AT401060B - Verfahren zur isolierung und reinigung von mevinolin - Google Patents
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Description
AT 401 060 B
Diese Erfindung betrifft ein verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mevinolin aus Fermentationsflüssigkeit.
Mevinolin (Lovastatin, Monacolin K, MK 803) ist ein bekanntes Anti-Hypercholesterinämie-Mittel, das durch Fermentation entweder unter Verwendung eines zur Art Aspergillus terreus gehörenden Mikroorganismus oder anderer Mikroorganismen, die als Art zur Monascus-Gattung gehörend identifiziert sind, erzeugt werden kann.
Die Isolierung des aktiven Bestandteils wird entweder durch das direkte Extrahieren der Fermentationsflüssigkeit mit einem Lösungsmittel oder durch das Extrahieren der filtrierten Flüssigkeit und der Biomasse sowie anschließendes Reinigen des Rohprodukts durch Chromatographie durchgeführt. Für die Extraktion wird Ethylacetat, Chloroform oder Benzol verwendet. Die Fermentationsflüssigkeit enthält teilweise die offenkettige Hydroxysäure-Form von Mevinolin, das heißt 3,5-Di-hydroxy-7-[1,2,6,7,8,8a-hexahydro-2,6-dimethyl-8-(2-methylbutyryloxy)-naphthalin-1-yl-]-heptansäure. Diese Verbindung wird in Toluol erhitzt, wobei sie zu Mevinolin lactonisiert wird. Die Reinigung des Mevinolin ausschließlich in Form eines Lacton enthaltenden Rohprodukts wird mittels Chromatographie und anschließender Umkristallisation durchgeführt (US-A-4 319 039, HU-A-182 069, 182 075 und 187 296).
Gemäß den US-A-4 231 938 und 4 319 039 wird neben der Extraktion auch ein XAD2-Adsorptionsharz zur Isolierung von Mevinolin verwendet.
Der Hauptnachteil des Extraktionsverfahrens liegt in der Tatsache, daß das Lösungsmittel, zusammen mit dem aktiven Bestandteil, viele gleichzeitig vorliegende Verunreinigungen löst, wodurch die weitere Reinigung komplizierter und teurer wird. Die Reinigung kann mit geeigneter Wirksamkeit nämlich nur mittels eines mehrstufigen Säulenchromatographieverfahrens und anschließender Umkristallisation durchgeführt werden.
Es wurden Versuche gemacht, um das in der HU-A-187 296 spezifizierte Extraktionsverfahren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung von Mevinolin aus Fermentationsflüssigkeit, die durch das Kultivieren eines Aspergillus obscurus MV-1 Holotyp-Stamms (Hinterlegungsnummer: NCAIM (P)F 001189) erhalten wurde, zu vergleichen. Die Ergebnisse von Beispiel 1 weisen nach, daß das aus der Fermentationsflüssigkeit durch Extraktion erhaltene Produkt durch Umkristallisation nicht geeignet gereinigt werden kann. Die Herstellung eines für pharmazeutische Zwecke geeigneten Produkts erfordert eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographieverfahren.
Die vorliegende Erfindung ist auf das Vorsehen eines Verfahrens zur Isolierung von Mevinolin aus Fermentationsflüssigkeit gerichtet, das leichter und wirtschaftlicher als die bisher bekannten Verfahren durchgeführt werden kann und die Herstellung des aktiven Bestandteils in einer für pharmazeutische Zwecke geeigneten Qualität ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntis, daß der aktive Bestandteil mit hoher Effizienz direkt aus dem Filtrat der Fermentationsflüssigkeit (nachstehend filtrierten Flüssigkeit) bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 1,0 abgetrennt werden kann. Das auf diese Weise getrennte Rohprodukt muß nicht durch Chromatographie gereinigt werden, da nur eine überraschend geringfügige Menge an Verunreinigungen mit demselben abgetrennt wird. So reicht eine einfache Umkristallisation aus, um das Produkt in geeigneter Qualität zu erhalten.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird der aktive Bestandteil aus der Biomasse in der Fermentationsflüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 10,0 gelöst, die Biomasse wird abfiltriert, das Rohprodukt wird von der filtrierten Flüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 1,0 abgetrennt und durch an sich bekannte Verfahren, vorzugsweise durch Umkristallisation, gereinigt.
