DE1617768B2

DE1617768B2 - Pyrimidinnucleoside (polyoxine d, e, f, g und h) und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE1617768B2
Application number: DE1967R0046181
Authority: DE
Priority date: 1966-06-06
Filing date: 1967-06-05
Publication date: 1976-12-16
Also published as: CH508041A; ES341402A1; IT1048383B; DE1617768A1; GB1156390A; US3703506A; NL6707840A

Description

HOCH

CH₂OCONH₂

OH OH

COOH

HOOC

OC-NCH 0 H₂NCH

CH₇ H

(II) CH₂OCONH₄

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, durch Züchten eines Mikroorganismenstammes von Streptomyces cacaoi var. asoensis mit einer der ATCC-Nummern 19 093 oder 19 094 in einem Züchtungsmedium, das sich aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und anorganischen Stoffen zusammensetzt, bei einer Temperatur von 25 bis 35°C, dadurch gekennzeichnet, daß man die angereicherten antibiotisch wirksamen Stoffe in üblicher Weise aus dem Züchtungsmedium isoliert und in die einzelnen Verbindungen auftrennt.

HOCH

OH OH

CH₂OCONH₂ COOH

CH, · CH

COOH

(III) Die Erfindung betrifft neue Pyrimidinnucleoside, nachfolgend als Polyoxine D, E, F, G und H bezeichnet, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese neuen Polyoxine D, E, F, G und H zeigen spezifische fungicide Wirksamkeiten gegen pflanzenpathogene Pilze.

Die neuen Polyoxine D, E, F, G und H besitzen die folgenden chemischen Strukturformeln:

CH₂OH

Polyoxin D:

HOOC

OC-NCH	H	[ 0	OH	\
I			OCONH₂	\
H₂NCH	4
CH₂	H		H
HOCH		OH
CH₂

(IV)

COOH

Polyoxin E;

COOH

HOOC

OC-NCH O

I H

H₇NCH

N^H

CH₂ H

HOCH ^{0H 0H} CH₂OCONH₂

Polyoxin F: COOH

HN

CH₃ · CH

^NC°

OC-NCH O

I H

H₇NCH

Xi

H H

HCOH H

\A

HOCH ^{0H 0H} CH₂OCONH₂

Polyoxin G:

HOOC

OC-NCH O

I H

H₇NCH

H.

CH₂ H
HOCH ^{0H 0H}

CH₂OCONH₂

Polyoxin H: COOH

HN

CH₃ · CH

NCO

OC-NCH O

I H

H₇NCH

N^H

H.

HCOH H

HOCH

OH OH

CH₂OCONH₂ (Π)

Im folgenden werden die physikochemischen Eigenschaften der neuen Polyoxine D, E, F, G und H beschrieben :

1. Zersetzungspunkte

Die Polyoxine D, E, F, G und H (nachfolgend auch kurz mit D, E, F, G und H bezeichnet) zeigen keine klaren Zersetzungspunkte, sondern werden allmäh-Hch angefärbt und zersetzen sich bei oberhalb 190° C, oberhalb 180°C, oberhalb 190°C, oberhalb 190°C und oberhalb 200⁰C, in der genannten Reihenfolge.

2. Werte der Elementaranalyse

	20 L)	39,44	4,45	13,62
pCOOH	E	40,52	4,88	14,02
	F	43,87	4,96	12,76
	G	41,61	5,17	14,16
/Tin	25 H	46,13	5,49	13,64

HlA

CH₇OH

(IV)

Die Differenz zu 100 entspricht jeweils dem Gehalt an Sauerstoff.

3. Molekulargewichte

D, E, F, G und H sind amphotere Stoffe, ihre Molekulargewichte, berechnet anhand der durch elektrometrische Titration ermittelten Neutralisationsäquivalente betragen:

40

45

(V)

D:	530.	C₁₇H₂₃	Uli⁰ --	N₅O₁₄.	(C =	1%,	Wasser).
E:	521.	Ci₇H₂₃	UVo =	N₅O₁₃.	(C =	1%,	Wasser).
F:	616.	C₂₃H₃₀	UVo⁰ -	,N₆O₁₅.	(C =	1%,	Wasser).
G:	497.	C₁₇H₂₅	UV⁰ =	N₅O₁₂.	(C =	1%,	Wasser).
H:	645.	C₂₃H₃₂	UV⁰ =	N₆O₁₃.	(C =	1,3°/	Ό, Wasser)
	Spezifische
	D:
	E:
	F:
	G:
Summenformeln:	H:
D:
E:
F:
G:
H:
Drehungen:
= +30°
= +19°
= -18°
= +37°
= -38°

55

60

6. UV-Absorptionsspektren

Die UV-Absorptionsspektren von D, E, F, G und H in 0,05 n-HCl. (durchgezogene Kurve) und 0,05 n-Na0H (unterbrochene Kurve) sind der Reihe nach in den Fig. 1, 2, 3, 4 und 5 wiedergegeben.

