DE2231979C3 - Pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung, Verfahren zu ihrer Herstellung und fungicide Mittel - Google Patents

Description

NH₂

CH,

und deren Säureadditionssalze, mit einer spezifischen Drehung des Hydrochloridsaizes von

[.i]P = 63,2° (c= 1,H₂O)

2. Verfahren zur Herstellung der pilzbefallverhindernden an tibio tischen Verbindung»F-l 028« gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces kagawaensis nov. sp. (FERM-P Nr. 953: ATCC 21 811) auf einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen züchtetunddie»F-1028«-Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert, indem man an einem Adsorbens adsorbiert und dann eluiert.

3. Fungicide Mittel, enthaltend die pilzbefallverhmdernde antibiotische Verbindung »F-1028« gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff

Die »F-1028«-Verbindung weist die folgenden Eigenschaften (i) — ßx)3u£

(i) Sie besitzt cjn Molekulargewicht von 219,

(ii) sie liegt in Form farbloser Kristalle vor,

(iii) der Schmelzpunkt des Hydrochlorids liegt über 195°C (Zersetzung),

(iv) die spezifische Drehung des Hydrochlorids beträgt [«]? = 63,2° (c = 1, H₂O),

(v) das UV-Spektrum einer wäßrigen Lösung des Hydrochlorids besitzt, wie in A b b. 1 dargestellt wird, keine besondere Absorption,

(vi) das IR-Spektrum einer Mischung des Hydrochlorids mit Kaliumbromid ist in F i g. 2 dargestellt,

(vii) sie besitzt einen Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel von 0,68, wenn man als Entwicklungslösungsmittel n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser in einem Verhältnis von 15:10:3:12 verwendet und einen Rf-Wert von 0,21, wenn man als Entwicklungsmittel eine Mischung aus Butanol-Essigsäure-Wasser in einem Verhältnis von 3:1:2 verwendet,

(viii) es ist in Wasser leicht löslich und in Chloroform, Benzol und Äther unlöslich und

(ix) die Farbreaktion ist positiv mit Ninhydrihn, Ehrlich-Reagens, Elson-Morgan-Reagens, ToI-lens- und Benedict-Reagens und negativ mit Moüsh-Reagens, Sakaguchi-Reagens, Maltol-Reagens und Eisen(III)-Chloridreagens.

Die Verbindung »F-1028« mit diesen Eigenschaften (i) bis (ix) ergibt bei der wissenschaftlichen Bestimmung der chemischen Struktur die folgende Formel

Die Erfindung betrifft eine neue pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« und die Säureadditionssalze davon, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung durch Fermentation und fungicide Mittel, die in der Landwirtschaft und beim Gartenbau nützlich sind.

Es wurde gefunden, daß eine pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung, die bis jetzt unbekannt war, hergestellt werden kann, wenn man btämme, die »F-1028«-Verbindung liefern und die zu dem Genus Streptomyces gehören, in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet.

Vor der vorliegenden Erfindung war das Vorhandensein eines Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört und der die Substanz »F-1028« liefert, die starke pilzbefallverhindernde Wirkung und wachstuminhibierende Wirkung bei verschiedenen Pilzen zeigt, insbesondere Schimmel, nicht bekannt.

Die neue pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung, die als »F-1028«-Verbindung bezeichnet wird, zeigt starke fungicide Aktivität gegen verschiedene Fungi, die Pflanzenkrankheiten verursachen und nur eine geringe antibakterielle Wirkung auf verschiedene Bakterien zeigen.

HCOH

HCNH₂
HOCH

I
CH3CHCONHCH

NH₂

CH,

Diese als »F-1028« bezeichnete Verbindung besitzt Aktivität gegen Archimycetes, Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und Fungi imperfecti. Sie kann beispielsweise als Pflanzenschutzfungicid verwendet werden und weist sowohl vorbeugende als auch heilende Wirkungen bei einer großen Vielzahl von Pflanzenpathogenen auf, die solche Krankheiten verursachen wie Pesthauch, Mehltau, Verdorren, Scheidetrockenfäule bzw. Brand der Obstbäume, bakterielle Blatt-Trockenfäule oder helminthosporische (helminthosporium) Blaltflecken bei Reis, Blattrost bei Weizen, bakterielle glatte oder klebearme Fäule bei Chinakohl, braune Fäule bei Pfirsich, Blattfäule bei Bananen, grauer Schimmel bei Erdbeeren und anderen erntetragenden Pflanzen, feinstflaumiger Schimmel bzw. Mehltau bei Trauben, Anthraknose von Trauben, Äpfeln und Birnen, Stammfaule bei Gemüse, Anlhraknose bei Melonen und Gurken, Melanose bei Zitrusfrüchten, pulverartiger Schimmel bzw. Mehltau bei Weizen, Äpfeln, Gurken und gegen schwarze Flecken,

durch Pilze verursacht werden, beispielsweise a braune Scbwarzfleckenkrankheiten an Äpfeln frühen Tau bei Kartoffeln, Schorf, der durch Jjkse verursacht wird, beispielsweise Schorf an Birnen ond Äpfeln.

• jßs wurde nun erstmals der Stamm, der die Veryudnng »F-1028« liefert, aus Erdboden isoliert, und $r wurde als Streptomyces kagawaensis bezeichnet. Streptomyces kagawaensis nov. sp. (FERM-P Nr. 953: ATCC 21 811) ist durch die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften charakterisiert:

I. Morphologische Eigenschaften

Nach mikroskopischen Untersuchungen ist das "'-Mycelium auf einem synthetischen Agarmedium einem Protamin- bzw. Proteinagarmedium unregelmäßig verzweigt. Die Sporangienträger (SporangjBphere) bilden geschlossene Spiralen mit kleinen Windungen. Die Spore ist eine Ellipse in einer Größe von 0,7 · 0,9 μ und besitzt eine stachelige bzw. dornenüagende Oberfläche.

H. Züchtungseigenschaften auf verschiedenen

Nährböden ²S

1. Saccharose-Nitrat-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, schwachgelblichbraun bis hell schwachgelb.

Aerobes Mycelium: pulverartig, im Überfluß, gräulichbraun.

Anaerob: gelb.

Lösliches Pigment: schwachbraun.

2. Glucose-Asparagin-Agarmedium (bei 27' C)

Wachstum,: gut, schwachgelb bis schwachgelblichbraun.

Aerobes Mycelium: pu'"erartig, im Überfluß, schwachrosa bis bräunlichweiß.

Anaerob: gelblichbraun.

Lösliches Pigment: schwachgelb.

