JP7305709B2 - 荷電質量標識系 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年1月22日に出願された米国仮特許出願第62/286,115号の利益およびそれに対する優先権を主張し、この出願の内容はその全体が本明細書において参照として援用される。
本発明は、一般に、荷電質量標識組成物、および試料中の標的分析物を検出するためのその使用方法に関する。
体液の希少(rare)分子(例えば、タンパク質、核酸など)を異常の存在について分析し、それによって、がんなどのある特定の状態の早期診断をもたらすことに集中したアッセイが、開発されている。しかし、典型的な体液試料において、大部分の希少分子は分解しており、目的の異常を含有する変質した任意の希少分子は、試料中の分子の総量に対して少量(例えば、1%未満)で存在する。このことによって、少量の異常な希少分子の検出が失敗する。
本発明は、一般に、試料のバックグラウンド質量から分析的に分離され、かつ高い効率でイオン化されるように設計された荷電質量標識組成物に関する。本発明の組成物は、親和性試薬、および親和性試薬に結合した質量標識前駆体を含む。親和性試薬の特異性のため、MS標識は、それぞれ、試料における1つまたはそれより多くの標的希少分子に対応することができる。多段MS(別名、MSn、CID)を使用して、試料中の異なる希少分子集団を検出することができる。結合した親和剤は、物質に曝露されてMS標識をMS分析のために化学的に放出し、それぞれ異なるMS標識の存在および/または量を決定する。それぞれ異なるMS標識の存在および/または量は、試料中のそれぞれ異なる希少分子集団の存在および/または量に関連する。
特定の実施形態では例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
親和性試薬と、
前記親和性試薬に結合した質量標識前駆体とを含む荷電質量標識組成物であって、前記質量標識前駆体が、標識結合ユニットおよび質量標識を含み、前記標識結合ユニットが、前記質量標識を前記親和性試薬に可逆的に結合し、前記質量標識が、電荷ユニット、および質量スペクトルにおいて所定の質量対電荷値を有する質量標識ユニットを含む、荷電質量標識組成物。
(項目2)
前記親和性試薬が、特定の結合対の少なくとも一方のメンバーを含む、項目1に記載の荷電質量標識組成物。
(項目3)
前記電荷ユニットが、イオン化によって電荷を有するように配置された1つまたはそれより多くの化学部分を含む、項目1に記載の荷電質量標識組成物。
(項目4)
前記電荷ユニットが、式I~VIIからなる群から選択される1つまたはそれより多くの化学部分を含み、
(項目5)
前記電荷ユニットが、カルニチン、イミダゾリウム、ピリジニウム、テトラエチルアミン、ベンザルコニウムアミン、アルキルベンゼトニウムアミン、トリフェニルホスホニウムカチオン、およびトリアルキル(2,3-ジヒドロキシプロピル)からなる群から選択される化学部分である、項目3に記載の荷電質量標識組成物。
(項目6)
前記質量標識ユニットが、イオン化により1つまたはそれより多くの断片を生成する化学部分の配置を含み、前記1つまたはそれより多くの断片のうちの少なくとも1つが、質量スペクトルにおいて所定の質量対電荷値を有する、項目1に記載の荷電質量標識組成物。
(項目7)
前記質量標識または前記質量標識の1つもしくはそれより多くの断片の前記質量スペクトルにおける前記所定の質量対電荷値が、前記質量スペクトルにおけるバックグラウンドの質量対電荷値と異なる、項目6に記載の荷電質量標識組成物。
(項目8)
前記質量標識ユニットおよび前記電荷ユニットが、イオン化による破壊に抵抗性がある1つまたはそれより多くの結合によって互いに結合される、項目1に記載の荷電質量標識組成物。
(項目9)
前記標識結合ユニットが可逆的結合を含む、項目1に記載の荷電質量標識組成物。
(項目10)
前記可逆的結合が、アセタールまたはケタール結合を含む、項目9に記載の荷電質量標識組成物。
(項目11)
試料中の標的分析物を検出する方法であって、
荷電質量標識組成物を、標的分析物を含む試料に導入するステップであって、前記荷電質量標識組成物が、親和性試薬、および前記親和性試薬に結合した質量標識前駆体を含み、前記質量標識前駆体が、標識結合ユニットおよび質量標識を含み、前記標識結合ユニットが、前記質量標識を前記親和性試薬に可逆的に結合し、前記質量標識が、電荷ユニット、および質量スペクトルにおいて所定の質量対電荷値を有する質量標識ユニットを含むステップと、
前記試料および前記荷電質量標識組成物をインキュベートし、それによって前記荷電質量標識組成物が、前記荷電質量標識組成物の前記親和性試薬と、前記標的分析物との相互作用を介して前記標的分析物に結合するステップと、
前記質量標識を、前記標識結合ユニットの1つまたはそれより多くの結合の破壊によって、前記親和性試薬から放出するステップと、
前記質量標識をイオン化するステップと、
前記イオン化質量標識および/またはその断片を、質量分析計において検出し、それによって、前記試料中の前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法。
(項目12)