Die Abtrennung des aktiven Bestandteils wurde bei verschiedenen sauren pH-Werten untersucht. Der ρΗ-Bereich von 2,4 bis 1,8, insbesondere 2,2 bis 2,0, hat sich als am meisten bevorzugt erwiesen. Außerdem wurde gefunden, daß die Trennung des aktiven Bestandteils von der filtrierten Flüssigkeit, und insbesondere die Filtrierbarkeit des Niederschlags, durch den Zusatz von zweiwertigen oder dreiwertigen Metallsalzen, wie Erdalkalimetallsalzen (CaCb, MgCl2, MgSO*) oder Erdmetallsalzen (Al2(SO*)3), verbessert werden kann.
Zur Bestätigung des obigen sind in der folgenden Tabelle Daten angegeben, um den Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit nach dem Abfiltrieren des aktiven Bestandteils bei unterschiedlichen pH-Werten in Anwesenheit von oder ohne den Zusatz von Calciumchlorid zur filtrierten Flüssigkeit anzuzeigen. Der Gehalt an aktivem Bestandteil wurde mittels HPLC bestimmt. 2
AT 401 060 B pH Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit (ug/cm3) ohne Zusatz irgendeines Salzes in Anwesenheit von 0,2 M CaCh 7,0 418 60 6,0 387 65,8 5,0 201 103 4,0 58 50 3,0 31 22 2,0 14 10 1,5 10 10 1,0 8 8
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß das meiste des aktiven Bestandteils an die Biomasse gebunden ist, sind sowohl die Effizienz des Lösens in der Fermentationsflüssigkeit als auch die Menge der gleichzeitig vorliegenden Verunreinigungen von großer Bedeutung.
Außerdem wurde auch gefunden, daß durch das Lösen des aktiven Bestandteils in der Fermentationsflüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 10,0, insbesondere zwischen 8,0 und 9,0, sowohl der Substanzverlust als auch die Menge der gleichzeitig vorliegenden Verunreinigungen auf ein Minimum reduziert werden können.
Unserer Erfahrung nach kann das Lösen des aktiven Bestandteils durch das Zusetzen einer geringfügigen Menge an Additiven zur Mischung verstärkt werden. Aliphatische Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Glykole mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, sekundäre oder tertiäre Amine mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkylacetate mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Dimethylformamid, Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol können als Additive dienen.
In der folgenden Tabelle ist der Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit vor der Abtrennung des aktiven Bestandteils bei pH 9,0 und nach der Filtration hievon bei pH 2,0, beides in Anwesenheit von und ohne den Zusatz von Additiven, gezeigt.
Additiv Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit (ug/cm3) 1 Vol.-% pH: 9,0 pH: 2,0 Diethylamin 412 9,2 Triethylamin 423 10,5 Dimethylformamid 460 6,9 Methanol 429 7,9 Ethanol 455 11,2 Isopropanol 467 8,7 Ethylenglykol 467 5,1 Propylenglykol 450 10,2 Polypropylenglykol 369 19,1 Isobutylacetat 258 8,8 Polyethylenglykol 431 11,8 Kontrolle (ohne Additiv) 193 8,6
Aus den Daten der obigen Tabelle ist ersichtlich, daß beim Zusatz verschiedener Additive der Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit höher ist als ohne die Verwendung derartiger Additive. So fördern die Additive das Lösen des aktiven Bestandteils aus der Biomasse in die Fermentationsflüssigkeit. Gleichzeitig geht auch hervor, daß die Additive keinen Einfluß auf die Trennung ausüben, diese letztere kann mit der gleichen Effizienz entweder in Anwesenheit von oder ohne den Zusatz von Additiven durchgeführt werden. Der Zusatz hievon ist gegebenenfalls annehmbar, da sie das technologische Verfahren vereinfachen. In Anwesenheit von Additiven ist nämlich eine einzige Bildung einer Suspension aus der Biomasse ausreichend, wohingegen ohne die Verwendung von Additiven dieses Verfahren wiederholt werden muß, um die gleiche Effizienz zu erhalten.
