DE1954110A1

DE1954110A1 - Neues Antibiotikum,Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Schaedlingsbekaempfungsmittel

Info

Publication number: DE1954110A1
Application number: DE19691954110
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Takashi Iwasa; Kazuho Matsuura; Komei Mizuno; Motoo Shibata; Osamu Wakae; Hiroichi Yamamoto
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1968-10-29
Filing date: 1969-10-28
Publication date: 1970-05-27
Also published as: FR2021851A1; NL6916326A; DK137862C; DK137862B; GB1278289A; CH532658A; NL149228B

Description

PATENTANWÄLTE DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHON WALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER D1PL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLOPSCH KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 22.10.1969 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27j Doshomaohi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Neues Antibiotikum, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Schädlingsbekämpfungsmittel

Die Erfindung "betrifft ein neu.es Antibiotikum, das als T-7545 bezeichnet wird und die Antibiotika T-7545-A, T-7545-B und deren Gemische umfaßt und durch Kultivierung eines das Antibiotikum 1-7545 bildenden Stammes von Actinomycetes erhalten wird.

Auf der Suche nach neuen antibiotisch aktiven Substanzen isolierte die Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen des Bodens und untersuchte ihre Metabolite„ Die Forschungsarbeit führte zu den Feststellungen, daß gewisse vom Boden isolierte Mikroorganismen das neu Antibiotikum T-7545 zu bilden vermögen, daß diese Mikroorganismen zu. Actinomycetes gehören, und daß es möglich ist, das Antibiotikum durch Kultivierung diesirTYfikroorganismen in einer Weise, daß das Antibiotikum im Kulturmedium angereichert wird, erhalten werden kann.

Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zu. Grunde» Die Erfindung betrifft somit ein neues Antibiotikum, das erhalten wird, indem ein T-7545 bildender

009822/189« SAD on_mAL

Stamm, der zu Actinomycetes gehört, so kultiviert wird, daß das Antibiotikum T-7545 im Kulturmedium gebildet wird, und das auf diese Weise im Kulturmedium angereicherte Biotikum isoliert wird.

Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß das neue Antibiotikum T-7545 ein ausgezeichnetes Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise des Blattscheidenbrandes (sheath blight) von Reispflanzen bei Anwendung in vivo ist, jedoch in vitro keine Wirkung gegen Bakterien und Pilze zeigt.

Die Erfindung betrifft demgemäß das neue Antibiotikum T-7545 und das Verfahren zu seiner Herstellung, ferner ein gegenüber Menschen, Tieren und Fischen ungiftiges, im wesentlichen keine Phytotoxizität aufweisendes Fungizid zur Bekämpfung von bakteriellen und pilzlichen Planzenkrankheiten«,

Die Erfindung umfaßt ferner eine Konzentratform dieses Fungizids, die nach einfacher Verdünnung vor dem Gebrauch auf die Wirtspflanzen für die oben genannten Zwecke an— wendbar, stabiler und zweckmäßiger zu lagern und zu transportieren ist als die verdünnten, gebrauchsfertigen Präparate und ein systemisches Fungizid darstellt, das leicht von den Pflanzen aufgenommen wird.

Das Antibiotikum T-7545 wird durch Kultivierung eines zu Actinomyces gehörenden Stammes, der dieses Antibiotikum zu bilden vermag, erhalten. Beispielsweise können der Stamm, der von den Erfindern von Bodenproben aus Akashi City, Präfektur Hyogo, Japan, isoliert wurde und als Streptomyces hygroscopicus var. limoneus bezeichnet wurde, sowie seine verwandten Stämme mit besonderem Vorteil verwendet werden.

JäH^X ^i 0 9 8 2 2/18 9 6

Die milcrobiologiscfaen Eigenschaffen und Kultureigenschaften von Streptomyces hygroseopicus var.limoneus sind nachstehend angegeben. Hierbei basieren die mit "Rdg·" gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf Ridgeway's "Color Standard and Color Nomenclature."

1) Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel dieses Stammes zeigt monopodiale Verzwei-' gung, und die Konidienketten sind spiralförmig. Der Mikroorganismus ist eiförmig oder rechteckig und hat eine Größe von 1,0 bis 1,3 M x 1_f0 bis 1,5« und eine glatte Oberfläche.

2) Kultureigenschaften

Die folgenden Kultureigenschaften werden, falls nicht anders angegeben, bei Kultivierung bei 28⁰C beobachtet. Wenn die Kultivierung bei anderen Temperaturen durchgeführt wurde, sind diese Temperaturen in Klammern angegeben.

a) Czapek-Agar

Wachstum: farblos,- faltig

Rückseite: Raw Sienna (Rdg., Ill, 17-i) bis Sudanbraun (Rdg., III, 15-k)

Luftmycel: Tilleul Buff (Rdg., XL, 17"'-f) bis Light Buff (Rdg., XV, 17'-f) teilweise mausgrau (Rdg., LI, 15""') längs der Peripherie der Kolonie.
Lösliches Pigment: Gelb mit schwach bräunlichen Ton.

b) Glucoee-Czapek-Agar: . Wachstum: farblos bis Sulph-in Yellow (Rdg., IV, 21-i),

faltig

Rückseite: Raw Sienna

Luftmycel: Tilleul Buff bis Massicot Yellow-(Rdg.,

XVI, 21"-f) teilweise Light Olive Gray (Rdg., LI, 25'""-ä) längs der Peripherie der Kolonie.
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- 4- 195A110

Lösliches Pigment: gelb mit schwach "bräunlichem Ton.

c) Glycerin-Czapek-Agar:

Wachstum: farblos bis Orange Citrine (Rdg., IV, 19-k), faltig
Rückseite: Raw Sienna

Luftmycel: Tilleul Buff bis Massicot Yellow, teilweise

hellolivgrau.
Lösliches Pigment: gelb mit schwach bräunlichem Ton

d) Glucose-Asparagin-Agar:
•JO* Wachstum: farblos

Rückseite: Old Gold (Rdg., XVI, 19'-i) bis Antimony

Yellow (Rdg,, XV, 17'-b) bis Cinnamon Brown (Rdg., XV, 15«-k).

Luftmycel: hellolivgrau bis mausgrau mit gelben Flecken und schwarzen feuchten Flächen.

Lösliches Pigment: hellbraun

e) Calciummaleatagar:

Wachstum: Primuline Yellow (Rdg., XVI, 19') Rückseite: Primuline Yellow
1 Luftmycel: zunächst spärlich, jedoch später Tilleul

Buff bis hell-olivgrau Lösliches Pigment: blaßgelb „

f) Stärkeagar: kein Wachstum

g) Modifiziertes Stärkeagar mit folgenden Bestandteilen: Lösliche Stärke 196

Kaliummonohyärogenphosphat 0,3$

CaIciurnearbonat 0,3#

Magnesiumsulfat 0,1#

Ammoniums ulf at 0,256

Natriumchlorid 0

Agar 256

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Wachstum* farblos bis Barium Yellow (Rdg,, XVI, 23'-d) Rückseite: Deep Colfcnial Buff (Rdg., XXX, 21"-Id) bis

Snuff Brown (Rdg., XXIX, 15^M-k) luftmycel: Cartridge Buff (Rdg·, XXX, 19"-f) bis mausgrau mit schwarzen feuchten Stellen Lösliches Pigment: hellbraun. Hydrolysierung der Stärke wurde beobaohtet.

h) Tyrosin-Agar:

Wachstum: farblos bis Irontian Yellow (Rdg.,XVI, 23') Rückseite: Pale Ochraoeous Buff (Rdg., XV, 15»-f) bis

Light Oohraceous Buff (Rdg., XV, 15'-d) Luftmyoel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nioht vorhanden

i) Hefeextrakt-Agar: Wachstum: farblos, faltig Rückseite: cbemefarben (Rdg·, XVI, 19'-f) Luftmyoel: weiß

Lösliches Pigment: hellbraun

j) Nähragar (37°O)i Wachstum: farblos

Rückseite: farblos ^v

Luftmyoel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

k) Gluoose-Nähragar (37⁰C): Wachstum: farblos, faltig Rüokseite: Cartridge Buff bis Pale Ochraoeous Buff Luftmycel: nicht vorhanden Lösliohes Pigment: nioht vorhanden

1) Nährbrühe (37⁰C): Wachstum: farbloses Oberfläohenwaohstum und farbloses

flookiges Wachstum am Boden. Luftmyoel: nioht vorhanden Lösliohes Pigment: nioht vorhanden

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m) Glucose-Nährbrühe (37⁰C) j

Wachstum: Oberflächenwachsturn Cartridge Buff und farbloses flockiges Wachstum am Boden· Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

n) Kartoffel-Stichkultur:

Wachstum: farblos bis Pale Ochraceous Buff Luftmycel: Tilleul Buff bis mausgrau Der Stich färbt sich Sayal Brown (Rdg., XXIX, 15"-i)

o) Möhrenstichkultur: Wachstum: farblos Luftmyoel: weiß bis mausgrau Der Stich färbt sich Cinnamon Rufous (Rdg., XIV, 11'-i) bis zimtbraun.

p) Cellulose:

Wachstum: Chartreuse Yellow (Rdg., XXXI, 25^M-d) bis

Reed Yellow (Rdg., XXX, 23"-b). Luftmycel: mausgrau Lösliches Pigment: blaßgelb

q) Gelatine (25⁰C):

Wachstum: sehr schlecht Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden Die Gelatine wird leioht verflüssigt.