Die maximalen Absorptionswerte sind folgende

D: ;Ca*"'^HC1 = 218 πΐμ (Ej* 217), 276 ηΐμ (EIS, 217),

ι 0,05 n-NaOH tj 1 _. /Cl% 1 1Π\

X_mM = 271 mμ (b_lcm lj/).

E: A°„;^o _a ⁵xⁿ"^HC' = 218 ηΐμ (EJ* 200),

276 ηΐμ (^El* ²⁰°)'

F:

_A0.05n-NaOH

0,05

H: ASi£-^HCI =

o,o5n-NaOH

max

215πΐμ(Εί?_Μ257), 276 mμ (EJ ?„ 181),

^O 1 'Πμ (,ί-Ίοπ I Iv),

₂64 Γπμ (Ei" 134)

265 πΐμ (EJS. 127),

E: 3200—3500, 1690, 1617, 147Q, 1410, 1385,
1345, 1275, 1120, 1065, 880, 823, 769 cm-'.

F: 3200—3500,1710,1635,1465,1380,1275,
1125,1665,810 cm-'.

_G. 3200—3500,1685,1605,1476,1415,1346,
1282,1125,1065,790,770Cm"¹.

H: 3400, 1693, 1640, 1470, 1380, 1320, 1280,

8. Löslichkeiten

'5 jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Benzol und Äther.

9. pK-Werte

D, E und F besitzen je 4 titrierbare Gruppen, G und H 3 titnerbare Gruppen. Die pK-Werte sind folgende:

Als Ergebnis von Abbau-Untersuchungen der genannten Polyoxine wurde klargestellt, daß die Absorption von G von der in dem Molekül enthaltenen chromophoren 5-Hydroxymethyluracil-Gruppe herrührt.

Die UV-Absorption von D, E und F ist auf den chromophoren Uracil^-carbonsäure-Rest und die UV-Absorption von H auf den chromophoren Thymin-Rest zurückzuführen.

7. IR-Absorptionsspektren

Die IR-Absorptionsspektren von D, E, F, G und H, gemessen als Kaliumbromidtabletten, sind in dieser Reihenfolge in den Fi g. 6, 7, 8, 9 und 10 dargestellt. Die Stellen der hauptsächlichen Absorption, angegeben in Frequenzen, sind folgende:

D: 3200-3500, 1716, 1620, 1565, 1463, 1410, 1350, 1257, 1130, 1070,970, 885, 606, 770 cm"'.

D:	2,6	3,7	7,3	9,4.
E:	2,8	3,9	7,4	9,3.
F:	2,7	3,9	7,2	9,3.
G:	3,2	7,3	9,3.
H:	3,2	7,2	9,4.
		10.	Stabilitäten

D, E, F, G und H sind alle instabil gegenüber Alkali, jedoch merklich stabil bei saurem oder neutralem pH. Bei pH 2 bis 7 werden sie kaum zersetzt, selbst wenn sie 15 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt werden. Sie sind ebenfalls stabil gegenüber UV-Bestrahlung, wenn ihre wäßrigen Lösungen 24 Stunden lang mit einer chemischen 20-W-Lampe aus einer Entfernung von 30 cm bestrahlt werden.

