KR20180102654A - 하전된 질량 표지 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 샘플 내 표적 분석물을 검출하기 위한 하전된 질량 표지 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 친화성 시약 및 친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체를 포함하는 하전된 질량 표지 조성물을 제공한다. 질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함한다. 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시킨다. 질량 표지는 전하 유닛 및 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함한다.

Description

하전된 질량 표지 시스템

관련 출원

본 출원은 2016년 1월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/286,115의 이익 및 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 샘플 내 표적 분석물을 검출하기 위한 하전된 질량 표지 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

이상의 존재에 대해 체액으로부터의 희귀 분자 (예를 들어 단백질, 핵산 등)를 분석하여, 암과 같은 특정 상태의 조기 진단을 유도하는 것에 초점을 맞춘 검정이 개발되었다. 그러나, 전형적인 체액 샘플에서, 대다수의 희귀 분자는 분해되고, 관심 이상을 함유하는 임의의 변경된 희귀 분자는 샘플 내 분자의 총량에 비해 소량 (예를 들어, 1% 미만)으로 존재한다. 이것은 소량의 비정상적 희귀 분자의 검출 실패를 초래한다.

친화도 검정, 핵산 검정 및 세포 분석 검정은 샘플 내 희귀 분자의 검출을 위해 개발되었다. 각각은 특정 결점을 갖는다. 예를 들어, mL당 1 내지 50,000 카피 범위 (펨토몰 (fM) 이하)의 희귀 분자의 검출은 희귀 분자에 대해 발견된 수를 훨씬 초과하는 다수의 분자 카피를 요구하는 통상적인 친화도 검정에 의해서는 달성될 수 없다. 면역검정은 전형적으로 10^-12 (1 pM)보다 높지 않은 항체의 친화도 결합 상수에 의해 제한된다. 면역검정은 10^-13인 오프-레이트로 인해 적어도 100배 항체 과잉을 요구하고, 항체 단백질의 용해도는 반응을 완결로 이끄는데 제한을 가한다.

핵산의 경우에, 증폭 기반 접근법 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 디지털 PCR, 정량적 PCR)은 이들 이상을 검출하기 위한 시도로 이전에 사용되었다. 그러나, 증폭 반응의 확률적 성질로 인해, 샘플에 소량으로 존재하는 분자의 집단은 종종 간과된다. 실제로, 희귀 핵산이 증폭의 처음 몇 회차에서 증폭되지 않는 경우에, 희귀 종이 어느 때고 검출될 것이라는 것은 점점 가능성이 없게 된다.

희귀 분자가 세포 결합되어 있거나 세포 내에 포함되어 있는 경우에, 희귀 분자를 포함하는 관심 세포의 단리를 요구하는 세포 분석 기술이 사용된다. 희귀 분자를 포함하는 그러한 세포는 전형적으로 분석 하의 샘플의 단지 적은 분율만을 나타낸다. 따라서, 높은 분리 효율 및 세포 회수율을 갖는 방법은 그러한 세포 내 희귀 분자의 검출 전에도 필요하다. 정제 후에, 희귀 세포는 통상적인 주사 현미경검사에 의해 단일 세포 수준까지 분석될 수 있다. 그러나, 스캐닝 및 분석의 자동화로도, 현미경검사 방법은 각각의 샘플을 스캐닝하는데 24시간 이상이 소요될 수 있다. 추가적으로, 다중 이미지를 갖는 모든 희귀 세포는 측정된 단백질 양의 유의성을 결정하기 위해 병리학자에 의해 육안으로 검사되어야 한다.

희귀 사건 검출을 위해 질량 분광측정법 (MS)을 사용하려는 시도가 이루어졌다. 그러나, 여러 문제가 발생하였다. 예를 들어, 관심 마커를 샘플 간섭으로부터 분리할 수 없다는 점이 존재한다 (매트릭스 중첩). 임상 샘플 내 배경으로 인한 보다 높은 검출 한계 (피코몰 (pM)이 나노몰 (nM)로 증가하였음)도 문제이다. 1 마이크로리터 (μl) 미만의 샘플은 이온화를 위해 비효휼적으로 포획되고 혈액과 같은 복합 샘플로부터 비효율적으로 단리되기 때문에 적은 nL 샘플 부피로는 작업할 수 없다는 점이 존재한다. 추가로, MS는 종종 이온화될 동일한 질량의 다른 이온과의 경쟁으로 인해 또는 특정한 매트릭스 성분의 존재에 의한 이온화의 억제로 인해 특정 질량을 검출할 수 없다. 이들 문제는 전형적으로 가양성 및/또는 가음성 결과로 인한 문제점을 야기한다.

상기 문제를 다루기 위해, 샘플 내 희귀 분자에 결합하는 질량 표지를 사용하는 것에 의존하는 기술이 개발되었다. 그러한 접근법은 질량 표지를 사용하는 것이 샘플 내 희귀 분자의 직접적 검출과 연관된 상기 문제를 극복해주기 때문에 질량 분광측정법이 희귀 사건 검출에 사용되는 것을 가능하게 한다.

그러나, 희귀 분자 검출을 위한 질량 분광측정법의 전체 잠재력을 제한해 온 질량 표지로 인한 문제점이 계속 존재한다. 예를 들어, 현행 MS 표지는 전형적으로 가역적 디술피드 결합에 의해 친화성 작용제에 결합된 펩티드를 이용한다. 그러나 펩티드는 질량 분광계에서 용이하게 양성자를 교환하는 경향이 있고 일반적으로 낮은 이온화 효율을 갖는다. 추가적으로, 디술피드 결합으로부터 펩티드를 방출시키는데 사용되는 화학물질, 예컨대 TCEP 및 DTT는 질량 스펙트럼에서 질량 표지로부터의 신호 강도를 억제할 수 있다. 강산, 예컨대 TFA가 이온화 효율을 개선시킬 수 있지만, 이들은 TCEP 및 DTT가 디술피드 결합을 절단하는 것을 방지하므로, 별개의 액체가 분무-기반 이온화에 의해 질량 표지를 방출 및 이온화하기 위해 필요하다.

따라서, 질량 표지 기술의 적용에 있어서 문제점이 여전히 존재하며; 즉, 질량 표지, 예컨대 펩티드는 이상적인 이온화 효율을 갖지 않고, 현행 질량 표지는 배경 잡음으로부터 분리가능한 예측가능한 질량으로 단편화될 수 없으며, 질량 표지는 친화성 시약으로부터 용이하게 절단되지 않는다.

본 발명은 일반적으로 샘플의 배경 질량으로부터 분석적으로 분리되도록 설계되고 높은 효율로 이온화되는 하전된 질량 표지 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 친화성 시약, 및 친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체를 포함한다. 친화성 시약의 특이성 때문에, 각각의 MS 표지는 샘플로부터의 1종 이상의 표적 희귀 분자에 대응할 수 있다. 다중 단계 MS (일명 MSⁿ, CID)는 샘플 내 희귀 분자의 상이한 집단을 검출하는데 사용될 수 있다. 결합된 친화성 작용제는 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양을 결정하는 MS 분석을 위해 MS 표지를 화학적으로 방출시키는 물질에 노출된다. 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 희귀 분자의 각각의 상이한 집단의 존재 및/또는 양과 관련된다.

질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함한다. 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시킨다. 표지 결합 유닛의 가역적 결합은 친화성 작용제로부터 MS 표지의 용이하고 믿을만한 절단을 가능하게 한다. 질량 표지는 전하 유닛 (예를 들어, 미리-하전된 (이온성 관능기), 예컨대 4급 암모늄 (4급 아민) 기, 또는 유사한 술포늄 또는 포스포늄 양이온, 또는 피리디늄 또는 이미다졸리늄)을 포함한다. 이 전하 유닛은 이온성이고, 따라서 MS에서 기체-상 이온으로서 용이하게 관찰된다. 질량 표지는 또한 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함한다. 질량 표지는 이온화 및 MS/MS시에 배경으로부터 분리된 적어도 1개의 예측가능한 m/z로의 단편화로 인해 적어도 1개의 고유 질량 단편을 생성할 수 있다. 질량 표지가 배경으로부터 분리된 예측가능한 m/z를 생성하기 때문에, 특징적인 질량 표지가 질량 분광측정법에 의해 용이하게 검출된다.

수많은 상이한 유형의 친화성 시약이 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화성 시약은 특이적 결합 쌍의 적어도 1종의 구성원을 포함한다. 친화성 시약은 비-미립자 또는 미립자일 수 있고, 질량 분광측정법 (MS) 표지 전구체에 연결되며, 이로부터 MS 표지를 포함하는 물질이 방출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 질량 표지 유닛 및 전하 유닛은 이온화시 파괴에 대해 저항성이 있는 1개 이상의 결합에 의해 서로 결합된다. 전형적으로, 표지 결합 유닛은 가역적 결합, 예컨대 아세탈 또는 케탈 결합을 포함한다.

전하 유닛은 이온화시에 전하를 갖도록 배열된 1개 이상의 화학적 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 전하 유닛은 화학식 I-VII로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다:

특정 실시양태에서, 적어도 1개의 X는 적어도 1개의 R에 의해 임의로 치환된 4급 암모늄 양이온 또는 4급 포스포늄 양이온이다. R은 수소, 알킬 또는 방향족 유기 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전하 유닛은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학적 모이어티이다: 카르니틴, 이미다졸륨, 피리디늄, 테트라 에틸 아민, 벤즈알코늄 아민, 알킬 벤제토늄 아민, 트리페닐 포스포늄 양이온, 및 트리알킬(2,3-디히드록시프로필).

질량 표지 유닛은 이온화시에 1개 이상의 단편을 생성하는 화학적 모이어티의 배열을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 1개 이상의 단편 중 적어도 1개는 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는다. 특정 실시양태에서, 질량 표지 또는 질량 표지의 1개 이상의 단편의 질량 스펙트럼에서의 미리-정해진 질량-대-전하-값은 질량 스펙트럼에서의 배경 질량-대-전하-값과 상이하다.

본 발명의 다른 측면은 샘플 내 표적 분석물을 검출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 표적 분석물을 포함하는 샘플에 하전된 질량 표지 조성물을 도입하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 하전된 질량 표지 조성물은 친화성 시약; 및 친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체를 포함하고, 여기서 질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함하고, 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시키고, 질량 표지는 전하 유닛 및 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함한다. 이어서 방법은 샘플 및 하전된 질량 표지 조성물을 인큐베이션하여 하전된 질량 표지 조성물의 친화성 시약과 표적 분석물 사이의 상호작용을 통해 하전된 질량 표지 조성물이 표적 분석물에 결합하도록 하는 것을 포함한다. 이어서 표지 결합 유닛의 1개 이상의 결합을 파괴함으로써 질량 표지를 친화성 시약으로부터 방출시킨다. 질량 표지를 이온화하고, 질량 분광계에서 이온화된 질량 표지 및/또는 그의 단편을 검출하여, 샘플 내 표적 분석물을 검출한다. 본 발명의 방법은 이온화된 질량 표지 및/또는 그의 단편을 정량화하여, 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 다양한 유형의 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 환경적 샘플, 농업 샘플 등에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 분석물은 표적 생물학적 분자이다. 전형적으로, 표적 생물학적 분자의 존재는 질환, 예컨대 암의 지표이다.

본원에 기재된 다른 예는 질량 분광측정법 (MS)에 의해 희귀 분자 및 비-희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 검출하는 방법에 관한 것이다. 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단의 농도는 존재하는 희귀 분자의 집단 중 1개의 표적 희귀 분자 집단에 대한 특이적 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제를 사용하여 비-희귀 분자의 농도에 대해서 검출된다. 친화성 시약은 비-미립자 또는 미립자일 수 있고, 질량 표지 전구체에 연결되며, 이는 표지 전구체 내의 질량 표지와 표지 결합 유닛 사이의 결합의 파괴를 용이하게 하는 시약을 함유하는 액체에 대한 노출 후에 질량 표지를 방출시킨다. 4원 질량 표지는 MS 분석에 적용되어 각각의 상이한 4원 질량 표지의 존재 및/또는 양이 결정된다. 4원 질량 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 표적 희귀 분자의 존재 및/또는 양과 관련된다.

본원에 기재된 또 다른 예는 질량 분광측정법 (MS)에 의해 희귀 분자 및 비-희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 검출하는 방법에 관한 것이다. 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단의 농도는 질량 표지 전구체에 연결된 친화성 시약을 표적 희귀 분자에 결합시킴으로써 비-희귀 분자의 농도에 대해서 검출된다. 친화성 시약이 희귀 분자에 결합한 후에, 질량 표지는 방출 시약에 의해 화학적으로 방출되고, MS 분석에 적용되어 4원 질량 표지 및 이에 따른 희귀 분자의 존재 및/또는 양이 결정된다. 질량 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 표적 희귀 분자의 존재 및/또는 양과 직접적으로 관련된다.

도 1은 본 발명의 한 실시양태의 예시이다. 희귀 분자/세포는 미립자 또는 비-미립자일 수 있는 친화성 시약에 결합된다. 차례로 친화성 시약은 질량 표지에 대한 가역적 접합을 용이하게 하는 표지 결합 유닛으로 관능화된다. 질량 표지 및 표지 결합 유닛은 질량 표지 전구체를 구성한다. 질량 표지는 전하 유닛 (이는 형식 전하, 예컨대 4급 암모늄, 술포늄 또는 포스포늄 염을 보유함) 및 형식적으로 중성이고 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 m/z 값으로 나타나는 질량 표지를 생성하도록 변경되는 가변 질량 유닛으로 구성된다.
도 2는 전하 유닛이며, 여기서 적어도 1개의 X는 N-R 모이어티, 예컨대 4급 암모늄 양이온이거나, 또는 여기서 적어도 1개의 X는 4급 포스포늄 양이온이고, 여기서 X= P-R이고 R은 수소, 알킬 또는 방향족 유기 유도체, 예컨대 메틸, 벤질 또는 페닐일 수 있다.
도 3 패널 A-D는 적어도 1개의 원자, 예컨대 CH, CH₂, O, N, S, P 또는 패널 B 및 패널 D에 제시된 페닐 기와 같은 3 kDA 미만의 질량을 갖는 분자를 포함하는 Y에 의해 나타내어지는 가변 질량 유닛을 제시한다. 질량 표지의 구성성분인 가변 질량 유닛, Y 및 전하 유닛은 패널 A 및 패널 B에 제시된 바와 같은 R₁에 의해 또는 패널 C 및 패널 D에 제시된 바와 같은 이민 결합을 통해 나타내어지는 아세탈 또는 케탈 결합을 통해 친화성 시약 또는 희귀 분자에 연결된다.
도 4는 L-카르니틴이다.
도 5는 전하 유닛으로서 이미다졸륨 (m/z 217) 및 피리디늄 (m/z 214) 구조를 갖는 질량 표지 뿐만 아니라 MS/MS로부터 생성된 이들의 각 생성물 이온을 제시한다. 이 경우에, 가변 질량 유닛은 미리-하전된 원자에 직접적으로 연결되지 않는 분자 내 모든 다른 원자로 구성된다. 질량 표지는 이들이 MS/MS에 적용되는 경우에 고유 단편 이온을 생성한다. 이미다졸륨 질량 표지의 경우, 고유 단편은 생성물 이온 MS/MS 스펙트럼에서 m/z 83으로 관찰가능하다. 피리디늄 질량 표지의 경우, 고유 단편 이온은 생성물 이온 MS/MS 스펙트럼에서 m/z 80으로 관찰가능하다.
도 6은 R에 의해 나타내어지는 친화성 시약 또는 미가공 분자가 질량 구조 Y 상의 디올에서 알데히드로의 반응에 의해 아세탈 또는 케탈 결합을 통해 4원 질량 표지에 어떻게 연결되는지를 제시한다. 디올은 먼저 베타-히드록시-감마-부티로락톤의 반응에 의해 친화성 시약 또는 희귀 분자의 아민에 부착되어 아미드 결합을 형성한다.
도 7은 보정 곡선을 사용하여 방출 용액 내로 방출된 질량 표지의 농도를 제시한다. 샘플 (삼각형)을 네 자릿수만큼 희석하였다. 방출 전 최종 세척으로부터의 상청액 (사각형)을 두 자릿수의 희석 후에 분석하였다.
도 8은 N-치환된 이미다졸의 보다 높은 질량 유사체로부터 유래된 질량 표지를 제시한다. 이들 경우에서의 전하 유닛은 여전히 4급 질소이지만, 가변 질량 유닛은 상이한 질량을 갖는 질량 표지를 생성하도록 변경되었다.
도 9는 질량 분광계에서 펩티드 질량 표지의 단편화를 예측하는 과정을 기재한다.
도 10은 소형 질량 분광계 내 다양한 구성요소 및 그의 배열을 예시하는 그림이다.

