DD252616B1 - Verfahren zur herstellung von cerulenin auf mikrobiologischem wege - Google Patents

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Wirkstoffes, der antibiotische Aktivität gegen Pilze, Hefen und grampositive Bakterien entfaltet und darüber hinaus als Inhibitor von Fettsäuresynthetaseund Polyketidsynthetase als Forschungsmittel bei der Hybridbiosynthese zur Herstellung neuer Hybrid-Antibiotica führen kann, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und von Mikroorganismen hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Bei dem Antibioticum und Enzym-Inhibitor handelt es sich um ein optisch aktives Keto-epoxydodecadienamid mit dem Namen Cerulenin, das in der mikrobiologischen und pharmazeutischen Industrie aufgrund seiner Einsatzbereitschaft zur gezielten Selektion von Antibiotica-Hochleistungsstämme zunehmende Bedeutung erlangt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Cerulenin wurde erstmals 1960 als antifungales Antibioticum aus Pilzkulturen der Art Cephalosporium caerulens isoliert und beschrieben (Hata, T. et al., Jpn. Bacteriol., 15,1057). Über Gewinnung und Eigenschaften des Cerulenin liegen Übersichten vor (Omura, S., 1976. Bacteriol. Rev., 40,681; Omura, S., 1981. In Lowenstein, J.M., Methods in Enzymology, Vol. 72,520-532; Masuma, R. et al., 1982. J. Antib. 35,1184). Es ist bekannt, daß bislang nur wenige Pilzarten zur Biosynthese von Cerulenin befähigt sind.

Helicoceras oryzae, H. certidis, H. plantaginis, H. nymphaerum sind bekannte Bildner des mit Cerulenin identischen Helicocerin (Engl. Pat. 1,154,133 1969). Cephalosporium caerulens (JP 65/9588 1965), Acrocylindrium oryzae (JP 70/21 638 1970) und Sartoriafumigata (JP 72241561972) sind weitere Bildner des Cerulenin, denen gemeinsam der Nachteil anhaftet, daß während der Fermentation außer dem gewünschten Cerulenin mehrere schwer abtrennbare steroidale Antibiotica, insbesondere Helvolsäure, synthetisiert werden, die die Isolierung des Cerulenin erschweren.

Bekannt ist auch, daß der Zusatz von Zeoliten während der Fermentation die Cerulenin-Biosynthese bei Cephalosporiumcaerulens begünstigt (JP 57206380 1982).

Aufgrund der zahlreichen Anwendungen und der Bedeutung des Cerulenin als spezifischer Enzym-Inhibitor sind auch mehrere Verfahren zur Totalsynthese von (± (-Cerulenin (Boeckmann, R. Kl und Thomas, E. W., 1979. J. Am. Chem. Soc, 101,897; Corey,

E. J. und Williams, D. R., 1977. Tetrahedron Lett., 1977,3847; Jakubowski, A.A. et al., 1982. J. Org. Chem., 47,1221) sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem (+)-Cerulenin entwickelt worden (Sveta, N. et al., 1979. Tetrahedron Lett., 1979, 2039). Die Synthesen führen jedoch über eine Reihe von chemischen Reaktionen mit zum Teil nur mäßigen Ausbeuten, so daß eine Synthese derzeit nicht ökonomisch erscheint.

Während die Grundstruktur des Antibioticums seit längerer Zeit bekannt ist (Omura, S. et al., 1969. Chem. Pharm. Bull., 1969, 2361; Arison, B. et al., 1974. J. Antib., 27,28), wurde erst in den letzten Jahren die absolute Konfiguration des Cerulenin als (2R,3S)-2.3-Epoxy-4-keto-7.10.trans, trans-dodecadienamid (Abb. 1) aufgeklärt (Sveta, N. et al., 1979. Tetrahedron Lett., 1979, 2039; Poughny, J. R. und Sinary, P., 1978. Tetrahedron Lett, 1978,3301; Vigneron, J. P. und Blanchard, J.M., 1980. Tetrahedron Lett. 1980,1739).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, das antibiotisch und enzym-inhibitorisch wirksame Cerulenin herzustellen. Damit soll die Palette bekannter Herstellungsverfahren für das in der pharmazeutischen Forschung und Industrie zunehmend bedeutungsvoller werdende Cerulenin durch einen originellen Prozeß erweitert werden, der die aufgeführten Nachteile bekannter Herstellungsverfahren vermeidet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, das es gestattet, Cerulenin mit Hilfe eines bisher nicht bekannten Mikroorganismen-Stammes ausschließlich und ohne schwer abtrennbare, steroidale Begleitantibiotica aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff-, Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen eine nach Mutagenese aus einer zu den Fungi imperfecti gehörenden Population IP 45 gezüchtet wird. Der Mikroorganismen, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 JENA, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 43807 hinterlegt worden und unterscheidet sich von bekannten Cerulenin-Bildnern durch morphologisch-physiologische Characteristics und dadurch, daß während der Fermentation keine Helvolsäure und andere steroidale Antibiotica als schwer abtrennbare Nebenprodukte synthetisiert werden. Auf geeigneten Agrarnährböden gezüchtete Kulturen des Stammes IP 45 werden in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft, und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C über einen Zeitraum von 2 bis 4Tagen, vorzugsweise 2 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH6,2 und pH 6,6 und am Ende des Prozesses zwischen pH 5,0 und pH 6,6 liegt.