Das gleiche ist bei Nährgelatine der Pail.

r) Ganzes Ei (37⁰C): Wachstum: farblos Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

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s) Laokmusmilch (37⁰C):

Wachstum: Oberfläohenwachsturn,cremefarben bis Seashell

^; Bink (Rdg., XIV, 11·-£) Luftmycel: nicht vorhanden

Das Medium wird sohwach koaguliert, dann peptonisiert, wobei es Army Brown (Rdg., XL, 13"'-i) und schwach sauer wird.

t) Löffler-Medium (37⁰C) :

Wachstum» Naples Yellow (Rdg., XVI, 19'-d) zuerst und später Light Buff.

Luftmyoel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden Keine Verflüssigung.

u) Peptongluoose-Agar:
Wachstum: Chartreuse Yellow
Rückseite: honiggelb
Luftmyoel: dünn, Cream Buff
Lösliches Pigment: gelb mit bräunlichem Ton

v) Flachagar:
Wachstum: spärliches und farbloses Wachstum in die

Substanz des Mediums
Rückseite: farblos bis mausgrau
Luftmycel: spärlich, Tilleul Buff bis mausgrau Lösliches Pigment: nicht vorhanden

3) Physiologische Eigenschaften:
a) Temperatur und p_H-Bereich

Kein Wachstum bei 1O⁰C und 50⁰C auf Bennett-Agar oder Glucoseasparaginagar unter aeroben Bedingungen. Wachstum findet bei 15 bis 45⁰C statt, besseres Wachstum bei 37 bis 4-5⁰C. Kein Wachstum, wenn das Medium einen p_H-Wert von 4 hat. Bei p_ß 5 bis 10 findet zwar Wachstum statt, jedoch liegt der optimale Bereich bei p_H 6 bis 7.

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b) Gelatine: leicht verflüssigt

c) Stärke: hydrolysiert

Durchmesser der hydrolysierten Fläche/Durohmesser der Kolonie = 33 mm/8 mm. d) Pyrosinasereaktion: negativ.

e) lackmusmilch: peptonisiert» Koagulierung zweifelhafte

f) Nitratreduktion: negativ.

g) Hydrolyse von Cellulo.se: negativ, h) Farbstoffbildung: negativ.

i) Produkt: Antibiotikum T-7545.

4) Verwertung von Kohlenstoffquellen: Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Mitarbeitern (Journal of Bacteriology £6 107-1H (1948)) ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Verwertung von Kohlenstoffquellen durch Streptomyces hygroscopicus var. limoneus

Erythrit - Inosit ++

Adonit - D-Mannit ++

Sorbit + Dulcit

D-Xylose ++ .Trehalose ++

L-Arabinose ++ Salicin

L-Sorbose - Esculin -

D-Galactose ++ Inulin ++

Glucose ++ Dextran +

D-Fructose ++ Mannose ++

L-Rhamnose ++ Stärke ++

Melibiose ++ Glycerin ++

Maltose ++ Natriumacetat +

Saccharose ++ N^triumsuccinat +

Lactose ++ Natriumeitrat + Raffinose ++ Calcium-2-keto-

gluconat

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++: gut verwertet; ' +: ziemlich gut verwertet -: nicht verwertete

Der gemäß der Erfindung verwendete Stamm zeigt somit monopodiale Verzweigung, wobei die Spitze seines Luftmycels spiralförmig ist· Die Konidien haben eine glatte Oberfläche. Der Stamm hat ein gelbes bis lederfarbenes Wachstum auf synthetischen Medien im allgemeinen und erzeugt auf proteinhaltigen Medien kein braunes lösliches Pigment»

Die vorstehenden Kultureigenschaften wurden mit den Beachreibungen in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology¹·, 7.Auflage (The Williams and Wilkins, 1957), in ^wThe Actinomycetes" von S₀A₀ Waksman, Band 2 (The Williams and Wilkins 1962) und in "Systematik der Stre-ptomyceten" von Ralph Hütter (Es, Karugas 1967) verglichen. Es wurde festgestellt, daß der Stamm den Stämmen Streptomyces ambofaciens, Streptomyoes platensis und Streptomyces hygroscopicus ähnlich ist.

Trotz der großen Ähnlichkeit in der Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels_vunterscheiden sich jedoch Streptomyces ambofaciens und der erfindungsgemäß verwendete Stamm dadurch, daß der erstere keine schwarzen feuohten Flecken im Iiuftmycel hat, daß er Gelatine in mittlerem Grade verflüssigt und ein gelbes flokkiges Wachstum im verflüssigten Teil bildet, und daß er andere Kohlenstoffquellen als der erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet· Streptomyces platensis unterscheidet sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm daduroh, daß er ein tief olivfarbenes vegetatives Mycel auf Ozapek-Agar bildet, wobei die Rüokseite der Kolonie mit der Zeit dunkel ollvfarben wird, daß er ein cremefarbenes bis stumpf-gelbliches Wachstum auf Stärkeagar ergibt, wobei sein Luftmyοel die Fafbe von Weiß nach

Mausgrau mit schwarzen Flecken verändert, und daß er 009822/1808

andere Kohlenstoffquellen als der erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet. Bin Vergleich der Beschreibungen von Streptomyces hygroscopicus mit den Kultureigenschaften des gemäß der Erfindung verwendeten Stammes zeigt, daß der letztere sich von Streptomyces hygroscopicus dadurch unterscheidet, daß sein Wachstum oder die Rückseite der Kolonie die hellgelbe Farbe bis Lederfarbe auf Czapek-Agar (einschließlich Glucose-Czapek-Agar und GIycerin-Czapek -Agar), Glucose-Asparagin-Agar, Calciummaleatagar und anderen Medien zeigt und ein gelblichweißes bis gelbes Luftmycel auf diesen Czapek-Agarmedien bildet. Viele Kultureigenschaften dieses Stammes fallen jedoch mit den stabilen Eigenschaften von Streptomyces hygroscopicus zusammen, die von !Dresner und Backus (Applied Microbiology, Band 4, Seite 243, 1956) angegeben werden. Demgemäß wurde von der Anmelderin der erfindungsgemäß verwendete Stamm als eine Variante von Streptomyces hygroscopicus identifiziert und als Streptomyoes hygros-

seiner copious var. limoneus bezeichnet. Dieser Stamm und einer/ Mutanten ist beim Institute for Fermentation, Osaka, unter der Nummer IPO 12703 hinterlegt worden.

Actinomyceten haben das allgemeine Merkmal, daß ihre mikrobiologischen Eigenschaften äußerst mutativ sind, und Streptomyces hygroscopicus var. limoneus ist keine Ausnahme von dieser Regel. Beispielsweise lassen sich seine Kultureigenschaften und die Art der Verwertung von Kohlenstoffquellen leicht ändern, und es können zahlreiche Mutanten vorhanden sein. Insbesondere lassen sich von ^; diesem Stamm leicht Mutanten erhalten,.die ein gelbes Luftmycel haben. Beispielsweise hat ein als IFO-12704 bezeichneter Stamm ähnliche Eigenschaften wie der Stamm IFO-12703, außer daß er ein gelbes Luftmycel hat, das nicht hygroskopisch wird. Diese Mutanten können jedoch ebenfalls für die Zwecke der Erfindung verwendet werden,

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soweit sie die Fähigkeit haben, das Antibiotikum T-7545 zytoilden. Es spielt natürlich keine Rolle, ob die Mutation spontan oder künstlich induziert wirdο

In das für die Zwecke der Erfindung verwendete Kulturmedium werden assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoffquellen, anorganische Salze u.dgl. einbezogen·· Gegebenenfalls können Spurenelemente, z.B. Spurehnährstoffe, Wachstumsfaktoren, Vorstufen usw., dem Kulturmedium zugesetzt werden· Zu den Kohlenstoffquellen, die der T-7545 bildende Stamm assimiliert, gehören u.a.

Kohlenwasserstoffe, Glucose, Saccharose, Melasse, Stärke, Dextrin und Glycerin. Als. Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische Stickstoffverbindungen wie Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton und Casein sowie anorganische Stickstoffverbindungen wie Nitrate und Ammoniumverbindungen, die sämtlich vorteilhaft verwendet werden können.

Die Kultivierung kann als Oberflächenkultur durchgeführt werden, jedooh ist es üblicher, die aerobe Submerskultur anzuwenden. Bei der Submerskultur wird der Pg-Wert des Mediums vorteilhaft in der Nähe des Neutralpunktes gehalten. Das Wachstum findet bei Bebrütungstemperaturen von 20 bis 40 G statt, jedoch wird das Medium vorzugsweise im Bereich von etwa 23 bis 37°C gehalten. Die Anreicherung des gewünschten Antibiotikums ist in 4 bis 7 lagen beendet.

T-7545 hemmt nicht das Wachstum von Bakterien und Pilzen beim In-vitro—Test, sondern verursacht nur bei Pellieularia sasakii und seinen eng verwandten Pilzen eine anomale Verzweigung (übermäßige Verzweigung, oder verzweigte Hyphen nehmen eine doldenartige Form an) an den Spitzen der Hyphen. Daher sollte die biologische Austestung des Antibiotikums T-7545 wie folgt vorgenommen

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werden:

Pellicularia sasakii wird als TestOrganismus und reines Agar als Nährmedium für den Test'verwendet. Der Testorganismus wird auf einer Kartoffel-(Saocharose)-Agarplatte 2 bis 5 Tage kultiviert. Die erhaltene Kultur wird verwendet, um in der Mitte einer 9 cm-Petrischale eine Platte von modifiziertem Pfeffer-Medium zu impfen. Dieses Medium wird dann 2 Tage bei 27⁰C bebrütet. Nach dieser Zeit hat sich das Mycel über die gesamte Oberfläche der 10* Platte ausgebreitet. Das Wachstum bis sun Umfang eines Kreises mit einem Radius von etwa 3 bis 3»5 cm von der Mitte wird mit einem Bohrer herausgeschnitten und die hierbei erhaltene Agarscheibe als Impfmaterial verwendet.

