DK147710B - Fremgangsmaade til fremstilling af antifungalt aktive peptidantibiotika valgt blandt aculeacin-aalfa, aculeacin-agamma, aculeacin-dalfa og aculeac in-dgamma - Google Patents

Description

147710

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antifungalt aktive peptidantibiotika valgt blandt aculeacin-Aa, aculeacin-Ay, aculeacin-Γα og aculeacin-Dy.

Det har vist sig, at en svamp tilhørende slægten Aspergillus, nemlig Aspergillus aculeatus, stamme nr. M 4845, NER! 11,270, fremstiller hidtil ukendte antibiotika, som er aktive mod sådanne svampe som Candida albicans og dermatofyter og plantepatogene svampe i lave koncentrationer. De nævnte antibiotika betegnes aculeacin-Αα, -Αγ, -Da og -Dy,

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at en mikroorganisme af en stamme af slægten Aspergillus og med væsentligt samme kaakteri-stika som Aspergillus aculeatus M 4845 NKRL 11.270 dyrkes i et næringsmedium indeholdende assimilerbart carbon og nitrogen, og at aculeaein-Αα, aculeaein-Αγ, aculeaci‘n-Da og./él-ler aculeacin-Dy isoleres derfra'.

Aspergillus-stammen M 4845 har følgende taksonomiske egenskaber: A. Makroskopisk iagttagelse: 1. Czapeok-agarmedium: Vækst: Hurtig diameter 55-65 mm ved 26°C på 10 dage.

Overflade af koloni: Plan og tynd, hvid i et tidligt stadium af dyrkningen; fawn (tone 4ig) afhængende af graden af dannelse af konidier. Dannelsen af konidier er rigelig.

Koloniens omgivelser: lidt spindelvævshinde.

Bagside af koloni: Farveløs - bleggul (tone Ica).

Ingen dannelse af diffusibelt pigment og eksudat.

Vækst ved 37°C: Langsom, 14-17 mm på 10 dage.

2, Maltekstraktagarmedium: Vækst: Hurtig, diameter 60-70 mm ved 26°C på 10 dage.

Overflade af koloni: Plan og tynd, hvis i et tidligt stadium af dyrkningen, beaver (tone 41i) afhængende af graden af dannelse af konidier,

Konidier: Rigelig dannelse.

2 147710

Koloniens omgivelser: Glat eller næsten glat.

Bagside af koloni: lysegul (tone 1 1/2 ca).

Ingen dannelse af diffusibelt pigment og eksudat.

Vækst ved 37°C: langsom; 10-12 mm på 10 dage, 3, Kartoffelglueoseagarmedium: Væksthastighed og -betingelse: Lignende som på malt- ekstraktagarmedium undtagen tydeligt spindelvævslignende omgivelser for koloni.

Angivelserne af farve er baseret på "Color Harmony Manual", udgave 1958 fra Container Corporation of America, B. Mikroskopisk iagttagelse:

Konidiehoved er kugleformet (globøst) i et tidligt stadium, hvorefter det bliver radialt segmenteret til flere søjler. Længde af konidiofor er 400-1500 μ. Bredden er 8-13 μ, farveløs/let gulligtbrun, og væggen er glat og lidt tyk. Tykkelsen er ca, 1,5-2,0 μ. Blære lysebrun og kugleformet eller næsten kugleformet,· diameter 30-75 μ, hovedsagelig 40-60 μ, Sterigma optræder enkeltrækket med en størrelse på 6-8 x 3-4 μ tæt i en række, Komidium er normalt kugleformet eller elliptisk visende variation i formen, og størrelsen er 3,5-5,0 x 3,0-3,5 μ, let gulligtbrunt farvet, og væggen er ru, C, Vækstbetingelser: Væksttemperatur: 13-40°C, vækst-pH-værdi: 2-9,