前記試料が生物学的試料である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記標的分析物が標的生物学的分子である、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記標的生物学的分子の存在が疾患を示す、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記疾患が、がんである、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記イオン化質量標識および/またはその断片を定量化し、それによって、前記試料中の前記標的分析物を定量化するステップを更に含む、項目11に記載の方法。
(項目17)
前記質量標識または前記質量標識の1つもしくはそれより多くの断片の前記質量スペクトルにおける前記所定の質量対電荷値が、前記質量スペクトルにおけるバックグラウンドの質量対電荷値と異なる、項目11に記載の荷電質量標識組成物。
(項目18)
前記質量標識ユニットおよび前記電荷ユニットが、イオン化による破壊に抵抗性がある1つまたはそれより多くの結合によって互いに結合される、項目11に記載の荷電質量標識組成物。
(項目19)
前記標識結合ユニットが可逆的結合を含む、項目11に記載の荷電質量標識組成物。
(項目20)
前記可逆的結合が、アセタールまたはケタール結合を含む、項目19に記載の荷電質量標識組成物。
本発明は、一般に、荷電質量標識組成物、および試料中の標的分析物を検出するためのその使用方法に関する。ある特定の態様において、本発明は、親和性試薬および親和性試薬に結合した質量標識前駆体を含む荷電質量標識組成物を提供する。質量標識前駆体は、標識結合ユニットおよび質量標識を含む。標識結合ユニットは、質量標識を親和性試薬に可逆的に結合する。質量標識は、電荷ユニットおよび質量スペクトルにおいて所定の質量対電荷値を有する質量標識ユニットを含む。
とによって、当業者は、試料中の希少核酸配列に結合する核酸親和性試薬を容易に設計することができる。
S A、74巻(12号):5463~67頁(1977年)に記載されているような、連鎖停止およびゲル分離によるものである。別の従来の配列決定方法は、核酸断片の化学分解を伴う。Maxamら、Proc. Natl. Acad. Sci.、74巻:560~564頁(1977年)を参照すること。最後に、ハイブリダイゼーションによる配列決定に基づいた方法が開発されている。例えば、Drmanacら(Nature Biotech.、16巻:54~58頁、1
998年)を参照すること。それぞれの参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
)をもたらす。新たに合成および標識されたDNA断片は変性され、一塩基を鎖の長さの差で分割することができる、変性ポリアクリルアミド尿素ゲルに対するゲル電気泳動を使用して、サイズによって分離される。4つのDNA合成反応のそれぞれが、同じ単色標識(例えば、放射線同位体)によって標識される場合、これらは、ゲルの4つの個別の隣接レーンのうちの1つで分離され、ゲルにおけるそれぞれのレーンは、それぞれの反応に使用されるジデオキシヌクレオチドに従って指定され、すなわち、ゲルレーンA、T、G、Cである。4つの異なる標識を利用した場合、反応をゲルの単一レーンに組み合わせることができる。DNAバンドは、オートラジオグラフィーまたは蛍光によって可視化され、DNA配列を、X線フィルムまたはゲル画像によって直接読み取ることができる。
号)、Quakeら(米国特許第6,818,395号)、Harris(米国特許第7,282,
337号)、Quakeら(米国特許出願第2002/0164629号)、およびBraslavskyら、PNAS(USA)、100巻:3960~3964頁(2003年)に示されており、これらの参考文献それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、一本鎖核酸(例えば、DNAまたはcDNA)を、フローセルの表面に付着したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチドは表面に共有結合的に付着され得る、または共有結合的連結以外の当業者に公知の様々な付着を用いることができる。更に付着は、表面に直接的または間接的に付着したポリメラーゼを介して、間接的であってもよい。表面は、平面であっても、そうでなくてもよく、および/あるいは多孔質もしくは非多孔質、または付着に適した当業者に公知の任意の他の種類の表面であってもよい。次に核酸は、単一分子を分割するために、オリゴヌクレオチドの成長鎖表面に組み込まれた蛍光標識ヌクレオチドのポリメラーゼ媒介付加を画像化することによって、配列決定される。
本明細書に組み込まれる。
