAS、FGFR1和R0S1。

例如，作为说明而非限制，内皮细胞分型标志物包括CD136、CD105/内皮糖蛋白、CD144/VE-钙粘蛋白、CD145、CD34、Cd41CD136、CD34、CD90、CD31/PECAM-1、ESAM、VEGFR2/Fik-1、Tie-2、CD202b/TEK、CD56/NCAM、CD73/VAP-2、紧密连接蛋白5、Z0-1和波形蛋白。

转移潜能生物标志物包括但不限于尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、CD95、丝氨酸蛋白酶(例如纤溶酶和ADAM)；丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如Bikunin)；基质金属蛋白酶(例如MMP9)；基质金属蛋白酶抑制剂(例如TIMP-1)。作为说明而非限制，化学抗性生物标志物包括PL2L piwi like、5T4、ADLH、β-整联蛋白、α6整联蛋白、c-kit、c-met、LIF-R、CXCR4、ESA、CD20、CD44、CD133、CKS、TRAF2和ABC转运蛋白，缺乏CD45或CD31但含有CD34的癌细胞指示癌症干细胞；和含有CD44但缺乏CD24的癌细胞。

在本文中的方法中，白细胞可以作为非罕见细胞排除掉。例如，存在于白细胞上的标志物(例如但不限于CD45、CTLA-4、CD4、CD6S和CDS)可用于指示细胞不是所关注的稀有细胞。在一个特定的非限制性实例中，CD45抗原(也称为蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型或PTPRC)和最初称为白细胞共同抗原可用于检测所有白细胞。

此外，CD45可用于区分可能被视为稀有细胞的不同类型的白细胞。例如，粒细胞由CD45+、CD15+指示；单核细胞由CD45+、CD14+指示；T淋巴细胞由CD45+、CD3+指示；T辅助细胞由CD45+、CD3+、CD4+指示；细胞毒性T细胞由CD45+、CD3+、CDS+指示；β-淋巴细胞由CD45+、CD19+或CD45+、CD20+指示；凝血细胞由CD45+、CD61+指示；并且自然杀伤细胞由CD16+、CD56+和CD3-指示。此外，两种常用的CD分子，即CD4和CD8，通常分别用作辅助T细胞和细胞毒性T细胞的标志物。这些分子与CD3+组合定义，因为一些其它白细胞也表达这些CD分子(一些巨噬细胞表达低水平的CD4；树突细胞表达高水平的CDS)。

在其它情况下，稀有细胞是病原体，其包括但不限于革兰氏阳性细菌(例如肠球菌属B群链球菌(Group B streptococcus)、凝固酶阴性葡萄球菌属草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和腐生葡萄球菌(saprophyicus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和其抗性菌株)；酵母，包括但不限于例如白色念珠菌(Candida albicans)；革兰氏阴性细菌，例如但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和类白喉菌(Diphtheroids)(gnb)和其抗性菌株；病毒，例如但不限于HIV、HPV、Flu和MERSA；以及性传播疾病。在检测稀有细胞病原体的情况下，添加颗粒试剂，其包含结合稀有细胞病原体群的结合配偶体。另外，对于病原体上的每个细胞靶标稀有分子群，添加了包含细胞靶标稀有分子的结合配偶体的试剂，其与群体中的细胞靶标稀有分子结合。

短语“非细胞靶标稀有分子”是指不与细胞结合和/或在样品中自由循环的靶标稀有分子。例如，这种非细胞靶标稀有分子包括用于疾病的医学诊断的生物分子，其包括但不限于用于检测癌症、心脏损伤、心血管疾病、神经疾病、止血、胎儿母体评估、生育力、骨骼状态、激素水平、维生素、过敏、自身免疫疾病、高血压、肾病、糖尿病、肝病、传染病的生物标志物和其它可用于疾病的医学诊断的生物分子。

“MS标记前体”是通过改变剂的作用产生MS标记的任何分子。MS标记前体本身可以是MS标记，其通过改变剂的作用，例如通过裂解，通过与部分反应，通过衍生化，或通过添加或通过减去分子、电荷或原子，或通过上述两种或更多种的组合转化为另一MS标记。MS标记前体包括标记结合单元和质量标记。

“质量标记”标记包括“电荷单元”和“质量单元”。

“电荷单元”包含以这样的方式排列的一组原子，即它们中的一个带有形式电荷。图2中所示的结构包括至少一个电荷单元X，其可以是例如N-R部分，例如季铵阳离子或至少一个X是季鏻阳离子，其中X＝P-R，其中R可以是氢、烷基或芳香族有机衍生物，例如甲基、苄基或苯基。实例包括肉碱、咪唑鎓、吡啶鎓、四乙胺、苯甲烃铵胺、烷基苯乙铵胺、三苯基鏻阳离子三烷基(2,3-二羟基丙基)鏻盐或其它四级结构。

术语“质量单元”包含至少一个如图3中的Y所示的原子，例如CH、CH₂、O、N、S、P或具有低于3kDA的组合质量的原子集合，例如在3a和3b中所示的苯基，并且附接到“电荷单元”。例如，可变质量单元可包括限定质量的结构，例如多肽、聚合物、羧酸、碳水化合物、环状环、芳环、烃、有机胺、核酸和有机醇，其质量可以通过取代和链大小来改变。“质量单元”可以包含额外的分子，例如芳环、肽、脂肪酸、碳水化合物、有机胺、核酸和有机醇(例如烷基醇、酰基醇、酚、多元醇(例如二醇)、硫醇、环氧化物、伯胺、仲胺和叔胺、吲哚、叔铵和季铵化合物、氨基醇、氨基硫醇、酚胺、吲哚羧酸、酚酸、插烯酸、羧酸酯、磷酸酯、羧酸酰胺、来自聚酰胺和聚酯的羧酸、腙、肟、三甲基甲硅烷基烯醇醚、氨基甲酸酯、脲、胍、异氰酸酯、磺酸、磺酰胺、磺酰脲、硫酸酯、甘油单酯、甘油醚、鞘氨醇，其允许根据本文所述原理的方法被多路复用以一次获得一个以上的结果。

“四级结构”和“质量结构”应通过抗断裂的键附接，例如C-C、C-O、C-N或其它多价键。例如，图4中所示的肉碱具有附接到肽质量标记的羧酸，例如L-肉碱-Phe-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys、L-肉碱-Phe-Thr-Ala-Ser-Ala-Cys、L-肉碱-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys、L-肉碱-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys、L-肉碱-phe-gly-gly-ser-cys、L-肉碱-phe-phe-ser-gly-cys、L-肉碱-phe-gly-thr-thr-cys、L-肉碱-phe-gly-thr-ala-cys、肉碱-arg-gly-cys和肉碱-phe-cys。在另一个实例中，四级质量标记的甲基咪唑鎓和吡啶鎓类似物通过-CH₂-键与芳香族质量标记连接，如图5所示。

质量标记能够通过标记结合单元附接到亲和试剂或稀有分子上，所述标记结合单元促进可逆键形成，例如缩醛或缩酮键，如图3嵌图A-D所示。图6显示由R表示的亲和试剂或稀有分子如何通过缩醛或缩酮键与四级质量标记连接。在这种情况下，标记结合单元是通过胺的修饰产生的二醇。该修饰可以通过胺与β-羟基-γ-丁内酯的反应来进行。其它可逆连接化学是本领域已知的并且适合于本发明的组合物，例如在美国专利申请公开号2011/0294952和2016/0086781中描述的那些，所述美国专利申请公开各自的内容通过引用整体并入本文。

这些缩醛或缩酮键在暴露于含水酸时通过水解而破坏，所述含水酸在这种情况下称为释放试剂。例如，乙腈或水与酸的溶剂将破坏缩醛或缩酮键并释放质量标记用于分析。重要的是缩醛或缩酮键不会因暴露于用于亲和反应的液体而过早破裂，并且在储存期间是稳定的。通常，标记结合单元和质量标记之间的结合可以用任何合适的释放试剂破坏，所述释放试剂例如可以是加热、超声处理或化学试剂如酸，这取决于哪一个是合适的。释放试剂还包括但不限于化学试剂，例如但不限于酸、催化剂(例如酶(包括假酶)和金属)、氧化剂、还原剂、酸、碱或促进缩醛或缩酮键断裂的其它试剂。