3. Glycerin-Asparagin-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, gelblichbraun, das vegetative Mycelum tritt in das Medium ein.
Aerobes Mycelium: weiß bis rosaweiß. Anaerob: braun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

4. Stärke-anorganisches-Salz-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, schwachgelb.
Aerobes Mycelium: pulverartig, bräunlichweiß bis schwachbraun.

Anaerob: gelblichbraun.

Lösliches Pigment: gelblichbraun.

5. Ί hyrosin-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: hellgelblichbraun bis dunkelbraun. Aerobes Mycelium: weiß bis bräunlichweiß.

Anaerob: braun bis dunkelbraun. Lösliches Pigment: schwarz.

6. Nähragarmedium (bei 27 C)

Wachstum: hellgelblichbraun.

Aerobes Mycelium: keines.

Anaerob: braun.

Lösliches Pigment: gelblichbraun.

7. Hefe-Malz-Agarmedium (bei 27° C)

Wachstum: gut, gelblichbraun, vegetatives Mycelium tritt ins Medium ein.

Aerobes Mycelium: baumwollartig, weiß bis schwachrosa.

Anaerob: braun.

Lösliches Pigment: gelblichbraun.

8. Weizenraehl-Agarmedium (bei 27° C)

Wachstum: gut, gelblichbraun, vegetatives Mycelium tritt ins Medium ein.

Aerobes Mycelium: pulverartig, reichlich, hellbraun. Anaerob: braun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

9. Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium (bei 27° C)

Wachstum: glänzendgelblichweiß. Aerobes Mycelium: keines.
Anaerob: graubraun.
Lösliches Pigment: dunkelbraun.

10. Loeifler-koaguliertes-Serum-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: glänzendbraun.
Aerobes Mycelium: knapp, farblos. Lösliches Pigment: braun, kein Schmelzen, keine Verflüssigung.

11. Ei-Agarmedium (bei 27^CC)

Wachstum: gebördelt bzw. gefaltet, gelblichbraun bis dunkelbraun.

Aerobes Mycelium: weiß bis trübeweiß. Anaerob: bräunlichbraun.

Lösliches Pigment: dunkelgelbbraun, kein Schmelzen.

12. Kartoflelstück (bei 27 C)

Wachstum: dick, erhaben, glänzendgelblichbraun. Aerobes Mycelium: schwach, weiß. Lösliches Pigment: gelblichbraun bis dunkelbraun.

13. Karottenstück

Wachstum: dick, erhaben, glänzendgelblichbraun. Aerobes Mycelium: baumwollartig, weiß. Lösliches Pigment: schwach, schwachgelblichbraun.

14. Glucose-Pepton-Gelalinemedium (bei 27 C)

Wachstum: gefaltet, schwachgraubraun. Aerobes Mycelium: schwachgrau-farblos. Lösliches Pigment: braun.

15. Magermilchmedium (bei 27 C)

Wachstum: Ring oder Membrane, schwachgelblichbraun.

Aerobes Mycelium: schwach, farblos. Lösliches Pigment: schwachgelblichbraun.

III. Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Bedingungen zum Wachstum: Temperatur: zwischen 25 bis 30' C. pH: zwischen 6 und 8.
Aerobe Bedingungen.

2. Bedingungen, bei denen Wachstum auftritt: Temperatur: zwischen 15 und 38 C. pH: zwischen 4 und 9.

3. Bildung von Melamin: positiv.

4. Reduktion von Salpetersäure: schwach.

5. Milchkoagulation: schwach.

6. Milchpeptonisierung: mäßig.

7. Gelatineverflüssigung: schwach.

8. Zersetzung von Stärke: positiv.

9. Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv.
10. Lösung von koaguliertem Serum: negativ.

IV. Assimilation von Kohlenstoffquellen

Die Assimilation von Kohlenstoffquellen wurde gemäß dem D. G. Pridham-et-aL-Verfahren untersucht.

Gute Assimilation: Arabinose, Glucose, Galactose, Glycerin, Lävulose, Mannose, Maltose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, Inosit, Mannit.

Mäßige Assimilation: Lactose, Xylose.

GeringeAssimilation:Raffinose,Rhair^ose,Sa]icin, Inulin, Sorbinol (Sorbit).

Keine Assimilation: Melezitose, Sorbose, Adonit, Dulcit.

Entsprechend diesen mikrobiologischen Eigenschaften nimmt man an, daß der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm, der mit schwachrosa oder gräulichbraunem aerobem Mycelium wächst und der ein braunes oder gelblichbraunes lösliches Pigment auf einem Protein-Agarmedium liefert, zu den Streptomycen, insbesondere zu Streptomyces lavendulae gehört.

Unter bekannten Species von Streptomyces, die diese charakteristischen Eigenschaften besitzen, sind Streptomyces lavendulae, Streptomyces venezuelae und Streptomyces verginiae, die in Bergeys Mannual of Determinative Bacteriology, 7'* Edition, beschrieben werden,und die Actimomyceten von W a k s m a n. Vol. 2, ähnlich dem erfindungsgemäßen Stamm.

Jedoch sind die Sporenoberflächen dieser drei Stämme glatt, und im Gegensatz hierzu ist die des »F-1028«-Verbindung liefernden Stamms stachelig. Ein Vergleich der kulturellen Eigenschaften zwischen dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm und diesen drei Stämmen zeigt, daß die drei Stämme kein U liches Pigment ergeben, daß aber der »F-1028«- Verbindung liefernde Stamm gelblichhraunes lösliches Pigment auf einem Rohrzucker-Nitrat-Agarmedium liefert. Weiterhin zeigen bei der Assimilation von Kohlenstoffquellen jeder dieser drei Stämme geringe oder keine Assimilation bei Merbiose, Saccharose, Inosit und Mannit. Dagegen assimiliert der so »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm diese Saccharide gut.

Durch die Unterschiede in den morphologischen, Wachstums- und physiologischen Eigenschaften kann der Stamm, der »F-1028«-Verbindung liefert, eindeutig von Streptomyces lavendulae, Strep'omyces venezuelae und Streptomyeo verginiae unterschieden werden. Der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm wurde als Streptomyces - lavendulae - Gruppe im Hinblick auf die Wachstums- und physiologischen Eigenschaften klassifiziert. Er ist aber ein neuer Stamm und unterscheidet sich von den bekannten Mikroorganismen. Er wurde daher mit dem Namen Streptomyces kagawaensis nov. sp. versehen, entsprechend den Unterschieden der Sporenoberflächenstruktur und der Saccharid-Assimilation und der Fähigkeit, die neue anlibiotische »F-1028«-Verbindung zu liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der pilzbefallverhindernden antibiotischen Verbindung »F-1028« ist somit dadurch gekennzeichne«, daß man den Stamm Streptomyces kagawaensis nov. sp. (FERM-P Nr. 953: ATCC 21 811) auf einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet und die »F-1028«-Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert, indem man an einem Adsorbens adsorbiert und dann elwierl.