^Π· Antimikrobiell Wirkungsspektrum

Die minimalen Hemmkonzentratioren der Poly_{oxine D>
E> F> G und H gegen verschied}ene pflanzenpathogene Pilze werden in der folgenden Tabelle I aufgezeigt:

Tabelle I

Testorganismus

Minimale Hemmkonzentration (\kg/m\) DEF

Piricularia oryzae	3,12	12,5	2,5	6,25	3,1
Cochliobolus miyabeanus	6,25	12,5	6,25	3,12	25-50
Pellicularia sasakii	<1,56	3,12	100	3,12	50
Alternaria kikuchiana	50	50	>100	6,25	25-50
Glomerella cingulata	>100 >	100	>100	>100	100
Guignardia laricina	100	50	>100	6,25	3,1-6,2
Cladosporium fulvum	100	25	25	3,12	12,5-25
Fusarium oxysporum	>100 >	100	>100	>100	>100
Phytophtora parasitica	nicht untersucht				100
Gibberella fujikuroi	nicht untersucht				>100
Helminthosporium sigmoideum	nicht untersucht				25-50
Leptosphaeria salvinii	nicht untersucht				25
Scherotinia sclerotiorum	nicht untersucht				6,2

(Die Konzentrationen wurden nach 48 Stunden unter Verwendung eines Kartoffel-Saccharose-Agarmediums ermittelt.)

Wie in der Tabelle gezeigt wird, besitzen D, E, F, G und H eine hohe Wirksamkeit gegen bestimmte Pflanzenpilze, jedoch wenig Aktivität gegenüber anderen Pilzen.

In Gefäßversuchen und in Feldversuchen gegen verschiedene pathogene Pilze zeigten die erfindungsgemäßen Polyoxine erhebliche präventive und curalive Wirksamkeiten.

Die folgenden Vergleichsversuche lassen die überlegene Wirkung der erfindungsgemäßen Polyoxine •jrkennen.

A. Topfversuche

In Topfversuchen wurde die Verhinderung des Befalls von Reispflanzen mit Pellicularia sasakii (Blattscheidebrand) durch die Polyoxine D, E, F, G und/ oder H geprüft. Auch in bezug auf die Verhinderung der Ausbreitung von kranken Stellen wurde eine Wirksamkeit beobachtet.

Eine fixierte Menge einer Lösung der zu prüfenden Substanz wurde über Reispflanzen (Jokkoku-Art, Halmhöhe: 45 cm) in Töpfen nach dem üblichen Sprüh verfahren versprüht, 1 Tag nach dem Besprühen wurde ein Testpilz inokuliert. Die Inokulation erfolgte, indem die Pilzkolonie (Markierung im Durchmesser von 8 mm) auf die Blattscheide von Reispflanzen gesetzt wurde. Nach der Behandlung wurde die Blattscheide mit einem aus Vinylchloridharz hergestellten Film überzogen und die Töpfe innerhalb des Gewächshauses gehalten. Nach 7 Tagen wurde die Länge der befallenen Stellen des Testpilzes in 3 Töpfen ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Bei keiner Substanz wurde eine Phytotoxizität gegenüber der besprühten Reispflanze festgestellt.

B. Feldversuche

Blattscheidebrand auf Reispflanzen: Reispflanzen wurden mit Polyoxinstaub, der die Polyoxine D und D, E und F enthielt, und mit einem Handelsprodukt gegen Blattscheidebrand behandelt. Die Applikationen waren wie folgt:

1. 2. August,

2. 15. August,

3. 30. August.

Die Ernte war am 22. Oktober. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

	Tabelle III	Befallener	Grad der	Ausbeute
	Behandlung	Stamm	Schädi	(g)
			gung	Korn
				gewichte
20		(%)		je 3,3 m²
		12,3	5,3	2,781
	Polyoxinstaub
	(mit 0,2% Polyoxin D)	16,5	8,4	2,613
25	Polyoxinstaub
	(mit 0,2% Polyoxin-
	komplex D, E, F)	18,7	9,3	2,487
	Organoarsonat
	(mit 0,4% Wirk
3°	bestandteil)	56,3	40,7	2,463
	Unbehandelt