Eine Verdünnungsreihe von Agarplatten, die unterschied-15' liehe Konzentrationen von Antibiotikum T-754-5 enthalten, wird nach der üblichen Agarverdünnungsmethode hergestellt.

Eine Glasscheibe von 8 mm Durchmesser und etwa 0,2 mm Dicke wird in die Mitte jeder Agarplatte der oben genannten Verdünnungsreihe gelegt, und die als Impfmaterial dienende Agarscheibe wird dann auf die Glasscheibe gelegt. Nach Bebrütung für 40 Stunden bei 27⁰C wird der Versuch ausgewertet. Eine Betrachtung mit dem bloßen Auge zeigt, daß bei Pellicularia sasakii die Spitze der Hyphen des Testorganismus, der auf der als Impfmaterial dienenden Agarscheibe wächst, eine anomale Verzweigung erfährt. Die Verdünnungseinheit stellt den Wert der maximalen Verdünnung dar, in der die Lösung eine solche anomale Verzweigung zu zeigen vermag. Eine wässrige Lösung, die 1000 γ-ml gereinigtes T-7545-A oder T-7545-B enthält, hat 100000 Verdünnungseinheiten/ml bzw. 1500 Verdünnungseinheiten/ml.

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Daa bei diesem Test verwendete modifizierte Pfeffer-Medium hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose	Ο,29έ
L-Asparagin	0,396
Ammoniumnitrat	0,19^
Kaliumdihydrogenphosphat	0,196
Magnesiumsulfat	0,001^6
Chelatverbindung ^wVelsenolⁿ*	1,2$
Agar
Eingestellt auf Pu 7	(Hersteller
♦Eisennatriumäthanoläthylendiamintriacetat
Dow Chemical).

Vor dem Gebrauch des Mediums werden die folgenden Vitamine in den genannten Mengen zugesetzt(Gewicht pro ml

Medium): ,

Thiamin 1 γ/ml

Riboflavin 1 "

dalciumpantothenat 1 ⁿ

Niacin 1 ^M

Biotin 0,005 "

Polsäure *0,5 "

Pyrddoxinhydrochlorid 2 "

p-Aminobenzoesäure 0,5 ^M

Cyancobalamin 0,0002"

Wenn Streptomyces hygrosoopicus var.limoneus in der oben beschriebenen Weise kultiviert wird, wird das Antibiotikum (D-7545 gebildet und hauptääohlioh in der Plüssigphase der Brühe angereichert. Zur Gewinnung von Antibiotikum T-7545 ist es daher zweckmäßig, die Brühe zu filtrieren und dann das Antibiotikum vom erhaltenen PiItrat abzutrennen. Wenn der verwendete Mikroorganismus nur eines der beiden Antibiotika T-7545-A uud T-7545-B zu bilden vermag» kann das gebildete Antibiotikum natürlich in üblicher Weise von der Kulturbrühe abgetrennt werden.

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Wenn der verwendete Mikroorganismus gleichzeitig beide Antibiotika zu bilden vermag, werden diese gleichzeitig in der Kulturbrühe angereichert, so daß beide Antibiotika von der Kulturbrühe als Gemisch oder einzeln abgetrennt werden können«

Zur Isolierung der Antibiotika können übliche Methoden der Isolierung von Metaboliten von Mikroorganismen von ihren Kulturbrühen allein oder in Kombination angewendet werden. Beispiele solcher Methoden sind die Filtration, Konzentrierung, Ionenaustauschchromatographie mit Ionenaustauschern, Adsorptionschromatdgrap&ie an Aktivkohle, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw., Gelfiltration mit "Sephadex" (Hersteller Pharmacia), Bio-Gel-P (BIO.RAD Laboratories) usw., Verwendung verschiedener Lösungsmittel zur Überführung des Gelösten in eine andere Flüssigphase, Ausfällung, Entfernung von Verunreinigungen, Dialyse, Trocknung und Umkristallisation.

Für die Abtrennung und Reinigung von Antibiotikum T-7545 von Verunreinigungen werden beispielsweise seine Wasserlöslichkeit und basischen Eigenschaften ausgenutzt. Während bejqaielsweise wasserlösliche Verunreinigungen von niedrigerem Molekulargewicht durchlaufen, kann das Antibiotikum T-7545 an Aktivkohle adsorbiert und mit einem angesäuerten wässrigen Alkohol und /oder wässrigem Aceton eluiert werden.

Das Antibiotikum T-7545 wird an Kationenaustauschharzen stark adsorbiert, wenn es sich in neutraler oder schwach saurer Lösung befindet, und mit einer gepufferten basischen Lösung oder einer wässrigen Salzlösung eluiert· Das Antibiotikum 1-7545 kann auoh schwach an Anionenaustauschharzen adsorbiert und mit Wasser eluiert werden·

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Die Trennung der Antibiotika T-7545-A und T-7545-B wird durch Ionenaustauechchromatographie unter Verwendung gepufferter Kationen- und Anionenaustauschharze vorgenommen. Beispielsweise kann das Antibiotikum T-7545 an dem Harz "Dowex 5OWx2" das mit Pyridin-Essigsäure-Puffer (Pjj 5-6) gepuffert ist, adsorbiert werden. T-7545-B wird mit der gepufferten Lösung (p_H 6,2 bis 6,8) eluiert, während T-7545-A mit der gepufferten Lösung (p_H 7 bis · 7,5) eluiert wird. Bei Verwendung des Harzes "Dowex 1x2" wird T-7545-A zuerst eluiert, worauf T»7545-B'mit Wasser eluiert wird. Bei Verwendung fron Kieselgel als Adsorptionsmittel wird zuerst T-7545-B eluiert, während anschließend T-7545-A mit n«-Propanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1) eluiert wird.

Als Ionenaustauschharze (stark oder schwach), die für den oben genannten Zweck verwendet werden können, eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite IR-100, 112 und 120·} "Amberlite XE-69", "Amberlite IRC-50", "Amberlite XE-89", "Amberlite XE-64", "Amberlite IR-45" und IRA-900 (Hersteller Rohm and Haas Co.), Dowex-50x2, Dowex-1x2, Dowex-1x8 (Hersteller Low Chemical Co.),"Duolite CS-65^H(Chemical Process Co.), "Permutit-50" (Permutit β©.). Diese Harze können nach Verfahren hergestellt werden, die in "Ion Exchange Resin" (Robert Kumin, herausgegeben von John Wiley ft Sons, Inc., New York, N.Y., Seite 87-97) oder an den dort genannten Schrifttumsstellen beschrieben sind. Die Korngröße und der Vernetzungsgrad sind für jeden Harztyp in Abhängigkeit ▼on der jeweiligen Phase oder Stufe des Verfahrens zu wählen.

Die oben genannten Salze umfassen nicht nur die Alkalisalze von starken Säuren wie Natriumchlorid und Ammoniumchlorid, sondern auch die Alkalisalze von organischen Säuren wie Natriumacetat, Aminoniumacetat usw. sowie die

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Salze von schwachen Säuren oder achwachen Basen, z.B. solche von Essigsäure, Pyridin u_edgl„

Die gewünschte Substanz, die in der oben "beschriebenen Weise ziemlich weitgehend gereinigt worden isi; (Reinheit 80$ oder mehr), wird in ihr Hydrochlorid (1 Mol) überführt, das durch Kristallisation aus einem Gemisch von Methanol und Aceton als weißes kristallines Pulver weiter gereinigt werden kann» Sowohl die freie Form der Substanz als auch ihr Salz (z.B. Hydrochlorid, Sulfat, organisches 10. SuIfonat) können somit vorteilhaft der Reinigung unterworfen werden.

Die in der beschriebenen Weise erhaltenen Antibiotika haben die nachstehend genannten physiaklischen, chemischen und physiologischen Eigenschaften«,

1) Physikalische und chemische Eigenschaften von Antibiotikum T-7545-A: __j . ,

a) Aussehen, Schmelzpunkt usw.s schwach basisches weißes hygroskopisches Pulver, das keinen scharfen Schmelzpunkt hat und sich bei 100 bis 135⁰C zersetzt.

b) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln (z.B. Methanol, Pyridin, Dimethylformamid und Dirnethylsulfoxyd); sohwer löslich in Aceton und Äthanol, unlöslich in Äthylacetat, Äther und Petroläter·

c) Farbreaktionen:

Molish-Reaktion (unter Erhitzen) · positiv

Pehlingsche Reaktion (unter Erhitzen) "

Anthronreaktion "

Phenol-Sulfonsäure-Reaktion ^w

- Orcinol-Sulfonsäure-Reaktion ^M

Naphthoresorein-Sulf onsäure-Reaktion "'

Benzidin-Perjodaä-Reaktion ^w

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Peptid-Nachweisreagens-Reaktion

(tert.-Butylhypochlorit)	positiv
Alkalisches Kaliumpermanganat	reduziert
Ninhydrin-Reaktion	schwache Pur
	purfarbe
d) pE'a und Molekulargewicht:
pK'a	6,2
Durch Titration ermitiBLtes Molekular
gewicht	510+25

e) Ultraviolett-äbsorptionsspektrum:

Oberhalb von 210 nm. wird keine charakteristische Absorption festgestellt.

f) Infrarot-Absorptionsspektrum (Fig.i): Deutliche

Absorptionsbanden:

3450 (stark) 2900 (mittel)

1640 (mittel) , 1450 (mittel)

1410 (mittel) 1370 (mittel)

1160 (mittel) 1120-1000 (s*kaffk)

920 (schwach) 900 (mittel)

855 (mittel)

g) Das kernmagnetische Resonanzspektrum der Probe läßt

die Anwesenheit von Methinprotonen (V)

-Q-H

in Nachbarstellung zum Sauerstoff erkennen.

h) Optische Drehung: /öj^² = 110° + 15° (0=1, H₂O) 110° + 15° (0=1, Pyridin)

92,5° + 10°(C=1, Dimethylformamid)

i) Elementaranalyse:

Die Verbindung besteht aus den Elementen 0, H, IST undO. Nach 6-stUndiger Trocknung mit Phosphorpentoxyd bei 60⁰C unter vermindertem Druck zeigt die Probe noch die Anwesenheit von Wasser.