Ein wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß man einen »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm, der zu Streptomyces kagawaensis gehört, kultiviert und die antibiotische »F-1028«-VerbJndung aus dem Kulturmedium isoliert.

Bei der vorliegenden Erfindung wird der »F-1028«- Verbindung liefernde Stamm in einem Kulturmedium, das Nährstoffe, die im allgemeinen bei Mikroorganismen verwendet werden, enthält, kultiviert. Als NährmittelqueJle können alle bekannten Nährmittel für Actimycen verwendet werden, beispielsweise im Handel erhältliche Glucose, Stärke, Glycerin, Saccharose, Maltose, Dextrin, Melasse und Fette als Kohlenstoffquellen (vgl. Tabelle 1).

Beispiele von Stickstoffquellen sind im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton. Hefe, Maiswasser, gepulverte -Baumwollsamen, gepulverte Erdnüsse, N-Z-Amin, Casein, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat (vgl. Tabelle 2).

Beispiele von Mineralien (oder anorganischen Salzen) sind Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphat, Magnesiumsulfat. Gewünschtenfalls kann eine Spur von Metallsalzen vorhanden sein.

Jede Verbindung dieser Nährstoffe kann verwendet werden, wenn sie von dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm assimiliert wird und bei der Herstellung der »F-1028«-Verbindung nützlich ist.

Herstellung von »F-1028«-Verbindung in einem

Kulturmedium, das verschiedene Kohlenstoffquellen

enthält

In ein Reagenzglas (20 mm Durchmesser) gibt man 13 ml eines flüssigen Kulturmediums, das ein basisches Medium enthält, das 0,5% Pepton, 0.5% Fleischextrakt, 0,3% getrocknete Hefe, 0,5% Natriumchlorid und 0,3% Calciumcarbonat enthält und die Kohlenstoffquelle, wie sie in der folgenden Tabelle (Tabelle 1) beschrieben wird. Dann wird die Saat- bzw. Impfkultur des »F-1028«-Verbindung liefernden Stamms auf dem Kulturmedium inokuliert. Das inokulierte Reagenzglas wird unter Schütteln in einer hin und her gehenden Schüttelvorrichtung bei 27 C inkubiert. Die Bildung der »F-1028«-Verbindung ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 K. ohlenstoffquelte

1. Glucose

2. Glycerin

3. Stärke

4. Glucose
Stärke

2,0%
2,0%
2,0%
1,0%
1,0%

2 Tage

pH

7,4
7,4
7,6

7,4

F-1028 mcg/ml

632

452
548

538

3 lage

pH

7,6
7,4
8,0

8,0

f-1028

mcg/ml

280
258
148

184

	Fortsetzung	KohlcnslolTquclIc	1,0%	2 Tage	pll	F-102X	y	pll	Tage
					7,6	mcg ml		8,0	1--102H
	Glycerin	2,0%		590		meg ml
	Stärke	2,0%	8,2		8,4	210
5·	Maltose	2,0%	7,8	78	7,8
	Dextrin	8,4	284	8,4	32
6.	Saccharose	36		420
7.
8.

Die Herstellung der »F-1028«-Verbindung in einem Kulturmedium, das verschiedene Stickstoffquellen enthält

Zu einem basischen Medium, das 2,0% Glucose, 0,5% Natriumchlorid, 0,3% Calciumcarbonat enthält, fügt man die in der folgenden Tabelle angegebenen Stickstoffquellen. Das Kulturmedium wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, sterilisiert, mit der Impfkultur des »F-1028«-Verbindung liefernden Stamms inokuliert und bei 27' C geschüttelt. Die Herstellung der »F-1028«-Verbindung ist in der Tabelle 2 *s beschrieben.

Tabelle 2

	2 Tage	pH	F-1028	3 Tage	pH	F-1028
Sticksloffquellc		7,6	mcg/ml		7,8	mcg/ml
	7,8	632	7,8	420
1. Pepton 1,0%	7,4	1212	7,8	358
2. Fleischextrakt 1,0%		580		322
3. gepulverte 3,0%	7,4		7,8
Sojabohnen	6,8	368	6,4	174
4. Maiswasser 2,0%		■ —		Π6
5. getrocknete 1,0%
Hefe	7,6		7,8
6. Pepton 0,5%		322		342
Fleischextrakt 0,5%
getrocknete
Hefe

35

40

45

Das beste Kultur- bzw. Züchiungsverfahren ist eine flüssige Kultur, insbesondere eine untergetauchte Kultur (d. h. eine Fermentationsmethode, wie Kulturverfahren, bei denen geschüttelt wird: Kesselfermentation; Tankkulturverfahren usw.) mit Belüftung bei Temperaturen im Bereich, bei dem der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm züchtbar ist und wobei die »F-1028«-Verbindung gebildet wird, bevorzugt bei 25 bis 35 C. Die praktische Kultur wird bei etwa S5 27 C durchgeführt und weitergeführt, bis sich ausreichend »F-1028«-Verbindung akkumuliert hat. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen 6 bis 9. vorzugsweise 6.2 bis 8.5. besonders bevorzugt 6.5 bis 8.

Die Konzentration an »F -IO28«-Verbindung in dem Kulturmedium erreicht ein Maximum innerhalb 2 bis 5 Tagen, sowohl bei dem Kuhurverfahrcn. bei dem geschüttelt wird, als auch bei dem Tankkulturverfahren. Da jedoch die Tage, die erforderlich sind, um die maximale Konzentration an »F-!O28«-Vcrbindung zu erzielen, variieren können gemäß den Belüftung*- und Rührungshcdingungcn im gleichen Kulturmedium bei der gleichen Temperatur, ist es wünschenswert, den Gehalt an »F-1028«-Verbindung zu bestimmen. Wenn der maximale GehaK erreicht ist, wird das Wachstum beendigt und die »F-1028«-Verbindung extrahiert. Um den Gehalt an »F-1028«-Verbindung zu bestimmen, wurde ein Verfahren verwendet, bei dem ein Inhibitionszyklus bestimmt wird, wobei man Sclerotinia cinerea (im folgenden als Sc bezeichnet) gemäßen bekannten Verfahren verwendete.