参照すること。それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドを合成する適切な方法は、Caruthers(Science、230巻:281~285頁、1985年)にも記載されており、その内容は参照により組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、Operon Technologies、Amersham Pharmacia Biotech、Sigma、およびLife Technologiesなどの市販の供給会社から得ることもできる。オリゴヌクレオチドは、同一の融解温度を有することができる。オリゴヌクレオチドの長さを、5’末端または3’末端で延長または短縮して、望ましい融解温度を有するオリゴヌクレオチドを生成することができる。また、それぞれのオリゴヌクレオチドのアニーリング位置を、核酸親和性試薬の配列および長さが、望ましい融解温度を生じるように設計することができる。25塩基対より少ない核酸親和性試薬の融解温度を決定する最も簡単な方程式は、ウォレスルール(Wallace Rule)(Td=2(A+T)+4(G+C))である。Array Designer Software (Arrayit Inc.)、遺伝分析用オリゴヌクレオチドプローブ配列設計ソフトウェア(Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis)(Olympus Optical Co.)、NetPrimer、およびHitachi Software EngineeringのDNAsisが含まれるが、これらに限定されないコンピュータプログラムを、オリゴヌクレオチドの設計に使用することもできる。それぞれのプローブのTM(融解温度)は、Invitrogen
Corp.から入手可能なOligo Designなどのソフトウエアプログラムの使用によって計算される。
Pathol. Med.、22巻(4号):145~152頁、1993年;Stauberら、J. Immunol. Methods、161巻(2号):157~168頁、1993年、およびVenkateswaranら、Hybridoma、11巻(6号)729~739頁、1992年を参照すること。こ
れらの技術を使用して、抗原特異的IgGおよびIgMモノクローナル抗体を含む、抗原反応性モノクローナル抗体を生成することができる。
る。例えば、Goldら(米国特許第5,270,163号および同第5,475,096号)を参照すること。それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。SELEXは、核酸の大きなプールから選択された分子標的に対する核酸リガンドを同定することに使用される反復方法である。この方法は、核酸リガンドの複数回の選択、分配、および増幅を使用して、標的分子に最高の親和性を有する核酸リガンドを分割する、標準的な分子生物学的技術に依存する。SELEX方法は、改善されたin vivo安定性または改善された送達特性などの改善された特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび/またはホスフェートおよび/または塩基の位置での化学置換が含まれる。基本的なSELEX方法に対して多数の改善が行われており、そのうちの任意のものを、本発明の方法に使用される核酸リガンドの発見に使用することができる。
細胞;免疫細胞(B細胞、T細胞、マクロファージ、NK細胞、単球);幹細胞;有核赤血球(正赤芽球または赤芽球);および未熟顆粒球であり得るが、これらに限定されない。希少分子は、例えば、PCT/US2016/053610に更に記載されており、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ser-Cys、L-カルニチン-Phe-Thr-Ala-Ser-Ala-Cys、L-カルニチン-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys、L-カルニチン-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys、L-カルニチン-phe-gly-gly-ser-cys、L-カルニチン-phe-phe-ser-gly-cys、L-カルニチン-phe-gly-thr-thr-cys、L-カルニチン-phe-gly-thr-ala-cys、カルニチン-arg-gly-cys、およびカルニチン-phe-cysなど、ペプチド質量標識に付着するためのカルボン酸を有する。別の例において、第四級質量標識のメチルイミダゾリウムおよびピリジニウム類似体は、図5に示されているように、-CH2-結合を介して芳香族質量標識に接続されている。
きる。長い鎖を有するケトンでは、マクラファティ転位は、多くの場合、強いピークをもたらす。芳香族ケトンでは、M+は明白である。一次切断は、カルボニルに対してαであり、強いArCO+ピーク(Ar=Phの場合、m/z105)をもたらす。このことによってCOを失い、フェニルカチオン(m/z77)をもたらす。
容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ペプチド断片化アルゴリズムも、市販されている。