Optimal væksttemperatur og pH-værdi: 29-31°C, pH 3-5» Ifølge ovenstående taksonomiske undersøgelser hører denne stamme til gruppen af Aspergillus niger (Japan J. Agricul. Chem., 27, 806-809 (1953) og slægten Aspergillus 328-331 (1965)) med sortbrune konidier. Endvidere differentieres denne gruppe i to grupper i overensstemmelse med uniseriate (en-keltrækkede) eller biseriate (dobbeltrækkede) sterigma. Denne stamme hører til den enkeltrækkede gruppe. Por nærværende er svampe med enkeltrækkede sterigma kendt som Aspergillus japo-nicus og Aspergillus aculeatus, og da konidium i Aspergillus japonicus er kugleformet eller subglobøst på 3-3,5 μ» og blæren er 15-45 μ, i hovedsagen 20-35 u, og konidium i Aspergillus U7710 3 aculeatus er suglobøst eller elliptisk på 4,5-5 x 3-3,5 μ, og blæren er 35-100 μ, i hovedsagen 60-80 μ, så ligner den foreliggende stamme Aspergillus aculeatus i taksonomi. Endvidere er stammen Aspergillus aculeatus ATCC 1034 opnået fra American Type Culture Colleetion, og den foreliggende stamme lig hinanden ved sammenligning, hvorfor den foreliggende stamme omtales som Aspergillus aculeatus M 4845« Denne stamme er deponeret i Institute for Industriel Fermentation and Technology, Agency of Industrial Science and Technology,

Japan, og har fået det permanente indleveringsnummer Ferm-P nr, 4023. Denne stamme er også deponeret i United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service,

Northern Utilization Research and Development Division og har fået det permanente indleveringsnummer RRRL 11,270.

Opfindelsen skal forklares nærmere i forbindelse med tegningen, hvor fig, 1 viser et U.V.absorptionsspektrum for aculeaoin--Aa i methanol, fig. 2 I,R.absorptionsspektrum, for aculeacin-Aa, fig. 3 aminosyreanalyse for aculeacin-Αα,: fig. 4 U.V.absorptionsspektrum for aculeacin-Αγ i methanol; . '· fig, 5 I.R.absorptionsspektrum for aculeacin-Αγ, fig, 6 aminosyreanalyse for aculeacin-Αγ, fig. 7 U.V.absorptionsspektrum for aculeacin-Dy i methanol, fig, 8 I.R.absorptionsspektrum for aculeacin-Dy, fig. 9 aminosyreanalyse for aculeacin-Dy, fig.10 U.V.absorptionsspektrum for aculeacin-Da i methanol, fig.11 I. R, absorptionsspektrum for aculeacin-Da, og fig.12 aminosyreanalyse for aculeacin-Da.

Dyrkningen af mikroorganismen kan udføres på et antal forskellige måder såsom væskedyrkning eller overfladedyrkning, Ved en industriel fremstilling foretrækkes submers luftningskultur podet med 1-2 dage dyrket væske eller sporesuspension af Aspergillus aculeatus M 4845 NRRI 11.270, Næringsmedier, som er egnede til fremstillingen af 147710 4 aculeaciner, omfatter en assimilerbar kilde for carbon såsom glucose, saccharose, lactose, maltose, stivelse, dex-tran, melasse og glycetol. Yderligere en assimilerbar kilde for organisk og uorganisk nitrogen såsom majsstøbevæske, sojabønnepulver, bomuldsfrøolie, hvedegluten, kødekstrakt, gæreketrakt, gær, caseinhydrolysat, pepton og ammoniumsalt eller nitrat, og medierne indeholder yderligere salte såsom phosphat, magnesium, calcium, kalium, natrium, zink, ferri-salte eller mangansalte.

Dyrkningstemperaturen for fremstillingen af aculea-ciner kan vælges i det temperaturområdé, hvori mikroorganismen kan vokse, og aculeacinerne fremstilles fortrinsvis i området 25-28°C.

Dyrkningsperioden er normalt 70-90 timer, og når dyrkningsvæsken når maksimal styrke i henseende til antibiotikumproduktion, bør dyrkningen afbrydes, I på denne måde opnåede dyrkede væsker samles aculeacinerne i myceliet og især på ydersiden deraf.

Aculeacinerne kan undersøges ved bægermetoden eller ved papirskivemetoden under anvendelse af Candida albicans eller Trichophyton asteroides som kontrolorganismer,

Aculeacinerne kan fortrinsvis isoleres effektivt fra myceliet.