Das Verfahren wurde folgendermaßen durchgeführt:

1 kg Kartoffeln und 15 1 Leitungswasser wurden 30 Minuten gekocht, und dann wurden die Kartoffeln durch ein Gazetuch abfiltriert. Man fügte dann zu dem Filtrat 5 1 Wasser und dazu 2% im Handel erhältliche Saccharose, wobei man ein Kulturmedium für Sc erhielt. Zu diesem flüssigen Medium fügte man Agar in einer Menge von 1,5% und gab das Medium in ein Reagenzglas, wobei man ein eine schräge Fläche bildendes Kulturmedium herstellte. Sclerotinacinerea-Stämme wurden auf dem eine schräge Fläche bildenden Medium inokuliert und 4 bis 7 Tage bei 27 C inokuliert Zwei oder drei Platinösen voll Sc-Stämme des eine schräge Fläche bildenden Kulturmediums wurden auf 100 ml Sc-K ulturmedium, das 0,3% Agar enthielt, in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert. Nachdem der Kolben 4 Tage bei 27 C geschüttelt worden war, wurde das Kulturmedium 2 Minuten bei 9000 rpm homogenisiert. Es wurde dann zum Impfen verwendet. Danach wurden 10 ml Sc flüssiges Medium, zu dem man 1 bis 1,2% Agar zugefügt hatte, in eine Petrischale gegeben, verfestigt und mit 4 ml des gleichen Agarmediums, das mit 10% kultiviertem Medium vermischt war, bedeckt. Das Plattenkulturmedium wurde in einem üblichen Schalenverfahren verwendet. Die Kultur wurde 2 Tage bei 27 C fortgeführt. Bei diesem Verfahren bildet eine 200-mcgml-Lösung der reinen »F-1028«-Verbindung eine Inhibitionszone mit einem Durchmesser von ungefähr 35 mm.

Die »F-1028«-Verbindung kann gemäß ihren im folgenden beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften extrahiert und gereinigt werden. Die »F-1028«-Verbindung wird in einer Kulturflüssigkeit gebildet. Die Mycelien werden durch Zenlrifugier- oder Filtrationsverfahren mit Hilfsfilterstoffen. wie Kieselgur, im sauren oder neutralen Medium entfernt. Dann wird die »F-1028«-Verbindung an einem Kationenaustauscherharz, beispielsweise schwachsaures Kationenaustauscherharz vomNa^-Tj poder schwachsaures K at ionenaustauscherharz vom H ⁺-Typ, adsorbiert, wobei man ansatzweise oder kontinuierlich, beispielsweise auf Säulen, arbeiten kann, und mit angesäuertem oder basisch gemachtem Wasser eluiert. Die »F-1028«-Verbindung ist eine starke basische Verbindung, die an schwachsaurem Kalionenaustauscherhar? vom H * -Typ nicht wesentlich adsorbiert wird, die aber an Harzen der Na⁺ -Art absorbiert wird. Beispielsweise kann man das Filtrat der Fermentationsmischung mit Oxalsäure behandeln und an schwachsaurem Kationenaustauscherharz vom Na'-Typ adsorbieren und das Antibiotikum schnell mit 1 n-HCl cluicren. Verwendet man aktivierten Kohlenstoff, so kann die »F-1028«-Verbindung an dem Kohlenstoff adsorbiert und mit wäßrigem Aceton und wäßrigem Methanol cluicit werden, jedoch nicht \ ollst iindi);

Nachdem das 1 luat. das die »l--l()2S«-Verbindung

509 636/188

enthält, unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann dasi Konzentrat gewünschtenfalls mit Methanol, Äthanol entsalzt werden. Man kann dann eine überschüssige Menge an Methanol, Äthanol und Aceton zufügen, wobei die »F-1028«-Verbindung in Form eines Pulvers ausfallt. Das Eluat von dem Harz zersetzt sich leicht und verfärbt sich braun, Wenn man direkt unter vermindertem Druck trocknet. Es ist daher erforderlich, die »F-l 028«-Verbindung schnell zu behandeln, da ihre Aktivität schlechter wird und sie sich gelb verfärbt, wenn sie längere Zeit steht. Die Mischung, die die »F-l028«-Verbindung enthält, zersetzt sich unter Braunfärbung durch Ausfällen mit Methanol, Äthanol und Aceton und Trocknen. Jedoch ist die »F-1028«-Verbindung sehr stabil in Form einer wäßrigen Lösung. Das Rohpulver, das man erhält, kann durch solche Verfahren wie Chromatographie an Kohlenstoff oder Dextran-Gel gereinigt werden, wobei man ein farbloses Pulver erhält.

Das Eluat wird als Hydrochlorid dann durch eine Säule von schwachbasischem Anionenaustauscherharz geleitet, wobei es in die freie Form überfuhrt wird und danach in das Sulfat, indem man mit Schwefelsäure eluiert. Wenn die Menge an schwachbasischem Anionenaustauscherharz nicht ausreicht und man die Eluate aus der Säule mit schwachbasischem Anionenaustauscherharz über eine Säule aus Dextran-Gel leitet, werden zwei Fraktionen aus der Dextran-Gel-Säi're eluiert. Die erste Fraktion war das Sulfat der »F-1028«-Verbindung. und die zweite Fraktion war das Hydrochlorid. Die letztere Fraktion wurde erneut durch eine Säule von schwachbasischem Anionenaustauscherharz geleilet und mil Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wurde der Dextran-Gel-Säule unterworfen, wobei man ein Sulfat erhielt. Die gemäß den oben beschriebenen Verfahren isolierte und gereinigte »F-1028«-Verbindung besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.

1. Farblose nadelartige oder blättchenartige Kristalle.

2. Schmelzpunkt {Hydrochloride Zersetzung über 195 C.

3. Elemeniaranalyse (als Hydrochlorid): gefunden: C 30.94, H 6,58. N 13.39. O 25.91. Π 23.18%.

4. Summenformel: C₈H_nN₁O₄ (Molekulargewicht: 219. durch Elementaranalyse. Titration und NMR-Spektrum).

5. Äquivalent: 122,5 (durch Titration).

6. Spezifische Drehung (Hydrochlorid) [«]?= 63.2 (C=I, H₂O)

7. 7. PKa : 7.02 und 8, !6.