可以将一个或多个质量标签附接到单个亲和试剂上，例如对于任何单个亲和试剂，可以使用1至3000个质量标签的任何数量。具有多于一个质量标记与单个亲和单元结合的优点是产生信号放大的能力。主要地，这种方法放大信号是因为产生了许多由MS测量的单个分子，所述方法将信号乘以产生的单个分子的数量。这在稀有事件检测中可能是重要的，其中靶标可能仅以少于样品的1％存在。

四级质量标记产生独特的质量碎片，因为电离后碎裂成至少一个可预测的质量，从背景中分析分离。在质谱仪内部检测质量标记及其产物离子。图5显示了甲基咪唑鎓和吡啶鎓的各自的碎裂途径。图7显示了较高分子量衍生物的碎裂途径。调节四级质量标记的分子量，使得独特的质量碎片不在与背景组分的质量重叠的区域中。图5显示具有甲基咪唑鎓(m/z 217)和吡啶鎓(m/z 214)作为四级结构和芳香族质量结构(m/z 135)的四级质量标记。四级质量标记由于在碰撞诱导解离时碎裂产生所显示的独特质量碎片，其由甲基咪唑鎓(m/z 83)和吡啶鎓(m/z 80)表示。图7显示具有咪唑鎓的高分子量衍生物(m/z 309和m/z259)的四级质量标记。这些四级质量标记由于在电离时碎裂而产生更高质量的碎片(m/z175和m/z 125)。

前体质量标记碎裂成一个或多个碎片(产物离子)的可预测性将取决于质量标记的化学结构。对于基于碳的质量标记，可预测性遵循某些规则。例如，碳阳离子的稳定性顺序为：初级<次级<三级，初级离子不如次级离子稳定，次级离子又不如三级离子稳定。将这种逻辑应用于碎片模式，这意味着产生次级碳阳离子的分裂比产生初级碳阳离子的分裂更成功。产生三级碳阳离子的分裂仍将更成功。在羰基C＝O的碳上带正电荷的离子也是相对稳定的。

通常，将使用以下约定来分析结构。大多数碎片是偶数电子阳离子。这些分裂产生更多的偶数电子阳离子。裂解给定键的概率与键强度和所形成碎片的稳定性有关。在预测给定分子最可能形成的离子时要记住的十个通用规则如下。

1)对于直链分子，M+峰的相对高度最大并且随着支化增加而降低。

2)对于同源系列，M+峰的相对高度随链长而降低。

3)在烷基取代的碳上有利于裂解，随着取代增加，裂解的可能性增加。

这些规则主要源于碳阳离子和自由基稳定性表现出以下趋势：(最稳定)苄基>烯丙基>三级>次级>>初级(最不稳定，“史蒂文森规则”)。在断裂点处，较大的碎片通常使自由基离开较小的阳离子。

4)双键、环状结构，尤其是芳环将稳定分子离子并增加其出现的可能性。

5)双键有利于烯丙基裂解，产生共振稳定的烯丙基碳阳离子，特别是对于环烯烃。

6)对于饱和环(如环己烷)，侧链倾向于首先裂解而留下具有环的正电荷。

7)不饱和环也可以进行逆狄尔斯-阿尔德反应(retro-Diels-Alder reaction)以消除中性烯烃。

8)芳香族化合物倾向于裂解以产生苄阳离子，或更可能是卓鎓阳离子。

9)紧邻杂原子的C-C键经常断裂，在带有杂原子的碳上留下正电荷。

10)如果能够驱除小的稳定分子如水、CO、NH₃、H₂S等，那么通常有利于裂解。

除了键断裂之外，可以发生各种分子内重排以产生有时意外的离子。MS中一种常见的重排类型是麦氏重排(McLafferty rearrangement)，其发生在含有羰基的化合物中。

通用规则1-3非常适用于烃。重排是常见的，但通常不会产生强烈的峰。碎裂模式的特征可在于由14个质量单元(CH₂基团)分开的峰。最强烈的峰是C3-C5碎片。支链饱和烃的MS是相似的，除了某些碎片变得更加突出。环状烃显示出更强烈的M+离子(规则4)，必须断裂两个键才能形成碎片。通常很容易看到烯烃的M+峰。在非环状烯烃中，双键在碎片中自由迁移，因此可能难以确定双键位置，但对于环状烯烃则更容易。裂解通常发生在烯丙基键上(规则5)。芳香烃通常显示出强M+峰(规则4)。芳环是稳定的并且具有较低的碎裂倾向。由于苄基裂解，烷基取代的苯通常在m/z 91处产生强峰(规则8)。

醇很容易碎裂-仲醇和伯醇显示非常弱的M+峰，而叔醇通常根本不显示M+。MW通常通过衍生化来确定。最靠近OH的C-C键通常是第一个断裂键。因此，伯醇通常在31m/z处显示突出的峰。仲醇以相同的方式裂解，通常显示突出的⁺CHR-OH峰。有时，1°和2°醇中的氢R₂CH-OH而不是烷基裂解。结果是M-1峰。叔醇以类似的方式裂解，得到⁺CRR-OH碎片。醇可能会失去一分子水，以显示有时突出的M-18峰。对于伯醇尤其明显。苄醇以与脂肪醇大不相同的方式碎裂。苄基裂解按预期发生(规则8)。苄醇通常会失去水(M-18)。对于分子来说，M-18峰特别强，其中失去水在机理上是简单明了的。苯酚通常在77m/z处显示由苯基阳离子形成所产生的峰，并且由CO(M-28)和CHO(M-29)的损失产生的峰通常存在于苯酚中。如果有其它有吸引力的裂解途径可用。

对于醚，裂解以两种主要方式发生：紧邻O的C-C键断裂(如醇)；或C-O键裂解，而电荷在C碎片上。对于芳香醚，M+通常很强。MS与苯酚相似-均形成苯氧基阳离子(m/z 93)和相关子体。

酮通常会产生强烈的M+峰。主要碎裂途径涉及α-裂解以产生酰基离子。含羰基的碎片也可以带有自由基。对于具有较长链的酮，麦氏重排通常会导致强峰。对于芳香酮，M+是明显的。初级裂解是羰基的α，以产生强ArCO+峰(当Ar＝Ph时m/z 105)。这将失去CO以得到苯基阳离子(m/z 77)。

醛显示弱但可辨别的M+峰。主要途径是α-裂解和麦氏重排。芳香醛类似于芳香酮。M+强，并且M-1(α-裂解成羰基)也强，得到ArCO+离子(Ar＝Ph，m/z 105)。从该离子失去CO对于得到m/z77苯基阳离子是常见的。

对于羧酸，M+是弱的，并且不总是可见的。由于麦氏重排，通常存在特征m/z 60峰。键合α至羰基也经常断裂，得到M-OH和M-CO₂H峰。

对于芳香酸，M+非常突出。常见的峰是OH(M-17)的损失和CO₂H(M-45)的损失。如果存在邻位含氢基团，那么也可见水(M-18)的损失。

对于脂肪族酯，M+通常是不同的。最具特色的峰是由于麦氏重排。除非RO链很长，否则M+通常很突出。基峰是RO的损失。麦氏重排产生相应的酸。更复杂的重排通常会产生突出的酸+1峰。

脂肪族单胺具有奇数编号的弱M+峰。最重要的裂解通常是紧邻C-N键的C-C键断裂。几乎所有伯胺的基峰均出现在30m/z处。对于芳香族胺，M+是强烈的。可以破坏NH键以产生中等强度的M-1峰。常见的碎裂是HCN和H₂CN的损失，在65和66m/z处产生峰。烷基取代的芳香族胺通常显示C-N旁边的C-C键断裂，当Ar＝Ph时在106处产生强峰。