Ifølge en foretrukken fremgangsmåde filtreres hele dyrkningsvæsken til opnåelse af mycelium indeholdende acu-leaciner under anvendelse af tromlefiltre, filterpresse eller centrifugalseparator. Det således opnåede våde mycelium ekstraheres med vandblandbart organisk opløsningsmiddel såsom etbanol og acetone, hvorpå opløsningsmidlet i ekstrakten destilleres af, resten fortyndes med vand, og fortyndingsvæsken ekstraheres med n-butanol eller ethylacetat, og ekstrakten vaskes med vand og inddampes under formindsket tryk til opnåelse af et olieagtigt materiale. Det olieagtige materiale kan renses ved adsorption eller fordelingschroma-tografi under anvendelse af aktivt aluminiumoxid, silicagel eller lignende, og den således opnåede aktive fraktion inddampes til opnåelse af et pulver, som udviser en enkelt plet U7710 5 ved tyndtlagschromatografi ved adskillige fremkaldende opløsningsmiddelsystemer.

De fysisk-kemiske egenskaber af aculeacinerne er som følger: 1. Elementæranalyse.

0# Μ M

Aculeacin-Aa 56,48 8,60 9,24

Aculeacin-Ay 54,70 8,23 10,51

Aculeacin-Da 55,96 8,44 9,96

Aculeacin-Dy 57,55 8,32 8,94

Svovl og halogen er ikke fundet,.

2, Molekylvægt.

Eastmetode Aminosyre- Gelfiltre- _ analyse x ringsmetode xxxx

Aculeacin-Aa 1015 (860xx 800 +110

Aculeacin-Αγ 1021 (860) xx 800 +110

Aculeacin-Da 1243 (555)n *** 850 +100

Aculeacin-Dy 1265 (555)D ss* 850 +100 s Beregnet ud fra detekteret mængde threohin.

xx 3,0 μιηοΐ threonin detekteres fra hydrolysat af 2,6 mg aculeacin-Αα eller -Ay » xxx 4,8 μmol threonin detekteres fra hydrolysatet af 2,6 mg aculeaoin-Da eller -Dy.

xxxx Skønnet ved elueringstiden i sammenligning med antibiotika med kendt molekylvægt under anvendelse af Sephadex EH-20, (indregistreret varemærke for Pharmacia Pine Chemicals Co, Sverige).

147710 6 3. Smeltepunkt.

Aculeacin-Αα 174-177°C

Aculeacin-Αγ Γ72-175°0

Aeuleaoin -Da 15 9-l62°C

Aculeacin-Dy 159-162°C

4. Drejningsevne a2^ (c = 0,25, methanol).

Aouleacin-Aa -46,8°

Aculeaein-Αγ -47f4°

Aculeacin-Da -45,7°

Aculeacin-Dy -46,7° 5. Farvereaktioner.

Reaktionerne er angivet med + for positive og med - for negative reaktioner: _Aouleaciner_ Αα Αγ Da Ργ

Pauli-reaktion + + + +

Folinreaktion +· + + +

HlO^-henzidin-reaktion + + + + KMfcO^-affarvningsreakt ion + + + +

Molisch-reaktion + + + +

Biuretreaktion + + + +

Xanthoproteinreaktion + + + +

Toliens-reaktion + + + +

Ninhydrinreaktion _ _ _ __

Bennedict-reaktion _ _ _ _

Sakaguohi-reaktion _ _ _ __

Ehlrich-reaktion _ __ _ _

Ferrichloridreaktion _ __ _ _

Dragendorff-reaktion _ _ _ _ 2,4-dinitrophenylhydrazinreaktion _ _ _ _ 6. Opløselighed.

Opløselig: lavmolekylære alkoholer, lidt opløselig: ethylacetat.

Næsten uopløselig: acetone, chloroform, n-hexan, petroleumsether og vand.

7.

Aculeacinerne er umulige at titrere, fordi de sønderdeles ved et alkalisk pH, og som følge af ringe opløselighed er aculeaci- 7

1477 TO

nerne ubevægelige ved elektroforese. Aculeaeinerne kan ikke overføres til vand ved pH = 2-9 fra butanol, Dette kan antyde den neutrale karakter af aculeaeinerne.

8. Farve.

Hvidt krystallinsk pulver.

9. Stabilitet.

Stabilt ved 37°C i 20 timer ved sure og neutrale betingelser. Ilstabilt ved alkalisk betingelse.