8. Ultraviolettes Absorptionsspektrum: keine besondere Absorption, wie es in Fig. 1 dargestellt ist.

9. IR-Spektrum: wie in F i g. 2 dargestellt ist. IO Rf-Wert: Wurde Dünnschichtchromatographie .τ» Silicalgel mit einem Entwtcklungsmittel durchgeführt, das ButanoJ. Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 3:1:2 enthielt, so zeigte die Verbindung einen Rf-Wert von 0.25. Verwendete man als Lösungsmittel n-Propanol. Pyridin. Essigsaure und Wasser in einem Verhältnis von 15:10: 3 : 12. so betrug der Rf-Wert 0.6S.
II. Löslichkeit: leicht löslich in Wasser: löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd: wenig löslich in Äthanol: unlöslich in Chloroform. Benzol and Äther.

12. Farbreaktion:

positiv: Ninhydrin-, Ehrlich-, Elson-Morgan-, Tollens- und Benedict-Reaktionen negativ: Molisch-, Sakaguchi-, Maltol- und Eisend I I )-chlorid-Reakt ionen.

13. Sie behält ihre Aktivität in saurer Lösung. Die Aktivität wird jedoch vermindert, wenn die Lösung in neutralen oder alkalischen Zustand überführt wird.

Biologische Eigenschaften der »F-1028«-Verbindung 1. Antimikrobielle Aktivität

Die minimale Inhibitorkonzentration (MIC) der is »F-1028«-Verbindung für verschiedene Mikroorganismen wurde untersucht gemäß dem Agar-Verdünnungsverfahren, und die Ergebnisse sind in Tabelle angegeben.

Tabelle 3

—

Mikroorganismen

Staphylococcus aureus FDA
is 209 ρ

Sarcina lutea PCI 1001

Bacillus subtilis PCI 219 ...

Mycobacterium ATCC 607 .
Escherichia coli NIHJ

Vibrio comma 904

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae.
Holmodendrum pedrosei .
Trichophyton rubrum
Ophiobolus miyabianus ..

Aspergillus niger

Xanthomonas oryzae ....

Xynthomonas citri

Alternaria japonica

Alternaria kikuchiana....

Sclerothinia cinerea

Sclerotinia sclerotiorum ..

Botorytis fabae

Botorytis cinerea

24 Stunden meg/ml

>100

3,12 >100 >100 100

12,5

48 Stunden

>100

>100

25

100

25

>100 50

>100 50

>100 12,5 1,56 6.25 6,25

48 Stunden meg. ml

> 100

> 100 >100

> 100

100

72 Stunden >100

> 100

25

> 100

25 100 100 100

50

> 100

25 3.12 25 12.5

Toxizität

i) Keine Abnormalitäten.

Mäuse (intravenöse Injektion) 125mgkg

(orale Verabreichung) 500 mg kg

Junge Karpfen: keine negativen Beobachtungen mit 250 ppm,

ii) Mäuse (intravenöse Injektion) LD₅,, 160 mg/ki (orale Verabreichung) LD₅₀ 750 mg/ki

Die »F-l028«-Verbindung besitzt somit eine seht niedrige ToxmtäJ Da diese physiologischen, chemischen und biologischen Eigenschaften der »F-1028«- verbmdung nicht denen bekannter zahlreicher Anti-Djoiika entsprechen, zeigt sich auch hier, daß die 6s antibiottschc »F-!O28«-Verbindung eine neue antirnotische Verbindung ist

Die erfindungsgemäße »F-1028«-Verbindung kann wirksam bei Pathogtnen angewendet werden, die

11 12

auf den Pflanzenteilen, die über dem Boden sind, Gips, Calcit, Muscovit, Vermiculit, Dolomit, Apatit,

leben, Palhogenen, die in die Pflanzen durch den Löschkalk, Magnesiumkalk, Kieselgar, anorganische

Boden eindringen und Tracheomycos verursachen Salze, wie Calciumcarbonat, Schwefel, Bimsstein,

und bei Pathogenen, die die Samen infizieren und bei synthetische Mineralpulver, wie hochdispergierte Kie-

Pathogenen, die den Boden infizieren. 5 seisäure oder synthetisches Aluminiumoxyd, syn-

Wie zuvor erwähnt, hat die erfindungsgemäße · thetische Harze, wie Phenolharze, Harnstoffharze

»F-1028«-Verbindung überlegene Kontrollwirkungen oder Phenylchloridharze.

gegen Pathogene, die Reis, Pflanzen und andere ernte- Beispiele von oberflächenaktiven Mitteln umfassen tragende Pflanzen befallen, und sie hat eine gute anionische oberflächenaktive Mittel, wie Alkylschtye-Verträglichkeit mit höheren Pflanzen. In gewöhn- 10 felsäureester(beispielsweiseNatriumlaurylsulfat),Aryllichen Dosen tritt gegenüber erntetragenden Pflanzen sulfonsäuren (beispielsweise Alkylarylsulfonsäuresalze keine Phytotoxizität auf, und gegenüber Haustieren oder Natriumalkylnaphthalinsulfonat), kationische und Fischen zeigt die erfindungsgemäße Verbindung oberflächenaktive Mittel, wie Alkylamine (beispielskaum toxische Wirkungen. Die Verbindung kann weise Laurylamin, Stearyltrimethylammoniumchlorid daher gegen Pflanzenpathogene als landwirtschaft- 15 oder Alkyldimethylbenzylammoniumchloride), oder liches und gartenbauliches Fungicid sehr zweckdien- Polyoxyäthylenalkylamine, nichtionische oberflächenlich verwendet werden, und sie ist praktisch sehr wert- aktive Mittel, wie Polyoxyäthylenglykoläther (beivoll, um die landwirtschaftliche Produktivität zu spielsweise Polyoxyäthylenalkylaryläther oder PoIyerhöhen. oxyäthylenalkylphenyläther), mehrwertige Alkohol-

Bei der Anwendung der erfindungsgemäßen 20 ester (beispielsweise Polyoxyäthylensorbitmonolaurat) »F-1028«-Verbim1ung als landwirtschaftliches und oder Polyoxyäthylenglykolester (beispielsweise Polygartenbauliches Fungicid kann die erfindungsgemäße oxyäthylenfettsäureester) und amphotere oberflächen-Verbindung nach der Verdünnung mit Wasser oder aktive Mittel.

in verschiedenen Formulierungen, hergestellt gemäß Als Beispiele von organischen Materialien können bekannten Verfahren, wie sie bei der Herstellung von 25 erwähnt werden Stabilisatoren, Verteilungsmittel (wie landwirtschaftlichen Chemikalien üblich sind, wobei Festhaltemittel), wie landwirtschaftliche Seifen, Cuman landwirtschaftliche chemische Hilfsmittel ver- maron- oder Indenharze oder Polyvinylbutyläther, wenden kann, eingesetzt werden. Diese verschiedenen Treibmittel für Aerosole, wie halogenierte Kohlen-Formulierungen können als solche oder nach Ver- Wasserstoffe (Freon usw.), Verbrennungsmitte] für dünnung mit Wasser auf die gewünschten Konzen- 30 Räuchermittel, wie Salze der salpetrigen Säure, Zinktrationen angewendet werden. pulver oder Dicyandiamid, Mittel, die Sauerstoff