Als Additiv werden Ethylenglykol und Ethanol besonders bevorzugt.
Unserer Erfahrung nach haben die Additive ihre vorteilhafte Wirksamkeit auch dann, wenn sie nur in einer geringfügigen Menge wie 0,1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen der Fermentationsflüssigkeit, 3
AT 401 060 B verwendet werden, und, sogar wenn sie in größeren Mengen eingesetzt werden, beeinflussen sie die Trennung des gelösten aktiven Bestandteils nicht.
Ethanol-Konzentration Gehalt an aktivem Bestandteil in der filtrierten Flüssigkeit (ug/cm3) < 0 1 'S σ' pH: 9,0 pH: 2,0 0,1 400 8,9 0,5 425 8,5 1,0 455 11,2 5,0 447 11,5 10,0 441 13,0 15,0 434 18,1 20,0 430 26,0 ?s
Das Rohprodukt kann durch ein beliebiges, bekanntes Verfahren gereinigt werden, z.B. durch einfache Umkristallisation. Gemäß unseren Versuchen wird es bevorzugt, die Umkristallisation aus Isobutylacetat derart durchzuführen, daß die Lösung der Substanz in Isobutylacetat mit einer schwach basischen 2,5 Masse*% Ammoniumsulfat-Lösung, eingestellt auf pH 8,5, gewaschen wird, die Lösungsmittelphase mit 20 Kohle geklärt und konzentriert wird, und das abgetrennte Produkt abfiltriert wird.
Die Vorteile des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sind wie folgt: es ermöglicht die Eliminierung der Extraktion sowohl der Fermentationsflüssigkeit als auch der Biomasse vom technologischen Verfahren, der von der filtrierten Flüssigkeit bei einem sauren pH abgetrennte aktive Bestandteil ist überraschend rein, so daß er nicht durch Chromatographie gereinigt werden muß, sondern eine einfache 25 Umkristallisation zu einem für pharmazeutische Zwecke geeigneten Produkt führt. Demgemäß ist das technologische Verfahren einfach und kann wirtschaftlich mit einem geringfügigen Substanzverlust (bei einer Ausbeute von mehr als 90 %) durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem von einer beliebigen wässerigen Fermentationsflüssigkeit ausgegangen wird, die durch einen Mevinolin, entweder als 30 offenkettige Hydroxysäure oder als Lacton, biosynthetisierenden Mikroorganismus kultiviert wurde.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele detailliert erläutert:
Beispiel 1: Vergleichsversuch gemäß dem in der HU-A-187 296 spezifizierten Extraktionsverfahren 35 800 g Fermentationsflüssigkeit, kultiviert durch einen Aspergillus obscurus MV-1 Holotyp-Stamm (Hinterlegungsnummer: NCAIM (P)F 001189), enthaltend eine Gesamtmenge von 670 mg Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit 20 Masse-% Schwefelsäure-Lösung auf pH 4 eingestellt. Dann wurde die Flüssigkeit mit 400 cm3 Ethylacetat extrahiert. Die den aktiven Bestandteil enthaltene organische Phase wurde abgetrennt und der wässerige Rückstand mit weiteren 400 cm3 Ethylacetat erneut 40 extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden kombiniert (760 cm3, Gehalt an aktivem Bestandteil: 643 mg), über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde in 100 cm3 Toluol 2 h lang gekocht. Dann wurden die ungelösten Teilchen abfiltriert und nacheinander mit 50 cm3 5 Masse-% Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 50 cm3 Wasser gewaschen. Die Toluol-Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Gehalt an aktivem Bestandes teil in den so erhaltenen 3,5 g des öligen Produkts betrug 630 mg. Für die Kristallisation wurde das ölige Produkt durch Erwärmen in 15 cm3 Ethanol gelöst und 24 h lang bei einer Temperatur von 5*C stehengelassen. Das Produkt trennte sich nicht in kristalliner Form ab. Dann wurde das Lösungsmittel entfernt, und die 3,5 g des öligen Produkts wurden in zwei Teile geteilt. 1,75 g Produkt wurden aus 6 cm3 Isobutylacetat umkristallisiert, wie in Beispiel 2 spezifiziert. Das so Produkt trennte sich nicht in kristalliner Form ab.