본 발명은 일반적으로 샘플 내 표적 분석물을 검출하기 위한 하전된 질량 표지 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 친화성 시약, 및 친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체를 포함하는 하전된 질량 표지 조성물을 제공한다. 질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함한다. 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시킨다. 질량 표지는 전하 유닛 및 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함한다.

질량 표지는 MS/MS에 적용되는 경우에 적어도 1개의 고유 단편을 생성한다. 이 단편화는 예측가능하고, 배경 스펙트럼으로부터 분석적으로 분리될 수 있는 적어도 1개의 질량을 생성한다. 질량 표지 이온은 주위 환경에서 이온화 사건에 의해 생성될 수 있다 (도 1). 질량 표지 및 그의 생성물 이온은 질량 분광계의 진공 하에 검출된다 (도 1). 질량 표지 (예를 들어, 4원 질량 표지)는 표지 결합 유닛 (예를 들어, 아세탈 또는 케탈 결합)에 의해 친화성 시약 또는 희귀 분자에 부착될 수 있고, 희귀 분자의 검출 방법에 사용될 수 있다.

일부 예는 질량 분광측정법 (MS)에 의해 희귀 분자 및 비-희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단을 검출하는 방법에 관한 것이다. 표적 희귀 분자의 1개 이상의 상이한 집단의 농도는 본 발명의 조성물을 샘플 내 표적 희귀 분자에 결합시킴으로써 비-희귀 분자의 농도에 대해서 검출될 수 있다. 부착은 변경 작용제를 갖는 액체에 대한 노출 후에 희귀 분자로부터 질량 표지를 방출시키는 질량 표지 전구체와 희귀 분자 사이에 비-미립자 또는 미립자 결합으로 행해질 수 있다. 처리된 샘플은 MS 분석에 적용되어 4원 질량 표지의 존재 및/또는 양이 결정 또는 정량화될 수 있다. 질량 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 표적 희귀 분자의 존재 및/또는 양과 관련될 수 있다.

용어 "친화성 시약"은 특이적 결합 쌍의 구성원을 지칭한다. 예는 면역학적 쌍, 예컨대 항원-항체 또는 합텐-항체, 비오틴-아비딘 쌍, 호르몬-호르몬 수용체, 효소-기질, 핵산 듀플렉스, IgG-단백질 A, 단백질-뉴클레오티드 쌍, 및 폴리뉴클레오티드 쌍, 예컨대 DNA-DNA, DNA-RNA를 포함한다. 예를 들어, 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)은 표적 핵산에 상보적인 "친화성 작용제"일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이의 뉴클레오티드인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결부 분석으로부터 정의된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 중합체의 조립 전 또는 후에 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 친화성 조성물은 유기 또는 무기 물질, 자기 또는 비-자기 물질일 수 있는, 증폭 및 포획을 위한 입자를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 친화성 시약은 핵산이다. 특정 실시양태에서, 표적 희귀 핵산의 서열은 문헌을 참조하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 암을 일으키는 유전 물질의 상실을 유발하는 돌연변이, 및 유전자 내 그의 위치는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press Limited (1995)]을 참조한다. 돌연변이 및 돌연변이의 위치를 알면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 샘플 내 희귀 핵산 서열에 결합할 핵산 친화성 시약을 용이하게 설계할 수 있다.

대안적으로, 대상체로부터의 샘플이 수득되고 서열분석되어 샘플 내 희귀 핵산의 서열이 결정될 수 있다. 전형적으로, 샘플은 대상체로부터 수득된다. 샘플은 임의의 임상적으로 허용되는 방식으로 수득될 수 있고, 핵산은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 샘플로부터 추출된다. 일반적으로, 핵산은 다양한 기술, 예컨대 문헌 [Maniatis, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281, 1982)] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기재된 것에 의해 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다.

수득되면, 핵산 분자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 앙상블 서열분석 또는 단일 분자 서열분석에 의해 서열분석된다. 서열분석을 수행하는 하나의 통상적인 방법은 문헌 [Sanger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 74(12): 5463 67 (1977)]에 기재된 바와 같은 쇄 종결 및 겔 분리에 의한 것이다. 또 다른 통상적인 서열분석 방법은 핵산 단편의 화학적 분해를 포함한다. 문헌 [Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 560 564 (1977)]을 참조한다. 최종적으로, 혼성화에 의한 서열분석에 기초한 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Drmanac, et al. (Nature Biotech., 16: 54 58, 1998)]을 참조한다. 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특정 실시양태에서, 서열분석은 생어 서열분석 기술에 의해 수행된다. 전형적인 생어 서열분석은 단일 가닥 DNA 주형, DNA 프라이머, DNA 폴리머라제, 방사성 또는 형광 표지된 뉴클레오티드, 및 DNA 가닥 연장을 종결시키는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 표지가 디데옥시뉴클레오티드 종결인자 (예를 들어, 표지된 프라이머)에 부착되지 않거나, 또는 단색 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소)이면, DNA 샘플은 4종의 표준 데옥시뉴클레오티드 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 4개의 별개의 서열분석 반응으로 나누어진다. 각각의 반응에 4종의 디데옥시뉴클레오티드 (ddATP, ddGTP, ddCTP, 또는 ddTTP) 중 단지 1종만이 첨가된다. 이들 디데옥시뉴클레오티드는 DNA 가닥 연장 동안 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포디에스테르 결합의 형성을 위해 요구되는 3'-OH 기가 결여된 쇄-종결 뉴클레오티드이다. 그러나, 각각의 디데옥시뉴클레오티드가 상이한 표지를 보유하면 (예를 들어, 4종의 상이한 형광 염료), 별개의 반응이 필요없이 모든 서열분석 반응이 함께 수행될 수 있다.

신생, 즉, 연장되는 DNA 가닥 내로의 디데옥시뉴클레오티드의 혼입은 DNA 가닥 연장을 종결시켜, 다양한 길이의 DNA 단편의 네스티드 세트를 생성한다. 새로 합성되고 표지된 DNA 단편은 변성되고, 쇄 길이 내의 단일-염기 차이를 분해할 수 있는 변성 폴리아크릴아미드-우레아 겔 상의 겔 전기영동을 사용하여 크기별로 분리된다. 각각의 4개의 DNA 합성 반응물이 동일한 단색 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소)로 표지되면, 이들은 겔 내의 4개의 개별 인접 레인 중 1개에서 분리되고, 여기서 겔 내의 각각의 레인은 각 반응에 사용된 디데옥시뉴클레오티드에 따라 명명된다 (즉, 겔 레인 A, T, G, C). 4개의 상이한 표지가 이용되면, 반응물은 겔 상의 단일 레인에서 합해질 수 있다. 이어서, DNA 밴드는 자가방사선촬영 또는 형광에 의해 가시화되고, DNA 서열은 X선 필름 또는 겔 이미지로부터 직접적으로 판독될 수 있다.

말단 뉴클레오티드 염기는 그 밴드 또는 그의 상응하는 직접적 표지를 생성하는 반응에 첨가된 디데옥시뉴클레오티드에 따라 확인된다. 이어서, 겔 내의 상이한 밴드의 상대적 위치는 나타난 바와 같은 DNA 서열을 (최단에서 최장으로) 판독하는데 사용된다. 생어 서열분석 과정은 퍼킨엘머, 베크만 쿨터, 라이프 테크놀로지스 등으로부터 상업적으로 입수가능한 것과 같은 DNA 서열분석기를 사용하여 자동화될 수 있다.

다른 실시양태에서, 핵산의 서열분석은 합성 기술에 의한 단일-분자 서열분석에 의해 달성된다. 단일 분자 서열분석은, 예를 들어 [Lapidus et al. (미국 특허 번호 7,169,560), Quake et al. (미국 특허 번호 6,818,395), Harris (미국 특허 번호 7,282,337), Quake et al. (미국 특허 출원 번호 2002/0164629), 및 Braslavsky, et al., PNAS (USA), 100: 3960-3964 (2003)] (이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제시된다. 간략하게, 단일-가닥 핵산 (예를 들어, DNA 또는 cDNA)은 유동 세포의 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화된다. 올리고뉴클레오티드는 표면에 공유 부착될 수 있거나, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 공유 연결 이외의 다른 다양한 부착이 사용될 수 있다. 더욱이, 부착은 간접적일 수 있으며, 예를 들어 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 폴리머라제를 통해 일어날 수 있다. 표면은 평면이거나 그렇지 않을 수 있고/있거나, 다공성 또는 비-다공성 또는 부착에 적합한 것으로 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 유형의 표면일 수 있다. 이어서, 단일 분자 분해능에서 성장중인 가닥 표면 올리고뉴클레오티드 내로 혼입된 형광-표지된 뉴클레오티드의 폴리머라제-매개된 부가를 영상화함으로써 핵산이 서열분석된다.

[Rothberg et al. (미국 특허 번호 7,335,762, 7,264,929, 7,244,559, 및 7,211,390) 및 Leamon et al. (미국 특허 번호 7,323,305)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 바와 같이, 다른 단일 분자 서열분석 기술은 DNA의 신생 가닥 내로의 단일 뉴클레오티드의 혼입으로부터 피로포스페이트가 절단됨에 따라 그의 검출을 포함한다.

다른 실시양태에서, 표적화된 재서열분석이 사용된다. 재서열분석은, 예를 들어 [Harris (미국 특허 출원 번호 2008/0233575, 2009/0075252, 및 2009/0197257)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제시된다. 간략하게, 표적의 특정 절편이 서열분석 전에 (예를 들어 PCR, 마이크로어레이, 또는 MIPS에 의해) 선택된다. 이 특정한 절편에 혼성화되도록 설계된 프라이머가 도입되고, 프라이머/주형 듀플렉스가 형성된다. 프라이머/주형 듀플렉스가 프라이머에 대한 주형 의존성 뉴클레오티드 부가에 충분한 조건 하에서 폴리머라제 및 적어도 1개의 검출가능하게 표지된 뉴클레오티드에 노출된다. 표지된 뉴클레오티드의 혼입, 뿐만 아니라 혼입된 뉴클레오티드의 반대편 위치에 있는 주형 상의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 정체가 결정된다.

중합 반응 후에, 프라이머는 듀플렉스로부터 제거될 수 있다. 프라이머는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 듀플렉스가 용융되도록 표면 또는 기질의 온도를 상승시킴으로써, 또는 듀플렉스를 불안정화시키기 위해 완충제 조건을 변화시킴으로써, 또는 그의 조합에 의해 제거될 수 있다. 주형/프라이머 듀플렉스를 용융시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [chapter 10 of Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3.sup.rd Edition, J. Sambrook, and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Press (2001)] (이의 교시는 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

프라이머를 제거한 후, 주형은 주형에 혼성화될 수 있는 제2 프라이머에 노출될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 프라이머는 제1 프라이머와 동일한 주형 영역 (또한 제1 영역으로 본원에서 지칭됨)에 혼성화되어, 주형/프라이머 듀플렉스를 형성할 수 있다. 이어서, 중합 반응이 반복되어, 주형의 적어도 일부분이 재서열분석된다.

샘플로부터의 핵산이 분해되거나 또는 샘플로부터 단지 최소량의 핵산만이 수득될 수 있는 경우에는, 서열분석에 충분한 양의 핵산을 수득하기 위해 핵산에 대해 PCR이 수행될 수 있다 (예를 들어, [Mullis et al. 미국 특허 번호 4,683,195] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).

희귀 핵산의 서열이 공지되어 있다면, 핵산 친화성 시약은 관련 기술분야에서 상용인 핵산 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (DNA microarray: A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003) 또는 Maniatis, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 적합한 방법은 또한 문헌 [Caruthers (Science 230:281-285, 1985)] (이의 내용은 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 상업적 공급원, 예컨대 오페론 테크놀로지스, 아머샴 파마시아 바이오테크, 시그마, 및 라이프 테크놀로지스로부터 입수될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 동일한 용융 온도를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 목적하는 용융 온도를 갖는 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 5' 말단 또는 3' 말단에서 연장 또는 단축될 수 있다. 또한, 각각의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 위치는 핵산 친화성 시약의 서열 및 길이가 목적하는 용융 온도를 생성하도록 설계될 수 있다. 25개 염기 쌍보다 더 작은 핵산 친화성 시약의 용융 온도를 결정하기 위한 가장 단순한 방정식은 월리스 규칙 (Td=2(A+T)+4(G+C))이다. 어레이 디자이너 소프트웨어 (어레이잇 인크.), 유전자 분석을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 서열 설계 소프트웨어 (올림푸스 옵티칼 캄파니), 네트프라이머, 및 히타치 소프트웨어 엔지니어링으로부터의 DNAsis를 포함하나 이에 제한되지는 않는 컴퓨터 프로그램이 또한 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용될 수 있다. 각각의 프로브의 TM (용융 온도)은 인비트로젠 코포레이션으로부터 입수가능한 소프트웨어 프로그램, 예컨대 올리고 디자인을 사용하여 계산된다

다른 실시양태에서, 친화성 시약은 항체일 수 있다. 항체가 결합하는 항원은 공개된 문헌으로부터 결정될 수 있다. 항혈청의 생산을 위해 동물을 선택할 때 고려되는 기준을 포함한, 항체 생산을 위한 일반적 방법론은 문헌 [Harlow et al. (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 93-117, 1988)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 크기의 동물, 예컨대 염소, 개, 양, 마우스 또는 낙타가 면역 반응을 생성하는데 효과적인 양의 면역원의 투여에 의해 면역화된다. 예시적인 프로토콜은 하기와 같다. 동물에게 동물의 크기에 따라 아주반트, 예를 들어 프로인트 완전 아주반트 중에 재현탁된 100 밀리그램의 항원을 주사하고, 이어서 3주 후에 동물의 크기에 따라 아주반트, 예를 들어 프로인트 불완전 아주반트를 함유하는 100 마이크로그램 내지 100 밀리그램의 면역원을 피하 주사한다. 동물의 혈액 중 적합한 역가의 항체가 달성될 때까지 2주마다 아주반트, 예를 들어 프로인트 불완전 아주반트를 함유하는 추가의 피하 또는 복강내 주사를 투여한다. 예시적인 역가는 적어도 약 1:5000의 역가 또는 1:100,000 또는 그 초과의 역가, 즉, 검출가능한 활성을 갖는 희석을 포함한다. 항체는, 예를 들어 단백질 G 수지 또는 표적-특이적 친화성 수지를 함유하는 칼럼 상의 친화도 정제에 의해 정제된다.

인간 림프구의 시험관내 면역화 기술이 모노클로날 항체를 생성하는데 사용된다. 인간 림프구의 시험관내 면역화를 위한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Inai, et al., Histochemistry, 99(5):335 362, May 1993; Mulder, et al., Hum. Immunol., 36(3):186 192, 1993; Harada, et al., J. Oral Pathol. Med., 22(4):145 152, 1993; Stauber, et al., J. Immunol. Methods, 161(2):157 168, 1993; 및 Venkateswaran, et al., Hybridoma, 11(6) 729 739, 1992]을 참조한다. 이들 기술은 항원-특이적 IgG 및 IgM 모노클로날 항체를 포함한, 항원-반응성 모노클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 접합체 모이어티는 압타머이다. 본원에 사용된, "압타머" 및 "핵산 리간드"는 표적 분자, 예컨대 단백질에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 핵산을 지칭하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 모든 핵산과 같이, 특정한 핵산 리간드는 전형적으로 15-40개 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 (A, U, T, C 및 G)의 선형 서열에 의해 설명될 수 있다. 핵산 리간드는 특정 질환의 존재 또는 부재와 연관된 것으로 공지된 표적 단백질의 상보적 서열을 코딩하도록 조작될 수 있다.