10. TT.V.absorptionsspektrum.

Fig. 1: Aculeacin-Αα i methanol (32,4 γ/ml)

Fig, 4: Aculeaein-Ay i methanol (32,4 γ/ml)

Fig. 7i Aculeacin-Da i methanol (40 γ/ml)

Fig.10: Aculeacin-Dy i methanol (40 γ/ml)

Som det fremgår af figurerne, har aculeacin-Αα og -Αγ maksimum ved 278 nm og skuldre ved 226 og 283 nm, og aculeacin-Da og -Dy har maksimum ved 278 nm og skuldre ved 226 nm og 284 nm.

Elcm for hver forbindelse fremgår af følgende tabel (methanol) : 226 nm 278 nm 283 nm 284 nm (skulder) (toppunkt) (skulder) (skulder)

Aa 146 16,0 13,5 Αγ 145 15,5 13

Da 138 17,5 - 14,7

Dy 137 17,0 - 14,2 11. I.R.absorptionsspektrum (KBr-tablet):

Aculeaciner Absorptionsbånd, cm"^

Fig. 2: Aculeacin-Aa 3350, 2910, 2840, 1620, 1510, 1435

Fig. 5: acuelacin-Αγ " " " " " "

Fig. 8: aculeacin-Da " " " " " ”

Fig.11: aculeacin-Dy " H " " ” ” 12. Bf-værdi.

Bærer: Silicagelark (Eastman Kodak Co., Eastman Chromagram Ark nr. 6060).

Opløsningsmiddel: A: Chloroform og methanol (10:3).

B: Ethylacetat, methanol og vand (20:4.*1).

C: Ethylacetat og n-butanol (3:1) mættet med vand.

8 147710

Fremkalder! lod

Biologisk undersøgelse under anvendelse af Candida albicans.

Opløsningsmiddelsystem __A_ _B_ j_

Aculeacin-Aa 0,47 0,28 0,37

Aculeacin-Ay 0,47 0,28 0,37

Aculeacin-Da 0,67 0,35 0,42

Aculeacin-Dy 0,67 0,35 0,42 13. Retentions tid ved væskechromatografi.

Retentionstid (minutter) Aculeacin-Aa 7,9

Aculeacin-Ay 12,3

Aculeacin-Da 9,2

Aculeacin-Dy 14,1 5 mg/ml aculeaciner opløst i 8 pliter methanol anbringes på en søjle på 15 x 500 mm. Bærer: Polystyrenharpiks. Fremkalder: 85$'s vandigt methanol indeholdende 0,01$ triethylamin. Søjletem-ratur: 55°C. Type: Hitaphi 634 fra Hitachi Corp., Japan.

14. Hydrolyse.

Hydrolysat

Aculeacin-Aa myristinsyre

Aeuleacin-Αγ palmitinsyre

Aculeacin-Da myristinsyre

Aculeacin-Dy palmitinsyre

Aculeacinerne hydrolyseres af 6 F HC1 ved: 110°C og eks-traheres med ether. Etherlaget anbringes i en gaschromatograf, og de frie fede syrer analyseres kvalitativt.

15. Aminosyresammensætning.

Aculeacinerne hydrolyseres med 6 U HC1 ved 110°C i 20 timer, og ninhydrinpositive komponenter analyseres ved hjælp af automatisk aminosyreanalysator (Japan Electron Optical Corp., type: JIC-5AH-analysator). Resultaterne fremgår af fig. 3 (aculeacin-Αα), fig. 6 (aculeacin-Αγ), fig. 9 (aculeacin-Dfc) og fig, 12 (aculeacin--Dy), hvor threonin og adskillige ukendte ninhydrinpositive komponenter findes.

Aculeacinerne er peptidantibiotika, som er næsten uopløselige i vand i overensstemmelse med ovenstående fysisk-kemiske egenskaber.

Blandt de hidtil rapporterede antibiotika med U.V.absorptions- 147710 9 maksimum ved 278 nm i methanol, som svarer til aculeacin-Αα, -Αγ, -Da og -Dy, er der henholdsvis myroridin (Japan, patentpublikation 45-12.276), athlestatin (Japan, patentpublikation 41-12.668), moni-lin (Takeda Institute Annual Report, 14. 8-10 (1955)), oryzamycin (Japan, patentpublikation 38-2800), saramycetin (Antimicobial Agents and Chemotherapy, 1961, 436-666) unamycin (J. Antibiotics, Ser. A, 13. 114-120 (1960)), vengicid (engelsk patentskrift 764.198); aculeacin-A og aculeacin-D (USA patentskrift 3.978.210) og eehino-candin B (antibiotikum Δ 32.204, schweizisk patentskrift 568.386.