ペプチドの断片化を予測する例示的なアルゴリズムは、Zhang(Analytical Chemistry、76巻、3908~3922頁、2004年)またはZhang(Analytical Chemistry、77巻、6364~6373頁、2005年)に記載されており、それぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゼ、およびカルボキシペプチダーゼ);アルドラーゼ(例えば、カルボキシルアルドラーゼ、アルデヒドアルドラーゼ、オキソ酸、トリプトファナーゼ);脂肪酸酵素(例えば、脂肪酸アミンヒドロラーゼ、脂肪酸シンターゼ、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ)、ならびに、上記の2つまたはそれよりも多くの組合せ(例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、オキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アシラーゼ、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、ホスホグルコムターゼ、リボヌクレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クエン酸シンテターゼ、ウレアーゼ、アミルグルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびスブチロペプチダーゼ(subtilopeptidase)の2つまたはそれよりも多い)が含まれるが、これらに限定されない。
試料
。
t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、Sigma Aldrichから市販されているポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテル緩衝液など)およびTWEEN-20(Sigma Aldrichから市販されているポリソルベート20)など)が含まれるが、これらに限定されない。1つまたはそれより多くの洗浄ステップを、緩衝水性媒体の使用により透過処理細胞に実施することができる。
アッセイ
することもできる。
質量タグのイオン発生
およびYamashitaら、J. Phys. Chem.、88巻:4451~4459頁、1984年)
、大気圧イオン化(APCI、Carrollら、Anal. Chem.、47巻:2369~2373
頁、1975年)、ならびに大気圧マトリックス支援レーザー脱離イオン化(AP-MALDI、Laikoら、Anal. Chem.、72巻:652~657頁、2000年、およびTanakaら、Rapid Commun. Mass Spectrom.、2巻:151~153頁、1988年)が含まれる。それぞれの参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
を利用する例示的な質量分析技術には、脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI、Takatsら、Science、306巻:471~473頁、2004年、および米国特許第7,3
35,897号)、リアルタイムでの直接分析(DART、Codyら、Anal. Chem.、77巻:2297~2302頁、2005年)、大気圧誘電体バリア放電イオン化(Atmospheric Pressure Dielectric Barrier Discharge Ionization)(DBDI、Kogelschatz、Plasma Chemistry and Plasma Processing、23巻:1~46頁、2003年、およびPCT国際公開第2009/102766号)、湿潤多孔質物質を使用するイオン発生(Paper Spray、米国特許第8,859,956号)、ならびにエレクトロスプレー支援レーザー脱離/イオン化(ELDI、Shieaら、J. Rapid Communications in Mass Spectrometry、19巻:3701~3704頁、2005年)が含まれる。それぞれの参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
04号を参照すること。この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)。ある特定の実施形態において、高電圧が適用され得る固体針状プローブまたは表面を使用して、質量タグのイオンを発生させる(例えば、Cooksらの米国特許出願公開第201402
64004号を参照すること。この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
イオン分析
instrumentation development, and performance」、Anal. Chem.、2014年、
86巻、2900頁~2908頁、DOI: 10.1021/ac403765x、それぞれの内容は、全体
が参照により本明細書に組み込まれる)、ならびにMini 10の真空系(Liang Gao、Qingyu Song、Garth E. Patterson、R. Graham Cooks、およびZheng Ouyang、「Handheld Rectilinear Ion Trap Mass Spectrometer」、Anal. Chem.、78巻(2006年)、5994~6002頁、DOI: 10.1021/ac061144k、この内容は、全体が参
照により本明細書に組み込まれる)を組み合わせて、図10に示されている小型質量分析計を作った。これは、靴箱(H20×W25cm×D35cm)と同様のサイズを有し得る。ある特定の実施形態において、小型質量分析計は二重LIT構成を使用し、これは、例えば、Owenら(米国特許出願第14/345,672号)、およびOuyangら(米国特許出願第61/865,377号)に記載されており、それぞれの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による組み込み