용액 중, 뉴클레오티드의 쇄는 분자를 복잡한 3차원 형상으로 폴딩하는 분자내 상호작용을 형성한다. 핵산 리간드의 형상은 그를 그의 표적 분자의 표면에 단단히 결합하게 한다. 주목할 만한 특이성을 나타내는 것에 추가로, 핵산 리간드는 일반적으로 그의 표적에 매우 높은 친화도로 결합하며, 예를 들어 대다수의 항-단백질 핵산 리간드는 피코몰 내지 낮은 나노몰 범위의 평형 해리 상수를 갖는다.

본 발명의 조성물에 사용된 압타머는 표적 조직에 좌우된다. 핵산 리간드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 발견될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 리간드는 SELEX (지수적 풍부화에 의한 리간드의 체계적 진화)로 지칭되는 시험관내 선택 과정을 사용하여 발견된다. 예를 들어, [Gold et al. (미국 특허 번호 5,270,163 및 5,475,096)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. SELEX는 핵산의 큰 풀로부터 선택된 분자 표적에 대한 핵산 리간드를 확인하는데 사용되는 반복 과정이다. 과정은 표적 분자에 대한 가장 높은 친화도를 갖는 핵산 리간드를 분해하기 위해 핵산 리간드의 선택, 분할 및 증폭의 다중 회차를 사용하는 표준 분자의 생물학적 기술에 의존한다. SELEX 방법은 리간드에 개선된 특징, 예컨대 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특징을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 고친화도 핵산 리간드의 확인을 포괄한다. 이러한 변형의 예는 리보스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 기초적 SELEX 방법에 대한 수많은 개선이 존재하였으며, 이들 중 어느 것은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 리간드를 발견하는데 사용될 수 있다.

"희귀 분자"는 샘플 내 비-희귀 분자의 양과 비교할 때 비교적 소량으로 샘플에 존재하는 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 희귀 분자는 희귀 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내 총 분자 집단의 약 10^-8% 내지 약 10^-2% (중량 기준)의 양으로 존재한다. 희귀 분자는 무세포 순환 분자, 또는 희귀 세포, 예컨대 악성 세포, 예컨대 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 상피 세포; 중간엽 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵구); 줄기 세포; 유핵 적혈구 (적혈모구 또는 적모구); 및 미성숙 과립구에서 발견되는 분자일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 희귀 분자는, 예를 들어 PCT/US2016/053610 (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다.

비-희귀 분자는 샘플 내 희귀 분자의 양과 비교할 때 비교적 다량으로 존재하는 그러한 분자이다. 일부 예에서, 비-희귀 분자는 비-희귀 분자 및 희귀 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내 총 분자 집단 중 희귀 분자의 양보다 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 10²배, 또는 적어도 약 10³배, 또는 적어도 약 10⁴배, 또는 적어도 약 10⁵배, 또는 적어도 약 10⁶배, 또는 적어도 약 10⁷배, 또는 적어도 약 10⁸배 더 많다. 비-희귀 분자는 무세포 순환 비-희귀 분자, 또는 비-희귀 세포, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 백혈구, 혈소판 및 적혈구에서 발견되는 비-희귀 분자일 수 있다.

용어 "희귀 분자"는, 예를 들어 항원, 단백질, 펩티드, 호르몬, 비타민, 알레르겐, 자가면역 항원, 탄수화물, 지질, 당단백질, 보조-인자, 항체, 효소, 효소 기질, 대사물, 핵산, 항체, 유기 아민, 지방산, 탄수화물, 시클릭 탄화수소, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 유기 카르복실산, 유기 아민, 세라민, 세레브로시드, 스테로이드, 프로스타글란딘, 탄수화물, 뉴클레오시드 및 치료 약물, 및 예를 들어 다른 생체분자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 암, 심장 손상, 심혈관 질환, 신경계 질환, 지혈/혈류정지, 태아 모체 평가, 생식능, 골 상태, 호르몬 수준, 비타민, 알레르기, 자가면역 질환, 고혈압, 신장 질환, 당뇨병, 간 질환, 감염성 질환의 검출을 위한 바이오마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환의 의료 진단에 유용한 생체분자, 및 예를 들어 질환의 의료 진단에 유용한 다른 생체분자를 포함한다. 바이오마커는, 예를 들어 세포, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균 및 원충; 악성 세포, 예컨대 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 종양 세포; 순환 암 줄기 세포; 순환 암 중간엽 세포; 순환 상피 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵구); 및 줄기 세포로부터의 것일 수 있다.

희귀 세포의 표적 희귀 분자는, 예를 들어 암 세포 유형 바이오마커, 종양단백질 및 종양유전자, 내화학성 바이오마커, 전이 잠재성 바이오마커, 및 세포 타이핑 마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암 세포 유형 바이오마커는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 시토케라틴 (CK) (CK1, CK2, CK3, CK4, CKS, CK6, CK7, CK8 및 CK9, CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 및 CK2), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), N-카드헤린, E-카드헤린 및 비멘틴을 포함한다. 돌연변이로 인해 치료 관련성을 가질 가능성이 있는 종양단백질 및 종양유전자는, 예를 들어 WAF, BAX-1, PDGF, JAGGED 1, NOTCH, VEGF, VEGHR, CAlX, MIB1, MDM, PR, ER, SELS, SEM1, PI3K, AKT2, TWIST1, EML-4, DRAFF, C-MET, ABL1, EGFR, GNAS, MLH1, RET, MEK1, AKT1, ERBB2, HER2, HNF1A, MPL, SMAD4, ALK, ERBB4, HRAS, NOTCH1, SMARCB1, APC, FBXW7, IDH1, NPM1, SMO, ATM, FGFR1, JAK2, NRAS, SRC, BRAF, FGFR2, JAK3, RA, STK11, CDH1, FGFR3, KDR, PIK3CA, TP53, CDKN2A, FLT3, KIT, PTEN, VHL, CSF1R, GNA11, KRAS, PTPN11, DDR2, CTNNB1, GNAQ, MET, RB1, AKT1, BRAF, DDR2, MEK1, NRAS, FGFR1, 및 ROS1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

내포 세포 타이핑 마커는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 CD136, CD105/엔도글린, CD144/VE-카드헤린, CD145, CD34, Cd41 CD136, CD34, CD90, CD31/PECAM-1, ESAM, VEGFR2/Fik-1, Tie-2, CD202b/TEK, CD56/NCAM, CD73/VAP-2, 클라우딘 5, Z0-1, 및 비멘틴을 포함한다.

전이 잠재성 바이오마커는 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 (uPA), 플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI-1), CD95, 세린 프로테아제 (예를 들어, 플라스민 및 ADAM); 세린 프로테아제 억제제 (예를 들어, 비쿠닌); 매트릭스 메탈로프로테이나제 (예를 들어, MMP9); 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예를 들어, TIMP-1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 내화학성 바이오마커는, 제한이 아닌 예시로서, PL2L piwi 유사, 5T4, ADLH, β-인테그린, α6 인테그린, c-kit, c-met, LIF-R, CXCR4, ESA, CD 20, CD44, CD133, CKS, TRAF2 및 ABC 수송체, 암 줄기 세포에 대한 지표인 CD34를 함유하지만 CD45 또는 CD31이 결여된 암 세포; 및 CD44를 함유하지만 CD24가 결여된 암 세포를 포함한다.

본원의 방법에서, 백혈구는 비-희귀 세포로서 제외될 수 있다. 예를 들어, 백혈구 상에 존재하는 마커, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 CD45, CTLA-4, CD4, CD6S 및 CDS는 세포가 관심 희귀 세포가 아님을 나타내는데 사용될 수 있다. 특정한 비제한적 예에서, 원래 백혈구 공통 항원이라 불리는 CD45 항원 (또한 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C 또는 PTPRC로도 공지됨)은 모든 백혈구를 검출하는데 유용하다.

추가적으로, CD45는 희귀 세포로 간주될 수 있는 상이한 유형의 백혈구를 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 과립구는 CD45+, CD15+로 나타내어지고; 단핵구는 CD45+, CD14+에 의해 나타내어지고; T 림프구는 CD45+, CD3+로 나타내어지고; T 헬퍼 세포는 CD45+, CD3+, CD4+로 나타내어지고; 세포독성 T 세포는 CD45+, CD3+, CDS+로 나타내어지고; β-림프구는 CD45+, CD19+ 또는 CD45+, CD20+로 나타내어지고; 혈전구는 CD45+, CD61+로 나타내어지고; 자연 킬러 세포는 CD16+, CD56+ 및 CD3-으로 나타내어진다. 추가로, 2개의 공통적으로 사용되는 CD 분자, 즉, CD4 및 CD8은 일반적으로, 각각 헬퍼 및 세포독성 T 세포에 대한 마커로서 사용된다. 이들 분자는 CD3+와 조합되어 정의되는데, 일부 다른 백혈구가 또한 이들 CD 분자를 발현하기 때문이다 (일부 대식세포는 낮은 수준의 CD4를 발현하고; 수지상 세포는 높은 수준의 CDS를 발현함).

다른 경우에 희귀 세포는 병원체이며, 이는 그람-양성 박테리아 (예를 들어, 엔테로코쿠스 종 군 B 스트렙토코구스, 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 종 스트렙토코쿠스 비리단스, 스타필로코쿠스 아우레우스 및 사프로피티쿠스, 락토바실루스 및 그의 내성 균주); 예를 들어 칸디다 알비칸스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 효모; 그람-음성 박테리아, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에, 시트로박터 코세리, 시트로박터 프레운디이, 클레브시엘라 옥시토카, 모르가넬라 모르가니이, 슈도모나스 프로테우스 미라빌리스, 세라티아 마르세센스 및 디프테로이드 (gnb) 및 그의 내성 균주; 바이러스, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 HIV, HPV, Flu 및 MERSA; 및 성 매개 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 희귀 세포 병원체를 검출하는 경우에, 희귀 세포 병원체 집단에 결합하는 결합 파트너를 포함하는 입자 시약이 첨가된다. 추가적으로, 병원체 상의 세포 표적 희귀 분자의 각각의 집단의 경우, 집단 내 세포 표적 희귀 분자에 결합하는 세포 표적 희귀 아에루기노사, 분자에 대한 결합 파트너를 포함하는 시약이 첨가된다.

어구 "비-세포 표적 희귀 분자"는 세포에 결합되지 않고/거나 샘플에서 자유롭게 순환하는 표적 희귀 분자를 지칭한다. 이러한 비-세포 표적 희귀 분자는, 예를 들어 암, 심장 손상, 심혈관 질환, 신경계 질환, 지혈/혈류정지, 태아 모체 평가, 생식능, 골 상태, 호르몬 수준, 비타민, 알레르기, 자가면역 질환, 고혈압, 신장 질환, 당뇨병, 간 질환, 감염성 질환의 검출을 위한 바이오마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환의 의료 진단에 유용한 생체분자, 및 질환의 의료 진단에 유용한 다른 생체분자를 포함한다.

"MS 표지 전구체"는 변경 작용제의 작용에 의해 MS 표지를 생성하는 임의의 분자이다. MS 표지 전구체는 그 자체가, 변경 작용제의 작용을 통해, 예를 들어 절단에 의해, 모이어티와의 반응에 의해, 유도체화에 의해, 또는 분자, 전하 또는 원자의 부가 또는 차감에 의해, 또는 상기의 둘 이상의 조합에 의해 또 다른 MS 표지로 전환되는 MS 표지일 수 있다. MS 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함한다.

"질량 표지" 표지는 "전하 유닛" 및 "질량 유닛"을 포함한다.

"전하 유닛"은 원자 중 하나가 형식 전하를 보유하는 방식으로 배열된 원자단을 포함한다. 도 2에 제시된 구조는 적어도 1개의 전하 유닛 X를 포함하며, 이는 예를 들어 N-R 모이어티, 예컨대 4급 암모늄 양이온일 수 있거나, 또는 적어도 1개의 X는 4급 포스포늄 양이온이고, 여기서 X= P-R이고 R은 수소, 알킬 또는 방향족 유기 유도체, 예컨대 메틸, 벤질 또는 페닐일 수 있다. 예는 카르니틴, 이미다졸륨, 피리디늄, 테트라 에틸 아민, 벤즈알코늄 아민, 알킬 벤제토늄 아민, 트리페닐 포스포늄 양이온 트리알킬(2,3-디히드록시프로필) 포스포늄 염 또는 다른 4차 구조를 포함한다.

용어 "질량 유닛"은 도 3에 Y로 제시된 적어도 1개의 원자, 예컨대 CH, CH₂, O, N, S, P 또는 3a 및 3b에 제시된 페닐 기와 같은 3 kDA 미만의 합한 질량을 갖는 원자의 집합을 포함하며, "전하 유닛"에 부착된다. 가변 질량 유닛은, 예를 들어 질량이 치환 및 쇄 크기에 달라질 수 있는, 예를 들어 폴리펩티드, 중합체, 카르복실산, 탄수화물, 시클릭 고리, 방향족 고리, 탄화수소, 유기 아민, 핵산 및 유기 알콜과 같은 정의된 질량의 구조를 포함할 수 있다. "질량 유닛"은 추가의 분자, 예컨대 방향족 고리, 펩티드, 지방산, 탄수화물, 유기 아민, 핵산 및 유기 알콜 (예를 들어, 알킬 알콜, 아실 알콜, 페놀, 폴리올 (예를 들어, 글리콜), 티올, 에폭시드, 1급, 2급 및 3급 아민, 인돌, 3급 및 4급 암모늄 화합물, 아미노 알콜, 아미노 티올, 페놀계 아민, 인돌 카르복실산, 페놀산, 비닐족체 산, 카르복실산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 카르복실산 아미드, 폴리아미드 및 폴리에스테르로부터의 카르복실산, 히드라존, 옥심, 트리메틸실릴 엔올 에테르, 카르바메이트, 우레아, 구아니딘, 이소시아네이트, 술폰산, 술폰아미드, 술포닐우레아, 술페이트 에스테르, 모노글리세리드, 글리세롤 에테르, 스핑고신을 포함할 수 있으며, 이는 본원에 기재된 원리에 따른 방법이 한번에 1가지 초과의 결과를 얻도록 멀티플렉스화되게 한다.

"4차 구조" 및 "질량 구조"는 단편화에 대한 저항성이 있는 결합, 예컨대 C-C, C-O, C-N 또는 다른 공유 결합을 통해 부착되어야 한다. 예를 들어, 도 4에 제시된 카르니틴은 펩티드 질량 표지에 부착되는 카르복실산을 가지며, 예컨대 L-카르니틴-Phe-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys, L-카르니틴-Phe-Thr-Ala-Ser-Ala-Cys, L-카르니틴-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys, L-카르니틴-Phe-Phe-Ala-Ser-Cys, L-카르니틴-phe-gly-gly-ser-cys, L-카르니틴-phe-phe-ser-gly-cys, L-카르니틴-phe-gly-thr-thr-cys, L-카르니틴-phe-gly-thr-ala-cys, 카르니틴-arg-gly-cys 및 카르니틴-phe-cys이다. 또 다른 예에서 4원 질량 표지의 메틸이미다졸륨 및 피리디늄 유사체는 도 5에 제시된 바와 같이 -CH₂- 결합을 통해 방향족 질량 표지에 연결된다.

질량 표지는, 예를 들어 도 3 패널 A-D에 제시된 바와 같은 아세탈 또는 케탈 결합과 같은 가역적 결합 형성을 용이하게 하는 표지 결합 유닛을 사용하여 친화성 시약 또는 희귀 분자에 부착될 수 있다. 도 6은 R에 의해 나타내어지는 친화성 시약 또는 희귀 분자가 아세탈 또는 케탈 결합을 통해 4원 질량 표지에 어떻게 연결되는지를 제시한다. 이 경우에 표지 결합 유닛은 아민의 변형에 의해 생성되는 디올이다. 이 변형은 아민과 β-히드록시-γ-부티로락톤과의 반응에 의해 수행될 수 있다. 다른 가역적 연결 화학은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 조성물에 적합하며, 예컨대, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0294952 및 2016/0086781 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것이다.