Aculeacinerne er imidlertid forskellige fra disse antibiotika af følgende grunde.

Myroridin er et basisk vandopløseligt antibiotikum, som adskiller sig fra aculeacinerne, Athlestatin ligner aculeacinerne i sine fysisk-kemiske egenskaber og biologiske egenskaber, men drejningsevnen for athlestatin er a2^ = -64° (c = 0,5$, methanol), og U.V.absorptionsmaksima for athlestatin er ved 278 og 225 nm, og dets elementæranalyse er: C i« 55,25, tø° 7,50, H# 9,41 tiXforskel fra aculeacinerne. Monilin er et basisk nucleosidstof, og nitrogenindholdet i dets elementæranalyse ligger højere end hos aculeacin. Oryzamycin er et surt olieagtigt stof. Saramycetin giver aspara-ginsyre, cystin, glycerin og threonin ved hydrolyse, og unamycin er et surt polyenstof. Tengicid er i lighed med molinin et nucleosidstof. Aculeacin-A, aculeacin-D og echinocandin B ligner aculea-cin-Αα og -Αγ henholdsvis aculeacin-Da og -Dy i fysisk-kemiske og biologiske egenskaber, men aculeacinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er forskellige fra kendt aculeacin-A og -D og echinocandin B i deres retentionstider ved væskechromatografi, hvor aculeacin-Αα er 7,9 minutter, aculeacin-Αγ er 12,3 minutter, og hydrolysatet, hvor der fås myristinsyre fra aculeacin-Aa og -Da, palmitinsyre fra aculeacin-Αγ og -Dy, og linolsyre og stearinsyre fra echinocandin B.

Således er aculeacin-Αα, -Αγ, -Da og -Dy hidtil ukendte antibiotika, som er forskellige fra de hidtil kendte antibiotika.

De biologiske egenskaber af aculeacinerne er som følger: 147710 10

Koncentration for 80%fs inhibering (γ/ml): . aouleacin-Αα -Av -Da . -Sl. Trichophyton asteroides 0,004 0,004' 0,001 0,002

Trichophyton rubrum 0,006 0,006 0,002 0,003

Microsporum gypseum 0,008 0,008 0,002 0,004

Eusarium oxysporum f. lini 2,0 2,0 0,1 1,0

Diaporthe phaseolorum 0,01 0,01 0,0025 0,005

Ascochyta soyaecola 0,08 0,08 0,02 0,04

Sclerotium bataticola 0,08 0,08 0,02 0,02 fflomerella singulata 0,06 0,03 0,01 0,03

Helminthosporium oryzae 0,008 0,008 0,002 0,004

Akut toksicitet på mus: ID,-q for aculeaciner i injektion fremstillet ved hjælp af natriumdeoxycholatadditiver er som følger: Indgiftsve .i _LD^q mg/kg_

Ag Ay Da Dv intravenøst 350 350 intramuskulært 600 600 over 1000 over 1000

Eksempel 1.

100 ml vandigt medium bestående af glucose 2$, polypepton 1$, majsstøbevæske 1$, KHgPO^ 0,2$ og MgS0^,7H20 0,1$ indføres i 500 ml erlenmeyerkolber (pH 6,5)’,- steriliseret ved 120°C i 15 minutter. Aspergillus aculeatus M 4845 HRRI 11.270 podes deri og dyrkes under omrystning ved 26°G i 48 timer. Dyrkningsvæsken podes aseptisk i 15 liter vandigt medium (pH 6,5) bestående af saccharose 1,5$, dextrin 1,4$, polypepton 2$, majsstøbevæske 0,45$, KHgPØ^ 0,2$, MgSO^ 0,1$ og antiskummiddel i en 30 liter dyrkningsbeholder, og der gæres ved 26°C i 96 timer under luftning med 30 liter pr minut og omrøring ved 250 omdrejninger pr. minut til opnåelse af ca. 15 liter gæret væske. Væsken prøves for aculeaoiner i filtratet og i myceliet med positivt resultat.

Eksempel 2.