由于R-CONH₂键的断裂，伯酰胺在m/z 44处产生强峰。脂肪族酰胺-M+弱但可辨别。对于超过3个碳的直链酰胺，麦氏在m/z 59处产生基峰。

对于腈类，脂肪族腈的M+弱或不存在。α-氢的损失可以产生弱的M-1峰。由于像麦氏这样的重排，基峰通常为41。这具有有限的诊断价值，因为(C3H5+)具有相同的质量。

脂肪族硝基化合物具有弱的奇数M+。主峰是直至M-NO₂的烃碎片。对于芳香族硝基化合物，M+很强。突出的峰由NO₂自由基的损失产生，从而产生M-46峰。同样突出的是失去NO的M-30。

图9描述用于预测质谱仪中肽质量标记的碎裂的方法。肽(氨基酸链)的断裂通常沿着肽骨架发生。肽链的每个残基在N->C和C->N方向上连续地分离。氨基酸的侧链不同。如图9所示，基于不同的侧链，每个氨基酸具有最弱的键，这导致肽的可预测的断裂。肽具有在Asp(D)处断裂的趋势(Mass Spectrometry in Proteomics Ruedi Aebersold*和DavidR.Goodlett 269Chem.Rev.2001,101,269-295)。预测质谱仪中肽的断裂进一步描述于例如Beardsley等人(Journal ofthe American Society for Mass Spectrometry,15(2):158-167,2004)中，其内容通过引用整体并入本文。肽断裂算法也是可商购的。用于预测肽断裂的示例性算法由Zhang(Analytical Chemistry 76,3908-3922,2004)或Zhang(AnalyticalChemistry 77,6364-6373,2005)描述，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在某些实施例中，肽在N端、C端或任何内部氨基酸残基处被标记。例如，可以选择市售的小半胱氨酸封端的肽(例如YGMTSR*YFC，其中精氨酸用13C6和14N4完全标记)作为质量标记。

术语“改变剂”或“释放剂”是指能够改变MS标记前体、破坏标记结合单元的键以释放质量标记的物质。在某些实施例中，改变剂能够与MS标记前体相互作用以获得具有约1Da至约3kDa范围内，或约1Da至约50Da范围内，或约50Da至约150Da范围内，或约150Da至约700Da的范围内，或约700Da至约3kDa的范围内的独特质量的MS标记。在一些实例中，MS标记的独特质量低于约3kDa。可以通过键破坏来改变MS标记前体以形成中性、负或正离子或自由基。通过改变剂改变MS标记前体可以是通过向MS标记前体添加原子、电荷或电子，或从MS标记前体减去原子、电荷或电子，或通过MS标记前体中的键裂解或键形成。改变剂包括但不限于化学试剂，例如但不限于催化剂(例如酶(包括假酶)和金属)、氧化剂、还原剂、酸、碱、促进取代反应或置换反应的试剂；和电离剂。在一些实例中，改变剂例如通过促进MS标记前体与部分反应以形成MS标记来促进MS标记前体形成MS标记。在一些实例中，改变剂例如通过促进MS标记从MS标记前体释放来促进MS标记前体形成MS标记。

MS标记前体的性质可能取决于例如以下一或多种：MS标记的性质、采用的MS方法的性质、采用的MS检测器的性质、靶标稀有分子的性质、亲和剂的性质、采用的任何免疫测定法的性质、样品的性质、采用的任何缓冲液的性质、分离的性质。在一些实例中，MS标记前体是质量可以通过取代和/或链大小而变化的分子。由MS标记前体产生的MS标记是限定质量的分子，其不应存在于待分析的样品中。此外，MS标记应在MS检测器检测的范围内，不应具有重叠质量并且应该可以通过初级质量检测到。作为说明而非限制，用于本发明方法的MS标记前体的实例包括(作为说明而非限制)多肽、有机和无机聚合物、脂肪酸、碳水化合物、环烃、脂肪烃、芳香烃、有机羧酸、有机胺、核酸、有机醇(如烷基醇、酰基醇、酚类、多元醇(如二醇)、硫醇、环氧化物、伯胺、仲胺和叔胺、吲哚、叔铵和季铵化合物、氨基醇、氨基硫醇、酚胺、吲哚羧酸、酚酸、插烯酸、羧酸酯、磷酸酯、羧酸酰胺、来自聚酰胺和聚酯的羧酸、腙、肟、三甲基甲硅烷基烯醇醚、缩醛、缩酮、氨基甲酸酯、脲、胍、异氰酸酯、磺酸、磺酰胺、磺酰脲、硫酸酯、甘油单酯、甘油醚、鞘氨醇碱、神经胺、脑苷脂、类固醇、前列腺素、碳水化合物、核苷和治疗药物。

MS标记前体可包括1至约100,000个MS标记，或约10至约100,000个MS标记，或约100至约100,000个MS标记，或约1,000至约100,000个MS标记，或约10,000至约100,000个MS标记。MS标记前体可以由蛋白质、多肽、聚合物、粒子、碳水化合物、核酸、脂质或其它能够通过附接包括多个MS标记重复单元的大分子构成。多个MS标记允许扩增，因为每个MS标记前体可以产生许多MS标记。

例如，对于多肽MS标记前体，可以调节多肽的链长以在没有背景峰的质量区域中产生MS标记。此外，MS标记可以由具有独特质量的MS标记前体产生，其在测试样品中不存在。多肽MS标记前体可以包含额外的氨基酸或衍生的氨基酸，这允许方法多路复用以一次获得多于一种结果。多肽MS标记前体的实例包括但不限于例如聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚半胱氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甲硫氨酸、聚脯氨酸、聚苯丙氨酸、聚酪氨酸、聚色氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚天冬酰胺、聚谷氨酰胺、聚组氨酸、聚赖氨酸和聚精氨酸。通过氨基酸或衍生氨基酸的混合物来区分的多肽MS标记前体产生具有偶数或奇数选择离子的有或无自由基的质量。在一些实例中，多肽能够通过催化修饰。例如，作为说明而非限制，可以使用过氧化物酶作为催化剂将苯酚和芳香族胺加入到聚苏氨酸中。在另一个实例中，作为说明而非限制，可以使用过氧化物酶作为催化剂将电子转移至芳香族胺。在另一个实例中，作为说明而非限制，可以使用磷酸酶作为催化剂从有机磷酸酯中去除磷酸酯。

在另一个实例中，作为说明而非限制，使用衍生剂作为部分以从MS标记前体产生MS标记。例如，二硝基苯基和其它硝基苯基衍生物可以由MS标记前体形成。作为说明而非限制，其它实例包括酯化、酰化、甲硅烷基化、保护性烷基化、通过酮-碱缩合例如希夫碱(Schiffbase)衍生化、环化、形成荧光衍生物和无机阴离子。衍生化反应可以在MS分析之前，但在亲和反应之后的微反应中发生或用于产生与亲和试剂缀合的MS标记前体。

在一些实例中，MS标记前体可以包含同位素，例如但不限于²H、¹³C和¹⁸O，其保留在衍生自MS标记前体的MS标记中。MS标记可以通过初级质量或电离后的次级质量来检测。在一些实例中，MS标记前体是具有相对较高的引发键裂解的可能性的前体，例如但不限于烷基化胺、缩醛、伯胺和酰胺，例如，其中MS标记可以产生具有偶数或奇数选择离子的有或无自由基的质量。多肽的选择可以产生独特的MS谱特征。

如上所述，改变剂可以是酶(其包括假酶)。在一些实例中，催化可以在用例如以下各物固定的水不溶性酶衍生物下进行：硅胶、木炭、DEAE-纤维素、DEAE-SEPHADEX(交联葡聚糖凝胶，可购自Sigma Aldrich)、纤维素柠檬酸盐、高岭土、纤维素磷酸盐、酸性粘土、AMBERLITE XE-97(由Rohm&Haas制造的羧酸阳离子交换树脂)、羧甲基纤维素、玻璃、石英、dowex-50、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚氨基酸或氨基苯甲基纤维素。交联剂可以用于固定酶。例如，这种交联剂包括但不限于戊二醛、己二酰亚胺酸二甲酯、碳化二亚胺、马来酸酐、MDA亚甲基二苯胺、酰肼和酰基叠氮化物。