이들 아세탈 또는 케탈 결합은 수성 산 노출시에 가수분해에 의해 파괴되며, 수성 산은 이 경우 방출 시약으로 지칭된다. 예를 들어, 용매 아세토니트릴 또는 산 함유 물은 아세탈 또는 케탈 결합을 파괴하고 분석을 위해 질량 표지를 유리시킬 것이다. 아세탈 또는 케탈 결합이 친화도 반응에 사용된 액체에 대한 노출에 의해 조기에 파괴되지 않고 보관 동안 안정하다는 것은 중요하다. 일반적으로, 표지 결합 유닛과 질량 표지 사이의 결합은, 예를 들어 어느 것이 적합한지에 따라 열, 초음파처리 또는 화학 시약, 예컨대 산일 수 있는 임의의 적합한 방출 시약으로 파괴될 수 있다. 방출 시약은 또한, 화학적 작용제, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 산, 촉매 (예를 들어, 효소 (유사효소 포함) 및 금속), 산화제, 환원제, 산, 염기, 또는 아세탈 또는 케탈 결합의 파괴를 촉진하는 다른 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

1개 이상의 질량 표지가 단일 친화성 시약에 부착될 수 있으며, 예컨대 1 내지 3000개의 질량 표지 중 임의의 수가 임의의 단일 친화성 시약에 부착될 수 있다. 1개 초과의 질량 표지가 단일 친화성 유닛에 결합되는 것의 이점은 신호 증폭을 생성하는 능력이다. 주로, 이러한 접근법은, MS에 의해 측정시 다수의 개별 분자가 생성되고, 신호에 생성된 개별 분자의 수를 곱하기 때문에, 신호를 증폭시킨다. 그것은 표적이 단지 샘플의 1% 미만으로 존재할 수 있는 희귀 사건 검출에 중요할 수 있다.

4원 질량 표지는 이온화시에 배경으로부터 분석적으로 분리된 적어도 1개의 예측가능한 질량으로의 단편화로 인해 고유 질량 단편을 생성한다. 질량 표지 및 그의 생성물 이온은 질량 분광계 내부에서 검출된다. 도 5는 메틸이미다졸륨 및 피리디늄에 대한 각 단편화 경로를 제시한다. 도 7은 보다 높은 분자량 유도체에 대한 단편화 경로를 제시한다. 4원 질량 표지의 분자량은 고유 질량 단편이 배경 성분의 질량과 중첩되는 영역에 있지 않도록 조정된다. 도 5는 4차 구조로서의 메틸이미다졸륨 (m/z 217) 및 피리디늄 (m/z 214) 및 방향족 질량 구조 (m/z 135)를 갖는 그러한 4원 질량 표지를 제시한다. 4원 질량 표지는 제시되어 있는 충돌 유도된 해리시에 단편화로 인해 고유 질량 단편을 생성하며, 이는 메틸이미다졸륨 (m/z 83) 및 피리디늄 (m/z 80)으로 나타내어진다. 도 7은 이미다졸륨의 고분자량 유도체 (m/z 309 및 m/z 259)를 갖는 그러한 4원 질량 표지를 제시한다. 이들 4원 질량 표지는 이온화시에 단편화로 인해 보다 높은 질량 단편 (m/z 175 및 m/z 125)을 생성한다.

전구체 질량 표지의 1개 이상의 단편 (생성물 이온)으로의 단편화의 예측가능성은 질량 표지의 화학 구조에 좌우될 것이다. 탄소 기재 질량 표지의 경우, 예측가능성은 특정 규칙을 따른다. 예를 들어, 탄소양이온의 안정성의 순서가 존재한다: 1급 < 2급 < 3급, 여기서 1급 이온은 2급 이온보다 덜 안정하고, 차례로 2급 이온은 3급 이온보다 덜 안정하다. 이러한 논리를 단편화 패턴에 적용하면, 2급 탄소양이온을 생성하는 분할은 1급 이온을 생성하는 분할보다 더 성공적일 것임을 의미한다. 3급 탄소양이온을 생성하는 분할은 훨씬 더 성공적일 것이다. 카르보닐 기 C=O의 탄소 상에 양전하를 갖는 이온은 또한 비교적 안정하다.

전형적으로, 구조는 하기 규정을 사용하여 분석될 것이다. 대부분의 단편은 짝수-전자 양이온이다. 이들은 분할되어 보다 많은 짝수-전자 양이온을 만든다. 주어진 결합을 절단할 확률은 결합 강도, 및 형성된 단편의 안정성과 관련된다. 주어진 분자에 대해 형성될 가장 가능성 있는 이온을 예측할 때 명심해야 할 10가지 일반적 규칙은 하기와 같다.

1) M+ 피크의 상대 높이는 직쇄 분자에서 가장 크고 분지화가 증가함에 따라 감소한다.

2) M+ 피크의 상대 높이는 동종 계열에 대해 쇄 길이와 함께 감소한다.

3) 절단은 알킬-치환된 탄소에서 유리하며, 절단의 확률은 치환이 증가함에 따라 증가한다.

이들 규칙은 대부분 탄소양이온 및 라디칼 안정성이 하기 경향을 나타낸다는 사실로부터 비롯된다: (가장 안정함) 벤질계 > 알릴 > 3급 > 2급 >> 1급 (최소 안정함, "스티븐슨 규칙"). 파괴 지점에서, 보다 큰 단편은 통상적으로 보다 작은 양이온을 남기기 위해 라디칼을 취한다.

4) 이중 결합, 시클릭 구조, 및 특히 방향족 고리는 분자 이온을 안정화시키고 그의 출현 확률을 증가시킬 것이다.

5) 이중 결합은, 특히 시클로알켄의 경우 공명 안정화된 알릴 탄소양이온을 생성하기 위해 알릴 절단을 선호한다.

6) 포화 고리 (예컨대 시클로헥산)의 경우, 측쇄가 먼저 절단되어 고리와 함께 양전하를 남기는 경향이 있다.

7) 불포화 고리는 또한 중성 알켄을 제거하기 위해 레트로-딜스-알더 반응을 겪을 수 있다.

8) 방향족 화합물은 절단되어 벤질계 양이온, 또는 보다 가능성 있게는 트로필륨 양이온을 생성하는 경향이 있다.

9) 헤테로원자 옆의 C-C 결합은 종종 파괴되어 헤테로원자와 함께 탄소 상에 양전하를 남긴다.

10) 절단은 그것이 물, CO, NH₃, H₂S 등과 같은 작은 안정한 분자를 배출시킬 수 있는 경우에 종종 선호된다.

결합 단편화에 추가로, 다양한 분자내 재배열이 일어나 때때로 예상외의 이온을 생성할 수 있다. MS에서 재배열의 한 흔한 유형은 카르보닐 기를 함유하는 화합물에서 일어나는 맥래퍼티 재배열이다.

일반적 규칙 1-3은 탄화수소에 잘 적용된다. 재배열은 흔하지만 통상적으로 강한 피크를 생성하지 않는다. 단편화 패턴은 14 질량 유닛 (CH₂ 기)에 의해 분리된 피크를 특징으로 할 수 있다. 가장 강한 피크는 C3 - C5 단편이다. 분지형 포화 탄화수소에 대한 MS는 유사하며, 예외로 특정 단편은 보다 현저해진다. 시클릭 탄화수소는 훨씬 더 강한 M+ 이온을 나타내며 (규칙 4) 2개의 결합은 단편을 형성하기 위해 파괴되어야 한다. 알켄의 M+ 피크를 보는 것은 통상적으로 용이하다. 비-시클릭 알켄에서, 이중 결합은 단편에서 자유롭게 이동하므로, 이중 결합 위치를 결정하는 것이 어려울 수 있지만, 시클릭 알켄의 경우에는 보다 용이하다. 절단은 통상적으로 알릴 결합에서 일어난다 (규칙 5). 방향족 탄화수소는 통상적으로 강한 M+ 피크를 나타낸다 (규칙 4). 방향족 고리는 안정하고, 단편화되는 경향이 보다 낮다. 알킬 치환된 벤젠은 종종 벤질계 절단으로 인해 m/z 91에서 강한 피크를 생성한다 (규칙 8).

알콜은 매우 용이하게 단편화되며 - 2급 및 1급 알콜은 매우 약한 M+ 피크를 나타내고, 3급 알콜은 종종 M+를 전혀 나타내지 않는다. MW는 종종 유도체화에 의해 결정된다. OH에 가장 가까운 C-C 결합은 빈번하게는 파괴될 제1 결합이다. 따라서 1급 알콜은 종종 31 m/z에서 현저한 피크를 나타낸다. 2급 알콜은 동일한 방식으로 절단되며, 종종 현저한 ⁺CHR-OH 피크를 나타낸다. 때때로 1° 및 2° 알콜에서 R₂CH-OH의 수소가 알킬 기보다 오히려 절단된다. 결과는 M-1 피크이다. 3급 알콜은 유사한 방식으로 절단되어 ⁺CRR-OH 단편을 생성한다. 알콜은 물 분자를 상실하여 때때로 현저한 M-18 피크를 나타낼 수 있다. 그것은 특히 1급 알콜에 대해 주목할 만하다. 벤질계 알콜은 지방족 알콜과 매우 상이하게 단편화된다. 벤질계 절단은 예상된 바와 같이 일어난다 (규칙 8). 벤질계 알콜은 통상적으로 물을 상실한다 (M-18). M-18 피크는 물의 상실이 기계론적으로 간단한 분자에 대해 특히 강하다. 페놀은 종종 페닐 양이온의 형성으로부터 유발되는 77 m/z에서의 피크를 나타내고, CO의 상실 (M-28) 및 CHO의 상실 (M-29)로부터 유발되는 피크는 페놀에서 통상적으로 발견된다. 대안적인 매력적 절단 경로도 이용가능하다.

에테르의 경우, 절단은 다음 2가지 주요 방식으로 일어난다: O 옆의 C-C 결합의 파괴 (알콜과 같이); 또는 C 단편 상에 전하를 갖는 C-O 결합 절단. 방향족 에테르의 경우, M+는 통상적으로 강하다. MS는 페놀과 유사하며 - 둘 다 페녹실 양이온 (m/z 93) 및 회합된 딸을 형성한다.

케톤은 통상적으로 강한 M+ 피크를 생성한다. 주요 단편화 경로는 α-절단을 포함하여 아실륨 이온을 생성한다. 카르보닐-함유 단편은 또한 라디칼을 취할 수 있다. 장쇄를 갖는 케톤의 경우, 맥래퍼티 재배열은 종종 강한 피크를 유도한다. 방향족 케톤의 경우, M+는 분명하다. 주요 절단은 카르보닐에 대한 α로 강한 ArCO+ 피크를 생성한다 (Ar = Ph인 경우 m/z 105). 이것은 CO를 상실하여 페닐 양이온 (m/z 77)을 생성한다.

알데히드는 약하지만 식별가능한 M+ 피크를 나타낸다. 주요 경로는 α-절단 및 맥래퍼티 재배열이다. 방향족 알데히드는 방향족 케톤과 유사하다. M+는 강하고, M-1 (카르보닐에 대한 α - 절단)도 또한 강하여 ArCO+ 이온을 생성한다 (Ar = Ph인 경우 m/z 105). 이 이온으로부터의 CO의 상실은 m/z77 페닐 양이온을 생성하는데 공통된다.

카르복실산의 경우, M+는 약하며 항상 가시적인 것은 아니다. 특징적인 m/z 60 피크는 종종 맥래퍼티 재배열로 인해 존재한다. 카르보닐에 대한 α 결합은 또한 빈번하게 파괴되어 M-OH 및 M-CO₂H 피크를 생성한다.

방향족 산의 경우, M+는 매우 현저하다. 공통 피크는 OH의 상실 (M-17) 및 CO₂H의 상실 (M-45)이다. 오르토 수소-보유 기가 존재하는 경우에, 물의 상실 (M-18)은 또한 가시적이다.

지방족 에스테르의 경우, M+는 통상적으로 특유하다. 가장 특징적인 피크는 맥래퍼티 재배열로 인한 것이다. RO 쇄가 장쇄가 아닌 한, M+는 통상적으로 현저하다. 기준 피크는 RO·의 상실이다. 맥래퍼티 재배열은 상응하는 산을 생성한다. 보다 복잡한 재배열은 종종 현저한 산+1 피크를 생성한다.

지방족 모노아민은 홀수 및 약한 M+ 피크를 갖는다. 가장 중요한 절단은 통상적으로 C-N 결합 옆의 C-C 결합의 파괴이다. 거의 모든 1급 아민에서의 기준 피크는 30 m/z에서 나온다. 방향족 아민의 경우, M+는 강하다. NH 결합은 파괴되어 중간 정도로 강한 M-1 피크를 생성할 수 있다. 공통 단편화는 HCN 및 H₂CN의 상실로 65 및 66 m/z에서 피크를 생성한다. 알킬 치환된 방향족 아민은 전형적으로 C-N 옆의 C-C 결합의 파괴를 나타내어 Ar = Ph인 경우 106에서 강한 피크를 생성한다.

1급 아미드는 R-CONH₂ 결합의 파괴로 인해 m/z 44에서 강한 피크를 생성한다. 지방족 아미드 - M+는 약하지만 식별가능하다. 3개 초과의 탄소의 직쇄 아미드의 경우, 맥래퍼티는 m/z 59에서 기준 피크를 생성한다.

니트릴의 경우, M+는 약하거나 지방족 니트릴의 경우에 부재한다. α- 수소의 상실은 약한 M-1 피크를 생성할 수 있다. 기준 피크는 통상적으로 맥래퍼티와 같은 재배열로 인해 41이다. 이것은 (C3H5+)가 동일한 질량을 갖기 때문에 제한된 진단 값을 갖는다.

지방족 니트로 화합물은 약한 홀수 M+를 갖는다. 주요 피크는 M-NO₂까지의 탄화수소 단편이다. 방향족 니트로 화합물의 경우, M+는 강하다. 현저한 피크는 M-46 피크를 생성하는 NO₂ 라디칼의 상실로부터 유발된다. 또한 NO의 상실로부터 M-30이 현저하다.

도 9는 질량 분광계에서 펩티드 질량 표지의 단편화를 예측하는 과정을 설명한다. 펩티드 (아미노산 쇄)의 단편화는 전형적으로 펩티드 백본을 따라 일어난다. 펩티드 쇄의 각각의 잔기는 N->C 및 C->N 방향 둘 다로 연속적으로 단편화되어 나간다. 아미노산은 그의 측쇄가 상이하다. 도 9에 제시된 바와 같이, 각각의 아미노산은 상이한 측쇄에 기초하여 가장 약한 결합을 가지며, 이는 펩티드의 예측가능한 단편화를 유발한다. 펩티드는 Asp (D)에서 단편화되는 경향을 갖는다 (Mass Spectrometry in Proteomics Ruedi Aebersold* and David R. Goodlett 269 Chem. Rev. 2001, 101, 269-295). 질량 분광계에서 펩티드의 단편화를 예측하는 것은 추가로 문헌 [Beardsley et al. (Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 15(2):158-167, 2004)] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 펩티드 단편화 알고리즘은 또한 상업적으로 입수가능하다. 펩티드 단편화를 예측하기 위한 예시적인 알고리즘은 문헌 [Zhang (Analytical Chemistry 76, 3908-3922, 2004) 또는 Zhang (Analytical Chemistry 77, 6364-6373, 2005)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 펩티드는 N 말단, C 말단 또는 임의의 내부 아미노산 잔기에서 표지된다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 작은 시스테인 종결된 펩티드 (예를 들어 YGMTSR*YFC, 여기서 아르기닌은 13C6 및 14N4로 완전히 표지됨)가 질량 표지로 선택될 수 있다.