Schwarzfleckkrankheit an Birnen: Birnbäume wurden mit benetzbarem Polyoxin-Pulver und mit einem Handelsprodukt gegen die Schwarzfleckkrankheit behandelt. Applikation: 8mal alle 10 Tage vom 25. Mai bis 10. August. Tag der Beobachtung: 30. August. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle II	Kf)T17Cn-	Tänffe der	Schutzwert	40	Tabelle IV	Konzen- % der	Zahl der	Bestandteil enthält.	heitsflecken
	tration der	befallenen					tration der befallenen Krank-	Säugetieren: Bei	je Blatt
	wirksamen	Stelle					wirksamen Blätter	zeigt selbst bei intravenöser Injektion von
	Substanz	(Summe			Behandlung		Substanz in
	in der	aus					der Sprüh
	Sprüh	3 Töpfen)				lösung
	lösung			45		(ppm)
	(ppm)	(cm)					0,38
						100 12,3
	10	36	90				0,59
	5	65	82	50		100 17,5
Polyoxin D					Polyoxin (D)		0,58
	50	54	85		benetzbares Pulver	50 + 50 14,3
	30	72	80		Polyoxin (G)		0,57
Polyoxin E	100	162	55		benetzbares Pulver	50 + 50 16,3	0,75
	60	209	42	55	Polyoxin (D + E)	800 15,7	2,83
Polyoxin F	300	126	65		benetzbares Pulver	— 63,7	\ - cyclohexen-
	100	235	35		Polyoxin (D + H) benetzbares Pulver	*) Fungicid, das 80% N - Tetrachloräthylthio - <■
Polyoxin G	500	90	75,1	60	Handelsprodukt*)	1,2-dicarboximid als aktiven	der Maus
	250	110	69		Unbehandelt	Toxizität gegenüber	500 mg/kg
Polyoxin H	10	258	28
Polyoxin B
Organoarsonat*)		362	0	65
(benetzbares Pulver)
Unbehandelt

'*) Fungicid, das 6,5% Ammoniumeisenmethanarsonat als aktiven Bestandteil enthält.

keine der erfindungsgemäßen Verbindungen eine toxische Wirkung.

609 551/355

In der deutschen Patentanmeldung P 1492 111.0 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von als Polyoxin A und Polyoxin B bezeichneten Pyrimidinnucleosiden unter Züchtung der Stämme von Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC-Nr. 19 093 oder 19 094 vorgeschlagen worden.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Züchten eines Mikroorganismenstammes von Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC-Nr. 19 093 oder 19 094 in einem Züchtungsmedium, das sich aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und anorganischen Stoffen zusammensetzt, bei einer Temperatur von 25 bis 35°C ist dadurch gekennzeichnet, daß man die angereicherten antibiotisch wirksamen Stoffe in üblicher Weise aus dem Züchtungsmedium isoliert und in die einzelnen Verbindungen auftrennt.

Die erfindungsgemäß verwendeten polyoxinproduzierenden Mikroorganismenstämme gehören zu einer neuen Art der Gattung Streptomyces und wurden aus dem Boden von Bochu, Aso-gun, Kumamoto Prefecture, Japan, isoliert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Züchtung entsprechend den Züchtungsverfahren für Actinomyceten durchgeführt werden. Jedoch wird der genannte Stamm im allgemeinen unter aeroben Bedingungen und Rühren bei 25—35⁰C gezüchtet, unter Verwendung eines im wesentlichen neutralen, flüssigen Nährmediums, welches als Kohlenstoffquelle Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin, Maltose oder Fruktose; als Stickstoffquelle Fleischextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe oder Weizenkeime und anorganische Stoffe, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat oder Kaliumphosphat enthält. Normalerweise erreicht die Konzentration des produzierten Antibiotikums ein Maximum nach 40 bis 100 Stunden. Die genannte Zeit variiert in Abhängigkeit von den Bedingungen des Rührens und der Belüftung, auch wenn die Temperaturbedingungen und das verwendete Nährmedium gleichbleiben, und kann daher in jedem Falle durch biologische Versuchsmessung der antibiotischen Wirksamkeit bestimmt werden.

Zur Gewinnung des gewünschten Antibiotikums aus der Kulturflüssigkeit kann ein übliches geeignetes physikochemisches Verfahren angewendet werden. Beispielsweise wird die Kulturflüssigkeit bei einem sauren oder neutralen pH mit Hilfe eines Filtrier-Hilfsmittels, wie z. B. Diatomeenerde, oder eines ähnlichen Mittels filtriert und dadurch das Mycel entfernt, dann wird das Filtrat bei saurem oder neutralem pH mit Aktivkohle behandelt und schließlich das Gemisch der Polyoxine aus der Aktivkohle mittels eines geeigneten Lösungsmittels, wie z. B. Methanol oder wäßrigem Aceton, eluiert. Ferner können die Polyoxine, da sie amphotere Eigenschaften besitzen, an ein Kationen- oder Anionen-Austauscherharz gebunden und mittels einer geeigneten Säure oder Lauge oder einer geeigneten Salzlösung eluiert werden. Das angesäuerte Filtrat der Kulturflüssigkeit wird zur Adsorption der Polyoxine über eine Austauschersäule geschickt, die ein stark saures Kationenaustauscherharz des Sulfonsäuretyps mit 8% Vernetzung enthält, von dem diese mittels einer 5%igen Natriumchloridlösung oder einer Phosphorsäurelösung eluiert werden können.