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C 47,6 + 1,50 ; H 7,17 + 0,50; N 3,01 + 0,50

j) Papierchromatographie: Die durch Papierchromatographie mit "Papier Whatman Nr₀1 und die durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel gemessenen Rf-Werte sind nachstehend in Tabelle genannt,Eine alkalische Kaliumpermanganatlösung (wässrige Lösung mit 20 Natriumcarbonat und 10 Kaliumpermanganat) wird als Nachweisreagens verwendet.

Tabelle 2	Lösungsmittelsystem	Papierheromatographie T-7545-A T-7545-A- hydrochlorid	0,10-0,12	Dünn- schicht- chromato- graphie T-7545-A
n-Butanol«Essigsäure: Wasser (4:1:2)	0,10-0,12	0,37-0,44	0,10
7O0iges wässriges Aceton	0,44	0,11-0,12	0,53
n-Butanol:Äthanol: Wasser:konz»wässriges Ammoniak (40:10:49:1)	0,11-0,12	0,01	0,08
Äthylacetat Essigsäure Wasser (3:1:3)	• 0,01	0,01-0,02	0,00
Äthylacetat:Pyridin: Wasser (2:1:2)	0,01-0,02	0,05	0,01
n-Butanol:Pyridin: Wasser (4:2:1 j	0,05	0,46-0,48	0,18
n-Butanol:Pyridin: Wasser (4:3:7)	0,46-0,48	0,55	0,27
8O0iges Phenol(NH₃)	0,55	0,35-0,39	0,38
n-Butanol:Äthanol: Wasser:Pyridin (35:15:40:107	0,35-0,39	0,06	0,44
n-Propanol:Wasser: konz«wässriges Ammoniak (70:29:1)	0,06-0,07		0,07
n-Propanol:Essigsäure: Wasser (4:1:1)			0,30

00 9 8 22/1898

lc) Elektrophorese

Die Papierelektrophorese wurde unter Verwendung von 0,05-molarem Borsäurepuffer (p_H 10) "bei einem Potentiäkunterschied von 2 kV 2 Stunden und unter Verwendung von Pyridin-Essigsäure (prr 6,0) "bei einem Potentialunterschied von 2 kV 3 Stunden durchgeführt. Die Wanderungsstrecken der Substanz sind nachstehend angegeben :

Borsäurepuffer (Pu 10) + 1,5 cm

Pyridin-Essigsäure-Puffer (p_H 6,0) - 8,5 cm

1) Salze

Das Antibiotikum T-754-5 ist schwach basisch und bildet Salze mit Säuren (z.B. Salzsäure, Schwefelsäure und organische Sulfonsäuren).

2) Physikalische und chemische Eigenschaften von Antibiotikum T-7545-B.

a) Aussehen, Schmelzpunkt usw.:

Schwach basisches weißes hygroskopisches Pulver, das keinen scharfen Schmelzpunkt hat und sich bei 95 bis HO⁰C zersetzt.

b) Löslichkeit:

Leicht löslich in Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln (z.B. Methanol, Pyridin, Dimethylformamid und Dirnethylsulfoxyd); schwer löslich in Aceton und Äthanol, unlöslich in Äthylacetat, Äther und Petroläther. .

c) Parbreaktionen:

Molish-Reaktion positiv Pehlingsche Reaktion (unter Erhitzen) " Anthronreaktion "

Phenolsulfonsäurereaktion ^M

Orcinol-Sulfönsäure-Reaktion "

009822/1 89 6

Benzidin-Perjodat-Reaktion positiv

Peptid-Nachweisreagens-Reaktion
(tert.-Butylhypochlorit) "

Alkalisches Kaliumpermanganat reduziert

Ninhydrin-Reaktion schwache Pupurfarbe

d)pK'a und Molekulargewicht:

pK'a 5,0

Durch Titration ermitteltes Molekulargewicht 520 +

10* e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Oberhalb von 210 mu. wird keine charakteristische Absorption festgestellt«

f) Infrarot-Absorptionsspektrum (Fig.2): Deutliche Absorptionsbanden

■ 3400 (stark) · 2910 (mittel)

1638 (mittel) 1415 (mittel)

1080 (stark) 1025 (stark)

900 (mittel) 84-0 (mittel)

g) Das kernmagnetische Resonanzspektrum der Probe läßt

^die Anwesenneit von Menthinprotonen ( , )

-G-H _v '

in Hachbarsteilung zum Sauerstoff erkennen,

h) Optische Drehung:

ß.J I³ = 102 + 10° (0=1, H₂O)

i) Elementaranalyse:

Die Verbindung besteht aus den Elementen G, H, N und 0· Hach 6-stündiger Trocknung mit Phosphorpentoxyd Taei 60⁰C unter vermindertem Druck zeigt die Probe noch die Anwesenheit von Wasser.
C= 46,46 + 1,5?έ, H = 7,06 + 0,5?έ, N = 2,44 + 0,5^

009822/1896

j) Dünnschichtchromatographie:

Der Rf-Wert betrug 0,43, gemessen durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, wobei alkalische Kaliumpermanganatlösung (wässrige Lösung mit 2$ Natriumoarbonat und 1$ Kaliumpermanganat) als Nachweisreagens und n-Propanol:Essigsäure!Wasser (4s1s1) als Entwickler verwendet wurde«,

k) Elektrophoreses

Die Papierelektrophorese wurde unter Verwendung von 0,05-molarem Borsäurepuffer (ρ_Η 10) bei einem Potentialunterschied von 2 kV 2 Stunden und unter Verwendung von Pyridin-Essigsäure (p_H 6,0) bei einem Potentialunterschied von '2 kV 3 Stunden durchgeführt. Die Wanderungsstrecken der Substanz sind nachstehend arigegeben:

Borsäurepuffer (p_H 10) +6,0

Pyridin-Essigsäure-Piffer - 4,0

1) Salzes

Das Antibiotikum T-7545-B ist schwach basisch und bildet Salze mit Säuren (z.B_e Salzsäure, Schwefelsäure und organische Sulfonsäuren)_e

3) Biologische Eigenschaften von Antibiotikum T-7545 Das antibiotische Spektrum ist in Tabelle 3 angegeben· Als Testmedium wurde ein modifiziertes Pfeffer-Medium (der oben genannten Zusammensetzung) für allgemeine Padenpilze und Hefen, G-lucosebouillon-Agar für pathogene Padenpilze und pflanzenpathogene Bakterien, Bouillonagar für gewöhnliche Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet. In jedem Pail wurde die Agar-Verdünnungs-Methode angewendet»

00822/189

Tabelle

Antibiotiacb.es Spektrum von T-7545 TestOrganismus

Hemmende Mindestkonzentration

y/ml T-7545-A T-7545-B

28⁰C,40 Std·
28⁰C,40 "

28⁰C, 40 »
28⁰C,40 »
28⁰C,40 "

28°C,40

>100 >100

>100 >100 >100

>100

>100 >100 >100

>100

Pyricularia oryzae Pellicularia sasakii

Colletotrichum ■jO lagenarium

Alternaria kikuchiana Aspergillus niger

Penicillium chrysogenum

Saccharomyces cerevisiae

Candida albioans

Trichophyton mentagrophytes

Xanthomonas oryzae Bacillus subtilis

Staphylococcus aureus

Sarcina lutea Escherichia coli Proteus vulgaris Mycobacterium avium Mycobacterium ATCC

Die Wirksamkeit der Substanzen gemäß der Erfindung gegen 30 verschiedene pflanzenpaöiogene Pilze, gemessen nach der vorstehend beschriebenen mikrobiologischen Testmethode,' ist in Tabelle 4 und 5 angegeben. Jede Zahl in diesen Tabellen ist jeweils der Wert der maximalen Verdünnung, bei der anomale Verzweigung durch eine wässrige Lösung 35 (1 mg/ml) des gereinigten Antibiotikums T-7545-A bzw. T-7545-B hervorgebracht wird·

28°C_s40	11	>100	>100
28⁰C,40	Il	>100	>100
28⁰C₈40	W	>100	>100
28⁰C₈40	Il	>100	>100
37⁰C,14	H	>100	>100
37⁰C,14	Il	>100	>100
37⁰C,14	H	>100	>100
37⁰C,14	N	>100	>100
37⁰C,14	Il	>100	>100
37⁰C,40	Il	>100	>100
37⁰C,40	H	>100	>100

■^; '009822/1896

Tabelle 4-Wirksamkeit von T-7545-A gegen pflanzenpathogene Pilze

Testorganismus

Wert maximaler Verdünnung, der zu anomaler Verzweigung der Hyphenspitze führt»

Pellicularia sasakii Rhizoctonia solani Corticium rolfsii Phytophthora infestans

100,000

50.000

< 100

<2000

Tabelle 5 Wirksamkeit von T-7545-3 gegen pflanzenpathogene Pilae

Testorganismus

Wert maximaler Verdünnung, der zu anomaler Verzweigung der Hyphenspitze führt

1500

<20

<100

<2000

Obwohl T-7545 das Wachstum einer Anzahl von Kikroorganismen einschließlich Pellicularia sasakii bei üblichen

Testmethoden (in vitro) nicht hemmt, zeigte das Antibiotikum eine bemerkenswerte Wirkung gegen den Blattscheidenbrand (sheath blight) von Reis in vivo.