10 liter dyrket væske fra eksempel 1 sugefiltreres til opnåelse af vådt mycelium (1 kg). Til det våde mycelium sættes 5 liter methanol, og man ekstraherer under omrøring i 2 timer, og me-thanolopløsningen fås ved vakuumfiltrering. Restmycelium ekstrahe-res igen med methanol (5 liter) til opnåelse af ekstrakt. De to ekstrakter slås sammen, og methanolet afdestilleres under formindsket tryk til opnåelse af 2 liter koncentrat. Til dette sættes 147710 11 2 liter vand, og mediet ekstraheres 2 gange med 2 liter n-butanol hver gang. laget af n-butanol samles. Efter at n-butanoliaget er vasket med vand (5 liter), inddampes butanolet i vakuum, medens man tilsætter en lille mængde vand til opnåelse af et mørkfarvet viskost koncentrat. Til dette sættes n-hexan (500 ml) til udfældning af materialet, som vaskes med ethylaeetat til opnåelse af 12,5 g rå aculeaciner.

Eksempel 5.

12,5 g rå aculeaciner fra eksempel 2 opløst i en lille mængde methanol adsorberes i silicagel (25 g, produkt fra E. Merck AG), og derefter afdestilleres methanolet under formindsket tryk.

Een således opnåede silicagel anbringes på en søjle (indvendig diameter 50 mm) pakket med silicagel (600 g) og elueres med et blandet opløsningsmiddel af ethylaeetat, isopropanol og vand (10:1,5s0,7) til fraktionering af hver 45 ml i en fraktion.

Eksempel 4.

Fraktionerne nr. 43 til 57 fra eksempel 3 kombineres og tørres i vakuum, og 10 μϋΐβτ tørret materiale opløst i methanol anbringes i en højtryksvæskechromatograf (type: Hitachi 634 fra Hitachi Corp., søjle: 5 x 500 mm, bærer: polystyren, fremkalder: 85# vandigt methanol indeholdende 0,01# triethylamin, søjletemperatur 55°0), og fraktionerne med retentionstids-værdier ved 7,4-8,4 minutter samles. Ee ved gentagne operationer opnåede fraktioner kombineres og tørres i vakuum og genopløses i en lille mængde methanol. Eer tilsættes et blandet opløsningsmiddel af ethylaeetat og n-hexan (1:1). Udfældningen samles til opnåelse af 230 mg renset aculeacin-Aa.

Eksempel 5.

I eksempel 4 samler man i stedet for fraktionerne med retentionstiderne 7,4 - 8,4 minutter fraktionerne med retentionstiderne 11,4 - 13,4 minutter i højtryksvæskechromatografen, og den øvrige behandling er som i eksempel 4, hvorved man får 50 mg renset aculea-cin-Αγ.

Eksempel 6.

Fraktionerne nr. 32 til 42 i eksempel 3 slås sammen og tørres i vakuum til opnåelse af et hvidt pulver (900 mg) og opløses 12 147710 i en lille mængde methanol. ffiethanolopløsningen adsorberes i sili-cagel (2 g), hvorefter methanolet afdestilleres under formindsket tryk. Den således opnåede silicagel anbringes på en søjle (indvendig diameter 25 mm) pakket med silicagel (45 g fra Tokyo Kasei Go.) og elueres med en blanding af chloroform og methanol (10:1,5), Fraktionerne nr, 76 til 141 (5 g i en fraktion) samles, og de kombinerede fraktioner tørres til opnåelse af 370 mg materiale indeholdende aculeacin-Da og -Dy, 10 μΙ^βΓ af methanolopløsningen deraf anbringes under de samme betingelser i en højtryksvæskechromatograf som i eksempel 4, og fraktionerne med retentionstider på 8,6 - 9,8 minutter samles,

De fraktioner, som fås ved gentagen operation, samles og tørres i vakuum og opløses derpå i en lille mængde methanol. Der tilsættes et blandet opløsningsmiddel af ethylacetat og n-hexan (1:1), Udfældningen samles, hvorved man får 115 mg renset aculeacin-Da.

Eksempel 7.

I eksempel 6 erstattes samlingen af fraktioner med retentionstider på ..8,6 - ' 9,8 minutter ved højtryksvæskechromatografi med samling af fraktionerne med retentionstider på 14,4 - 16,4 minutter, og den øvrige béhandling udføres på samme måde som i eksempel 6, hvorved der fås 15 mg renset aculeacin-Dy.