Das erhaltene ungereinigte Polyoxingemisch kann säulenchromatographisch gereinigt werden unter Ver wendung eines Ionenaustauschers, wie z. B. eine Ionenaustauschers aus sulfoäthyliertem vernetzten Dextran, Sulfoäthylcellulose oder Sulfomethylcellu lose oder mittels Zonenelektrophorese. Bei Verwen dung eines basischen Harzes wird der Polyoxinkom plex in die am Harz adsorbierten Polyoxine D, I und F und die nichtadsorbierten Polyoxine A, B, C und H getrennt. Die adsorbierten Polyoxine D, I

ίο und F werden mit einer anorganischen Salzlösung Säure oder Lauge eluiert.

Bei Anwendung des Elektrophorese-Verfahrer unter Verwendung einer Pufferlösung mit einer pH-Wert über 3,0 wird das Polyoxingemisch au, geteilt in D, E und F, welche eine größere Wände rungsdistanz zur Anode aufweisen, und A, B, G un H, deren Wanderungsdistanz kleiner ist.

Die so aufgetrennten Polyoxingemische A-B-G-l· und D-E-F können auf chromatographischem Weg unter Verwendung von Cellulosepulver oder SiI kagel in ihre Einzelkomponenten aufgetrennt werdet z. B. unter Verwendung eines Gemisches aus Butane Essigsäure und Wasser als Elutionsmittel. Wiede holtes Umkristallisieren aus wäßrigen Lösungsmi teln ist ebenso wirksam zur Auftrennung in die eir zelnen Bestandteile.

Bei der Umkristallisation aus einem wäßrigen Alki hol werden die getrennten und gereinigten Polyoxir als kristalline Pulver erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindung gemäße Verfahren zur Herstellung der neuartige antibiotischen Polyoxine D, E, F, G und H.

Beispiel 1

Lösliche Stärke 12,0 kg

Weizenkeimlinge 8,0 kg

Trockenhefe 4,0 kg

Sojabohnenmehl 2,0 kg

Glukose 2,0 kg

Calciumcarbonat 0,4 kg

Wasser 400 Liter

Ein Nährmedium dieser Zusammensetzung wur 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. In dies Medium wurde der Stamm Streptomyces asoen> ATCC 19 093 eingeimpft, nachdem er 48 Stund; vorgezüchtet worden war, und unter aeroben Bedi gungen und unter Rühren bei 27° C gezüchtet. D Züchtung wurde weitergeführt, während die Wir samkeit mittels Pellicularia sasakii als Testorgan i mus untersucht wurde, bis die maximale Wirksam^ erreicht worden war. Die Wirksamkeit erreichte i Maximum nach etwa 96 Stunden, wobei die Submei kultur bei 220 U/min und unter Einleitung vi 400 Liter sterilisierter Luft pro Minute ausgefüh worden war. Die minimale Hemmkonzentration b trug 1800 μg/ml, berechnet unter Zugrundelegui der Wirksamkeit von Polyoxin D in Anwendu¹ auf Pellicularia sasakii als Testorganismus.

Beispiel 2

Lösliche Stärke 10,0 kg

Weizenkeime 4,0 kg

Hefe 6,0 kg

Sojabohnenmehl 4,0 kg

Calciumcarbonat 0,8 kg

Wasser 400 Liter

11 12

Ein Medium dieser Zusammensetzung wurde bei von 10%iger Salzsäure auf pH 5 eingestellt, anden gleichen Bedingungen der Sterilisation und Züch-, schließend auf 70⁰C erhitzt, mit 8 kg Diatomeenerde

tung wie im Beispiel 1 angewendet, wiederum Pelli- versetzt und dann unter Verwendung einer Filter-

cularia sasakii als Testorganismus verwendet. 72 bis presse filtriert.