Die andere Portion des Produkts wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule, gefüllt mit 20 g Kieselgel 60 (0,063 bis 0,2 mm) (Höhe: 22 cm, Durchmesser 1,6 cm), unterworfen. Die Säule wurde mit einer 40:60 Mischung von Ethylacetat und Methylenchlorid bei einer Rate von 20 cm3 h eluiert. Die 6 bis 10 Fraktionen, die den aktiven Bestandteil enthielten, wurden kombiniert, mit Aktivkohle 55 geklärt, filtriert und im Vakuum eingedampft, wobei 260 mg eines gelblichweißen festen Rückstands erhalten wurden, der aus Ethanol umkristallisiert wurde. Die abgetrennten Kristalle wurden durch ein G-4-Sieb filtriert, mit 10 cm3 n-Hexan gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. So wurden 180 mg chromatographisch reines Mevinolin erhalten. Der Verdampfungsrückstand der Mutterlauge, erhal- 4
AT 401 060 B ten während der Umkristallisation, wurde erneut aus Ethanol umkristallisiert, wobei weitere 35 mg Mevinolin erhalten wurden. Die Qualität des Produkts war die gleiche wie jene der ersten Generation.
Beispiel 2: 800 g Fermentationsflüssigkeit, kultiviert durch den in Beispiel 1 angegebenen Aspergillus-Stamm, enthaltend eine Gesamtmenge von 536 mg Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit Wasser auf 1200 g verdünnt. Dann wurde die Lösung mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung unter kontinuierlichem Rühren während 2 h bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 gehalten. Anschließend wurde die Biomasse abfiltriert und 2 x in je 400 cm3 Wasser suspendiert. Die Suspension wurde mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 eingestellt, erneut filtriert, und die Filtrate wurden kombiniert. So wurden 1900 cm3 filtrierte Flüssigkeit, enthaltend 530 mg aktiven Bestandteil, erhalten. Dann wurde die Flüssigkeit unter Rühren mit 15 Masse-% Schwefelsäure-Lösung auf pH 2,1 eingestellt. Der abgetrennte Niederschlag setzte sich ab, wurde filtriert, in 100 cm3 einer auf pH 2 eingestellten Schwefelsäure-Lösung suspendiert und erneut filtriert. Die Konzentration des aktiven Bestandteils im Filtrat betrug 12 ug/cm3.
Der filtrierte wässerige Niederschlag wurde in 50 cm3 Isobutylacetat gelöst, die wässerige Phase abgetrennt und die Lösungsmittelphase auf 2,5 cm3 konzentriert. Das Konzentrat wurde in 60 cm3 Isobutylacetat gelöst, 2 x mit je 60 cm3 wässeriger Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen, mit Ammoniumhydroxid auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,5 g Kohle geklärt, auf 10 cm3 konzentriert, 24 h lang bei 5*C kristallisieren gelassen, filtriert und im Vakuum getrocknet. So wurden 436 mg Mevinolin isoliert. Gehalt an aktivem Bestandteil: 98,7 % (HPLC).
Aus den kombinierten Mutterlaugen wurden weitere 65 mg Mevinolin mit einer Reinheit von 92,8 % erhalten.
Die Rohprodukte wurden kombiniert und aus Ethanol umkristallisiert. So wurden 450 mg Produkt isoliert.
Gehalt an aktivem Bestandteil: 99,8 % (HPLC).
Dihydromevinolin-Gehalt: 0,17 % (GC).
[e]250 = +329,8* (c = 0,5; Acetonitril).
Beispiel 3: 800 g Fermentationsflüssigkeit, kultiviert durch den in Beispiel 1 spezifizierten Aspergillus-Stamm, enthaltend eine Gesamtmenge von 605 mg Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit Wasser auf 1200 g verdünnt. Dann wurden der Mischung 2,4 g Ethylenglykol zugesetzt, und sie wurde durch das Zusetzen von 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung unter kontinuierlichem Rühren während 2 h bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 gehalten. Anschließend wurde die Biomasse abfiltriert und in 400 cm3 Wasser, enthaltend 0,8 g Ethylenglykol, suspendiert. Die Suspension wurde mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 eingestellt, erneut filtriert, und die Filtrate wurden kombiniert. Die so erhaltenen 1470 cm3 filtrierte Flüssigkeit, enthaltend 600 mg aktiven Bestandteil, wurden mit 15 Masse-% Phosphorsäure unter Rühren auf pH 2,1 eingestellt. Der Niederschlag setzte sich 4 h lang ab. Des weiteren wurde wie im in Beispiel 2 spezifizierten Verfahren vorgegangen.