Der Ultraviolettbereich des Spektrums, das Infrarotspektrum, das kernmagnetische Resonanzspektrum, die Elementaranalyse und die übrigen Eigenschaften von Antibiotikum T-7545 lassen annehmen, daß es ein Aminocyclitol-Antibiotikum ist, das Glucose in I'IoleKül enthält» Das Antibiotikum gemäß der Erfindung unterscheidet sich jedoch von den bekannten Aminocyclitol-Antibiotika und ihren
verwandten Verbindungen im Ausgangsmikroorganismus, in den physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie
in den physiologischen Eigenschaften» Das Antibiotikum

00982 2/189 6

BAD

gemäß der Erfindung ist somit als neues Antibiotikum anzusehen. T-7545-A und T-7545-B haben fast die gleichen Infrarotspektren und Ultraviolettspektren, jedoch sind der Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie, die Wanderung bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese und die pK'a-Werte deutlich verschieden, und die Antibiotika können durch Flüssigkeitschromatographie getrennt werden*

Diese Antibiotika zeigen in vitro keine wesentliche antimikrobische Wirkung, jedoch üben sie eine starke Schutz-·

10* wirkung auf lebende Pflanzen gegen Pellicularia sasakii, Leptosphaeria salvini, Rhizoctdmia solani, Corticium rolfsii, Phytophthora infestans, Sclerotinia aLerotiorum, Xanthomonas oryzae und Oladosporium fulvum aus, so daß sie als landwirtschaftliches Fungizid oder Bestandteile von Fungiziden verwendet werden kännenjSie können in pulverförmigen, flüssigen oder körnigen Präparaten mit oder ohne Hilfsstoffe oder Streckmittel verwendet werden. Die Konzentration der Antibiotika in diesen Präparaten kann im allgemeinen etwa 0,0001 bis 80$ betragen und in Abhängigkeit von den zu bekämpfenden Schädlingen oder von den Bedingungen variieren.

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Beispiel 1

Za einem wässrigen Gemisch (p_H 7)» das 3$ Glucose, 2,296 Sojabohnenmehl und 0,3$ Pepton enthält, werden 0,4$ • gefälltes Calciumcarbonat gegeben. Insgesamt 4 1 dieses Gemisches werden in aliquoten Teilen von je 50 ml in 200 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, die dann sterilisiert werden. Jeder Kolben wird mit 1 ml einer Impfkultur von Streptomyces hygroscopicus var· limoneus (lFÖ-12703) geimpft, die durGh Schüttelkultur in einem Medium der oben genannten Zusammensetzung für eine Dauer von 2 Tagen hergestellt worden ist, und II4 Stunden bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 TJpM bebrütet, Die erhaltenen Kulturbrühen werden vereinigt und filtriert« Auf diese Weise werden 2,8 1 einer filtrierten Brühe erhalten, die pro Milliliter 2QO γ T7545-A und 150 γ T-7545-B enthält.

Mit der Kultur von Streptomyces hygrosoopicus var.limoneus (IFW2703 wird ein gutes Ergebnis erhalten.

Beispiel 2

Zu einem wässrigen Gemisch (p_H 7), das 3$ Glucose, 2$ Sojabohnenmehl und 0,3?6 Pepton enthält, werden 0,4$ gefälltes Oaloiumcarbonat gegeben. Insgesamt 2 1 dieses Gemisches werden in aliquoten Teilen von je 500 ml in vier Sakaguchi-Kolben gegeben, die ein Fassungsvermögen von 2 1 haben und dann sterilisiert werden. Jeder Kolben wird mit einer Schlaufenmenge einer Schrägkultur von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12703) geimpft. Die geimpften Kolben werden 2 Tage bei 28⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet, die eine Sohwingap|>litttd* von 10 cm hat und mit 120 Zyklen/Minute bewegt wird, um eine Impfkultur herzustellen. In einen 200 1-Tank aus nichtrostendem Stahl werden 100

009822/1896

eines Mediums gegeben, das durch Zugabe von 0,656 gefälltem Calciumcarbonat zu einem wässrigen Gemisch (p™ 7), das 5$ Glucose, 3,696 Sojabohnenmehl und O,5# Pepton enthält, hergestellt worden ist. Das Gemisch im Tank wird sterilisiert und dann mit 2 1 der oben genannten Impfkultur geimpft und 114 Stunden bei 27°C bei 5O#iger Belüftung und 200 UpM bebrütet. Die Kultur wird filtriert, wobei 4 kg Diatomeenerde als Filterhilfsmittel verwendet werden. Hierbei werden 68 1 einer filtrierten Kulturbrühe erhalten, die ein Gemisch von 100 γ T-7545-A und 150 γ Ϊ-7545-Β pro Milliliter enthält.

Mit der Kultur von Streptomyces hygroscopicus var.limoneus

ebenso
(IPO 12704) wird ein/gutes Ergebnis erhalten.

Beispiel 3-A

Zu 680 1 einer filtrierten Kulturbrühe (die 100 γ Ϊ-7545-Α und 150 γ T-7545-B pro ml enthält), die auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erhalten worden ist, werden 13,6 kg Aktivkohle gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde

so
gerührt,/daß die in der filtrierten Brühe enthaltenen aktiven Ingredientien an der Aktivkohle adsorbiert werden. Die Aktivkohle wird dann abfiltriert und zweimal mit je 136 1 Wasser gewaschen. Die gewaschene Aktivkohle wird zweimal zur Entfernung der gewünschten Produkte mit je 136 1 eines Gemisches von Aceton und 0,5n-Salzsäure (7:3) eluiert, wobei 272 1 Eluat erhalten werden, das dann durch eine Säule von 20 1 des Ionenaustauschharzes Amberlite IR-45 (0H-Form) geleitet wird, die Lösung wird dann unter vermindertem Druck eingeengt und mit dem 10-fachen Volumen Aceton versetzt, wobei 4,2 kg einer rohen Substanz erhalten werden, die 10 γ T-7545-A und 15 γ T-7545-B pro mg enthält. (Aasbeute etwa 6256).

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Beispiel 3-B

Zu 680 1 einer filtrierten Kulturbrühe (die 100 γ Ϊ-7554-Α und 150 γ T-7545-B pro ml enthält), die auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erhalten worden ist, werden 13,6 kg Aktivkohle gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, wobei die in der filtrierten Kulturbrühe enthaltenen aktiven Bestandteile an der Aktivkohle adsorbiert werden. Die Aktivkohle wird dann abfiltriert und zweimal mit je 136 1 Wasser gewaschen. Eine Säule (70 1), die mit der so behandelten Aktivkohle gefüllt ist, wird mit 250 1 Wasser, das mit Butanol gesättigt ist, eluiert, wodurch die aktiven Bestandteile aus der Aktivkohle entfernt werden. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und mit dem 10-fachen Volumen Aceton versetzt, wobei 770 g eines rohen Gemisches erhalten werden, das 70 γ !D7545-A und 100 γ T-7545-B pro mg enthält (Ausbeute etwa 80#).

Beispiel 4

Die gemäß Beispiel 2 erhaltene filtrierte Kulturbrühe (680 1 mit 100 γ T-7545-A und 150 γ T-7545-B pro ml) wird durch eine Säule, die mit 55 1 des Ionenaus tauschharzes IR-120 (H-Form) S.V. = 5) gefüllt ist,und dann durch eine weitere Säule geleitet, die mit 65 1 des Ionenaustauschharzes "Amberlite IR-45^M (OH-Form, S.V. =5) gefüllt ist. Diese Säulen werden mit 120 1 Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird mit der durchgeleiteten Lösung vereinigt. Die vereinigte Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 60 1 des Ionenaustauschharzes Dowex 5OWX-2 (H-Form, 149-297 μ) (S.V. = 2) gefüllt ist, wobei die aktiven Bestandteile am Harz adsorbiert werden.

Das Harz wird mit 350 1 Wasser gewaschen, worauf die aktiven Bestandteile mit 200 1 0,5η-ΝΪ,0Η eluiert werden. Nachdem die ersten 30 1 des Ablaufs verworfen worden sind, werden die folgenden 125 1 aufgefangen und unter vermin-

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dertem Druck eingeengt, worauf das 10-fache Volumen Aceton zugesetzt wird. Hierbei werden 4-20 g der pulverförmigen rohen aktiven Bestandteile gewonnen, worin etwa 150 γ T-7545-A und 200-250 γ T-7545-B pro mg enthalten sind (Ausbeute 92$).

Beispiel 5

Eine Lösung von 420 g des gemäß Beispiel 4 hergestellten rohen Pulvers in 21 1 Pyridin-Essigsäure-Puffer (0,1-molar, p_H 6,0) wird hergestellt. Die Lösung wird bei S₀Ve 2 durch eine Säule (17,8 χ 146 cm) gegossen, die mit 35 1 des Ionenaustauschharzes Dowex 5Ox-2 (149-297 w) gefüllt ist, das mit der oben genannten Pufferlösung gepuffert wird, wodurch die aktiven Bestandteile am Harz adsorbiert werden·

Weitere 75 1 Pufferlösung der oben genannten Zusammensetzung werden über die Säule gegossen, wodurch die Verunreinigungen und Pigmente eluiert werden« Anschließend wird T-7545-B mit 125 1 Pyridin-Essigsäure-Puffer (0,1-molar, p_H 6,5) bei SV 2 eluiert, wobei 75 1 Eluat

entsprechend den Fraktionen 3 bis 5 (25 l/Fraktion) mit positiver Reaktion mit Anthron-Reagens aufgefangen werden. Dieses Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 112g (750 γ/mg) rohes T-7545-B in Pulverform erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 90?i.