Als Kohlenstoffquellen in den Nähermedien können Glukose, Glycerin und Saccharose verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen Trockenhefe, Fleischpepton und Natriumnitrat in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen und Zeosorb-Molekularsieben erreicht werden. Letztere begünstigen als selektive Adsorbentien und Austauscher den Verlauf der Fermentation. In komplexen Medien haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natriumphosphat bzw. Kaliumphosphat als vorteilhaft erwiesen. Die Fermentation des Cerulenin-Bildners ZIMET 43807 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermentor sowie in V2 A-Stahltanks vorgenommen werden. Die Isolierung des Cerulenin wird in der Weise durchgeführt, daß das Antibioticum aus dem Kulturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel reextrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zurTrockne gebracht, anschließend in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wieder aufgenommen und säulenchromatographisch gereinigt wird. Aus dem kristallinen Rohprodukt, das nach Abdestillieren des Lösungsmittels der vereinigten Antibioticafraktionen der Säulenchromatographie resultiert, wird das Cerulenin durch Umkristallisieren als reine kristalline Verbindung erhalten. Eigenschaften des Cerulenin

Farblose, mikrokristalline Substanz aus Tetrachlormethan. Fp.: 90-93⁰C , Summenformel: C₁₂H₁₇NO₃, MG: 223, IaI I^s- -12°C (Chloroform, с = 1.0). Löslichkeit: Gut löslich in Chloroform, Tetrachlormethan, Benzol und Essigsäureäthylester, mäßig löslich in Wasser.

Massenspektrum m/z: M⁺ gef.: 223.1185; ber.: 223.1208; Fragmentierung m/z: 206 (M⁺-NH₃); 179 (M⁺-CONH₂, Basispeak); 142 (M⁺-C₆H₉). IR-Spektrum (КВг)сітГ¹: 3380,3210 (-NH₂, Amid); 1720 (C=O); 1663 (C=O, Amid); 1610 (C=C); 967 (^H C=C _н). ¹³C-NMR-Spektrum: Die Daten der ¹³C-NMR-Analyse sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Sie sind charakteristisch für Cerulenin (Funabashi, H. et al., 1983. Tetrahedron Letters, 24,2673) mit der Struktur (2R,3S)-2.3-Epoxy-4-keto-7.10-trans, transdodecadienamid (Formel, Abb. 1).

Die Vorteile des hier beschriebenen Herstellungsverfahrens für den Enzym-Inhibitor Cerulenin werden zusammenfassend gesehen

— in der Bereitstellung eines Mikroorganismus, der neben Cerulenin keine weiteren, von diesem Wirkstoff schwer abtrennbaren Substanzen ins Fermentationsmedium abgibt bzw. im Mycel anreichert;

— in der Möglichkeit, in guten Ausbeuten und bei Rückgriff auf billige Einsatzstoffe darüber hinaus eine für die pharmazeutische Forschung und Industrie bedeutsame Biofeinchemikalie verfügbar machen zu können, die für die Konstruktion von Hybrid-Antibiotica mit neuartiger Struktur und Wirkungsweise wie auch für die Selektion von Industrie-Hochleistungsstämmen von potentiellem Nutzen ist;

— in einer stereospezifisch verlaufenden Biosynthese des optisch aktiven Ceruienin, das während der Fermentation mit der für die biochemische Wirkung des Enzym-Inhibitors relevanten Konfiguration in hoher Ausbeute erhalten wird;

— in der einfachen Isolierung des Cerulenin aus dem Kulturfiltrat des Bildners ohne die Notwendigkeit der Abtrennung der Helvolsäure bzw. anderer steroidaler Antibiotica.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt. 1. Zwei 500ml Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Vorzucht-Mediums:

Glukose 2,0%

Pepton 0,5 %

Fleischextrakt 0,5%

Trockenhefe 0,3%

Natriumchlorid 0,5%

Kalziumkarbonat 0,3%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 110⁰C . Die Acidität liegt nach der Sterilisation bei pH 6,3. Jede Steilbrustflasche wird mit Mycelfragmenten des Cerulenin-Bildners IP 45 beimpft, der auf folgendem Näherboden angezüchtet wurde:

Malzextrakt 3,0%

Agar-Agar 1,2%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35Min. bei 115°C. Die Acidität beträgt nach der Sterilisation pH6,3. Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/min bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500 ml Steilbrustflaschen, die je 80ml des folgenden Produktions-Mediums enthalten:

Glycerin 3,0%

Glukose 1,0%

Pepton 0,5%

Natriumchlorid 0,2%

Zeosorb-Molekularsieb

4 A pulverförmig 1,0%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35Min. bei 115°C . Die Acidität beträgt nach der Sterilisation pH6,3. Während der Fermentation liegt die Temperatur bei 28⁰C und die Schüttelfrequenz beträgt 180U/min. Mit einer Kultur des Cerulenin-Bildners IP 45 von einem festen Nährboden beimpft man 80 ml des angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml Steilbrustflasche enthalten ist. Man brütet 48Std. bei 28⁰C auf einem Schütteltisch mit einer Schüttelfrequenz von 180U/min. 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2I Glaskolben enthalten ist. Man brütet weitere 48Std. bei 28⁰C bei einer Schüttelfrequenz von 180U/min., ehe die so erhaltenen 400ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 201 des beschriebenen Produktions-Mediums dienen. Letzteres ist in einem 321 Glasfermenter enthalten. Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min, und mit einer Luftzufuhr von 151/min. ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen Antafron kontrolliert werden. 201 Kulturbrühe, die man von einem Fermentationsansatz im 321 Glasfermenter erhält, werden zentrifugiert und das überstehende Kulturfiltrat erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wird im Vakuumrotationsverdampfer abdestilliert, der ölige Rückstand in wenig Chloroform aufgenommen und an Kieselgel (0,063 bis 0,2 mm) mit Chloroform, Chloroform/Essigsäureäthylester = 95/5 und Chloroform/Essigsäureäthylester = 90/10 chromatographiert. Fraktionen, die dünnschichtchromatographisch einheitliches Cerulenin enthalten, werden im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Man erhält 2,7 g kristallines Cerulenin-Rohprodukt, das zur Feinstreinigung aus Benzol/Petroläther und anschließend aus Tetrachlormethan umkristallisiert werden kann

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 4,0%

Pepton 1,0 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 115°C. Die Acidität beträgt nach der Sterilisation pH6,3. Man verfährt wie im Beispiel 1 mit der Unterschied, daß das Anzucht-Medium folgende Zusammensetzung hat:

	Kartoffelextrakt	2,0%
	Glukose	1,0%
	Pepton	0,1 %
	Agar-Agar	1,2%
	in Leitungswasser
35Min.	bei 12O0C, natursauer.
Tabelle 1

¹³C-NMR-Daten von Cerulenin (CDCI3) im Vergleich zu Literaturangaben von Funabashi etal./i/. Die chemischen Verschiebungen sind auf Tetramethylsilan als inneren Standard bezogen.

C-Atom	Chemische Verschiebung	1)
	Eigene Messung	167,3
C-1	167,27	55,4
C-2	55,33	58,4
C-3	58,36	202,0
C-4	201,97	40,9
C-5	40,84	26,0
C-6	25,95	125,8
C-7	125,79	127,8
C-8	127,78	129,2
C-10	129,20	130,7
C-11	130,66	35,5
C-9	35,41	17,9
C-12	17,82

/1/ H. Funabashi, S.lwasaki and S.Okuda Tetrahedron Letters 24 (1983) 2673-2676

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Cerulenin auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung eines den Fungi imperfecti zuzuordnenden Stammes, gekennzeichnet dadurch, daß

- zur Fermentation der pilzliche Mikroorganismus IP45 Stamm ZIMET 43807 eingesetzt,

- die Kultivierung unter aeroben sowie sterilen Submersbedingungen unter Zusatz von Zeosorb-Molekularsieb durchgeführt und

- die anschließende Extraktion unter Einsatz von Trichlormethan vorgenommen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung unter Zusatz von pulverförmigem Zeosorb-Molekularsieb 4A durchgeführt wird.