均等物
2013年、Elsevier Inc.、225 Wyman Street、Waltham MAによって記載されてい
るものなどの、標準的なバイオコンジュゲーション技術によって調製した。イミダゾリウムおよびピリジニウム質量標識は、Michael W. PenningtonおよびBen M. Dunn in Imidazolium Synthesis Protocols、第1版、1994年11月、Springer-Verlag、New York、LLC、New York NYによって記載されているものなどの、標準的なイミダゾリ
ウム合成技術によって調製した。材料は、材料の記載に使用される一般的な用語と共に、表1に示されている。
実施例1:標的希少分子のための第四級質量標識化の方法
実施例2:第四級質量標識化の検出
Thermo Fisher)を使用して、(3に等しいシグナル対ノイズ比をもたらす濃度として評価した)検出限界を試験するため、ナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)により生成された質量標識イオンを分析した。機器の設定は、以下のとおりである:噴霧電圧1.5kV、毛管温度150℃、チューブレンズ65V、毛管電圧15V、衝突エネルギー35、Q活性化0.3。
実施例3:第四級質量標識のメチルイミダゾリウムおよびピリジニウム類似体
クロロメチルサリチルアルデヒドの調製
(メチルイミダゾール)メチルサリチルアルデヒドの調製
イミン結合ナノ粒子コンジュゲート種の形成のための一般的手順
アセタール保護イミダゾリウム質量標識の調製
ジオール官能化プロピルアミンの調製
ジオールによるプロピルアミン官能化シリカナノ粒子の修飾
Claims (10)
- 希少分子および非希少分子の1つまたはそれより多くの異なる集団を含むことが推定される試料中の標的希少分子の1つまたはそれより多くの異なる集団を検出する方法であって、
(1)荷電質量標識組成物を、標的希少分子と非希少分子との1つまたはそれより多くの異なる集団および(2)内部標準である第2の質量標識を含むと疑われる試料に導入するステップであって、前記荷電質量標識組成物が、存在する前記希少分子の前記集団のうちの1つの標的希少分子集団への特異的結合パートナーを含む親和性試薬と、前記親和性試薬に結合した質量標識前駆体とを含み、前記質量標識前駆体が、標識結合ユニットおよび質量標識を含み、前記標識結合ユニットが、前記質量標識を前記親和性試薬に可逆的に結合し、前記質量標識が、質量標識ユニットに化学的に連結した電荷ユニットを含み、前記質量標識ユニットが、中性であり、かつ、質量スペクトルにおいて所定の質量対電荷値を有し、イオン化されると、前記電荷ユニットが前記質量標識ユニットから放出され、前記質量スペクトルにおいて前記質量標識ユニットが前記所定の質量対電荷値を有することにより、前記質量標識ユニットが前記質量スペクトルにおいて検出可能であるステップと、
前記試料および前記荷電質量標識組成物をインキュベートし、それによって前記荷電質量標識組成物が、前記荷電質量標識組成物の前記親和性試薬と、前記標的希少分子集団との相互作用を介して前記標的希少分子集団に結合するステップと、
前記質量標識を、前記標識結合ユニットの1つまたはそれより多くの結合の破壊によって、前記親和性試薬から放出するステップと、
前記質量標識および前記内部標準である第2の質量標識をイオン化するステップと、
前記質量標識および/またはその断片および前記内部標準である第2の質量標識を、質量分析計において検出し、それによって、前記試料中の前記標的希少分子集団を検出するステップと
を含む方法。 - 前記試料が生物学的試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的希少分子の1つまたはそれより多くの異なる集団のうちの1つが標的生物学的希少分子の集団である、請求項2に記載の方法。
- 前記標的生物学的希少分子の集団の存在が疾患を示す、請求項3に記載の方法。
- 前記疾患が、がんである、請求項4に記載の方法。
- 前記質量標識および/またはその断片を定量化し、それによって、前記試料中の前記標的生物学的希少分子の集団を定量化するステップを更に含む、請求項3に記載の方法。
- 前記質量標識ユニットまたは前記質量標識ユニットの1つもしくはそれより多くの断片の前記質量スペクトルにおける前記所定の質量対電荷値が、前記質量スペクトルにおけるバックグラウンドの質量対電荷値と異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記質量標識ユニットおよび前記電荷ユニットが、イオン化による破壊に抵抗性がある1つまたはそれより多くの結合によって互いに結合される、請求項1に記載の方法。
- 前記標識結合ユニットが可逆的結合を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記可逆的結合が、アセタールまたはケタール結合を含む、請求項9に記載の方法。
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