Durch die Säule, aus der T-7545-B eluiert worden ist, werden 500 1 Pyridin-Essigsäure-Puffer (0,1-molar, p_H 7,5) bei SV 2 gegossen, wobei 250 1 Eluat, das den Fraktionen 5 bis 14 entspricht (25 l/Fraktion) mit positiver Reaktion mit Anthron-Reagens aufgefangen werden. Dieses Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 75 g (750 γ/mg) rohes T-7545-A in Pulverform erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 90$.

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Beispiel 6

Eine Lösung von 42 g des gemäß Beispiel 4 hergestellten Gemisches (enthaltend 150 γ I-7545-A und 200 bis 250 γ .T-7545-B pro mg) in 210 ml Wasser wird hergestellt. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 600 ml Ionenaustauschharz »Amberlite IRA-900» (OH-Form) (0,25

\ gefüllt ist,
bis. 0,84 mm) -βΓ, worauf mit Wasser eluiert und Fraktionen von je 200 ml Ablauf abgenommen werden_β

Die Fraktionen, die die aktiven Bestandteile enthalten, die positiv mit Anthron-Reagens reagieren, werden ermittelt» Die Fraktionen werden dann durch Dünnschichtchromatographie in T-7545-A-reiche Fraktionen (3» bis 7»Fraktion) und T-7545-B-reiche Fraktionen (8» bis 16. Fraktion) getrennt» Die ersteren (Fraktionen mit hohem Gehalt an T-7545-A) werden vereinigt, worauf eine geringe Menge Ionenaustauschharz "Amberlite IRO-50 (H)" zugesetzt und der Pjr-Wert auf 8 eingestellt wird. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, worauf das 10-fache Volumen Aceton zugesetzt wird, wobei 5,6 g rohe Substanz erhalten werden, die 650 bis 700 γ Ϊ-7545-Α und 250 bis 300 γ T-7545-B pro mg enthält» _x

Der gleichen Behandlung werden die an I-7545-B -reichen Fraktionen unterworfen, wobei 9,5 g rohe Substanz erhalten werden, die 200 γ T-7545-A und 600 bis 700 γ T-7545-B pro mg enthält. Ausbeute etwa 8596.

Beispiel 7

Zu 150 g Aktivkohle für Chromatographiezwecke (Tokusei-Shirasagi, hergestellt durch die Anmelderin) werden 450 ml Wasser gegeben, worauf der p_H-Wert der oben stehenden Schicht durch Zusatz von In-HCl auf 3 eingestellt wird.

Das Gemisch wird in eine Säule von 750 ml (Verhältnis von Höhe zu Durohmesser = 10) gepackt. Die Säule wird mit

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Wasser gewaschen, bis der Pg-Wert des ablaufenden Waschwassers 3,5 beträgt. Durch diese Säule wird mit SV 3 eine Lösung von 8,5 g rohem Ϊ-7545-Α (750 γ/mg) in 750 ml n/500-HCl geleitet, wobei der aktive Bestandteil adsorbiert wird.

Die Säule wird mit 3 1 n/500-HCl gewaschen, worauf der aktive Bestandteil mit einem Gemisch von Methanol und n/500-HCl (3:7) eluiert wird. Die ersten 500 ml des Ablaufs werden verworfen, worauf die folgenden 2,0 1 des Ablaufs, der farblos ist und positiv mit Anthron-Reagens reagiert, aufgefangen wird. Die hierbei erhaltene aktive Fraktion wird bei SV 5 durch eine Säule (200 ml, Verhältnis von Höhe zu Durchmesser = 6) geleitet, die mit Ionenaustauschharz "Amberlite IR 45 (OH)¹¹ gefüllt ist, das vorher mit 30$igem wässrigem Methanol gewaschen worden istβ Hierbei wird die durchgelaufene Lösung aufgefangen. Die Säule wird mit 500 ml 30$igem wässrigem Methanol gewaschen, um die an der Säule verbliebenen aktiven Bestandteile auszuwaschen.

Die durchgelaufene Lösung wird mit der Waschflüssigkeit vereiniget und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Konzentrat wird das 10-fache Volumen Aceton gegeben, wobei 5,4 g fast reines It-7545-A (950 bis 1000 γ/mg) als weißes Pulver erhalten werden (Ausbeute etwa 85$).

Eine Wiederholung des vorstehend beschriebenen Versuchs mit 8,5 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen rohen T-7545-B (750 γ/mg) ergibt 5,7 g fast reines T-7545-B (950 bis / 1000 γ/mg) als weißes Pulver (Ausbeute etwa

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Beispiel 8

Eine Lösung von 5,6 g des an T-7545-A-reichen Pulvers (700 γ/mg A, 300 γ/mg B) in 30 ml W_asser wird hergestellt. Die Lösung wird durch die mit 500 ml Harz ("Dowex 1x2,DH") (Verhältnis von Höhe zu Durchmesser = 30) gegossen, wobei die aktiven Bestandteile an den Harzen, adsorbiert werden. Die Harze werden mit Wasser eluiert. Der Ablauf wird in Fraktionen von je 500 ml aufgefangen, während die Fraktionen auf die Anwesenheit von aktiven Bestandteilen mit Hilfe von Anthron-Reagens untersucht werden. Hierbei wird T-7545-A in der 5. bis 7.Fraktion und I-7545-B.in der 17«bis 25.Fraktion festgestellt. Die erstgenannten Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 3,6 g T-7545-A (1000 γ/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 90$. Die Fraktionen, die T-7545-B enthalten, werden unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 1,3 g T-7545-B (1000 γ/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa

Eine Lösung von 9,5 g des gemäß Beispiel 6 erhaltenen, an T-7545-B-reichen Pulvers (700 γ/mg B, 180 γ/mg A) in 50 ml Wasser wird hergestellt. Die Lösung wird durch eine Säule (Verhältnis von Höhe zu Durchmesser = 30) gegossen, die mit 11 Harz (Dowex 1x2, OH) gegossen wird, wobei die aktiven Bestandteile am Harz adsorbiert werden. Das Harz wird mit Wasser eluiert. Der Ablauf wird in Fraktionen von je 500 ml aufgefangen, wobei auf Anwesenheit von aktiven Bestandteilen in jeder Fraktion mit Hilfe von Anthron-Reagens geprüft wird. Hierbei wird T-7545-A in der 9. bis 11.Fraktion und T-7545-B in der 35.bis 60. Fraktion nachgewiesen. Die erstgenannten Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 1,45 g T-7545-A (1000 γ/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 85$. Die Fraktionen,

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die T-7545-B enthalten, werden in der gleichen Weise behandelt, wobei 5,5'g T-7545-B (1OOO γ/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 83$.

Beispiel 9

Eine Lösung von 1 g des gemäß Beispiel 6 erhaltenen, an T-7545-A reichen Gemisches von T-7545-A und T-7545-B in 50 ml Methanol wird hergestellt. Die Lösung wird mit 1 g Kieselgel gut gemischt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Gemisch wird' oben auf eine Säule gegeben (1,5 χ 90 cm), die mit Kieselgel gefüllt ist, worauf Säulenchromatographie unter Elution mit n-Propanol:Essigsäure:Wasser (4:1:1) mit Hufe von Dünnschicht Chromatographie folgt. ·

Es wird festgestellt, daß zuerst T-7545-B und dann T-7545-A eluiert wird. Die Fraktionen, die jeweils den aktiven Bestandteile enthalten, werden aufgefangen. Jede Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, worauf mit Aceton gefällt wird, wobei 190 mg T-7545-B als weißes Pulver (Ausbeute etwa 65$) und 420 mg T-7545-A als weißes Pulver (Ausbeute etwa 60$) erhalten werden.

Beispiel ^10

Eine Lösung von 1 g des gemäß Beispiel 7, 8 oder 9 erhaltenen gereinigten Pulver« von T-7545-A in 20 ml Methanol wird hergestellt. Zur Lösung werden 2 ml In-HCl gegeben, worauf das Wasser und Methanol abdestilliert werden. Hierbei wird 1 g T-7545-A-hydrochlorid erhalten.

Die gleiche Behandlung von 1 g gereinigtem pulverförmigem T-7545-B, das gemäß Beispiel 7, 8 oder 9 erhalten worden ist, ergibt 1 g I-7545-B-hydrochlorid.

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Bisher wurd,en organische Arsenmittel weitgehend für die Bekämpfung des Blattscheidenbrandes der Reispflanze (sheath blight), organische Quecksilberverbindungen für die Bekämpfung der Stengelfäule und Mittel auf Basis von Pentachlornitrobenzol (nachstehend kurz als PCNB bezeiohnet) für die Fußkrankheit des Getreides, Weißährigkeit und die Sclerotiniakrankheit verwendete Diese Mittel sind jedoch nicht immer unschädlich für Menschen und Haustiere oder sogar Fische und Pflanzen. Beispielsweise sind organische Arsenmittel nicht nur chronisch giftig für Mensch und Tier, sondern verschlechtern auch den Ernteertrag bei Reis, während organische Quecksilberverbindungen nicht nur chronisch giftig für Menschen und (Diere, sondern auch giftig für Fische sind. PCNB ist auch insofern schädlich, als es das Wachstum der zu schützenden jungen Sämlinge beeinträchtigt· Angesichts dieser Nachteile besteht ein dringendes Bedürfnis für ein neues verbessertes Präparat«

Von der Anmelderin wurde überraschenderweise gefunden, daß die Kulturbrühe eines 1-7545 bildenden Stammes von Mikroorganismen eine sehr starke hemmende Wirkung gegen Blattscheidenbrand (Pellicularia sasakii) in vivo (Anwendung auf junge Reissämlinge) hat, obwohl sie bei der üblichen mikrobiologischen Austestung (in vitro) praktisch keine antibiotische Wirkung hat. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß dieses Antibiotikum T-7545 die Besonderheit aufweist, daß es nur dann eine starke krankheitsbekämpfende. Wirkung hat, wenn die Pflanze oder der Boden damit behandelt wird.