96 Stunden nach Einimpfen von Streptomyces 5 Das Filtrat wurde über eine Säule geschickt, die

asoensis ATCC 19 093 wurde eine Wirksamkeit von mit 40 Litern eines schwach basischen Anionenaus-

1800 μg/ml, berechnet auf der Basis von Polyoxin D tauscherharzes (hergestellt durch Polykondensation

erhalten. ^von Phenol, Formaldehyd und Polydiamin) von

. ίο 50—100 mesh gefüllt war, um die antibiotisch wirk-

H e ι s ρ ι e _{o samen} stoffe an das Harz zu adsorbieren. Die Säule

Glukose 6,0 kg wurde mit Wasser gewaschen und mit 0,3 n-Ammo-

Glycerin 4,0 kg niumhydroxid eluiert. Die erhaltenen aktiven Eluate

Sojabohnenmehl 6,0 kg wurden bei Temperaturen unter 50⁰C auf etwa ¹I₄

Ammoniumsulfat 2,0 kg ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und dann

Hefe 2,0 kg 15 sprühgetrocknet, wobei etwa 900 g eines braunen

Natriumchlorid 2,0 kg ungereinigten Pulvers erhalten wurden. 150 g dieses

Calciumcarbonat 1,6 kg Pulvers wurden in 0,1-m Salzsäure-Phosphat-Puffer-Wasser 400 Liter lösung von pH = 2,0 gelöst, zur Absorption über

eine mit 20 Litern eines stark sauren Kationenaus-

Ein Medium dieser Zusammensetzung wurde wie 20 tauscherharzes des Sulfonsäuretyps mit 8% Ver-

im Beispiel 1 sterilisiert und zur Züchtung verwendet. netzung (100—200 mesh) gefüllte Säule geschickt,

72 bis 96 Stunden nach Einimpfen von Streptomyces die zuvor mit der gleichen Pufferlösung gepuffert

asoensis ATCC 19 093 wurde unter Verwendung worden war, und dann entwickelt und eluiert mit

von Pellicularia sasakii als Testorganismus eine Wirk- einer0,l-m Phosphorsäure-Pufferlösung von pH = 5,3.

samkeit von 800 μg/ml, berechnet auf der Basis von 25 Nach einem Entsalzungsprozeß mit Aktivkohle wur-

Polyoxin D, erhalten. den 30 g eines hellgelben Pulvers erhalten. Dieses

Pulver wurde chromatographisch an einem Ionen-

Beispiel 4 austauscher aus sulfoäthyliertem vernetzten! Dex-

_r] , , „, trän weiter gereinigt. Das Pulver wurde in einer

P, . JZ t ³° °^'^m Salzsäure-Phosphat-Pufferlösung gelöst, über

Q · ^Ck"i? ""Vi «η l^S eine mit 50 g des Ionenaustauschers gefüllte Säule

aojaDonnenmeni o,u Kg geschickt, die mit der gleichen Pufferlösung gepuffert

Ammoniumsuiiat /,UKg _worden war, und schließlich mit derselben Puffer-

1 rocKenneie 2,u Kg lösung entwickelt, wobei 15 g eines weißen gerei-

Natriumcnioria ζ,υ Kg j Pulvers des Polyoxinkomplexes erhalten wur-

Calciumcarbonat 1,6 kg d

^Wasser; · · ⁴^ ^Llter Der erhaltene Polyoxinkomplex wurde in Wasser

Ein Medium dieser Zusammensetzung wurde auf gelöst und über eine mit 500 Litern eines schwach pH = 7,6 eingestellt und dieselben Bedingungen der basischen Formaldehyd-Phenol-Polydiamin-PolySterilisation und Züchtung wie im Beispiel 1 ange- 40 kondensationsanionenaustauschers (Cl-Form, 100— wendet, mit der Abwandlung, daß Streptomyces 200 mesh) gefüllte Säule geschickt. Die Ablauflösung asoensis ATCC 19 094 verwendet wurde. Die Züch- und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und bei tung wurde weitergeführt unter Verwendung von vermindertem Druck eingeengt, wobei 6 g eines wei-Alternaria kikuchiana und Cochlibolus miyabeanus ßen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver enthielt als Testorganismen, bis die maximale Wirksamkeit 45 die Polyoxine A, B, G und H. Die Harzsäule wurde erreicht worden war. mit einer 6%igen Natriumchloridlösung entwickelt