在一些实例中，符合本文所述的原理的用于达成目的的酶是具有高转换率的任何酶，其可以将酶底物(例如MS标记前体)转化成在未转化的底物存在下被质谱仪的质量检测器检测到的MS标记。酶不应在测试的样品中，或如果存在于样品中，必须在测试前将其从样品中去除。适合于达成此目的的酶的实例包括但不限于例如磷酸酶(例如碱性磷酸酶、脂质磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、丝氨酸磷酸酶、苏氨酸磷酸酶和组氨酸磷酸酶)；氧化酶(例如辣根过氧化物酶、铜胺氧化酶、D-氨基酸氧化酶、半乳糖氧化酶、血浆胺氧化酶、色氨酸过氧化酶、尿酸酶氧化酶和黄嘌呤氧化酶)；β-半乳糖苷酶；转移酶(例如D-丙氨酸转移酶、糖基转移酶、酰基转移酶、烷基转移酶、芳基转移酶、单碳转移酶、酮转移酶、醛转移酶、含氮转移酶、磷转移酶、硫转移酶和戊糖基转移酶)；肽酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶(凝乳酶)、肾素、凝血酶、胰蛋白酶、基质金属肽酶、组织蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶和羧肽酶)；醛缩酶(例如羧基醛缩酶、醛醛缩酶、含氧酸、色氨酸酶)；脂肪酸酶(例如脂肪酸胺水解酶、脂肪酸合成酶和胆碱乙酰基转移酶)和上述两种或更多种的组合(例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、酰化酶、天冬酰胺酶、催化酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、转化酶、脂肪酶、葡萄糖磷酸变位酶、核糖核酸酶、乙酰胆碱酯酶、醇脱氢酶、醛缩酶、胆碱酯酶、柠檬酸合成酶、尿素酶、戊基葡萄糖苷酶、羧肽酶、胆碱酯酶、荧光素酶、核糖核酸酶、丙酮酸激酶和枯草杆菌蛋白酶中的两种或更多种)。

用于酶的底物是MS标记前体，其包含通过酶对底物的作用释放的MS标记。作为说明而非限制，可以是酶底物的一部分的这类MS标记包括例如酚类(来自例如磷酸对硝基苯酯、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷、氨基酸、肽、碳水化合物(6-磷酸-D-葡萄糖酸盐)、脂肪酸(乙酰-CoA)、烷基胺、甘油等底物)；以及萘酚(来自例如磷酸对硝基萘酯、对硝基-萘基-β-D-半乳糖苷等底物)。

可以用于从附接到亲和剂的部分释放MS标记的金属包括但不限于例如过渡金属(例如钯、铂、金、钌、铑或铱)、螯合金属(例如与乙二胺四乙酸酯(EDTA)、N-(2-羟基乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)或反式-1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)络合的铁、铜、钴、镁)、金属氧化剂(例如次氯酸钠、高碘酸钾、氧化银、铬酸、高锰酸钾和过硼酸钠)和金属还原剂(例如氢化锂铝、硼氢化钠、抗坏血酸钠、亚磷酸盐和钠)。

可以直接检测MS标记，或者释放的MS标记可以进一步与另一种化合物反应形成衍生MS标记，其通过MS技术检测。衍生MS标记是由从MS标记前体获得的MS标记形成的化合物，其中该化合物也可通过MS技术检测。这种形成衍生MS标记的方法进一步增强了根据本文所述原理的方法的多路复用能力。例如，释放的苯酚或萘酚可在过氧化物酶存在下与芳香族胺偶联(参见例如美国专利号5,182,213，其相关公开内容通过引用并入本文)。在一个实例中，释放的萘酚与苯二胺(例如α-苯二胺二盐酸盐)在碱性介质中在过氧化活性物质存在下偶联，以产生衍生MS标记。可以使用不同萘酚和/或不同苯二胺实现多路复用。

内标是质谱分析的一个重要方面。在一些实例中，除了用于检测稀有靶分子的MS标记之外，还可以添加可以测量的第二质量标记(作为内标)。内标具有与MS标记类似的结构，质量略有变化。可以制备包含额外氨基酸或衍生氨基酸的内标。或者，内标可以通过掺入同位素标记来制备，例如但不限于²H(D)、¹³C和¹⁸O。MS同位素标记的质量高于天然存在的物质。例如，同位素标记的MS标记，例如甘油-C-d7、乙酸钠-C-d7、丙酮酸钠-C-d7、D-葡萄糖-C-d7、氘化葡萄糖和右旋糖-C-d7，将分别充当甘油、乙酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和右旋糖的内标。

MS标记前体或改变剂可以直接通过键或通过中间连接基团共价附接到亲和剂(以产生改性亲和剂)。在一些实施例中，改性亲和剂的制备可以通过使用适于通过直接键将MS标记前体或改变剂附接到亲和剂上的官能团来进行。采用的官能团的性质取决于例如以下一个或多个：MS标记前体的性质、改变剂的性质和亲和剂的性质，包括例如可以是亲和剂的一部分的载体粒子和标记粒子的一个或多个不同粒子的性质。大量合适的官能团可用于附接到氨基和醇；这类官能团包括例如活化酯，包括例如羧酸酯、亚胺酯、磺酸酯和磷酸酯；活化亚硝酸酯；醛；酮；以及烷基化剂。

连接基团可以是具有1至约60或更多个原子或1至约50个原子或1至约40个原子或1至30个原子或约1至约20个原子或约1至约10个原子的链，原子各自独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷、通常碳和氧组成的组。连接基团中杂原子的数目可以为约0至约8，约1至约6，或约2至约4。连接基团的原子可以被除氢以外的原子取代，例如呈例如烷基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基形式的碳、氧和氮中的一个或多个。作为一般规则，可以任意选择特定连接基团的长度以提供合成的便利性，条件是在连接的分子能够执行与本文中所公开的方法相关的功能下连接基团造成的干扰最小。

连接基团可以是脂肪族或芳香族的。当存在杂原子时，氧将通常以氧基或氧代基形式存在，键结于碳、硫、氮或磷；硫将通常以硫醚或硫羰基形式存在；氮将通常以硝基、亚硝基或氨基形式存在，通常键结于碳、氧、硫或磷；磷将通常键结于碳、硫、氧或氮，通常呈膦酸酯和磷酸酯单酯或二酯形式。连接基团中存在的官能团可以包括酯、硫酯、酰胺、硫酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮基、硫醚、羧酸酯等等。连接基团还可以是大分子，例如多糖、肽、蛋白质、核苷酸和树枝状大分子。

在一些实施例中，MS标记前体或改变剂(视情况而定)和亲和剂可以非共价连接在一起。采用结合对、通常特异性结合对的成员，其中一个成员连接到亲和剂并且另一成员连接到MS标记前体或改变剂。结合对成员的结合引起亲和剂与MS标记前体或改变剂的非共价连接。结合对成员可以直接连接到MS标记前体或改变剂和亲和剂中的一个或两个，或通过中间连接基团间接连接，连接基团的性质在上文论述。在一些实例中，特异性结合对的成员具有相对较高的结合常数，例如，作为说明而非限制，抗生物素蛋白(抗生蛋白链菌素)-生物素结合、荧光素(FITC)和用于FITC的抗体、若丹明(德克萨斯红)和用于若丹明的抗体、毛地黄皂苷(DIG)和用于DIG的抗体、非人类物种抗体(例如山羊、兔、小鼠、鸡、绵羊)和抗物种抗体。

改性亲和剂可以通过在单独的个别反应中将每个不同亲和剂连接到MS标记前体或改变剂，然后将改性亲和剂组合以形成包含改性亲和剂的混合物来制备。或者，可以组合不同的亲和剂，并且可以在组合时进行将亲和剂与MS标记前体或改变剂连接的反应。这允许方法多路复用，一次获得超过一个结果。