Es wurde ferner gefunden, daß das Antibiotikum T-7545 ni$ht nur gegen den Blattsoheidenbrand bei der Reispflanie, sondern auoh gegen andere Pflanzenkrankheiten, z.B. die Wurzelfttule des Reises und die Fußkrankheit des Getreides

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und Sclerotiafäule von Gemüse, blühenden Pflanzen und Schößlingen von Bäumen sehr wirksam ist. Ferner ist das Antibiotikum T-7545 im wesentlichen unschädlich für Mensch und Tier sowie Fische und beeinträchtigt selbst bei Anwendung in hohen Konzentrationen praktisch nicht die Keimung, das Wachstum, den Ertrag und andere Merk-• male von Nutzpflanzen.

Die wirtschaftlichen Giftpräparate gemäß der Erfindung können die Kulturbrühe eines das Antibiotikum T-7545 bildenden Stamms der Gattung Streptomyces, das Filtrat der Kulturbrühe, ihr Konzentrat oder ein gereinigtes Präparat der Kulturbrühe enthalten» Es ist auch möglich, das Antibiotikum Τ-7Φ45 in Form der freien Base sowie in Form von Salzen mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren (z.B. Oxalsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure, und Salzsäure) oder mit Metallen (z.B. Natrium, Kobalt, Kupfer, Aluminium und Calcium) zu verwenden.Ebenso ist es/möglich, einen Ester oder Äther von T 7545 zu verwenden, der beispielsweise durch Veresterung der Hydroxylgruppe von T-7545 mit einer Säure (z.B. Essigsäure, Malonsäure oder Apfelsäure) erhalten werden kann.

Das Giftpräparat gemäß der Erfindung kann in beliebiger geeigneter Weise angewendet werden. Beispielsweise kann die Substanz in Abhängigkeit vom jeweiligen Anwendungszweck, von der Anwendungszeit und der Anwendungsmethode usw. unmittelbar als solche, nach Auflösung oder Diapergierung in einem geeigneten flüssigen Träger oder nach Vermischung mit einem geeigneten festen Träger oder Streckmittel angewendet werden. Gegebenenfalls kann die Substanz gemäß der Erfindung durch Zusatz eines Emuigators, Dispergiermittels, Suspendiermittels, Adsorptionsmittels, Penetrationsmittels, Netzmittels, Verdickungsmittels, Stabilisators und/oder Hilfsstoffs in verschie-

0 0 9822/1896

denen Präparatformeη, beispielsweise in Form von Lösungen in Öl, Emulsionen, Netzpulvern, wässrigen Lösungen, löslichen Pulvern, Stäubemitteln, Tabletten, Granulat und Aerosolen zur Anwendung kommen.

Es ist ferner möglich, diese Präparate nach Vermischung mit anderen Germiziden, z.B. Kupfergermiziden, Germiziden mit,organischem Schwefel, Germiziden mit organischem Chloi; Organophosphorgermiziden, anderen Antibiotika, Insektiziden (z.B. Insektiziden mit organischem-Chlor, Organophosphorinsektiziden, Carbaminsäureinsektiziden, natürlichen Insektiziden), Akariziden, Nematoziden, Herbiziden, Pflanzenwachstumsreglern,. Synergisten, insektenanziehenden oder -abweisenden Mitteln, Duftstoffen, Pflanzenmährst offen, Düngemitteln u.dgl. zu verwenden.

Die antibiotischen Substanzen T-7545-A und T-7545-B haben die folgende Toxizität:

a) Die Toxizität von Antibiotikum T-7545-A, das einer der Wirkstoffe des Präparats ist, kann beispielsweise ermittelt. werden, indem das Antibiotikum T-7545-A Mäusen intravenös injiziert und der LDcQ-Wert ermittelt oder die mittlere Letaldosis für Oryzias latipes gemessen wird. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6: Akute Toxizität von T-7545-A VersuchstierTestmethodeToxizität

Mäuse intravenöse Injektion LDc₀ >2000 mg/kg

Oryzias latipes Einsetzen in wässrige TIi >4O ppm

Lösung

b) Die Toxizität von Antibiotikum T-7545B, das ein weiterer Wirkstoff der Präparate ist, kann in der gleichen Weise, wie oben für T-7545-A angegeben, ermittelt werden. Die Ergebnisse dieser Messungen sind nachstehend in Tabelle 7 genannt:

009822/1896

Tabelle 7: Akute Toxizität von T-7545-B Versuchstier Testmethode Toxizität

Mäuse intravenöse Injektion LD₅₀>2000 mg/kg

Oryzias latipes Einsetzen in wässrige ti. >40 ppm Lösung

Die Konzentration des Wirkstoffs in den grauchsfertigen Fungiziden gemäß der Erfindung beträgt gewöhnlich etwa 0,0001 bis 1,0 Gew.-^, vorzugsweise etwa 0,0003 bis 0,3 Gew.-⁰Jo bei flüssigen Präparaten (d_eh. Lösungen, Sus-Pensionen oder Emulsionen) und etwa 0,01 bis 30 Gew.-^, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 Gew.-# bei festen Präparaten. Nach Bedarf können jedoch auch Präparate mit höherer oder niedrigerer Konzentration verwendet werden. Bei der Herstellung in Konzentratform kann der Wirkstoffgehalt der

15-- Konzentrate etwa 0,5 bis 80 Gew.-^ betragen.

Versuch 1

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises (Rice sheath blight).

Versuchsmethode: Kinmaze-Reispflanzen wurden in 9 cm-Topfen (3 Sämlinge pro Topf) kultiviert« Die Sämlinge wurden 80 Tage nach dem Einpflanzen getestet, wobei jeweils 6 Töpfe pro Behandlung verwendet wurden.

Impfmethode; Pathogene Pilze Pellicularia sasakii wurden 48 Stunden bei 3O⁰C auf einer Platte aus Kartoffel-Infusionszucker-Agar kultiviert. Eine Agarscheibe von 10 mm Durchmesser wurde aus einer peripheren Kolonie ausgeschnitten. Die Scheibe wurde in dem Innenraum der Blattscheide in der Nähe der Bodenoberfläche eingesetzt, und zwar jeweils eine Scheibe pro Pflanze. Die Töpfe wurden unxer einer PVC-Atideckung bei der normalen Umgebungstemperatur von 32 bis 25 C und bei einer relativen Feuchtigkeit von 100 bis 70% gehalten. Die Impfung wurde beim

GG9872/1896 '

•ad

prophylaktischen Test unmittelbar naoh Trocknung des aufgebrachten Präparats an der Luft und beim Bekämpfungatest 3 Tage vor der Anwendung vorgenommene

Anwendung des Präparats: Eine Reihe von wässrigen lösungen wurde aus einer Kulturbrühe von Streptomyces hygroscopi- · cus varolimoneus mit 10000 Verdünnungseinheiten/ml hergestellte Ferner wurden verdünnte flüssige Präparate von handelsüblichen Bekämpfungsmitteln hergestellt. Zu jeder dieser Lösungen und Präparate wurden 0,05$ (endgültige Konzentration) Dyne (ein von der Anmelderin hergestelltes Verlaufmittel) gegeben« Das Gemisch wurde mit einer Spritzpistole in einer Menge von 30 ml/6 Töpfe, gleichmäßig über die Blätter gesprüht. Der das Antibiotikum bildende Stamm wurde wie folgt kultiviert: Aliquote Teile von je 60 ml eines flüssigen Mediums wurden in 200 ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Jeder Kolben wurde mit einer Ösenmenge des oben genannten Stammes geimpft. Die Kolben wurden 5 Tage bei 28⁰O auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM bebrütet«, Das verwendete Medium hatte folgende Zusammensetzung: 3$ Glucose, 2,25ε rohes Sojabohnenpulver, 0,3$ Pepton und 0,4$ Calciumcarbonat.

Bestimmungsmethode: 10 Tage nach der Anwendung des Präparats wurde die Länge jedes Stengels von· Bodenhöhe bis zur Oberkante der Läsion direkt gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 8 genannt.

0 0 9822/1896

Tabelle 8

Wirkung der Kulturbrühe bei der Bekämpfung des Blatt-Scheidenbrandes,(mittlere Länge der Läsionen/Stengel in cm)

Präparat Dosierung Präventiv- Heil- Schädigung wirkung wirkung der Pflanze

Unbehandelte

Vergleichsproben - 27,9 30,1

Emulgierbares
Konzentrat von
Polyoxin PS(I) ^x60° ⁶»4 15,0

Monzet-Uetzpulver

(2) X200C 0 1,1 ++

Kulturbrühe von Streptomyces 15 hygroscopicus var.limoneus

X200C	0	1,1
unverdünnt	0	0,4
χ 2	0	0,4
x 4	0	0,7
χ 8	0	1,2
x16	0	1,5
x32	0	3,7

Auswertung; Bis zu einer 16-fachen Verdünnung war die Kulturbrühe sowohl für die Prophylaxe als auch für die Behandlung gegen den Blattscheidenbrand des Reises überaus wirksam» Keinerlei Schädigung der Pflanzen wurde festgestellt.

(1) Enthalten! 30.000 PS-Einheiten/g als Polyoxin B.

(2) Enthaltend 20$ Methylarsin-bis-dimethyldithiocarbamat, 20$ Zinkdimethyldithiocarbamat und 40$ Bis-(dimethyI-thiocarbamoyl)disulfid.