In der vorliegenden Anmeldung werden als land- ergeben, wie Perchlorate oder Bichromate, Mittel, wirtschaftliche und gartenbauliche Hilfsmittel bei- die die Phytotoxizität vermindern, wie Zinksulfat, spielsweise inerte lösungsmittel und oder Verdün- Eisen(III)-chlorid oder Kupfernitrat. Mittel, die die nungsmiitel (Streckmittel oder Trägerstoffe) (diese 35 Wirkung verlängern, wie chloriertes Terphenyl, Diwerden verwendet, um den aktiven Bestandteil zu spersionsstabilisatoren, wie Casein, Tragacanth, Carbden pathogenen Fungi und/oder dem Ort des Vor- oxymethylcellulose oder Polyvinylalkohol,
kommens der pathogenen Fungi zu transportieren) Die erfindungsgemäße Verbindung kann in ververstanden. Verschiedene oberflächenaktive Mittel schiedcnen Formulierungen verarbeitet werden, ge- und/oder organische Materialien, wie Stabilisatoren. 40 maß Verfahren, die im allgemeinen auf dem Gebiet Verteilungsmittel (Festhaltemittel [stickers]). Treib- der Herstellung von landwirtschaftlichen Chemikalien mittel für Aerosole oder synergistische Mittel (diese verwendet werden.

werden verwendet, um die Wirkung der aktiven Ver- Beispiele von Formulierungen sind flüssige Präpa-

bindung in stärkerem Maße zu ermöglichen, auf- rationen, wie emulgierbare Konzentrate, benetzbare

rechtzuerhalten oder zu aktivieren) können ebenfalls 45 Pulver, Tabletten, lösliche Pulver oder Lösungen,

mit in den Formulierungen enthalten sein. Staube. Granulate, Räuchermittel oder Aerosole.

Beispiele von Lösungsmitteln umfassen Wasser Das erfindungsgemäße Fungicid kann den obigen

und organische Lösungsmittel, beispielsweise ali- aktiven Bestandteil in einer Menge von 0,1 bis 95 Ge-

phatische oder alicyclische Kohlenwasserstoffe, wie wichtsprozent, vorzugsweise 0,5 bis 90 Gewichtspro-

n-Hexan. industrielle bzw. technische Gasoline (Pe- 50 zent enthalten.

troläther. Lösungsnaphtha usw.), Petroleumfraktionen Bei der tatsächlichen Anwendung liegt die geeignete

(Paraffinwachs, Kerosin,leichtes öl, M ittelöl. Schweröl Men»e an aktivem Bestandteil, der in den oben-

usw.), aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol. erwähnten verschiedenen Formulierungen oder in

Toluol. Xylole oder aromatisches Naphtha, halo- den fertigen Präparationen vorhanden ist, im allge-

genierte Kohlenwasserstoffe, wie Chlormethylen. 55 meinen im Bereich von 0,0001 bis 20 Gewichtsprozent.

Chloräthylen. Kohlenstofftetrachlorid, Tnchloräthy- vorzugsweise im Bereich von 0.005 bis 10 Gewichts-

len. Älhylendibromid oder Chlorbenzol. Alkohole. prozent.

wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Propyialkohol oder Der Gehalt des aktiven Bestandteils kann ent-

Äthylenglykol. Äther, wie Äthyläther. Äthylenoxyd sprechend den Formulierungen, den Verfahren, dem

oder Dioxan. Alkoholäther, wie Äthylenglykol oder 60 Zweck, der Zeit und dem Ort der Anwendung und

Monomethyläther, Ketone, wie Aceton und Isophoron. dem Zustand der Infektion usw. in geeigneter Weise

Ester, wie Äthylacetat oder Amylacetat, Amide, wie gewechselt werden.

Dimethylformamid oder Dimelhylacetamid und SuIf- Verschiedene Formulierungen oder fertige, d. h

oxyde, wie Dimethylsulfoxyd. sofort zu verwendende Präparationen, die den erfin-

Beisrnele von Verdünnungsmitteln (Streckmittel 65 dunesgemäßen aktiven !Bestandteil, wie oben be-

oder Trägerstoffe) umfassen pflanzliche Pulver. Mine- schrieben, enthalten, können gemäß Verfahren, die

ralpulver. Tonmineralien, wie Kaolinite. Montmonllo- üblicherweise auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen

nite oder Aitapulgite. Talk. Pyrophyllite. Glimmer. Chemikalien verwendet werden, eingesetzt werden.

wie Versprühen (beispielsweise ein Versprühen von flüssigen Präparationen, Vernebeln, Atomisieren, Versprühen von Staub, Versprühen von Granulaten. Anwendung auf Wasseroberflächen oder Verstreuen), durch Vernebeln, Anwendung auf den Boden (beispielsweise durch Versprühen, Verdampfen oder Vergießen), Anwendung auf die Oberfläche des Bodens (beispielsweise überziehen, Verteilen [banding], Verteilen von Staub oder Bedecken) oder durch Imprägnieren. Sie können ebenfalls durch das Ultra-niedrig-Volumensprühverfahren verteilt werden. Bei diesen Verfahren kann der aktive Bestandteil in einer Menge bis zu 95% oder selbst 100% vorhanden sein.

Die Menge, die pro Flächeneinheit an erfindungsgemäßem Fungicid aufgebracht wird, beträgt ungefähr 3 bis 1000 g, vorzugsweise 30 bis 600 g, pro 10 Ar, berechnet als aktive Verbindung. In speziellen Fällen kann die Menge jedoch entweder über oder unterhalb dieses Bereichs liegen und manchmal, wenn erforderlich, kann sie von diesem Bereich abweichen.

Gegenstand der Erfindung ist eine fungicide Zusammensetzung, die die Verbindung der Formel I als aktiven Bestandteil und/oder ein Lösungsmittel und/oder ein Verdünnungsmittel (Streckmittel oder Trägerstoff) und/oder ein oberflächenaktives Mittel.

Die Erfindung betrifft somit fungicide Mittel, enthaltend die pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« als Wirkstoff; dieser ist vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 95 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, vorhanden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

In F i g. 1 ist das UV-Spektrum einer wäßrigen Lösung des Hydrochlorids der erfindungsgemäßen antibiotischen »F-1028«-Verbindung dargestellt.