本发明的方法中采用的每种不同的改性亲和剂的量取决于例如以下一个或多个：每个不同的靶标稀有分子群的性质和可能量、MS标记的性质、亲和剂的性质、细胞(如果存在)的性质、粒子(如果采用)的性质以及封闭剂(如果采用)的量和性质。在一些实例中，采用的每种不同的改性亲和剂的量为约0.001μg/μL至约100μg/μL，或约0.001μg/μL至约80μg/μL，或约0.001μg/μL至约60μg/μL，或约0.001μg/μL至约40μg/μL，或约0.001μg/μL至约20μg/μL，或约0.001μg/μL至约10μg/μL，或约0.5μg/μL至约100μg/μL，或约0.5μg/μL至约80μg/μL，或约0.5μg/μL至约60μg/μL，或约0.5μg/μL至约40μg/μL，或约0.5μg/μL至约20μg/μL或约0.5μg/μL至约10μg/μL。

采用的改变剂的数量可以是每个MS标记前体一个，或每两个MS标记前体一个，或每三个MS标记前体一个，至多所有采用的MS标记前体一个，这取决于MS标记前体的性质、改变剂的性质、改变剂在介质中是游离的还是改性亲和剂的一部分，以及所用的不同亲和剂的性质和数量中的一个或多个。例如，在每个MS标记前体包括不同MS标记与亲和剂的不稳定酯键或不稳定酰胺键的情况下，可以采用引起二硫键、酯键或酰胺键水解以得到不同MS标记的单个改变剂。在其它实例中，可以利用一种改变剂，或者采用比MS标记前体的数量少的改变剂。在另一个实例中，可以针对所使用的每种不同类型的亲和剂使用不同的改变剂来产生MS标记。

在水性介质中包含样品(任选地浓缩)和改性亲和剂的组合通过保持在使改性亲和剂与细胞上或粒子试剂上的靶标稀有分子结合的温度下一段时间来处理。对于包含改变剂的每种改性亲和剂，改变剂所作用的MS标记前体包括在组合中，其中MS标记前体被转化为MS标记。在一些实例中，添加另外的部分，其中改变剂促进部分与MS标记前体的反应以产生MS标记。在一些实例中，改性亲和剂包含MS标记前体，并且改变剂作为介质中的未结合物质包含在组合中。在此实例中，改变剂作用于亲和剂的MS标记前体以产生MS标记。在一些实例中，采用从亲和剂释放包含MS标记前体的实体的第一改变剂，并且随后采用第二改变剂以促进从MS标记前体形成MS标记。

该处理的温度和持续时间取决于例如样品的性质、靶标稀有分子的性质、非稀有分子的性质、改性亲和剂的性质、MS标记前体的性质以及改变剂的性质。在一些实例中，通常采用中等温度并且通常是恒定温度，优选室温。保持期间的温度通常为例如约5℃至约99℃或约15℃至约70℃，或约20℃至约45℃。保持时间为例如约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1至约15分钟。时间段取决于例如介质的温度和多种试剂的结合速率。

已经结合于靶标稀有分子的改性亲和剂，即改变剂已起作用的亲和剂，任选地与未结合于靶分子的改性亲和剂分离。在一些实例中，这种分离涉及减少样品中非稀有分子的数量。

样品

本发明的组合物可用于分析许多不同类型的样品。可以分析多种异质样品，例如生物样品、环境样品(包括例如工业样品和农业样品)和食品/饮料产品样品等。

示例性环境样品包括但不限于地下水、地表水、饱和土壤水、非饱和土壤水；工业化过程，例如废水、冷却水；过程中使用的化学品、工业过程中的化学反应，以及涉及废物场所渗滤液的其它系统；废水和注水过程；储存罐中液体或周围的泄漏检测；来自工业设施、水处理厂或设施的排放水；来自农田的排水和沥滤液、来自城市土地用途的排水，例如地表、地下和下水道系统；来自废物处理技术的水；以及来自矿物开采或其它提取自然资源的工艺如石油生产和原位能源生产的排水。

另外，示例性环境样品包括但不限于农业样品，例如作物样品，例如谷物和饲料产品，例如大豆、小麦和玉米。通常，需要关于产品成分的数据，例如水分、蛋白质、油、淀粉、氨基酸、可提取的淀粉、密度、测试重量、消化率、细胞壁含量以及具有商业价值的任何其它成分或特性。

示例性生物样品包括人体组织或体液，并且可以任何临床上可接受的方式收集。组织是大量连接的细胞和/或细胞外基质材料，例如来源于例如人类或其它哺乳动物的皮肤组织、毛发、指甲、鼻腔组织、CNS组织、神经组织、眼组织、肝组织、肾组织、胎盘组织、乳腺组织、胎盘组织、乳腺组织、胃肠组织、肌肉骨骼组织、泌尿生殖组织、骨髓等，包括与细胞和/或组织相关的连接材料和液体材料。体液是来源于例如人类或其它哺乳动物的液体材料。这些体液包括但不限于粘液、血液、血浆、血清、血清衍生物、胆汁、血液、母体血液、痰、唾液、痰液、汗液、羊水、月经液、乳液、腹膜液、尿液、精液和脑脊液(CSF)，如腰椎或心室CSF。样品也可以是细针抽吸或活检组织。样品也可以是含有细胞或生物材料的培养基。样品也可以是血凝块，例如在去除血清后从全血中获得的血凝块。

在一个实施例中，生物样品可以是血液样品，可以从中提取血浆或血清。可以通过标准静脉切开术获得血液，然后分离。用于制备血浆样品的典型分离方法包括离心血液样品。例如，在抽血后立即将蛋白酶抑制剂和/或抗凝血剂加入血液样品中。然后将管冷却并离心，随后可以置于冰上。将所得样品分成以下组分：上层相中的血浆的澄清溶液；血沉棕黄层，它是一层薄薄的与血小板混合的白细胞；和红细胞。通常，8.5mL全血将产生约2.5-3.0mL血浆。

以非常类似的方式制备血清。收集静脉血，然后通过倒置将蛋白酶抑制剂和凝结剂与血液混合。在室温下垂直竖立管使血液凝结。然后将血液离心，其中所得上清液是指定的血清。随后应将血清样品置于冰上。

在分析样品之前，可以例如使用过滤或离心来纯化样品。例如，这些技术可用于去除颗粒和化学干扰。用于去除颗粒的各种过滤介质包括滤纸，例如纤维素和膜滤器，例如再生纤维素、乙酸纤维素、尼龙、PTFE、聚丙烯、聚酯、聚醚砜、聚碳酸酯和聚乙烯吡咯烷酮。用于去除颗粒和基质干扰的各种过滤介质包括功能化膜，例如离子交换膜和亲和膜；SPE滤芯，例如基于硅胶和聚合物的滤芯；和SPE(固相萃取)圆盘，例如基于PTFE和玻璃纤维。这些过滤器中的一些可以盘形式提供，用于松散地放置在过滤器保持器/壳体中，其它过滤器设置在可以放置在例如标准血液收集管上的一次性尖端内，还有一些以带有用于接收移液样品的孔的阵列形式提供。另一类型的过滤器包括旋转过滤器。旋转过滤器由具有乙酸纤维素滤膜的聚丙烯离心管组成，并与离心结合使用以从样品(例如通常在水性缓冲液中稀释的血清和血浆样品)中去除颗粒。

过滤受到孔隙率值的部分影响，使得较大的孔隙率仅过滤掉较大的颗粒并且较小的孔隙率过滤掉较小和较大的孔隙率。用于样品过滤的典型孔隙率值为0.20和0.45μm孔隙率。含有胶体材料或大量细颗粒的样品可能需要相当大的压力来迫使液体样品通过过滤器。因此，对于例如土壤提取物或废水的样品，可以使用预滤器或深度过滤床(例如“2合1”过滤器)并将其置于膜的顶部以防止被含有这些类型颗粒的样品堵塞。

在某些情况下，不使用过滤器的离心可用于去除颗粒，这通常用尿样进行。例如，将样品离心。然后取出所得上清液并冷冻。

在获得并纯化样品后，可以用本发明的组合物分析样品以检测一种或多种靶标分析物，例如血浆样品中的稀有分子。关于血浆样品的分析，血浆中存在许多元素，例如蛋白质(例如白蛋白)、离子和金属(例如铁)、维生素、激素和其它元素(例如胆红素和尿酸)。可以使用本发明的组合物检测这些元素中的任何一种。更具体地，本发明的组合物可用于检测生物样品中指示疾病状态的分子。以下提供具体实例。