용어 "변경 작용제" 또는 "방출 작용제"는 표지 결합 유닛의 결합을 파괴하여 질량 표지를 방출시키는, MS 표지 전구체를 변경하는 능력을 갖는 물질을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변경 작용제는, 약 1 Da 내지 약 3 kDa의 범위, 또는 약 1 Da 내지 약 50 Da의 범위, 또는 약 50 Da 내지 약 150 Da의 범위, 또는 약 150 Da 내지 약 700 Da의 범위, 또는 약 700 Da 내지 약 3 kDa의 범위의 고유 질량을 갖는 MS 표지를 달성하도록 MS 표지 전구체와 상호작용할 수 있다. 일부 예에서, MS 표지의 고유 질량은 약 3 kDa 미만이다. MS 표지 전구체는 결합 파괴에 의해 변경되어 중성, 음 또는 양의 이온, 또는 라디칼을 형성할 수 있다. 변경 작용제에 의한 MS 표지 전구체의 변경은 MS 표지 전구체에의 원자, 전하 또는 전자의 부가, 또는 그로부터의 원자, 전하 또는 전자의 차감에 의한 것, 또는 MS 표지 전구체 내의 결합 절단, 또는 그 내의 결합 형성에 의한 것일 수 있다. 변경 작용제는 화학적 작용제, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 촉매 (예를 들어, 효소 (유사효소 포함) 및 금속), 산화제, 환원제, 산, 염기, 치환 반응 또는 대체 반응을 촉진하는 작용제; 및 이온화제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 변경 작용제는, 예를 들어 MS 표지 전구체와 모이어티와의 반응을 촉진하여 MS 표지를 형성함으로써 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 한다. 일부 예에서, 변경 작용제는, 예를 들어 MS 표지 전구체로부터 MS 표지의 방출을 촉진함으로써 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 한다.

MS 표지 전구체의 성질은, 예를 들어 MS 표지의 성질, 사용된 MS 방법의 성질, 사용된 MS 검출기의 성질, 표적 희귀 분자의 성질, 친화성 작용제의 성질, 사용된 임의의 면역검정의 성질, 샘플의 성질, 사용된 임의의 완충제의 성질, 분리의 성질 중 1개 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, MS 표지 전구체는 질량이 치환 및/또는 쇄 크기에 의해 달라질 수 있는 분자이다. MS 표지 전구체로부터 생성된 MS 표지는 분석하고자 하는 샘플에 존재하지 않아야 하는 정의된 질량의 분자이다. 추가로, MS 표지는 MS 검출기에 의해 검출되는 범위에 있어야 하고, 중첩 질량을 가지지 않아야 하며, 1차 질량에 의해 검출가능하여야 한다. 제한이 아닌 예시로서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 MS 표지 전구체의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 폴리펩티드, 유기 및 무기 중합체, 지방산, 탄수화물, 시클릭 탄화수소, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 유기 카르복실산, 유기 아민, 핵산, 유기 알콜 (예를 들어, 알킬 알콜, 아실 알콜, 페놀, 폴리올 (예를 들어, 글리콜), 티올, 에폭시드, 1급, 2급 및 3급 아민, 인돌, 3급 및 4급 암모늄 화합물, 아미노 알콜, 아미노 티올, 페놀계 아민, 인돌 카르복실산, 페놀산, 비닐족체 산, 카르복실산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 카르복실산 아미드, 폴리아미드 및 폴리에스테르로부터의 카르복실산, 히드라존, 옥심, 트리메틸실릴 엔올 에테르, 아세탈, 케탈, 카르바메이트, 우레아, 구아니딘, 이소시아네이트, 술폰산, 술폰아미드, 술포닐우레아, 술페이트 에스테르, 모노글리세리드, 글리세롤 에테르, 스핑고신 염기, 세라민, 세레브로시드, 스테로이드, 프로스타글란딘, 탄수화물, 뉴클레오시드 및 치료 약물을 포함한다.

MS 표지 전구체는 1 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 10 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 100 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 1,000 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 10,000 내지 약 100,000개의 MS 표지를 포함할 수 있다. MS 표지 전구체는 단백질, 폴리펩티드, 중합체, 입자, 탄수화물, 핵산, 지질, 또는 부착에 의해 MS 표지의 다중 반복 유닛을 포함할 수 있는 다른 거대분자로 구성될 수 있다. 다중 MS 표지는 모든 MS 표지 전구체가 많은 MS 표지를 생성할 수 있기 때문에 증폭을 가능하게 한다.

폴리펩티드 MS 표지 전구체로, 예를 들어, 폴리펩티드의 쇄 길이를 조정하여 배경 피크 없이 질량 영역 내 MS 표지를 얻을 수 있다. 추가로, MS 표지는, 시험된 샘플에 존재하지 않는 고유 질량을 갖는 MS 표지 전구체로부터 생성될 수 있다. 폴리펩티드 MS 표지 전구체는 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 방법이 한번에 1가지 초과의 결과를 얻도록 멀티플렉스화되게 한다. 폴리펩티드 MS 표지 전구체의 예는, 예를 들어 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리시스테인, 폴리발린, 폴리류신, 폴리이소류신, 폴리메티오닌, 폴리프롤린, 폴리페닐알라닌, 폴리티로신, 폴리트립토판, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴, 폴리글루타민, 폴리히스티딘, 폴리리신 및 폴리아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 또는 유도체화된 아미노산의 혼합물에 의해 구별되는 폴리펩티드 MS 표지 전구체는 라디칼이 존재 또는 부재하는 짝수 또는 홀수의 전자 이온을 갖는 질량을 생성한다. 일부 예에서, 폴리펩티드는 촉매작용에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 제한이 아닌 예시로서, 페놀 및 방향족 아민은 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 폴리트레오닌에 부가될 수 있다. 또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 전자는 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 방향족 아민에 전달될 수 있다. 또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 포스페이트는 촉매로서 포스파타제를 사용하여 유기 포스페이트로부터 제거될 수 있다.

또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 유도체화 작용제가 모이어티로서 사용되어 MS 표지 전구체로부터 MS 표지가 생성된다. 예를 들어, 디니트로페닐 및 다른 니트로페닐 유도체가 MS 표지 전구체로부터 형성될 수 있다. 다른 예는, 제한이 아닌 예시로서, 에스테르화, 아실화, 실릴화, 보호 알킬화, 쉬프 염기와 같은 케톤-염기 축합에 의한 유도체화, 고리화, 형광 유도체 및 무기 음이온의 형성을 포함한다. 유도체화 반응은 MS 분석 전이지만 친화성 반응 후에 마이크로반응으로 일어날 수 있거나, 또는 친화성 시약에 접합된 MS 표지 전구체를 생성하는데 사용될 수 있다.

일부 예에서, MS 표지 전구체는, 예를 들어 동위원소, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 ²H, ¹³C 및 ¹⁸O를 포함할 수 있으며, 이는 MS 표지 전구체로부터 유래된 MS 표지에 남아있다. MS 표지는 이온화 후 1차 질량 또는 2차 질량에 의해 검출될 수 있다. 일부 예에서, MS 표지 전구체는 결합 절단을 유발하는 비교적 높은 잠재력을 갖는 것, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 알킬화 아민, 아세탈, 1급 아민 및 아미드이며, 이 경우 MS 표지는 라디칼이 존재 또는 부재하는 짝수 또는 홀수의 전자 이온을 갖는 질량을 생성할 수 있다. 폴리펩티드의 선택은 고유 MS 스펙트럼 서명을 생성할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 변경 작용제는 효소 (유사효소 포함)일 수 있다. 일부 예에서, 촉매작용은, 예를 들어 실리카 겔, 목탄, DEAE-셀룰로스, DEAE-세파덱스 (시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수가능한 가교된 덱스트란 겔), 셀룰로스 시트레이트, 카올리나이트, 셀룰로스 포스페이트, 산 점토, 앰버라이트 XE-97 (롬 앤드 하스에 의해 제조된 카르복실 양이온 교환 수지), 카르복시메틸 셀룰로스, 유리, 석영, 다우엑스-50, 전분 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 폴리 아미노산, 또는 아미노벤질 셀룰로스로 고정화된 수불용성 효소 유도체에 의해 일어날 수 있다. 가교제는 효소를 고정화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 가교제는, 예를 들어 글루타르알데히드, 디메틸 아디프이미데이트, 카르보디이미드, 말레산 무수물, MDA 메틸렌디아닐린, 히드라지드 및 아실 아지드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 예에서, 본원에 기재된 원리에 따른 목적을 위한 효소는, 효소 기질 (예컨대 MS 표지 전구체)로서, 비전환된 기질의 존재 하에 질량 분광계의 질량 검출기에 의해 검출되는 MS 표지로 전환될 수 있는 높은 전환율을 갖는 임의의 효소이다. 효소는 시험된 샘플에 존재해서는 안되거나, 또는 샘플에 존재하는 경우 시험 전 샘플로부터 제거되어야 한다. 이러한 목적에 적합한 효소의 예는, 예를 들어 포스파타제 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 지질 포스파타제, 티로신 포스파타제, 세린 포스파타제, 트레오닌 포스파타제 및 히스티딘 포스파타제); 옥시다제 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 구리 아민 옥시다제, D-아미노산 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 혈장 아민 옥시다제,트립토판 퍼옥시다제, 우리카제 옥시다제, 및 크산틴 옥시다제); β-갈락토시다제; 트랜스퍼라제 (예를 들어, D-알라닌 트랜스퍼라제, 글리코실 트랜스퍼라제, 아실 트랜스퍼라제, 알킬 트랜스퍼라제, 아릴 트랜스퍼라제, 단일 탄소 트랜스퍼라제, 케톤 트랜스퍼라제, 알데히드 트랜스퍼라제, 질소함유 트랜스퍼라제, 인 트랜스퍼라제, 황 트랜스퍼라제, 및 펜토실 트랜스퍼라제); 펩티다제 (예를 들어, 펩신, 파파인, 레닌 (키모신), 레닌, 트롬빈, 트립신, 매트릭스 메탈로펩티다제, 카텝신, 시스테인 프로테아제 및 카르복시펩티다제); 알돌라제 (예를 들어, 카르복실 알돌라제, 알데히드 알돌라제, 옥소산, 트립토파나제); 지방산 효소 (예를 들어, 지방산 아민 히드롤라제, 지방산 신타제, 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제), 및 상기 중 2종 이상 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 산 포스파타제, 옥시다제, β-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 아실라제, 아스파라기나제, 카탈라제, 키모트립신, 아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 인버타제, 리파제, 포스포글루코뮤타제, 리보뉴클레아제, 아세틸콜린에스테라제, 알콜 데히드로게나제, 알돌라제, 콜린에스테라제, 시트레이트 신테타제, 우레아제, 아밀글루코시다제, 카르복시펩티다제, 콜린에스테라제, 루시페라제, 리보뉴클레아제, 피루베이트 키나제, 및 서브틸로펩티다제 중 2종 이상)의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

효소에 대한 기질은 기질에 대한 효소의 작용에 의해 방출되는 MS 표지를 포함하는 MS 표지 전구체이다. 효소 기질의 일부일 수 있는 이러한 MS 표지는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 페놀 (예를 들어 p-니트로페닐 포스페이트, p-니트로페닐-β-D-갈락토시드, 아미노산, 펩티드, 탄수화물 (6-포스포-D-글루코네이트), 지방산 (아세틸-CoA), 알킬 아민, 글리세롤과 같은 기질로부터의 것); 및 나프톨 (예를 들어 p-니트로나프틸 포스페이트, p-니트로-나프틸-β-D-갈락토시드와 같은 기질로부터의 것)을 포함한다.

친화성 작용제에 부착된 모이어티로부터 MS 표지를 방출시키는데 사용될 수 있는 금속은, 예를 들어 전이 금속 (예를 들어, 팔라듐, 백금, 금, 루테늄, 로듐 또는 이리듐), 킬레이트화된 금속 (예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA), N-(2-히드록시에틸)-에틸렌디아민트리아세트산 (HEDTA), 또는 트랜스-1,2-시클로헥산디아민테트라아세트산 (CDTA)에 의해 착물화된 철, 구리, 코발트, 마그네슘), 금속 산화제 (예를 들어, 차아염소산나트륨, 과아이오딘산칼륨, 산화은, 크로뮴산, 과망가니즈산칼륨, 및 과붕산나트륨) 및 금속 환원제 (예를 들어, 수소화알루미늄리튬, 수소화붕소나트륨, 아스코르브산나트륨, 포스파이트, 및 나트륨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

MS 표지는 직접 검출될 수 있거나 또는 방출된 MS 표지가 또 다른 화합물과 추가로 반응하여 유도체 MS 표지를 형성할 수 있으며, 이것이 MS 기술에 의해 검출된다. 유도체 MS 표지는 MS 표지 전구체로부터 얻어지는 MS 표지로부터 형성되는 화합물이며, 여기서 화합물은 또한 MS 기술에 의해 검출가능하다. 유도체 MS 표지를 형성하는 이러한 접근법은 본원에 기재된 원리에 따른 방법의 멀티플렉스화 능력을 추가로 증진시킨다. 예를 들어, 방출된 페놀 또는 나프톨은 퍼옥시다제의 존재 하에 방향족 아민에 커플링될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,182,213 (이의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조). 한 예에서, 방출된 나프톨은 알칼리성 매질 중 과산화 활성 물질의 존재 하에, 예를 들어 α-페닐렌디아민 디히드로클로라이드와 같은 페닐렌디아민과 커플링되어 유도체 MS 표지를 생성한다. 멀티플렉스화는 상이한 나프톨 및/또는 상이한 페닐렌디아민을 사용하여 달성될 수 있다.

내부 표준은 질량 스펙트럼 분석의 중요한 측면이다. 일부 예에서, 희귀 표적 분자의 검출에 사용되는 MS 표지에 추가로 (내부 표준으로서) 측정될 수 있는 제2 질량 표지가 추가될 수 있다. 내부 표준은 질량에서 약간의 이동이 있는 MS 표지와 유사한 구조를 갖는다. 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 포함하는 내부 표준이 제조될 수 있다. 대안적으로, 내부 표준은, 예를 들어 동위원소 표지, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 ²H (D), ¹³C, 및 ¹⁸O를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. MS 동위원소 표지는 자연 발생 물질보다 더 높은 질량을 갖는다. 예를 들어, 동위원소 표지된 MS 표지, 예를 들어 글리세롤-C-d7, 아세트산나트륨-C-d7, 피루브산나트륨-C-d7, D-글루코스-C-d7, 중수소화 글루코스, 및 덱스트로스-C-d7은 각각 글리세롤, 아세트산나트륨, 피루브산나트륨, 글루코스 및 덱스트로스에 대한 내부 표준으로서의 기능을 할 것이다.

MS 표지 전구체 또는 변경 작용제는 결합에 의해 직접 또는 연결기의 중개를 통해 공유적으로 친화성 작용제에 부착될 수 있다 (변형된 친화성 작용제가 생성됨). 일부 실시양태에서, 변형된 친화성 작용제의 제조는, 직접 결합에 의해 친화성 작용제에 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제를 부착시키기에 적합한 관능기를 사용함으로써 수행될 수 있다. 사용되는 관능기의 성질은, 예를 들어 MS 표지 전구체의 성질, 변경 작용제의 성질, 및 예를 들어 친화성 작용제의 일부일 수 있는 캐리어 입자 및 표지 입자와 같은 1개 이상의 상이한 입자의 성질을 포함한 친화성 작용제의 성질 중 1개 이상에 좌우된다. 다수의 적합한 관능기가 아미노 기 및 알콜에의 부착에 이용가능하며; 이러한 관능기는, 예를 들어 활성화된 에스테르, 예컨대 카르복실산 에스테르, 이미드산 에스테르, 술폰산 에스테르 및 포스페이트 에스테르; 활성화된 니트라이트; 알데히드; 케톤; 및 알킬화제를 포함한다.