In F i g. 2 ist das IR-Spektrum des Hydrochlorids der »F-1028«-Verbindung vermischt mit Kaliumbromid dargestellt.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, das 0.5% Fleischextrakt. 0.5% Natriumchlorid. 0,3% Hefeextrakt. 2% Glucose, 0.5% Pepton und Calciumcarbonat enthielt, wurde mit einer öse voll Mycelium von Streptomyces kagawaensis. dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm, inokuliert. Nachdem das inokulierte Medium unter Schütteln 2 Tage gezüchtet worden war. wurde es in einen 100-1-Fermentationstank mit 75 1 des gleichen Kulturmediums gegeben. Dieses inokulierte Medium wurde bei 27 C mit Belüftung von 10 l/Min., Rühren von 250 rpm und einem inneren Druck von 0.5 kg cm² während 2 Tagen inkubiert. Es hatten sich dann 400 meg, ml in der Lösung »F-1028«-Substanz gebildet. 701 des gesichteten Mediums wurden mit gesättigter Oxalsäurelösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit einer Konzentration von Celit von 0,5% filtriert. Das Filtrat wurde dann mit 2n-NaOH auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und zusammen mit 2,8 1 schwach saurem Kationenaustauscherharz vom Na*-Typ während 30 Minuten gerührt. Danach wurden die Harze durch Filtration abgetrennt und das Filtrat erneut auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und mit 1,4 I schwach saurem Kationenaustauscherharz vom Na"-Typ vermischt, gerührt und filtriert. Die gesammelten Harze wurden vereinigt. Nach zwei solchen Behandlungen waren 95% der »F-1028«-Verbindung im Filtrat von dem Har? adsorbiert. Danach wurde das Harz, das die »F-1028«-Substanz adsorbiert enthielt, ausreichend mit Wasser gewaschen und in eine Säule gefüllt. Die »F-1028«-Verbindung wurde mit 1 n-HCl eluiert, und ungefähr 5 1 des Eluats, das die aktive Verbindung enthielt, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert. Nach Abfiltrieren des Natriumchlorids, das sich bei dieser Stufe gebildet hatte, wurde zu der Lösung die dreifache Menge an Methanol zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter kalten Bedingungen aufbewahrt. Es bildete sich weiteres Natriumchlorid, das abfiltriert wurde, und dann wurde die zehnfache Menge an Aceton zugefügt. Es bildete sich ein Niederschlag an »F-1028«- Verbindung, dieser wurde abfiltriert. Man erhielt 95 g der »F-1028«-Verbindung als rohes Pulver (Ausbeute: 60 bis 70%), nachdem man den Niederschlag getrocknet hatte.

Beispiel 2

125 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 3% Sojabohnenmehl, 0,5% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat enthielt, wurden in einen 500-ml-Sakaguchikolben gegeben, sterilisiert und mit 2 ml vorgezogenem Medium von Streptomyces kagawaensis. dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm, inokuliert. Der Kolben wurde dann bei 27 C unter Rühren mit 120 rpm und mit einer 8 cm Amplitude inkubiert. Nach 48 Stunden betrug die Konzentration an »F-1028«-Verbindung 580mcg/ml. Die Lösung wurde gesammelt, und die aktive Verbindung wurde gemäß den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, extrahiert, wobei man das rohe Pulver erhielt.

Beispiel 3

6 g der rohen gepulverten »F-1028«-Verbindung. die man im Beispiel 1 erhalten hatte, wurden in 10 ml Wasser gelöst und an einer Säule, die mit 60 g aktiviertem Kohlenstoff für die Chromatographie gefüllt war (hergestellt von Wako Seiyaku Co., Ldt.) adsorbiert und mit Wasser entwickelt. Die »F-1028«-Verbindung wurde al s farblose, wäßrige Lösung! Ausbeute: 91,5%) eluiert. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und mit der 20fachen Menge Äthanol vermischt. Der Niederschlag wurde getrocknet, wobei

man 4 g der rohen »F-1028«-\erbindung als Pulver erhielt Nacheinander wurden 2 g des Pulvers in 4 ml Wasser gelöst, in eine Dextran - Gel - Säule (2.5 150 cm) gegeben und mit Wasser entwickelt. Die aktive Fraktion wurde im Vakuum konzentriert, wobei man 1.25 g farbloses Pulver erhielt. Eine MethanoUösung des farblosen Pulvers wurde stehengelassen, wobei Kristalle ausfielen. 170 rag blättchenartige oder nadelartige Kristalle der »F-1028«-Verbindung wurden als Hydrochlorid erhalten.

Beispiel 4

Eine wäßrige Lösung des Hydrochlorids der »F-1028«-Verbindung. eluiert aus einer Säule mit aktiviertem Kohlenstoff gemäß dem im Beispiel 3

beschriebenen Verfahren, wurde durch eine Säule gegeben, die mit schwachbasischem Anionenaustauscherharz in der OH ~-Forai gefuUt war. Die Lösung, die aus der Säule abfloß, wurde mil Schwefelsäure neutralisiert, konzentriert und mit der lOfachen Meng« Äthanol oder Aceton vermischt. Man erhielt ein Sulfat der »F-1028«-Verbindung als Pulver. Das Pulver v.urde dann auf eine Dextran-Gd-Säule gegeben und in zwei Fraktionen geteilt. Die ersterc

Fraktion war das Sulfat, und die letztere Fraktion war das Hydrochlorid. Die letztere Fraktion wurde erneut über eine Dextran-Gel-Säule gegeben, wobei man das Sulfat erhielt. Eine wäßrige Lösung des Sulfate wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man ein farbloses Pulver erhielt

Die ausgezeichneten Eigenschaften und die beiöndere Wirkung der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung als landwirtschaftliches und gartenbauwirtschaftliches Fungidd ist aus den Ergebnissen der folgenden Untersuchungen erkennbar, wobei es in diesen Versuchen gegen verschiedene pathogene Pilze verwendet wurde.