当一种或多种靶标稀有分子是细胞的一部分时，水性介质还可以包含用于裂解细胞的裂解剂。裂解剂是破坏细胞膜完整性从而释放细胞的细胞内内含物的化合物或化合物的混合物。裂解剂的实例包括但不限于例如非离子型清洁剂、阴离子型清洁剂、两性清洁剂、低离子强度水溶液(低渗溶液)、细菌剂、脂肪醛和引起补体依赖性裂解的抗体。稀释介质中可存在各种辅助材料。水性介质中的所有材料以足以获得所需效果或功能的浓度或量存在。

在一些实例中，当一种或多种靶标稀有分子是细胞的一部分时，可能需要固定样品的细胞。细胞的固定使细胞固定并保持细胞结构且维持细胞处于近似于类似体内的条件下的细胞的条件下和所关注的抗原能够被特定亲和剂识别的条件下。采用的固定剂的量是保持细胞但不会在随后测定中导致错误结果的量。固定剂的量可以取决于例如固定剂的性质和细胞的性质中的一种或多种。在一些实例中，固定剂的量是以重量计约0.05％至约0.15％或约0.05％至约0.10％或约0.10％至约0.15％。用于固定细胞的试剂包括但不限于例如交联剂，例如醛试剂(如例如甲醛、戊二醛和多聚甲醛)；醇(例如C1-C5醇，例如甲醇、乙醇和异丙醇)；酮(例如C3-C5酮，例如丙酮)。名称C1-C5或C3-C5是指醇或酮中的碳原子数。可以使用缓冲的水性介质对固定的细胞进行一个或多个洗涤步骤。

如果需要，在固定后，细胞制剂也可以进行透化。在某些情况下，固定剂例如醇(例如甲醇或乙醇)或酮(例如丙酮)也会导致透化，并且不需要额外的透化步骤。透化提供了通过细胞膜进入所关注的靶分子的途径。采用的透化剂的量是破坏细胞膜并允许进入靶分子的量。透化剂的量取决于透化剂的性质和细胞的性质和量中的一种或多种。在一些实例中，透化剂的量为约0.01％至约10％，或约0.1％至约10％。用于进行细胞透化的试剂包括但不限于醇(例如C1-C5醇，例如甲醇和乙醇)；酮(例如C3-C5酮，例如丙酮)；清洁剂(例如皂苷、TRITON X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚缓冲液，可购自Sigma Aldrich)和TWEEN-20(聚山梨醇酯20，可购自Sigma Aldrich))。可以使用缓冲的水性介质对透化细胞进行一个或多个洗涤步骤。

样品与本发明组合物的接触持续一段时间，足以使亲和试剂与样品中的靶标稀有分子结合。该时间段可以取决于例如靶标稀有细胞的不同群体的性质和大小、反应混合物的性质或待过滤的体积(任选)中的一个或多个。在一些实例中，接触时段为约1分钟至约1小时，约5分钟至约1小时，或约5分钟至约45分钟，或约5分钟至约30分钟，或约5分钟至约20分钟，或约5分钟至约10分钟，或约10分钟至约1小时，或约10分钟至约45分钟，或约10分钟至约30分钟，或约10分钟至约20分钟。

测定法

本发明的组合物可用于进行特异性地将质量标签与稀有分子相关联的测定法。示例性测定法使用亲和试剂特异性结合样品中的稀有分子。质量标签与亲和试剂相关联，并与之结合。在捕获部分与靶标分析物特异性结合后，质量标签与稀有分子相关联。然后进行分离步骤，例如洗去未结合的亲和试剂或进行纯化将稀有分子/亲和试剂/质量标签复合物与样品分离。在分离步骤(洗涤或纯化)之后，然后通过使用如上所述的释放剂破坏亲和试剂和质量标记之间的标记单元的键，从亲和试剂中洗脱质量标签。然后将质量标记电离并分析。具体地，可以产生促进质量标签与部分解离的环境。例如，pH变化可用于促进解离。或者，化学试剂可用于促进解离。或者，可以使用热来促进解离。在某些实施例中，使用技术组合，例如pH变化和释放剂的组合。结合和释放可以涉及硫醇/二硫化物化学，其在生物化学中已经很好地建立，但是可以使用如PNA的互补结合的替代方案(R.J.Ball等人ArtificialDNA:PNA and XNA,1(2010)27-35)。

特异性结合或特异性缔合是指在异质分子群中决定所关注的靶标分析物的结合反应。因此，在指定条件下(例如免疫测定条件)，指定的捕获部分(例如抗体可变结构域)与其特定的“靶标”结合，并且不与样品中存在的其它分子大量结合。特异性结合/缔合意指结合在选择的靶标识别、高、中或低结合亲和力或亲合力方面是选择性的。如果结合常数或结合动力学至少相差10倍，那么通常实现选择性结合。

另一方面，非特异性结合涉及分子之间的非共价结合，其相对独立于特定表面结构。非特异性结合可能由若干因素引起，包括分子之间的疏水相互作用。

质量标签的离子生成

可以采用本领域已知的任何用于产生质量标签的离子的方法。在大气压下利用电离源进行质谱分析的示例性质谱技术包括电喷雾电离(ESI；Fenn等人,Science,246:64-71,1989；和Yamashita等人,J.Phys.Chem.,88:4451-4459,1984)；大气压电离(APCI；Carroll等人,Anal.Chem.47:2369-2373,1975)；和大气压基质辅助激光解吸电离(AP-MALDI；Laiko等人Anal.Chem.,72:652-657,2000；和Tanaka等人Rapid Commun.MassSpectrom.,2:151-153,1988)。这些参考文献中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。

利用直接环境电离/取样方法的示例性质谱技术包括解吸电喷雾电离(DESI；Takats等人,Science,306:471-473,2004和美国专利号7,335,897)；实时直接分析(DART；Cody等人,Anal.Chem.,77:2297-2302,2005)；大气压介电阻挡放电电离(DBDI；Kogelschatz,Plasma Chemistry and Plasma Processing,23:1-46,2003和PCT国际公告号WO 2009/102766)、使用湿润多孔材料的离子生成(纸喷雾，美国专利号8,859,956)和电喷雾辅助激光解吸/电离(ELDI；Shiea等人,J.Rapid Communications in MassSpectrometry,19:3701-3704,2005)。这些参考文献中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。

离子生成可以通过将样品置于多孔材料上并从多孔材料或其它类型的表面产生质量标签的离子来实现，如Ouyang等人，美国专利申请公开号2012/0119079所示，其内容通过引用整体并入本文。或者，可以进行测定法并且从无孔材料产生离子，参见例如Cooks等人，美国专利申请序列号14/209,304，其内容通过引用整体并入本文)。在某些实施例中，可以施加高电压的固体针头探针或表面用于产生质量标签的离子(参见例如Cooks等人，美国专利申请公开号20140264004，其内容通过引用整体并入本文)。

离子分析

在某些实施例中，通过将离子引导至质谱仪(台式或微型质谱仪)来分析离子。图10是示出微型质谱仪中的各种组件及其布置的图片。Mini 12的控制系统(Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Yue Ren,Paul I.Hendricks,R.Graham Cooks和Zheng Ouyang“Miniature Ambient Mass Analysis System”Anal.Chem.2014,86 2909-2916,DOI:10.1021/ac403766c；和860.Paul I.Hendricks,Jon K.Dalgleish,Jacob T.Shelley,Matthew A.Kirleis,Matthew T.McNicholas,Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Chien-HsunChen,Jason S.Duncan,Frank Boudreau,Robert J.Noll,John P.Denton,TimothyA.Roach,Zheng Ouyang和R.Graham Cooks“Autonomous in-situ analysis and real-time chemical detection using a backpack miniature mass spectrometer:concept,instrumentation development,and performance”Anal.Chem.,2014,86 2900-2908DOI:10.1021/ac403765x，其各自的内容通过引用整体并入本文)和Mini 10的真空系统(LiangGao,Qingyu Song,Garth E.Patterson,R.Graham Cooks和Zheng Ouyang,“HandheldRectilinear Ion Trap Mass Spectrometer”，Anal.Chem.,78(2006)5994-6002DOI:10.1021/ac061144k，其内容通过引用整体并入本文)可以被组合以产生图10中所示的微型质谱仪。它的尺寸可能类似于鞋盒(H20×W25cm×D35cm)。在某些实施例中，微型质谱仪使用双LIT配置，其描述于例如Owen等人(美国专利申请序列号14/345,672)和Ouyang等人(美国专利申请序列号61/865,377)中，其各自的内容通过引用整体并入本文。