연결기는, 통상적으로 탄소, 산소, 황, 질소 및 인, 대개는 탄소 및 산소로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 약 60개 또는 그 초과의 원자, 또는 1 내지 약 50개 원자, 또는 1 내지 약 40개 원자, 또는 1 내지 30개 원자, 또는 약 1 내지 약 20개 원자, 또는 약 1 내지 약 10개 원자의 쇄일 수 있다. 연결기 내 헤테로원자의 수는 약 0 내지 약 8개, 약 1 내지 약 6개, 또는 약 2 내지 약 4개의 범위일 수 있다. 연결기의 원자는, 예를 들어 알킬, 아릴, 아르알킬, 히드록실, 알콕시, 아릴옥시 또는 아르알콕시 기의 형태에서 수소 이외의 원자, 예컨대, 예를 들어 탄소, 산소 및 질소 중 1개 이상으로 치환될 수 있다. 일반적으로, 특정한 연결기의 길이는 합성의 편의를 제공하도록 임의적으로 선택될 수 있으며, 단 연결된 분자가 본원에 개시된 방법과 관련된 그의 기능을 수행하는 능력을 갖는 연결기에 의해 최소의 간섭이 야기된다.

연결기는 지방족 또는 방향족일 수 있다. 헤테로원자가 존재하는 경우에, 산소는 통상적으로 탄소, 황, 질소 또는 인에 결합된 옥시 또는 옥소로서 존재할 것이고; 황은 통상적으로 티오에테르 또는 티오노로서 존재할 것이고; 질소는 통상적으로 탄소, 산소, 황 또는 인에 결합된, 통상적으로 니트로, 니트로소 또는 아미노로서 존재할 것이고; 인은 통상적으로 포스포네이트 및 포스페이트 모노- 또는 디에스테르로서, 통상적으로 탄소, 황, 산소 또는 질소에 결합될 것이다. 연결기 내에 존재하는 관능기는 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 티오아미드, 에테르, 우레아, 티오우레아, 구아니딘, 아조 기, 티오에테르, 카르복실레이트 등을 포함할 수 있다. 연결기는 또한 거대분자, 예컨대 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 및 덴드리머일 수 있다.

일부 실시양태에서, 경우에 따라 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제, 및 친화성 작용제는 비-공유적으로 함께 연결될 수 있다. 결합 쌍, 통상적으로 특이적 결합 쌍의 구성원이 사용되며, 여기서 한 구성원은 친화성 작용제에 연결되고 다른 구성원은 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결된다. 결합 쌍 구성원의 결합은 친화성 작용제 및 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제의 비-공유 연결을 유발한다. 결합 쌍 구성원은 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제 및 친화성 작용제 중 하나 또는 둘 다에 직접 연결되거나, 또는 연결기의 중개를 통해 간접 연결될 수 있으며, 이의 성질은 상기 논의되어 있다. 일부 예에서, 특이적 결합 쌍의 구성원, 예컨대, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 아비딘 (스트렙타비딘)-비오틴 결합, 플루오레세인 (FITC) 및 FITC에 대한 항체, 로다민 (텍사스 레드) 및 로다민에 대한 항체, 디기토닌 (DIG) 및 DIG에 대한 항체, 비-인간 종 항체 (예를 들어, 염소, 토끼, 마우스, 닭, 양) 및 항-종 항체는 비교적 높은 결합 상수를 갖는다.

변형된 친화성 작용제는 각각의 상이한 친화성 작용제를 별개의 개별 반응으로 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결한 다음, 변형된 친화성 작용제를 조합하여 변형된 친화성 작용제를 포함하는 혼합물을 형성함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 상이한 친화성 작용제가 조합될 수 있고, 조합으로 친화성 작용제를 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결하는 반응이 수행될 수 있다. 이것은 방법이 한번에 1가지 초과의 결과를 위해 멀티플렉스화되게 한다.

본 발명의 방법에 사용되는 각각의 상이한 변형된 친화성 작용제의 양은, 예를 들어 표적 희귀 분자의 각각의 상이한 집단의 성질 및 잠재적 양, MS 표지의 성질, 친화성 작용제의 성질, 세포의 성질 (존재하는 경우), 입자의 성질 (사용되는 경우), 및 차단제의 양 및 성질 (사용되는 경우) 중 1개 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 사용되는 각각의 상이한 변형된 친화성 작용제의 양은 약 0.001 μg/μL 내지 약 100 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 80 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 60 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 40 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 20 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 10 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 100 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 80 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 60 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 40 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 20 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 10 μg/μL이다.

사용된 변경 작용제의 수는 MS 표지 전구체의 성질, 변경 작용제가 매질 중에서 자유롭든지 또는 변형된 친화성 작용제의 일부이든지 변경 작용제의 성질, 및 사용된 상이한 친화성 시약의 성질 및 수 중 1개 이상에 따라, MS 표지 전구체당 1개, 또는 2개의 MS 표지 전구체당 1개, 또는 3개의 MS 표지 전구체당 1개, 내지는 사용된 모든 MS 표지 전구체당 1개일 수 있다. 예를 들어, 각각의 MS 표지 전구체가 친화성 작용제에 대한 상이한 MS 표지의 불안정성 에스테르 또는 불안정성 아미드 연결을 포함하는 경우에, 디술피드, 에스테르 또는 아미드 연결의 가수분해를 유발하는 단일 변경 작용제가 사용되어 상이한 MS 표지를 생성할 수 있다. 다른 예에서, 한 변경 작용제, 또는 MS 표지 전구체의 수보다 더 적은 변경 작용제를 이용하는 것이 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 사용된 각각의 상이한 유형의 친화성 작용제에 대해 상이한 변경 작용제가 사용되어 MS 표지를 생성할 수 있다.

수성 매질 중 변형된 친화성 작용제 및 샘플 (임의로 농축됨)을 포함하는 조합은 세포 또는 입자 시약 상의 표적 희귀 분자에 대한 변형된 친화성 작용제의 결합을 위해 소정 온도에서 소정 기간 동안 유지함으로써 처리된다. 변경 작용제를 포함하는 각각의 변형된 친화성 작용제의 경우, 변경 작용제가 작용하는 MS 표지 전구체가 상기 조합에 포함되며, 여기서 MS 표지 전구체는 MS 표지로 전환된다. 일부 예에서, 추가의 모이어티가 추가되며, 여기서 변경 작용제는 모이어티와 MS 표지 전구체와의 반응을 용이하게 하여 MS 표지를 생성한다. 일부 예에서, 변형된 친화성 작용제는 MS 표지 전구체를 포함하고, 변경 작용제는 매질 중 비결합된 물질로서 상기 조합에 포함된다. 이 예에서, 변경 작용제는 친화성 작용제의 MS 표지 전구체에 작용하여 MS 표지를 생성한다. 일부 예에서, 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체를 포함하는 물질을 방출시키는 제1 변경 작용제가 사용되고, 이후 MS 표지 전구체로부터 MS 표지의 형성을 용이하게 하는 제2 변경 작용제가 사용된다.

이러한 처리의 온도 및 지속기간은, 예를 들어 샘플의 성질, 표적 희귀 분자의 성질, 비-희귀 분자의 성질, 변형된 친화성 작용제의 성질, MS 표지 전구체의 성질, 및 변경 작용제의 성질에 좌우된다. 일부 예에서, 통상적으로 중간 온도 및 대개는 일정한 온도, 바람직하게는 실온이 사용된다. 소정 기간의 유지 동안 온도는 통상적으로, 예를 들어 약 5℃ 내지 약 99℃ 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃의 범위이다. 유지 기간은, 예를 들어 약 0.2초 내지 약 24시간, 또는 약 1초 내지 약 6시간, 또는 약 2초 내지 약 1시간, 또는 약 1 내지 약 15분이다. 시간 범위는, 예를 들어 매질의 온도 및 다양한 시약의 결합 속도에 좌우된다.

표적 희귀 분자에 결합되는 변형된 친화성 작용제, 즉, 변경 작용제가 작용한 친화성 작용제는 임의로, 표적 분자에 결합되지 않는 변형된 친화성 작용제로부터 분리된다. 일부 예에서, 이러한 분리는 샘플 내 비-희귀 분자의 수를 감소시키는 것을 포함한다.

샘플

본 발명의 조성물은 많은 상이한 유형의 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다. 폭넓은 범위의 이종 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 환경적 샘플 (예를 들어 산업 샘플 및 농업 샘플 포함), 및 식품/음료 제품 샘플 등이 분석될 수 있다.

예시적인 환경적 샘플은 지하수, 지표수, 포화 토양수, 불포화 토양수; 산업화 처리물, 예컨대 폐수, 냉각수; 공정에 사용된 화학물질, 산업 공정에서의 화학 반응물, 및 폐기물 장소로부터의 침출액을 포함하는 다른 시스템; 폐기물 및 물 주입 처리물; 저장 탱크 내 액체 또는 저장 탱크 주위의 누수 검출물; 산업 시설, 물 처리 플랜트 또는 시설로부터의 배출수; 농업 용지로부터의 배수 및 침출액, 도시 토지 사용, 예컨대 지표, 지표하 및 하수관 시스템으로부터의 배수; 폐기물 처리 기술로부터의 물; 및 미네랄 추출 또는 천연 자원을 추출하는 다른 공정, 예컨대 오일 생산 및 현장 에너지 생산으로부터의 배수를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

추가적으로 예시적인 환경적 샘플은 농업 샘플, 예컨대 작물 샘플, 예컨대 곡물 및 사료 제품, 예컨대 대두, 밀 및 옥수수를 포함하나 확실히 이에 제한되지는 않는다. 종종, 제품의 구성성분에 대한 데이터, 예컨대 수분, 단백질, 오일, 전분, 아미노산, 추출가능한 전분, 밀도, 시험 중량, 소화율, 세포벽 내용물, 및 상업적 가치를 갖는 임의의 다른 구성성분 또는 특성이 바람직하다.

예시적인 생물학적 샘플은 인간 조직 또는 체액을 포함하고, 임의의 임싱적으로 허용되는 방식으로 수집될 수 있다. 조직은, 예를 들어 인간 또는 다른 포유동물로부터 유래된, 연결된 세포들 및/또는 세포외 매트릭스 물질의 덩어리, 예를 들어 피부 조직, 모발, 손발톱, 비도 조직, CNS 조직, 신경 조직, 눈 조직, 간 조직, 신장 조직, 태반 조직, 유선 조직, 태반 조직, 유선 조직, 위장 조직, 근골격 조직, 비뇨생식기 조직, 골수 등이고, 세포 및/또는 조직과 회합된 연결 물질 및 액체 물질을 포함한다. 체액은, 예를 들어 인간 또는 다른 포유동물로부터 유래된 액체 물질이다. 이러한 체액은 점액, 혈액, 혈장, 혈청, 혈청 유도체, 담즙, 혈액, 모체 혈액, 점액질, 타액, 객담, 땀, 양수, 월경액, 유액, 복막액, 소변, 정액, 및 뇌척수액 (CSF), 예컨대 요추 또는 뇌실 CSF를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 샘플은 또한 미세 바늘 흡인물 또는 생검 조직일 수 있다. 샘플은 또한 세포 또는 생물학적 물질을 함유하는 배지일 수 있다. 샘플은 또한 혈병, 예를 들어 전혈로부터 혈청을 제거한 후 수득한 혈병일 수 있다.

한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플일 수 있으며, 이로부터 혈장 또는 혈청이 추출될 수 있다. 혈액은 표준 정맥절개술 절차에 의해 수득된 다음, 분리될 수 있다. 혈장 샘플을 제조하기 위한 전형적인 분리 방법은 혈액 샘플의 원심분리를 포함한다. 예를 들어, 혈액 채취 직후, 프로테아제 억제제 및/또는 항응고제가 혈액 샘플에 첨가될 수 있다. 이어서, 튜브가 냉각 및 원심분리되고, 이후 얼음 상에 배치될 수 있다. 생성된 샘플은 하기 성분으로 분리된다: 상부 상 중 투명한 혈장 용액; 혈소판과 혼합된 백혈구의 박층인 백혈구 연층; 및 적혈구. 전형적으로, 전혈 8.5 mL는 혈장 약 2.5-3.0 mL를 생성할 것이다.

혈청은 매우 유사한 방식으로 제조된다. 정맥 혈액이 수집되고, 이어서 반전에 의해 프로테아제 억제제 및 응고제와 혈액과의 혼합이 수행된다. 혈액은 튜브를 실온에서 수직으로 방치하여 응고되게 된다. 이어서, 혈액은 원심분리되며, 여기서 생성된 상청액이 지정된 혈청이다. 혈청 샘플은 이후 얼음 상에 배치되어야 한다.

샘플을 분석하기 전에, 샘플은, 예를 들어 여과 또는 원심분리를 사용하여 정제될 수 있다. 이들 기술은, 예를 들어 미립자 및 화학적 간섭을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 입자의 제거를 위한 다양한 여과 매체는 필터 종이, 예컨대 셀룰로스 및 막 필터, 예컨대 재생된 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 나일론, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에테르술폰, 폴리카르보네이트 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 미립자 및 매트릭스 간섭의 제거를 위한 다양한 여과 매체는 관능화된 막, 예컨대 이온 교환 막 및 친화도 막; SPE 카트리지, 예컨대 실리카- 및 중합체-기재 카트리지; 및 SPE (고체 상 추출) 디스크, 예컨대 PTFE- 및 섬유유리-기재 디스크를 포함한다. 이들 필터 중 일부는 필터 홀딩/하우징에 느슨하게 배치하기 위해 디스크 포맷으로 제공될 수 있고, 다른 것은, 예를 들어 표준 혈액 수집 튜브 상에 배치될 수 있는 일회용 팁 내에 제공되고, 또 다른 것은 피펫팅된 샘플을 받기 위한 웰을 갖는 어레이 형태로 제공된다. 필터의 또 다른 유형은 스핀 필터를 포함한다. 스핀 필터는 셀룰로스 아세테이트 필터 막을 갖는 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 이루어지고, 전형적으로 수성 완충제 중에 희석된 샘플, 예컨대 혈청 및 혈장 샘플로부터 미립자를 제거하기 위해 원심분리와 함께 사용된다.

여과는 부분적으로 다공성 값에 의해 영향을 받아, 보다 큰 다공성은 단지 보다 큰 미립자만을 여과하고, 보다 작은 다공성은 보다 작은 및 보다 큰 미립자 둘 다를 여과한다. 샘플 여과를 위한 전형적인 다공성 값은 0.20 및 0.45 μm 다공성이다. 콜로이드성 물질 또는 다량의 미세 미립자를 함유하는 샘플의 경우, 액체 샘플이 필터를 통과하게 하는데 상당한 압력이 요구될 수 있다. 따라서, 토양 추출물 또는 폐수와 같은 샘플의 경우, 프리필터 또는 심층 필터 층 (예를 들어 "2-in-1" 필터)이 사용될 수 있고, 이는 이들 유형의 미립자를 함유하는 샘플에 의한 막힘을 방지하기 위해 막의 상부에 배치된다.

일부 경우에, 종종 소변 샘플에서 행해지는 바와 같이, 필터 없이 원심분리가 미립자를 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 원심분리된다. 이어서, 생성된 상청액은 제거되고 동결된다.

샘플이 수득되고 정제된 후, 샘플은 혈장 샘플 내 1종 이상의 표적 분석물, 예컨대 희귀 분자를 검출하기 위해 본 발명의 조성물로 분석될 수 있다. 혈장 샘플의 분석에 관하여, 혈장에 많은 요소, 예컨대 단백질 (예를 들어, 알부민), 이온 및 금속 (예를 들어, 철), 비타민, 호르몬, 및 다른 요소 (예를 들어, 빌리루빈 및 요산)가 존재한다. 이들 요소 중 어느 것이 본 발명의 조성물을 사용하여 검출될 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 조성물은 질환 상태의 지표인 생물학적 샘플 내 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 구체적 예는 하기에 제공된다.