So wurden 548 mg Mevinolin isoliert.
Gehalt an aktivem Bestandteil: 99,7 % (HPLC).
Dihydromevinolin-Gehalt: 0,15 % (GC).
[α]25ο = +329* (c = 0,5; Acetonitril).
Beispiel 4: 800 g Fermentationsfiüssigkeit, kultiviert durch den in Beispiel 1 spezifizierten Aspergillus-Stamm, enthaltend eine Gesamtmenge von 575 mg Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit Wasser auf 1200 g verdünnt. Dann wurden der Mischung 2,4 g Ethylenglykol zugesetzt, und der pH wurde durch das Zusetzen von 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung unter kontinuierlichem Rühren während 2 h bei 9,0 bis 9,5 gehalten. Anschließend wurde die Biomasse abfiltriert und in 400 cm3 Wasser suspendiert. Die Suspension wurde mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 9,0 und 9,5 eingestellt, erneut filtriert, und die Filtrate wurden kombiniert. So wurden 1480 cm3 filtrierte Flüssigkeit, enthaltend 567 mg aktiven Bestandteil, erhalten. Dann wurden 3,5 g Calciumchlorid zugesetzt, und die Lösung wurde mit 15 Masse-% Schwefelsäure-Lösung unter Rühren auf pH 2,1 eingestellt. Der 5
AT 401 060 B abgetrennte Niederschlag setzte sich 4 h lang ab. Des weiteren wurde wie im in Beispiel 2 spezifizierten Verfahren vorgegangen, mit dem Unterschied, daß der aktive Bestandteil mit 120 cm3 Isobutylacetat aus dem Niederschlag gelöst wurde.
So wurden 527 mg Mevinolin isoliert. 5 Gehalt an aktivem Bestandteil: 99,2 % (HPLC).
Dihydromevinolin-Gehalt: 0,25 % (GC).
[a]25D = + 329,5 * (c = 0,5; Acetonitril).
Beispiel 5: 10 10 000 g Fermentationsflüssigkeit, kultiviert durch den in Beispiel 1 spezifizierten Aspergillus-Stamm, enthaltend eine Gesamtmenge von 4180 mg Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit Wasser auf 15 000 g verdünnt. Dann wurden der Mischung 30 g Ethylenglykol zugesetzt, und sie wurde durch das Zusetzen von 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung unter kontinuierlichem Rühren 15 während 2 h bei einem pH-Wert zwischen 8,0 und 8,5 gehalten. Anschließend wurde die Biomasse abfiltriert und in 5 dm3 Wasser, enthaltend 10 g Ethylenglykol, suspendiert. Die Suspension wurde mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 8,0 und 8,5 eingestellt, erneut filtriert, und die Filtrate wurden kombiniert. So wurden 18 200 cm3 filtrierte Flüssigkeit, enthaltend 4091 mg aktiven Bestandteil, erhalten. Dann wurden der Mischung 20 g Magnesiumsulfat zugesetzt, und sie wurde mit 15 20 Masse-% Schwefelsäure-Lösung unter Rühren auf pH 2,1 eingestellt. Der abgetrennte Niederschlag setzte sich ab, wurde filtriert, in 1200 cm3 einer wässerigen Schwefelsäure-Lösung, eingestellt auf pH 2, suspendiert und erneut filtriert. Der filtrierte wässerige Niederschlag wurde in 600 cm3 Isobutylacetat gelöst, die wässerige Phase abgetrennt und die Lösungsmittelphase auf 30 cm3 konzentriert. Das Konzentrat wurde in 400 cm3 Isobutylacetat gelöst, 2 x mit je 400 cm3 2,5 Masse-% Ammoniumsulfat-Lösung 26 gewaschen, mit Ammoniumhydroxid-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und mit 6 g Kohle unter Rühren während i h bei Raumtemperatur geklärt. Die Lösung wurde auf 80 cm3 konzentriert, 24 h lang bei 5*C kristallisieren gelassen, filtriert und im Vakuum getrocknet. Des weiteren wurde wie im in Beispiel 2 spezifizierten Verfahren vorgegangen.