质谱仪(微型或台式)可配备不连续的界面。例如在Ouyang等人(美国专利号8,304,718)和Cooks等人(美国专利申请公开号2013/0280819)中描述了不连续界面，其各自的内容通过引用整体并入本文。

应控制检测灵敏度的因素是化学方法中所有步骤的组合效率、每种亲和试剂的标签数量、每种稀有分子的亲和试剂数量和每质量标签的离子数量、MS中的电离灵敏度、MS中的S/N比、对应于正在测量的不同质量标签的不同转变的数量，以及MS获取时间。然而，在这样的超痕量分析中，通常化学噪声的大小决定了性能。正是由于这个原因，在复杂混合物的情况下，MS/MS通常比正常MS具有更低的检测极限，即使后一种情况下的总信号可能数量级更大。

通过引用并入

在本公开通篇参考并引用了其它文献，例如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网络内容。所有此类文献在此出于所有目的通过引用整体并入本文。

等同物

除本文展示且描述的之外，本发明的各种修改及其许多进一步实施例将从本文档的完整内容对所属领域的技术人员变得显而易见，包含对在此引用的科学和专利文献的参考。本文的主题含有可以在其各种实施例及其等同物中适用于本发明的实践的重要信息、示例和指导。

实例

除非另有说明，否则用于这些实施例的材料来自Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis MO)。抗体缀合物通过标准生物缀合技术制备，例如Greg T.Hermanson在Bioconjugate Techniques,第三版2013,Elsevier Inc.,225Wyman Street,Waltham MA中所述。咪唑鎓和吡啶鎓质量标记通过标准咪唑鎓合成技术制备，例如MichaelW.Pennington和Ben M.Dunn在Imidazolium Synthesis Protocols,第1版,1994年11月,Springer-Verlag,New York,LLC,New York NY中所述。表1中显示了材料以及材料描述中使用的常用术语。

实例1：用于靶标稀有分子的四级质量标记的方法

通过在1000μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤培养的SKBR人类乳腺癌细胞两次并离心(2分钟，2500rpm(Eppendorf Centrifuge 5417C))来制备癌细胞用于与质量标记反应。两次都弃去溶液，得到细胞离心块。将细胞悬浮于含有0.2％Triton X100的1000μL PBS(PBST 0.2％)中作为透化步骤，将细胞培育7分钟，然后在1000μL PBS中洗涤4次。将细胞悬浮于1000μL酪蛋白缓冲液中作为封闭步骤，将细胞培育7分钟，然后在1000μL PBST0.05％)中洗涤1次。使细胞与300μL的缀合有Dylight 550荧光标记的10μg/mL CK-8-18抗体在酪蛋白缓冲液中反应，以使癌细胞可视化。将细胞培育25分钟，然后在1000μL PBST(0.05％)中洗涤4次。使细胞与500μl的1μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液反应，以使癌细胞核可视化。将细胞培育1分钟，然后在1000μL PBST(0.05％)中洗涤4次。将染色的细胞混合物用PBS稀释至1mL，并在显微镜下检查2μL样品以验证染色的细胞计数(～66500个细胞/mL)。

通过使用偶联剂3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)将L-肉碱-F-G-G-S-C(QC5-1)和生物素偶联到丙胺官能化的二氧化硅和可裂解的二硫键连接臂(即标记结合单元)来制备质量标记。将针对Her-2/neu稀有分子的抗体与Dylight488缀合，并通过与N-羟基琥珀酰亚胺酯的酰胺键进一步缀合丙胺官能化的二氧化硅(纳米粒子，200nm，中孔孔径4nm)以制备抗体-纳米粒子(亲和试剂，图1)。通过SPDP反应将生物素用二硫键连接到亲和试剂。将QC5-1纳米粒子和亲和试剂与抗生蛋白链菌素磁珠(Pierce 1％，0.756μM，10mg/ml)缀合，提供18.2ug/mL的组合抗体-QC5-1粒子，以制备附接于亲和试剂的四级质量标记。使用相同的方法将其它质量标记附接到亲和试剂

通过向染色的SKBR3细胞(～20,000个细胞)添加300μL的0.075μg/ml抗体-QC5-1粒子，使染色细胞与附接到亲和力的四级质量标记反应。将所得混合物在辊式混合器上以75rpm在室温下培育2小时。将混合物离心，倾析出液体，然后用1mL PBST(0.3％)洗涤两次，用1mL PBS洗涤两次。在荧光显微镜下检查反应的细胞，并验证100％的SBKR细胞与抗体-QC5-1粒子反应。这证明了四级质量标记方法可用于稀有分子检测。

实例2：四级质量标记的检测

台式线性离子阱质谱仪(LTQ Thermo Fisher)用于分析纳米电喷雾电离(nESI)产生的质量标记离子，以测试检测极限(估计浓度给出信噪比等于3)。仪器设置如下：喷雾电压，1.5kV；毛细管温度，150℃；镜筒透镜，65V；毛细管电压，15V；碰撞能量，35；Q激活，0.3。

表1中提供了所测试的化合物清单，其包括具有和不具有四级结构的潜在质量标记的类型，并且包括不同的3个氨基酸肽、6个氨基酸肽和9个氨基酸肽以及小分子四级咪唑鎓盐(甲基咪唑鎓-甲基-水杨醛，MIMSA)和四级染色试剂尼罗蓝A。对于肽，通过向N端添加L-肉碱残基来制备四级结构。缺乏四级结构的肽在10至50nM的检测极限下检测到。添加四级结构将检测极限提高到1nM。这表明四级质量标记允许更高的灵敏度并且易于电离以便检测。

表1：nESI的质量标记检测极限

实例3：四级质量标记的甲基咪唑鎓和吡啶鎓类似物

合成四级质量标记的甲基咪唑鎓和吡啶鎓类似物。为了将这样的质量标记与丙胺官能化的二氧化硅纳米粒子结合，直接形成亚胺或用1,2-二醇改性纳米粒子以通过四级质量标记的醛官能团形成缩醛。甲基咪唑鎓和吡啶鎓类似物由水杨醛通过首先进行Blanc氯甲基化反应，然后分离产物，与N-取代的咪唑或吡啶类似物进一步反应来制备。咪唑的N-取代基结构的改变或引入氯甲基化水杨醛的吡啶的取代促进了具有不同结构的质量标记的合成。图5显示甲基咪唑鎓(m/z 217)和吡啶鎓(m/z 214)质量标记。质量标记由于电离后的碎裂而产生独特的产物离子并随后通过MS/MS进行分析，所述产物离子由甲基咪唑鎓(m/z83)和吡啶鎓(m/z 80)表示。

图6显示由R表示的亲和试剂或稀有分子如何通过缩醛或缩酮键与四级质量标记连接。通过与R连接的二醇和四级质标记的醛的反应形成键。首先通过β-羟基-γ-丁内酯的反应形成酰胺键，将二醇与亲和试剂或稀有分子(R)的胺连接。制造此类材料的详细程序如下：

氯甲基水杨醛的制备

在室温下，在搅拌下将多聚甲醛(1g)悬浮于12M盐酸(4mL)中。使多聚甲醛粉末在酸中部分溶解(使得没有干燥的多聚甲醛漂浮在液体上)，然后是水杨醛(经半小时的过程逐滴添加0.6g)。所得混合物呈现黄色调，最终在多聚甲醛完全溶解时澄清。将溶液搅拌12小时，随着时间推移它失去颜色，形成白色沉淀状的产物。过滤产物并用去离子水洗涤三次以去除残留的酸。将粗物质风干并不经进一步纯化用于下一步骤。