표적 희귀 분자 중 1개 이상이 세포의 일부인 경우, 수성 매질은 또한 세포의 용해를 위한 용해제를 포함할 수 있다. 용해제는 세포 막의 완전성을 파괴하여 세포의 세포내 내용물을 방출시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물이다. 용해제의 예는, 예를 들어 비-이온성 세제, 음이온성 세제, 양쪽성 세제, 저 이온 강도 수용액 (저장성 용액), 박테리아제, 지방족 알데히드, 및 보체 의존성 용해를 유발하는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 보조 물질이 희석 매질 중에 존재할 수 있다. 수성 매질 중 모든 물질은 목적하는 효과 또는 기능을 달성하기에 충분한 농도 또는 양으로 존재한다.

일부 예에서, 표적 희귀 분자 중 1개 이상이 세포의 일부인 경우, 샘플의 세포를 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 세포의 고정은 세포를 고정화시키고, 세포 구조를 보존하고, 세포를 생체내-유사 조건에서의 세포와 밀접하게 닮은 조건 및 관심 항원이 특이적 친화성 작용제에 의해 인식될 수 있는 조건에서 유지시킨다. 사용되는 고정제의 양은, 세포를 보존하지만 후속 검정에서 잘못된 결과로 이어지지 않는 양이다. 고정제의 양은, 예를 들어 고정제의 성질 및 세포의 성질 중 1개 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 고정제의 양은 약 0.05% 내지 약 0.15% 또는 약 0.05% 내지 약 0.10%, 또는 약 0.10% 내지 약 0.15% (중량 기준)이다. 세포의 고정을 수행하기 위한 작용제는, 예를 들어 가교제, 예컨대, 예를 들어 알데히드 시약 (예컨대, 예를 들어 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 파라포름알데히드); 알콜 (예컨대, 예를 들어 C1-C5 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올); 케톤 (예컨대 C3-C5 케톤, 예컨대 아세톤)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 명칭 C1-C5 또는 C3-C5는 알콜 또는 케톤 내 탄소 원자의 수를 지칭한다. 고정된 세포에 대해 완충 수성 매질을 사용하여 1개 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다.

고정 후 필요하다면, 세포 제제는 또한 투과화에 적용될 수 있다. 일부 경우에, 고정제, 예컨대 알콜 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올) 또는 케톤 (예를 들어, 아세톤)은 또한 투과화를 유발하고, 추가의 투과화 단계는 필요하지 않다. 투과화는 세포 막을 통한 관심 표적 분자에의 접근을 제공한다. 사용되는 투과화제의 양은, 세포 막을 파괴하고 표적 분자에의 접근을 허용하는 양이다. 투과화제의 양은 투과화제의 성질 및 세포의 성질 및 양 중 1개 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 투과화제의 양은 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%이다. 세포의 투과화를 수행하기 위한 작용제는 알콜 (예컨대, 예를 들어 C1-C5 알콜, 예컨대 메탄올 및 에탄올); 케톤 (예컨대 C3-C5 케톤, 예컨대 아세톤); 세제 (예컨대, 예를 들어 사포닌, 트리톤 X-100 (4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 완충제, 시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수가능함), 및 트윈-20 (폴리소르베이트 20, 시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수가능함)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 투과화된 세포에 대해 완충 수성 매질을 사용하여 1개 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다.

샘플과 본 발명의 조성물과의 접촉은 샘플 내 표적 희귀 분자에 대한 친화성 시약의 결합을 달성하기에 충분한 기간 동안 계속된다. 기간은, 예를 들어 표적 희귀 세포의 상이한 집단의 성질 및 크기, 반응 혼합물의 성질, 또는 여과될 부피 (임의적) 중 1개 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 접촉 기간은, 예를 들어 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 45분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 45분, 또는 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분이다.

검정

본 발명의 조성물은 질량 태그를 희귀 분자와 특이적으로 회합시키는 검정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 검정은 샘플 내 희귀 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 시약을 사용한다. 질량 태그는 친화성 시약과 회합되고, 그에 결합된다. 표적 분석물에 대한 포획 모이어티의 특이적 결합시에, 질량 태그는 희귀 분자와 회합되게 된다. 이어서, 분리 단계가 수행되며, 예컨대 비결합 친화성 시약을 세척해내거나 또는 샘플로부터 희귀 분자 / 친화성 시약 / 질량 태그 복합체를 분리하는 정제를 수행한다. 분리 단계 (세척 또는 정제) 후에, 이어서 질량 태그는 상기 기재된 바와 같은 방출 작용제를 사용하여 친화성 시약과 질량 표지 사이의 표지 유닛의 결합을 파괴함으로써 친화성 시약으로부터 용리된다. 이어서, 질량 표지는 이온화되고 분석된다. 구체적으로, 모이어티로부터 질량 태그의 해리를 촉진하는 환경이 만들어질 수 있다. 예를 들어, pH 변화가 해리를 촉진하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 화학 시약이 해리를 촉진하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 열이 해리를 촉진하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 기술의 조합, 예를 들어 pH 변화 및 방출 작용제의 조합이 사용된다. 결합 및 방출은 생물학적 화학에서 널리 확립되어 있는 티올/디술피드 화학을 수반할 수 있지만 PNA의 상보적 결합과 같은 대안 (R. J. Ball et al. Artificial DNA: PNA and XNA,1(2010) 27 - 35)이 사용될 수 있다.

특이적 결합 또는 특이적 회합은 분자의 불균일 집단에서 관심 표적 분석물을 결정해주는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예를 들어 면역검정 조건) 하에서, 명시된 포획 모이어티 (예를 들어, 항체 가변 도메인)은 그의 특정한 "표적"에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 분자에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 특이적 결합 / 회합은 선택된 바와 같이 결합이 표적 정체, 고, 중 또는 저 결합 친화도 또는 결합력의 관점에서 선택적이라는 것을 의미한다. 선택적 결합은 결합 상수 또는 결합 역학이 적어도 10배 상이한 경우에 통상적으로 달성된다.

다른 한편으로는, 비-특이적 결합은, 특정 표면 구조와 비교적 무관한 분자간 비-공유 결합을 수반한다. 비-특이적 결합은 분자간 소수성 상호작용을 포함한 여러 인자로부터 유발될 수 있다.

질량 태그의 이온 생성

관련 기술분야에 공지되어 있는, 질량 태그의 이온을 생성하기 위한 임의의 접근법이 사용될 수 있다. 질량 분광측정법을 위해 대기압에서 이온화 공급원을 이용하는 예시적인 질량 분광측정법 기술은 전기분무 이온화 (ESI; Fenn et al., Science, 246:64-71, 1989; 및 Yamashita et al., J. Phys. Chem., 88:4451-4459, 1984); 대기압 이온화 (APCI; Carroll et al., Anal. Chem. 47:2369-2373, 1975); 및 대기압 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (AP-MALDI; Laiko et al. Anal. Chem., 72:652-657, 2000; 및 Tanaka et al. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2:151-153, 1988)를 포함한다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

직접적 주위 이온화/샘플링 방법을 이용하는 예시적인 질량 분광측정법 기술은 탈착 전기분무 이온화 (DESI; Takats et al., Science, 306:471-473, 2004 및 미국 특허 번호 7,335,897); 실시간 직접적 분석 (DART; Cody et al., Anal. Chem., 77:2297-2302, 2005); 대기압 유전 장벽 방전 이온화 (DBDI; Kogelschatz, Plasma Chemistry and Plasma Processing, 23:1-46, 2003, 및 PCT 국제 공개 번호 WO 2009/102766), 습윤화 다공성 물질을 사용하는 이온 생성 (페이퍼 스프레이, 미국 특허 번호 8,859,956), 및 전기분무-보조 레이저 탈착/이온화 (ELDI; Shiea et al., J. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 19:3701-3704, 2005)를 포함한다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

[Ouyang et al., 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0119079] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 바와 같이, 이온 생성은 샘플을 다공성 물질 상에 배치하고 다공성 물질 또는 다른 유형의 표면으로부터 질량 태그의 이온을 생성함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 검정이 수행될 수 있고, 이온이 비-다공성 물질로부터 생성될 수 있다 (예를 들어, [Cooks et al., 미국 특허 출원 일련 번호 14/209,304] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 특정 실시양태에서, 높은 전압이 인가될 수 있는 고체 바늘 프로브 또는 표면이 질량 태그의 이온을 생성하는데 사용된다 (예를 들어, [Cooks et al., 미국 특허 출원 공개 번호 20140264004] (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).

이온 분석

특정 실시양태에서, 이온은 이들을 질량 분광계 (벤치-탑 또는 소형 질량 분광계) 내로 지시함으로써 분석된다. 도 10은 소형 질량 분광계 내 다양한 구성요소 및 그의 배열을 예시하는 그림이다. 미니 12의 제어 시스템 (Linfan Li, Tsung-Chi Chen, Yue Ren, Paul I. Hendricks, R. Graham Cooks and Zheng Ouyang "Miniature Ambient Mass Analysis System" Anal. Chem. 2014, 86 2909-2916, DOI: 10.1021/ac403766c; and 860. Paul I. Hendricks, Jon K. Dalgleish, Jacob T. Shelley, Matthew A. Kirleis, Matthew T. McNicholas, Linfan Li, Tsung-Chi Chen, Chien-Hsun Chen, Jason S. Duncan, Frank Boudreau, Robert J. Noll, John P. Denton, Timothy A. Roach, Zheng Ouyang, and R. Graham Cooks "Autonomous in-situ analysis and real-time chemical detection using a backpack miniature mass spectrometer: concept, instrumentation development, and performance" Anal. Chem., 2014, 86 2900-2908 DOI: 10.1021/ac403765x (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)), 및 미니 10의 진공 시스템 (Liang Gao, Qingyu Song, Garth E. Patterson, R. Graham Cooks and Zheng Ouyang, "Handheld Rectilinear Ion Trap Mass Spectrometer", Anal. Chem., 78 (2006) 5994-6002 DOI: 10.1021/ac061144k (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨))은 도 10에 제시된 소형 질량 분광계를 제조하기 위해 조합될 수 있다. 그것은 구두상자의 크기와 유사한 크기를 가질 수 있다 (H20 x W25cm x D35cm). 특정 실시양태에서, 소형 질량 분광계는 이중 LIT 구성을 사용하며, 이는 예를 들어 [Owen et al. (미국 특허 출원 일련 번호 14/345,672) 및 Ouyang et al. (미국 특허 출원 일련 번호 61/865,377)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

질량 분광계 (소형 또는 벤치탑)는 불연속적 계면을 갖추고 있을 수 있다. 불연속적 계면은, 예를 들어 [Ouyang et al. (미국 특허 번호 8,304,718) 및 Cooks et al. (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0280819)] (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

검출 감수성을 제어해야 하는 인자는 화학에서의 모든 단계의 조합 효율, 친화성 시약당 태그의 수, 희귀 분자당 친화성 시약의 수 및 질량 태그당 이온의 수, MS에서의 이온화 감수성, MS에서의 S/N 비, 측정되고 있는 상이한 질량 태그에 상응하는 상이한 전이의 수, 및 MS 획득 시간이다. 그러나, 이와 같은 초미량 분석에서, 그것은 종종 성능을 결정하는 화학적 잡음의 크기이다. 이러한 이유로 복합 혼합물의 경우, MS/MS는, 통상의 MS의 경우에 총 신호가 더 큰 자리수일 수 있기도 하지만, 종종 통상의 MS보다 더 낮은 검출 한계를 제공한다.

참조로 포함

본 개시내용 전반에 걸쳐 특허, 특허 출원, 특허 공개, 저널, 서적, 논문, 웹 콘텐츠와 같은 다른 문헌을 참조 및 인용하였다. 모든 이러한 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

등가물

본원에 제시되고 기재된 것에 추가로, 본 발명의 다양한 변형 및 그의 많은 추가 실시양태는, 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌에 대한 참조를 포함한 본 문헌의 전체 내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 것이다. 본원의 대상은 그의 다양한 실시양태 및 그의 등가물에서 본 발명의 실시에 적합화될 수 있는 중요한 정보, 예시 및 지침을 함유하고 있다.

실시예

이들 실시예에 사용된 물질은 달리 나타내지 않는 한 시그마-알드리치 코포레이션 (미주리주 세인트 루이스)으로부터의 것이었다. 항체 접합체는 문헌 [Greg T. Hermanson in Bioconjugate Techniques, Third Edition 2013, Elsevier Inc., 225 Wyman Street, Waltham MA]에 기재된 바와 같은 표준 생접합 기술에 의해 제조하였다. 이미다졸륨 및 피리디늄 질량 표지는 문헌 [Michael W. Pennington and Ben M. Dunn in Imidazolium Synthesis Protocols, Edition 1, November 1994, Springer-Verlag, New York, LLC, New York NY]에 기재된 바와 같은 표준 이미다졸륨 합성 기술에 의해 제조하였다. 물질은 물질에 대한 설명에 사용되는 통상의 용어와 함께 표 1에 제시된다.

실시예 1: 표적 희귀 분자의 4원 질량 표지 방법

배양된 SKBR 인간 유방암 세포를 1000 μL 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 2회 세척하고 원심분리 (2500 rpm으로 2분 (에펜도르프 원심분리 5417C))하여 암 세포를 질량 표지와의 반응을 위해 준비하였다. 둘 다의 시기에서, 용액을 폐기하여 세포의 펠릿을 생성시켰다. 세포를 투과화 단계로서 0.2% 트리톤 X100을 함유하는 1000 μL PBS (PBST 0.2%) 중에 현탁시키고, 세포를 7분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 1000 μL PBS 중에서 4회 세척하였다. 세포를 차단 단계로서 1000 μL 카세인 완충제 중에 현탁시키고, 세포를 7분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 1000 μL PBST (0.05%) 중에서 1회 세척하였다. 세포를 카세인 완충제 중 다이라이트 550 형광 표지와 접합된 10 ug/mL CK -8-18 항체 300 μL와 반응시켜 암 세포의 가시화를 가능하게 하였다. 세포를 25분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 1000 μL PBST (0.05%) 중에서 4회 세척하였다. 세포를 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)의 1 μg/mL 용액 500 μl와 반응시켜 암 세포 핵의 가시화를 가능하게 하였다. 세포를 1분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 1000 μL PBST (0.05%) 중에서 4회 세척하였다. 염색된 세포 혼합물을 PBS에 의해 1 mL로 희석하고, 2 μL 샘플을 현미경 하에서 검사하여 염색된 세포 수의 계수를 검증하였다 (~66500개 세포/mL).

커플링제 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)를 사용하여 L-카르니틴-F-G-G-S-C (QC5-1) 및 비오틴을 프로필아민 관능화 실리카에 및 절단가능한 디술피드 결합 링커 아암 (즉, 표지 결합 유닛)과 커플링시킴으로써 질량 표지를 준비하였다. Her-2/neu 희귀 분자에 대한 항체를 다이라이트488에 접합시키고, 추가로 N-히드록시숙신이미드 에스테르와의 아미드 결합에 의해 프로필아민 관능화 실리카 (나노입자, 200 nm, 메소다공성 세공 크기 4 nm)에 접합시켜 항체-나노입자 (친화성 시약, 도 1)를 제조하였다. 비오틴을 SPDP 반응에 의해 디술피드 결합을 갖는 친화성 시약에 부착시켰다. QC5-1 나노입자 및 친화성 시약을 스트렙타비딘 자기 비드 (피어스 1%, 10 mg/ml의 0.756 uM)에 접합시켜 조합된 항체- QC5-1 입자 18.2 ug/mL를 생성시킴으로써 친화성 시약에 부착된 4원 질량 표지를 제조하였다. 친화성 시약에 다른 질량 표지를 부착시키는데 동일한 방법을 사용하였다.

염색된 SKBR3 세포 (~20,000개 세포)에 0.075 ug/mL 항체- QC5-1 입자 300 μL를 첨가함으로써 염색된 세포를 친화성 시약에 부착된 4원 질량 표지와 반응시켰다. 생성된 혼합물을 RT에서 2시간 동안 75 rpm으로 롤러 혼합기 상에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 원심분리하고, 액체를 경사분리한 후, 이어서 1 mL의 PBST (0.3%)로 2회 및 1 mL의 PBS로 2회 세척하였다. 반응한 세포를 형광 현미경 하에서 검사하고, SBKR 세포의 100%가 항체- QC5-1 입자와 반응하였다는 것을 검증하였다. 이것은 4원 질량 표지 방법이 희귀 분자 검출에 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.