Beispiel S

Versuche an Sclerotinia-Fäule von Bohnen und '⁵ grauem Schimmel an Gemüsen {Vorbeugungsversuch):

Das Hydrochlorid der »F-1028«-Verbindung in einer vorgegebenen Konzentration wurde auf Bohnen versprüht (Art: Taisho Kintoki), und zwar im Zustand, in dem die Pflanzen zwei bis drei Blätter hatten und in einer Menge von 15 ecm pro Topf. Einen Tag nach dem Versprühen wurden die Blätter abgeschnitten, und die Hyphen liefernden Teile eines grauen Schimmelpilzes und eines Sclerotinia-Fäulepilzes, die zuvor in einem PDA-PlattenKulturraedium gezogen worden waren, wurden in einer Größe mit einem Durchmesser von 7 rom und einer Dicke von 2 mm ausgestampft, und damit wurden die Blätter inokuliert. Die inokulierten Blätter wurden in ein Gefäß mit konstanter Temperatur (20 C, Feuchtigkeit mehr als 98%) gegeben,und nachdem 3 Tage vergangen waren, wurden die Durchmesser der vergrößerten Krankheitsflecken bestimmt. Dann wurde das Inhibitationsverhältnis bei den Krankheitsflecken berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.

Das Inhibitaüonsverhälinis der Krankheitsflecken wurde folgendermaßen bestimmt:

Krank heitsfleckeninhibitationsverhältnis (%)

Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blattes

- Durchmesser der mit Krankheit befallenen Steljejles behandelten Blaues

Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blattes

	Konzentralion an aktivem Bestandteil	Tabelle 4	lnhibitations- vcrhältnis	Sclcrotinia-Fäulcpilz	Inhibitions- verhältnis
	50 ppm		67	Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle <"/·)	100
Verbindung	25 ppm	Grauer Schimmelpilz	23	0	71
F-1028-Verbindung	ursprüngliche	Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle	63	10	100
Hydrochlorid	Flüssigkeil 8 χ	10	40	0	100
F-1028-Verbindung	χ HKX)	23		0
Kulturflüssigkeit	(500 ppm)	11	67		91
Allisan (50%)*) (im Handel	χ 1000	18		3
erhältlich, Vergleich)	(50 ppm)		37		57
Polyoxyn**)(5%)(im Han		10	0	20	0
del erhältlich, Vergleich)			35
Nicht behandelt	19
	3G

*) Allisan:2,6-Dichlor-4-nitroanilin ·*) Antibiotische Substanz, hergestellt durch Streplomyces cacaoi var. asoensis.

Beispiel 6

Versuch an grauem Schimmel und Sclerotinia-Fäule von Bohnen (Heilungsversuch)

Bohnenblätter (Art: Taisho Kintoki) wurden abgeschnitten und grauer Schimmelpilz und Sclerotinia-Fäulepilz. die in einem PDA-Plattenkulturmedium gezogen worden waren und in einer Größe mit einem Durchmesser von 7 mm und einer Dicke von 2 mm ausgestanzt worden waren, wurden auf den Blättern inokuliert. Die inokulierten Blätter wurden 24 Stunden in einer feuchten Kammer bei 20⁰C gegeben. Die Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stellen wurden bestimmt.

Die »F-1028«-Verbindung, die auf eine vorgegebene Konzentration verdünnt war, wurde auf die Blätter in einer Menge versprüht, so daß sie von den Blättern abtropfte. Die Blätter wurden in Luft getrocknet und erneut in eine Kammer mit konstanter Temperatur bei 20° C gegeben. Nachdem 48 Stunden vergangen waren, wurden die Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stellen gemessen. Der Grad des Forlschreitens der Krankheit an den verschiedenen Stellen, verglichen mit den vor dem Versprühen mit den Chemikalien befallenen Stellen, wurde bestimmt und ausgedrückt als Inhibitationsverhältnis der mit Krankheit befallenen Stellen:

55 Inhibitationsverhältnis der mit

Krankheit =
befallenen Stellen

- {dt₂-dt_x

dc₂ —

-^ · 100

dc_x: Durchmesser der mit Krankheil befallenen Stelle des nicht behandelten Blatts vor der Anwendung der Chemikalien.;

de-,: Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blatts nach der Anwendung der Chemikalien.
di_x: Durchmesser der mit Krankheil befallenen Stelle

vor der Anwendung der Chemikalien.
dt₂ '· Durchmesser der mit Krankheil befallenen Stelle nach der Anwendung der Chemikalien.

509 636/188

17

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt:

Tabelle 5 A. Testergebnisse beim jrauen Schunme!^

Verbindung

F-1028-Verbindurig

Konzentration an aktivem Bestandteü

100 ppm 50
25
x 1000 (500 ppm)

Durchmesser

der mit Krankheit

befallenen Stelle

,or dem Versprühen

Durchmesser

der mit Krankheit

befallenes Stelle

nach dem Versprühen

(mm)	(mm)
14,0	16,3
14,0	17,0
14,0	19,3
12,6	18,0
14,0	17,7
11,0	23,3

Allisan (50%} (technisch im
Handel erhältlich, Vergleich)

.wv ,,-, ,„, _v . _T ' χ 1000 (200 ppm)

Handel erhältlich, Vergleich)
Nicht behandelt
*) Sclex: S-ß.S-DichlorphenylJ-S.S-dimelhyl-oxazolidindion-ZA Tabelle 5 (Fortsetzung)
B. Testergebnisse bei Sclerotiniafäule

Inhibitalions-

verhiiltnis der

mit Krankheil

befallenen Stellen

81 75 59

43

61

Verbindung

F-1028-Verbindung

Allisan (50%) (technisch im
Handel erhältlich. Vergleich)

Nicht behandelt

Konzentration an aktivem Bestandteil

100 ppm 50 1000 (500 ppm)

Durchmesser

der mit Krankheit

befallenen Stelle

ιοί dem Versprühen

(min) _

11,3
11,3
13,6

12,0

Durchmesser

der mit Krankheil

befallenen Stelle

vor dem Versprühen

(mm)

16,3 19.6 26,6

33

Inhibitionsverhällnis der mit Krankheit befallenen Stellen

76 62 62

Beispiel 7

Versuch an brauner Fäule (Sclerotinia cineria) bei Pfirsichen (Feldversuch)

40

Tabelle 6
Testversuche bei brauner Fäule_

Verbindung der verwendeten Probe Konzentration beim Sprühen

ppm
xlOOO

Infektion beim Fmtcn

xl500

0
0,3

Infektion.

nachdem

man 7 Tage

verpackt

gelagert

hatte

0,03
38,5

0 46,1

F-1028-Verbindung

Benlat(50%)(im Handel erhältlich, Vergleich)

Sclex (20%) (im Handel erhältlich, Vergleich)

Nicht behandelte

Probe

Bemerkung:

Benlat = Methyl-l-(butyl-carbamoyl)-2-bcnzimidazolcarbamat. Sclex = 3-(3,5-Dichlorphcnyl)-5.5-dimethyl-oxazolidindion-2,4.

7,7 61,6

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   U Pilzbefall verhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« der Formal

   HCOH

   HCNH₂
   HOCH
   CH,CHCONHCH