Die Wirksamkeit erreichte ihr Maximum nach und eluiert. Die aktiven Eluate wurden zur Adsorp-72—96 Stunden der Fermentation nach dem Ein- tion der Polyoxine mit Aktivkohle behandelt. Nachimpfen von Streptomyces asoensis ATCC 19 094 in dem die Aktivkohle mit Wasser gewaschen worden das Medium. 50 war, wurden die Antibiotika mit Methanol-Pyridin-

70 ml des Mediums wurden in einen 300-ml-Erlen- Wasser (5:1:4, bezogen auf das Volumen) eluiert,

meyerkolben abgefüllt, der Stamm wurde 48 Stun- das Eluat zum Trocknen eingedampft, wobei 4 g

den lang einer Schüttelkultur unterworfen und dann eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver

in 400 Liter Nährmedium eingebracht, wo er eine enthielt die Polyoxine D, E und F. Da sie fest gebun-

Submersfermentation bei 220 U/min unter Einlei- 55 dene Metallionen (vorwiegend Calcium) enthalten,

tung von 400 Liter/min sterilisierter Luft unterworfen wurden die folgenden Arbeitsweisen zur Entfernung

wurde. Die Produktion des Antibiotikums erreichte dieser Ionen ausgeführt: Das Pulver wurde in 0,2 n-

das Maximum nach 72 Stunden. Salzsäure gelöst, die Lösung dann über eine mit

Die Wirksamkeit betrug 2000 μg/ml, berechnet 400 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes

auf der Basis von Polyoxin D, bei Verwendung von 60 des Sulfonsäuretyps mit 8% Vernetzung gefüllte

Pellicularia sasakii als Testorganismus. Säule geschickt, durch die die aktiven Stoffe hindurchpassierten, während die Metalle durch das Harz

Isolierung der Polyoxine aus der Kulturflüssigkeit gebunden wurden. Die Ablauflösung und die Wasch-

. · ι τ lösungen wurden zur Adsorption der Polyoxine mit

ö e 1 s ρ 1 e 1 1 ₆₅ Aktivkohle behandelt. Nachdem die Aktivkohle mit

400 Liter Kulturflüssigkeit, die unter Anwendung Wasser gewaschen worden war, wurden die PoIy-

der im Beispiel 1 beschriebenen Züchtungsbedin- oxine mit Methanol-Essigsäure-Wasser (5:1:4, be-

gungen erhalten worden war, wurden durch Zugabe zogen auf das Volumen) eluiert und das Eluat zum

Trocknen eingedampft, wobei 3,4 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver ist aschefrei.

Um die Polyoxine G und H aus der Fraktion, die die Polyoxine A, B, G und H enthält, rein zu isolieren, wurden eine Cellulose-Säulenchromatographie durchgeführt. 5 g dieser Mischung wurden über eine Cellulosesäule von 55 mm Durchmesser und 1000 mm Länge geschickt, wobei als Lösungsmittel eine Lösung verwendet wurde, die Butanol, Essigsäure und Wasser in einem Volumenverhältnis von 4:1:2 enthielt, wodurch H, A, G und B in dieser Reihenfolge nacheinander eluiert wurden mit Ausbeuten von 0,1 bzw. 1,3, 0,15 und 1,1 g.

Die Isolierung der Polyoxine D, E und F wird in genau derselben Weise mittels Cellulose-Säulenchromatographie durchgeführt. In diesem Falle wurden, als 4 g des Gemisches unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 4:1:2) chromatographiert wurden, die Polyoxine F, E und D in dieser Reihenfolge mit Ausbeuten von 0,98 g D, 0,12 g E und 1,04 g F eluiert.

Bei der Umkristallisation aus wäßrigem Alkohol wurden die Polyoxine E, F und G einzeln als farblose Pulver erhalten. Ferner wurden die Polyoxine D und H einzeln als farblose kristalline Pulver erhalten.

Beispiel II

430 Liter einer Kulturflüssigkeit, die durch Züchten gemäß Beispiel 4 erhalten worden war, wurden durch Zugabe von 10%iger Salzsäure auf pH = 2,0 eingestellt, auf 70⁰C erhitzt, und mit Hilfe von 9 kg Diatomeenerde durch eine Filterpresse filtriert.

Das Filtrat wurde mit 8 kg Aktivkohle und 8 kg Diatomeenerde versetzt, gerührt und dann filtriert; die Aktivkohle wurde mit 350 Liter Wasser gewaschen. Die Aktivkohle wurde zweimal mit 100 Liter 60%igem Aceton extrahiert, anschließend das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 4 Liter konzentrierter Lösung erhalten wurden. Hierzu wurden 50 Liter Aceton hinzugefügt, anschließend der ausgefällte Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 644 g eines braunen ungereinigten Pulvers erhalten wurden.