(甲基咪唑)甲基水杨醛的制备

在室温下将粗制氯甲基水杨醛(1当量)溶解在二氯甲烷中。逐滴添加甲基咪唑(1.5当量)，使所需产物几乎立即沉淀(当加入咪唑时，以小部分沉淀)。将沉淀物过滤并用二氯甲烷洗涤三次，以去除所有残留的有机物(基本上纯化该物质)。

形成亚胺结合的纳米粒子缀合物种类的通用程序

将甲基咪唑鎓)甲基水杨醛(1.2当量)溶解于Eppendorf管中的无水甲醇(1mL)中。将相应的胺缀合物配偶体(1当量)加入到Eppendorf管中，并将溶液放置30分钟，在此期间它呈现黄色，表明亚胺的形成。

缩醛保护的咪唑鎓质量标记的制备

将咪唑鎓质量标记(0.3g)溶解在无水二甲基甲酰胺中，加入Amberlyst-15(氢型，未测定质量)。一旦咪唑鎓质量标记溶解，将乙二醇(0.2g)加入到溶液中，并将反应混合物搅拌6小时。通过质谱确认所得缩醛的结构。

二醇官能化的丙胺的制备

将丙胺(纯净，1当量)与β-羟基-γ-丁内酯(纯净，1当量)混合。随着反应进行完全，反应立即放热并最终结晶。产率基本上是定量的。

用二醇改性丙胺官能化的二氧化硅纳米粒子

在Eppendorf管中用β-羟基-γ-丁内酯(300μL)覆盖丙胺官能化的二氧化硅纳米粒子(0.03g)并使其反应1小时。在较大规模上，该反应产生强到足以在皮肤上感觉到的放热，表明酰胺化反应类似于对游离丙胺观察到的反应。

图5显示通过该方法制备的四级质量标记的咪唑鎓(A)和吡啶鎓(B)类似物。甲基咪唑鎓(m/z 217)和吡啶鎓(m/z 214)质量标记。在这些实例中，质量结构由不通过单键或通过缀合与形式正电荷直接连接的所有其它原子构成，即水杨醛部分和甲基。使用甲基水杨醛的醛通过亚胺键或者在胺的改性之后，通过缩醛键结合丙胺官能化的二氧化硅纳米粒子的胺，如图3所示。

比较了两种与醛附接的方法。使用有机胺制备亚胺键(图3的嵌图D)和缩醛键(图3的嵌图B)作为稀有分子和亲和试剂的模型。研究了MIMSA与丙胺、巯基苯胺和1,6-二氨基萘的缀合物。亚胺键在无水甲醇中快速形成。发现该键在含水溶剂例如PBS的存在下易于裂解。为了在方法中使用这些材料，重要的是用于连接四级质量标记的键在通常用于测定法程序的缓冲水溶液中是稳定的。亚胺系统被认为是不可接受的，因为在暴露于含水溶剂20分钟后，键完全水解。缩醛和材料在至少20分钟内几乎完全稳定。

为了通过缩醛键与有机胺缀合，首先通过与β-羟基-γ-丁内酯反应，使游离胺经1,2-二醇结构官能化(参见图6)。该反应方案成功应用于有机胺和胺纳米粒子。它产生了所需的二醇结构(标记结合单元，图1)，并显示了与质量标记的醛和酮共轭的有效方法。所得缩醛和缩酮具有与乙二醇衍生的缩醛相同的水解稳定性。通过简单的一步液体加入酸化的喷雾溶剂例如50％乙腈水溶液和0.1％三氟乙酸(TFA)，缩醛和缩酮也易于与亲和试剂分离。通过nESI从含有0.1％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈水中未观察到质谱中质量标记信号的抑制。相比之下，在水中以1mg/mL使用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)以破坏二硫键导致通过nESI的质量标记检测极限抑制50％或更多。因此，二硫键不适合附接四级质量标记。

进行并入上述所有元素的示例工作流程。用β-羟基-γ-丁内酯进行丙胺官能化的二氧化硅纳米粒子的改性。然后将质量标记的甲基咪唑鎓类似物(图5，A)与所得二醇官能化的纳米粒子结合。在该缀合和随后的洗涤步骤之后，将与纳米粒子结合的质量标记释放到三氟乙酸水溶液的释放溶液中，并使用针对内标的校准曲线对释放的质量标记进行定量。内标是质量标记的吡啶鎓类似物(图5，B)。释放溶液中计算的质量标记浓度比从前一洗涤步骤的上清液测量的浓度高两个数量级(图7)。

图8显示具有咪唑鎓的高分子量衍生物(m/z 309和259)的质量标记有效地形成具有更高质量可变质量单元的质量标记。这些质量标记也被碎裂以产生独特的产物离子(m/z175和m/z 125)，其为可预测的并且可与背景质谱分析分离。

Claims

1.一种带电质量标记组合物，其包含：

亲和试剂；和

与所述亲和试剂结合的质量标记前体，其中所述质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，所述标记结合单元将所述质量标记可逆地结合到所述亲和试剂，并且其中所述质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。

2.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述亲和试剂包含特异性结合对的至少一个成员。

3.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元包含一个或多个化学部分，其被布置成在电离时具有电荷。

4.根据权利要求3所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元包含一个或多个选自由式I-VII组成的组的化学部分：

其中至少一个X是季铵阳离子或季鏻阳离子，其任选被至少一个选自由氢、烷基或芳香族有机衍生物组成的组的R取代。

5.根据权利要求3所述的带电质量标记组合物，其中所述电荷单元是选自由以下组成的组的化学部分：肉碱、咪唑鎓、吡啶鎓、四乙胺、苯甲烃铵胺、烷基苯乙铵胺、三苯基鏻阳离子以及三烷基(2,3-二羟基丙基)。

6.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记单元包含在电离时产生一个或多个碎片的化学部分的排列，其中所述一个或多个碎片中的至少一个在质谱中具有预定义的质荷比值。

7.根据权利要求6所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记或所述质量标记的一个或多个碎片的质谱中的预定义质荷比值不同于所述质谱中的背景质荷比值。

8.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记单元和所述电荷单元通过一个或多个抗电离时断裂的键彼此结合。

9.根据权利要求1所述的带电质量标记组合物，其中所述标记结合单元包含可逆键。

10.根据权利要求9所述的带电质量标记组合物，其中所述可逆键包含缩醛或缩酮键。

11.一种用于检测样品中的靶标分析物的方法，所述方法包含：

将带电质量标记组合物引入包含靶标分析物的样品，其中所述带电质量标记组合物包含亲和试剂；和与所述亲和试剂结合的质量标记前体，其中所述质量标记前体包含标记结合单元和质量标记，所述标记结合单元将所述质量标记可逆地结合到所述亲和试剂，并且其中所述质量标记包含电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元；

培育所述样品和所述带电质量标记组合物，使得所述带电质量标记组合物通过所述带电质量标记组合物的亲和试剂和所述靶标分析物之间的相互作用结合所述靶标分析物；

通过破坏所述标记结合单元的一个或多个键从所述亲和试剂释放所述质量标记；

电离所述质量标记；和

在质谱仪中检测所述电离的质量标记和/或其碎片，从而检测所述样品中的所述靶标分析物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品是生物样品。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶标分析物是靶标生物分子。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶标生物分子的存在指示疾病。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是癌症。

16.根据权利要求11所述的方法，其进一步包含定量所述电离的质量标记和/或其碎片，从而定量所述样品中的所述靶标分析物。

17.根据权利要求11所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记或所述质量标记的一个或多个碎片的质谱中的预定义质荷比值不同于所述质谱中的背景质荷比值。

18.根据权利要求11所述的带电质量标记组合物，其中所述质量标记单元和所述电荷单元通过一个或多个抗电离时断裂的键彼此结合。

19.根据权利要求11所述的带电质量标记组合物，其中所述标记结合单元包含可逆键。

20.根据权利要求19所述的带电质量标记组合物，其中所述可逆键包含缩醛或缩酮键。