실시예 2: 4원 질량 표지의 검출

벤치탑 선형 이온 트랩 질량 분광계 (LTQ 써모 피셔)를 사용하여 나노-전기분무 이온화 (nESI)에 의해 생성된 질량 표지 이온을 분석하여 검출 한계를 시험하였다 (신호-대-잡음 비가 3인 농도로 추정됨). 기기 세팅은 하기와 같았다: 분무 전압, 1.5 kV; 모세관 온도, 150℃; 튜브 렌즈, 65 V; 모세관 전압, 15 V; 충돌 에너지, 35; Q 활성화, 0.3.

다양한 3개 아미노산 펩티드, 6개 아미노산 펩티드 및 9개 아미노산 펩티드 뿐만 아니라 소분자 4원 이미다졸륨 염 (메틸이미다졸륨-메틸-살리실알데히드, MIMSA) 및 4원 핵 염색 시약인 나일 블루 A를 포함한, 4차 구조가 존재 및 부재하는 잠재적 질량 표지의 유형을 포함하는 시험된 화합물의 목록이 표 1에 제시된다. 펩티드의 경우, 4차 구조는 N-말단에 L-카르니틴 잔기를 부가함으로써 제조하였다. 4차 구조가 결여된 펩티드는 10 내지 50 nM의 검출 한계에서 검출되었다. 4차 구조를 부가하는 것은 검출 한계를 1 nM로 개선시켰다. 이것은 4원 질량 표지가 더 큰 감수성을 가능하게 하고 검출을 위해 용이하게 이온화된다는 것을 입증한다.

표 1: nESI에 의한 질량 표지 검출 한계

실시예 3: 4원 질량 표지의 메틸이미다졸륨 및 피리디늄 유사체

4원 질량 표지의 메틸이미다졸륨 및 피리디늄 유사체를 합성하였다. 이러한 질량 표지를 프로필아민 관능화 실리카 나노입자에 접합시키기 위해, 이민을 직접적으로 형성시키거나 또는 1,2-디올을 사용하여 4원 질량 표지의 알데히드 관능기를 통해 아세탈을 형성시키도록 나노입자를 변형시켰다. 메틸이미다졸륨 및 피리디늄 유사체는 살리실알데히드로부터 먼저 블랑크 클로로메틸화 반응을 수행한 다음 N-치환된 이미다졸 또는 피리딘 유사체와의 1개의 추가의 반응을 위한 생성물을 단리함으로써 제조하였다. 클로로메틸화 살리실알데히드에 도입된 이미다졸의 N- 치환기 또는 피리딘의 치환기의 구조에 대한 변화는 상이한 구조를 갖는 질량 표지의 합성을 용이하게 하였다. 도 5는 메틸이미다졸륨 (m/z 217) 및 피리디늄 (m/z 214) 질량 표지를 제시한다. 질량 표지는 이온화시에 단편화로 인해 및 후속 MS/MS에 의한 분석으로 인해 고유 생성물 이온을 생성하며, 이는 메틸이미다졸륨 (m/z 83) 및 피리디늄 (m/z 80)으로 나타내어진다.

도 6은 R에 의해 나타내어지는 친화성 시약 또는 희귀 분자가 아세탈 또는 케탈 결합을 통해 4원 질량 표지에 어떻게 연결되는지를 제시한다. 결합은 R에 연결된 디올 및 4원 질량 표지의 알데히드의 반응에 의해 형성된다. 디올은 먼저 β-히드록시-γ-부티로락톤의 반응에 의해 친화성 시약 또는 희귀 분자 (R)의 아민에 부착되어 아미드 결합을 형성한다. 이러한 물질을 제조하는 상세한 절차는 하기와 같다:

클로로메틸살리실알데히드의 제조

파라포름알데히드 (1 g)를 교반하면서 실온에서 12 M 염산 (4 mL) 중에 현탁시켰다. 파라포름알데히드 분말을 산 중에 부분적으로 가용화시키고 (따라서 액체의 상부에 건조 파라포름알데히드가 부유하지 않음), 이어서 살리실알데히드 (0.6 g을 30분 과정에 걸쳐 적가하였음) 중에 부분적으로 가용화시켰다. 생성된 혼합물은 황색 색조를 띄었으며, 이는 파라포름알데히드가 완전히 용해됨에 따라 결국 투명해졌다. 용액을 12시간 동안 교반되도록 두었으며, 그 시간에 걸쳐 용액은 그의 색상을 잃고 생성물이 백색 침전물로서 형성되었다. 생성물을 여과하고, 탈이온수로 3회 세척하여 잔류 산을 제거하였다. 조 물질을 공기-건조시키고, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(메틸이미다졸)메틸살리실알데히드의 제조

조 클로로메틸살리실알데히드 (1 당량)를 실온에서 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 메틸이미다졸 (1.5 당량)을 적가하여 목적 생성물이 거의 즉시 침전되도록 하였다 (이미다졸로서 조금씩 첨가하였음). 침전물을 여과하고, 디클로로메탄으로 3회 세척하여 모든 잔류 유기물을 제거하였다 (물질을 본질적으로 정제함).

이민-결합된 나노입자 접합체 종의 형성을 위한 일반적 절차

(메틸이미다졸륨)메틸살리실알데히드 (1.2 당량)를 에펜도르프 튜브 내 무수 메탄올 (1 mL) 중에 용해시켰다. 상응하는 아민 접합체 파트너 (1 당량)를 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 용액을 30분 동안 두었으며, 그 시간에 걸쳐 용액은 황색 색상을 띄어 이민의 형성을 나타냈다.

아세탈 보호된 이미다졸륨 질량 표지의 제조

이미다졸륨 질량 표지 (0.3 g)를 무수 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 앰버리스트-15 (수소 형태, 질량은 측정되지 않음)를 첨가하였다. 이미다졸륨 질량 표지가 용해되었을 때 에틸렌 글리콜 (0.2 g)을 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 6시간 동안 교반되도록 두었다. 생성된 아세탈의 구조를 질량 분광측정법에 의해 확인하였다.

디올 관능화 프로필아민의 제조

프로필아민 (순수, 1 당량)을 베타-히드록시-감마-부티로락톤 (순수 1 당량)과 혼합하였다. 반응은 즉각적 발열을 나타내면서 진행하였고, 결국 반응이 완결될 때까지 결정화가 이어졌다. 수율은 본질적으로 정량적이었다.

프로필아민 관능화 실리카 나노입자의 디올에 의한 변형

프로필아민 관능화 실리카 나노입자 (0.03 g)를 에펜도르프 튜브 내에서 베타-히드록시-감마-부티로락톤 (300 μL)으로 덮고, 1시간 동안 반응하도록 두었다. 보다 큰 규모에서, 상기 반응은 피부에서 느껴지기에 충분히 강한 발열을 생성하였으며, 이는 유리 프로필아민에 대해 관찰된 것과 유사한 아미드화 반응을 나타낸다.

도 5는 이 방법에 의해 생성된 4원 질량 표지의 이미다졸륨 (A) 및 피리디늄 (B) 유사체를 제시한다. 메틸이미다졸륨 (m/z 217) 및 피리디늄 (m/z 214) 질량 표지. 이들 예에서, 질량 구조는 형식적 양전하, 즉, 살리실알데히드 모이어티 및 메틸 기에 단일 결합을 통해 또는 접합에 의해 직접적으로 연결되지 않는 모든 다른 원자로 구성된다. 메틸 살리실알데히드의 알데히드는 이민 결합을 통해 또는 아민의 변형 후 도 3에 제시된 바와 같은 아세탈 결합을 통해 프로필아민 관능화 실리카 나노입자의 아민에 결합하는데 사용되었다.

알데히드에의 부착을 위한 2종의 방법을 비교하였다. 희귀 분자 및 친화성 시약을 위한 모델로서 유기 아민을 사용하여 이민 결합 (도 3 패널 D) 및 아세탈 결합 (도 3 패널 B)을 제조하였다. MIMSA와 프로필아민, 메르캅토아닐린 및 1,6-디아미노나프탈렌과의 접합체를 조사하였다. 이민 결합은 무수 메탄올에서 신속하게 형성되었다. 결합은 수성 용매, 예컨대 PBS의 존재 하에 용이하게 절단되는 것으로 발견되었다. 방법에서 이들 물질을 사용하기 위한 목적으로, 4원 질량 표지를 연결하는데 사용된 결합은 검정 절차에 전형적으로 사용되는 완충 수용액 중에서 안정해야 한다는 것이 중요하다. 이민계는 수성 용매에의 20분 노출 시간 후에 결합의 완전한 가수분해로 인해 허용될 수 없는 것으로 간주되었다. 아세탈 및 물질은 적어도 20분에 걸쳐 거의 완벽히 안정하였다.

아세탈 연결을 통한 유기 아민에의 접합의 목적을 위해, 유리 아민을 먼저 β-히드록시-γ-부티로락톤과의 반응에 의해 1,2-디올 구조로 관능화시켰다 (도 6 참조). 반응식은 유기 아민 및 아민 나노입자에 성공적으로 적용되었다. 그것은 요구되는 디올 구조 (표지 결합 유닛, 도 1)를 생성하였고, 질량 표지의 알데히드 및 케톤과 접합시키기에 효과적인 수단을 제시하였다. 생성된 아세탈 및 케탈은 에틸렌 글리콜 유래된 아세탈과 동일한 가수분해적 안정성을 가졌다. 아세탈 및 케탈은 또한, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 물 중 50% 아세토니트릴과 같은 산성화된 분무 용매의 간단한 1 단계 액체 첨가에 의해 친화성 시약으로부터 용이하게 분리되었고 분리된다. 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 50% 아세토니트릴 물로부터는 nESI에 의해 질량 스펙트럼에서 질량 표지로부터의 신호의 억제가 관찰되지 않았다. 비교로, 디술피드 결합을 파괴하기 위한 물 중 1mg/mL의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드)의 사용은 nESI에 의해 질량 표지 검출 한계의 50% 이상의 억제를 유발하였다. 따라서 디술피드 결합은 4원 질량 표지의 부착을 위해 이상적이지 않았다.

상기 논의된 모든 요소를 혼입시키는 예시적인 작업흐름을 수행하였다. 프로필아민 관능화 실리카 나노입자의 변형을 β-히드록시-γ-부티로락톤으로 수행하였다. 이어서, 질량 표지의 메틸이미다졸륨 유사체 (도 5, A)를 생성된 디올 관능화 나노입자에 결합시켰다. 이 접합 및 후속 세척 단계 후에, 나노입자에 결합된 질량 표지를 수성 트리플루오로아세트산의 방출 용액 내로 방출시키고, 방출된 질량 표지를 내부 표준에 대한 보정 곡선을 사용하여 정량화하였다. 내부 표준은 질량 표지의 피리디늄 유사체 (도 5, B)였다. 방출 용액 중 질량 표지의 계산된 농도는 선행 세척 단계의 상청액으로부터 측정된 것보다 두 자릿수 더 컸다 (도 7).

도 8은 이미다졸륨의 고분자량 유도체 (m/z 309 및 259)를 갖는 질량 표지가 보다 높은 질량의 가변 질량 유닛을 갖는 질량 표지를 효과적으로 형성한다는 것을 제시한다. 이들 질량 표지는 또한 단편화되어 고유 생성물 이온 (m/z 175 및 m/z 125)을 생성하였으며, 이들은 배경 질량 스펙트럼으로부터 예측가능하고 분석적으로 분리가능하였다.

Claims (20)

1. 친화성 시약; 및
   친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체
   를 포함하며, 여기서 질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함하고, 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시키고, 질량 표지는 전하 유닛 및 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함하는 것인
   하전된 질량 표지 조성물.
2. 제1항에 있어서, 친화성 시약이 특이적 결합 쌍의 적어도 1개의 구성원을 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
3. 제1항에 있어서, 전하 유닛이 이온화시에 전하를 갖도록 배열된 1개 이상의 화학적 모이어티를 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
4. 제3항에 있어서, 전하 유닛이 화학식 I-VII로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 화학적 모이어티를 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
   

   

   
   여기서 적어도 1개의 X는 수소, 알킬 또는 방향족 유기 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 R에 의해 임의로 치환된 4급 암모늄 양이온 또는 4급 포스포늄 양이온이다.
5. 제3항에 있어서, 전하 유닛이 카르니틴, 이미다졸륨, 피리디늄, 테트라 에틸 아민, 벤즈알코늄 아민, 알킬 벤제토늄 아민, 트리페닐 포스포늄 양이온 및 트리알킬(2,3-디히드록시프로필)로 이루어진 군으로부터 선택된 화학적 모이어티인 하전된 질량 표지 조성물.
6. 제1항에 있어서, 질량 표지 유닛이 이온화시에 1개 이상의 단편을 생성하는 화학적 모이어티의 배열을 포함하며, 여기서 1개 이상의 단편 중 적어도 1개는 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
7. 제6항에 있어서, 질량 표지 또는 질량 표지의 1개 이상의 단편의 질량 스펙트럼에서의 미리-정해진 질량-대-전하-값이 질량 스펙트럼에서의 배경 질량-대-전하-값과 상이한 것인 하전된 질량 표지 조성물.
8. 제1항에 있어서, 질량 표지 유닛 및 전하 유닛이 이온화시 파괴에 대해 저항성이 있는 1개 이상의 결합에 의해 서로 결합되어 있는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
9. 제1항에 있어서, 표지 결합 유닛이 가역적 결합을 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
10. 제9항에 있어서, 가역적 결합이 아세탈 또는 케탈 결합을 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
11. 표적 분석물을 포함하는 샘플에 하전된 질량 표지 조성물을 도입하는 단계이며, 여기서 하전된 질량 표지 조성물은 친화성 시약; 및 친화성 시약에 결합된 질량 표지 전구체를 포함하고, 여기서 질량 표지 전구체는 표지 결합 유닛 및 질량 표지를 포함하고, 표지 결합 유닛은 질량 표지를 친화성 시약에 가역적으로 결합시키고, 질량 표지는 전하 유닛 및 질량 스펙트럼에서 미리-정해진 질량-대-전하-값을 갖는 질량 표지 유닛을 포함하는 것인 단계;
    샘플 및 하전된 질량 표지 조성물을 인큐베이션하여 하전된 질량 표지 조성물의 친화성 시약과 표적 분석물 사이의 상호작용을 통해 하전된 질량 표지 조성물이 표적 분석물에 결합하도록 하는 단계;
    표지 결합 유닛의 1개 이상의 결합을 파괴함으로써 질량 표지를 친화성 시약으로부터 방출시키는 단계;
    질량 표지를 이온화하는 단계; 및
    질량 분광계에서 이온화된 질량 표지 및/또는 그의 단편을 검출하여, 샘플 내 표적 분석물을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 내 표적 분석물을 검출하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
13. 제12항에 있어서, 표적 분석물이 표적 생물학적 분자인 방법.
14. 제13항에 있어서, 표적 생물학적 분자의 존재가 질환의 지표인 방법.
15. 제14항에 있어서, 질환이 암인 방법.
16. 제11항에 있어서, 이온화된 질량 표지 및/또는 그의 단편을 정량화하여, 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 제11항에 있어서, 질량 표지 또는 질량 표지의 1개 이상의 단편의 질량 스펙트럼에서의 미리-정해진 질량-대-전하-값이 질량 스펙트럼에서의 배경 질량-대-전하-값과 상이한 것인 하전된 질량 표지 조성물.
18. 제11항에 있어서, 질량 표지 유닛 및 전하 유닛이 이온화시 파괴에 대해 저항성이 있는 1개 이상의 결합에 의해 서로 결합되어 있는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
19. 제11항에 있어서, 표지 결합 유닛이 가역적 결합을 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.
20. 제19항에 있어서, 가역적 결합이 아세탈 또는 케탈 결합을 포함하는 것인 하전된 질량 표지 조성물.

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