370 g dieses ungereinigten Pulvers wurden in Wasser gelöst, auf pH 2,0 eingestellt, und dann über eine mit 4,5 Litern eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (H-Form, 50—100 mesh) gefüllte Säule geschickt, wobei die Fungicide adsorbiert wurden. Nachdem die Harzsäule mit Wasser gewaschen worden war, wurden die Fungicide mit 5%iger Natriumchloridlösung eluiert. Das erhaltene aktive Eluat wurde einem Entsalzungsprozeß mit Aktivkohle unter Adsorption und Desorption unterworfen, wobei 60 g eines leicht braunen Pulvers erhalten wurden.

Dieses Pulver wurde chromatographisch mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp mit 8% Vernetzung weiter gereinigt. Das Pulver wurde in 0,1-m Phosphat-Pufferlösung gelöst, an einer mit 2 Litern des Kationenaustauschers (100—200 mesh) gefüllten Harzsäule adsorbiert, die mit Salzsäure-Phosphat-Pufferlösung von pH = 2,0 gepuffert worden war, und anschließend mit einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung bei pH = 4,3 zur EIuierung der Fungicide entwickelt. Das erhaltene aktive Eluat wurde einem Entsalzungsprozeß unterworfen,

ίο wobei 29 g eines gelblichen Pulvers erhalten wurden.

Dieses Pulver wurde chromatographisch mit sulfo-

äthyliertem, vernetztem Dextran weiter gereinigt,

d. h., das Pulver wurde über eine mit 50 g eines Ionenaustauschers aus sulfoäthyliertem vernetztem Dextran gefüllte Säule geschickt, welche mit einer 0,01-m Phosphatpufferlösung von pH = 2,0 gepuffert worden war, und wurde entwickelt, indem die Konzentration der Pufferlösung kontinuierlich auf 0,1-m erhöht wurde, wobei schließlich 14 g eines weißen gereinigten Pulvers des Polyoxinkomplexes erhalten wurden.

Der so erhaltene Polyoxinkomplex wurde in Wasser gelöst und über eine mit 500 Litern eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes aus Formaldehyd - Phenol - Polydiamin - Polykondensationsmaterial (Cl-Form, 100—200 mesh) gefüllte Säule geschickt. Die Ablauflösung und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 10 g eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Die Polyoxine D, E und F waren an dem Harz adsorbiert. Das Pulver enthielt die Polyoxine A, B, G und H. Um G und H in reiner Form aus dem Pulver abzutrennen, wurde eine Cellulose-Säulenchromatographie durchgeführt. Das Pulver wurde einer chromatographischen Auftrennung mittels einer Cellulosesäule von 35 mm Durchmesser und 1000 mm Länge unterworfen, wobei ein Lösungsmittelsystem Butanol-Essigsäure-Wasser im Volumenverhältnis 4:1:2 verwendet wurde. Dabei wurden die Polyoxine H, A, G und B in dieser Reihenfolge nacheinander abgetrennt und eluiert, es wurden 0,25 g G und 0,? g H aus 5 g des Polyoxinkomplexes erhalten.

Die Polyoxine G und H wurden gereinigt mittels Zonen-Elektrophorese. Die Polyoxine G und H wurden einzeln 16 Stunden lang einer Elektrophorese bei 150 V unterworfen, unter Verwendung eines Copolymerisats aus Vinylchlorid und Vinylacetat mit einem Polymerisationsgrad von 450 als Träger in Gegenwart eines 0,1-m Phosphatpuffers. Die erhaltenen antibiotisch aktiven Stoffe wurden mit Wasser extrahiert und einem Entsalzungsprozeß mit Aktivkohle unterworfen, wobei G und H als gereinigte Pulver erhalten wurden. Die Ausbeuten betrugen je etwa 50%.

Die so gereinigten Polyoxine G und H wurden einzeln aus wäßrigem Alkohol umkristallisiert, wobei Polyoxin G als weißes Pulver und Polyoxin H als weißes kristallines Pulver erhalten wurden.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Pyrimidinnucleoside der Formeln

CH, · CH

COOH

HOOC
OC-NCH 0

(I) OC-NCH O
H