So wurden 3432 mg Mevinolin isoliert. 30 Gehalt an aktivem Bestandteil: 99,1 % (HPLC).
Dihydromevinolin-Gehalt: 0,19 % (GC).
[a]250 = +328,9' (c = 0,5; Acetonitril).
Beispiel 6: 35 100 kg Fermentationsflüssigkeit, kultiviert durch den in Beispiel 1 spezifizierten Aspergillus-Stamm, enthaltend eine Gesamtmenge von 44,3 g Mevinolin sowohl als Lacton als auch als Hydroxysäure, wurden mit Wasser auf 150 kg verdünnt. Dann wurden der Mischung 300 g Ethylenglykol zugesetzt, und sie wurde durch das Zusetzen von 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung unter kontinuierlichem Rühren während 2 h 40 bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 gehalten. Anschließend wurde die Biomasse abfiltriert und in 50 kg Wasser, enthaltend 100 g Ethylenglykol, suspendiert. Die Suspension wurde mit 20 Masse-% Kaliumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 eingestellt, erneut filtriert, und die Filtrate wurden kombiniert. So wurden 183 kg filtrierte Flüssigkeit, enthaltend 42,9 g aktiven Bestandteil, erhalten. Dann wurden 200 g Magnesiumsulfat zugesetzt, und die Lösung wurde mit 15 Masse-% Schwefelsäure-Lösung 45 unter Rühren auf pH 2,1 eingestellt. Der abgetrennte Niederschlag setzte sich ab, wurde filtriert, in 12 dm3 einer Schwefelsäure-Lösung, eingestellt auf pH 2, suspendiert und erneut filtriert. Der filtrierte wässerige Niederschlag wurde in 6 dm3 Isobutylacetat gelöst, die wässerige Phase abgetrennt und die Lösungsmittelphase auf 300 cm3 konzentriert. Das Konzentrat wurde in 4 dm3 Isobutylacetat gelöst, 2 x mit je 4 dm3 2,5 Masse-% Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen, mit Ammoniumhydroxid-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und so mit 60 g Kohle unter Rühren während i h bei Raumtemperatur geklärt. Die Lösung wurde auf 0,8 dm3 konzentriert, 24 h lang bei 5 · C kristallisieren gelassen, filtriert und im Vakuum getrocknet. Des weiteren wurde wie im in Beispiel 2 spezifizierten Verfahren vorgegangen.
So wurden 37,03 g Mevinolin isoliert.
Gehalt an aktivem Bestandteil: 99,3 % (HPLC). 55 Dihydromevinolin-Gehalt: 0,18 % (GC).
[a]25D = +329,5' (c = 0,5; Acetonitril). 6
Claims (4)
- AT 401 060 B Patentansprüche 1. Verfahren zur Isolierung von Mevinolin durch Lösen des aktiven Bestandteils aus der Biomasse in der Fermentationsflüssigkeit und anschließendes Trennen desselben von der filtrierten Fermentationsflüssigkeit, gekennzeichnet durch das Lösen des aktiven Bestandteils bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 10,0, vorzugsweise zwischen 8,0 und 9,0, Trennen desselben von der filtrierten Flüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 1,0, vorzugsweise zwischen 2,2 und 2,0, und Filtrieren und Reinigen desselben in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Umkristallisation.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösen in Anwesenheit eines oder mehrerer der folgenden Additive, angewendet in einer Menge von zumindest 0,1 Masse-% in bezug auf das Volumen der Fermentationsflüssigkeit, erfolgt: aliphatische Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Glykole mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, sekundäre oder tertiäre Amine mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkylacetate mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Dimethylformamid und/oder Polyethylenglykol und/oder Polypropylenglykol.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Ethanol oder Ethylenglykol als Additv eingesetzt wird.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der filtrierten Flüssigkeit vor der Trennung ein Erdalkalimetallsalz oder ein Erdmetallsalz zugesetzt wird. 7
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