Versuch 2

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises durch

Vorbehandlung des Bodens

Versuchsmethode; Die gleichen Reispflanzen wie bei Versuch 1 wurden verwendet. Die Pflanzen wurden auf die gleiche Weise wie bei Versuch 1 geimpft.

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Anwendung des Präparats; Wässrige Lösungen von pulverförmigem !"-7545-A wurden auf die gleiche Weise wie bei Versuch 1 auf die Pflanzen gesprüht "bzw, in einer Menge von 5 ml/Topf in den Boden gespritzt.

Bewertungsmethode t Wie bei Versuch 1... Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 genannt.

!Tabelle 9

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises durch Vorbehandlung des Bodens (mittlere Länge der Läsionen/ Stengel in cm).

Präparat Dosierung Präventiv- Heil- Schädigung

-wirkung wirkung der Pflanze

TJnbehandelte Vergleiche-15 proben

T-7J45-A auf die Pflanzen gesprüht

20 T-7545-A in

den Boden gespritzt

Auswertung; T-7545-A hatte bei Einspritzung in den Boden und beim Aufsprühen auf die Pflanzen die gleiche Wirksamkeit gegen den Blattscheidenbrand von Reis. Eine Schädigung der Pflanze bei der Behandlung vor dem Auflaufen wurde nicht festgestellt.

Versuch 3

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises Kinmaze-Reispflanzen wurden zu je 3 Pflanzen/Topf in a/5000-Wagner-Töpfe gepflanzt. G-ruppen von je 5 Töpfen im ährentragenden Stadium wurden für den Versuch verwendet. Die Impfung wurde wie bei Versuch 1 vorgenommen, d.h. eine Agarscheibe von 20 mm Durchmesser wurde auf die

009822/1896

	—	25,	CVJ	28,7
20	ppm	0,	7	1,5
40	ppm	0		0,6
80	ppm	0		0,3
20	ppm	o,	6	1,3
40	ppm	0		0,5
80	ppm	0		0,4

Blattscheide in der Nähe der Bodenoberfläche (1 Scheibe/ 2 Stengel) eingesetzt. Die Töpfe wurden in ein Gewächshaus gestellt. 5 Tage nach der Impfung wurde T-7545-A in einer Menge von 500 ml/5 Töpfe wie bei Versuch 1 aufgebracht.

Die Bewertung wurde 21 bzw. 35 Tage nach der Behandlung wie bei Versuch 1 vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 genannt.

Tabelle 10

Wirkung von T-7545-A bei der Bekämpfung des Blattscheidenbrandes (mittlere Länge der Läsionen/Stengel in cm)

Präparat Dosis Heilwirkung Schädigung

nach nach der Pflanze

21 Tg. 35 Tg. _

Unbehandelte Vergleichs- -

pflanzen - 32,5 56,3

Emulgierbares Konzentrat von Polyoxin PS	X	5	600	14,0	24,5
Monzet-Netzpulver	X	10	2000	9,9	10,1
T-7545-A	20	ppm	10,9	15,8
	40	ppm	9,5	9,6
	ppm	9,2	9,2
	ppm	9,0	9,0

Bei einer Konzentration von 10 ppm oder mehr war T-7545-A äußerst wirksam bei der Behandlung nach dem Auftreten der Krankheit und unterdrückte die Bildung von neuen Läsionen mehr als 1 Monat nach der Einwirkung. Keinerlei Schädigung der Pflanzen wurde selbst bei einer Konzentration von 40 ppm festgestellt.

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Versuch 4 Bekämpfung der Stengelfäule des Reises

Versuchspflanzen: wie "bei Versuch 3 Anwendung des Präparats: wie bei ^ersuch 3 Impfmethode: Pathogene Pilze Helminthosporium sigmoideum wurden auf Reisstrohmedium 14 Tage bei 28⁰C kultivierte Je 1 Stück der erhaltenen Kultur (2 cm Länge) wurde pro Stengel in den Innenraum am Fuß der Blattscheide jeder Reispflanze eingesetzt, nachdem das aufgesprühte Präparat an der Luft getrocknet war₀ Anschließend wurde auf die gleiche Weise wie bei Versuch 1 gearbeitet. Die Töpfe wurden in einen PVG-Raum gestellt» 14 Tage nach der Impfung wurde die Länge der Läsion bei jedem Stengel gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 genannt«

Tabelle 11

Wirksamkeit von T-7545-A bei der Bekämpfung der Stengelfäule (mittlere Länge der Läsionen/Stengel in cm)

Präparat Dosis Präventiv- Schädigung der wirkung. Pflanze

Unbehandelte
-----

Unbehandelte	-	8,5
Vergleichsprobe
Fumiron-lietzpulver	X25OO	2,1
(3)	X125O	0,6
	10 ppm	2,3
T-7545-A	20 ppm	1,8
	40 ppm	0,4

Bei einer Konzentration von 10 ppm oder mehr zeigte T-7545-A eine starke Wirkung auf die Stengelfäule.

(3) Enthält 5$ Phenylquecksilber(II)-jodid.

0 9 8 2 2/1898

_ 42 - 195A 110

Versuch 5

Bekämpfung der Würzelfäule der Gurke (damping-off) Versuchamethode; Rhizoctonia solani wurde auf Gerstenmedium 5 Tage "bei 28⁰C kultiviert. Eine Bodenprobe des Feldes wurde in 9 cm-Töpfe gefüllt, die dann mit Wasserdampf sterilisiert wurden. Das Häcksel-Impfmaterial wurde gleichmäßig in die Oberschicht jedes Topfes bis zu einer Tiefe von e twa 3 cm in einer Menge von 2 g/Topf eingearbeitet. Die Töpfe wurden 24 Stunden bei 28⁰C in einer Impfkammer gehalten und dann in ein Gewächshaus überführt.

Das Präparat wurde wie bei Versuch 1 angewendet, d.h_e es wurde in einer Menge von 30 ml/6 Töpfe/Gruppe auf die Bodenoberflache gesprüht.

Gesunde Gurkensamen (Sorte Suyo) wurden unmittelbar nach der Behandlung in einer Menge von 10 Samen/Topf in die Töpfe eingesetzt. Die Töpfe wurden dann in einem Gewächshaus bei 32 bis 28⁰C gehalten. 14 Tage nach dem Säen wurden die Ergebnisse als Läsionskoeffizienten ermittelt» Ferner wurde der Grad der Schädigung berechnet.

Läsionskoeffizienten (I)

0 : gesund

0,5 : nur die Wurzelhaare sind leicht angegriffen

1 : Luftteile in der Nähe der Bodenoberfläche und Wurzeln sind angegriffen.

2 : Anfangsphase des Abfaulens

3 ϊ Bei der Keimung angegriffen; Wachstum gehemmt.

Grad der Schädigung (96). = x 100 Hierin ist η die Zahl der Proben, die jedem Läsionskoeffizienten entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 genannt.

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Tabelle 12 Wirkung von T-7545-A "bei der Bekämpfung der Wurzelfäule

Präparat

Dosis

Grad der Schädigung,

Schädigung der Pflanze

Unbehandelte
Vergleichsproben

Pe nt achlornitrο-benzol

xtOOO

100

10

§0?6iges Netzpulver (Vergleichsprobe) χ 500 Ϊ-7545-Α

7 1 0,5 0

5 ppm 10 ppm 20 ppm 40 ppm

Bei einer Konzentration von 10 ppm oder mehr war T-7545-A äußerst wirksam gegen die durch Rhizoctonia solani verursachte Wurzelfäule und hatte keinen schädigenden Einfluß auf die Keimung des Samens und das Wachstum der Sämlinge.

Tersuch 6

Bekämpfung der Wurzelfäule der Gurke durch Umhüllen des Samens _; ; ; '

Impfmethode: wie bei Versuch 5

Anwendung des Präparats: Die Samen wurden mit Wasser benetzt ttnd dann mit pulverförmigem T-7545-A leicht umhüllt. Mittlere Auftragmenge: 80 mg/10 Samen. Versuchspflanze: wie bei Versuch 5. Bewertungsmethode: wie bei Versuch 5.

09822/18^6

Tabelle 13 ■

Wirkung von T-7545-A "bei der Bekämpfung der Wurzelfäule durch Umhüllen des Samens

Wirkstoffgehalt, i>

T-7545-A-Pulver,

Pentachlornitrobenzol-

Grad der Schädigung pulver Schädi- der Grad der Schädigung gung,?b Pflanze Schädigung, der __^ Pflanze

O, Vergleichsprobe (4) 100 -

0,04 30 - 100 -

0,08 16 - 100

0,16 6 - 100 -

0,32 3 - 95

0,64 1 - 58 -

1,28 0,3 - 45 -

2,56 0 - 24 +

5,12 0 - 12 +

(4)

mit dem Hilfsstoff (Talkum) umhüllt.

T-7545-A ist gegen die Wurzelfäule auch wirksam, wenn es als Staub auf die Samen aufgebracht wird. Bei diesem Verfahren wurde keine Schädigung der Pflanzen festgestellt«

Versuch 7 Bekämpfung von Corticium rolfsii bei der Gurke

Impfmethode: wie bei Versuch 5, d.h. pathogene Pilze Corticium rolfsii wurden 10 Tage kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde in einer Menge von 5 g/Topf in den Boden gegeben. Die Töpfe wurden in der oben beschriebenen Weise behandelt.

Das Präparat wurde wie bei Versuch 5 in einer Menge von 30 ml/6 Töpfe/Gruppe aufgebracht. Die gleichen Versuchspflanzen wie bei Versuch 5 wurden verwendet. Ebenso war die iewertungsmethode die gleiche wie bei Versuch 5.

Π09822/ 1 898

- 45 -

Tabelle 14-

Wirkung von T-7545-A bei der Bekämpfung von Oorticium rolfsii _; .

Präparat Dosierung Grad der Schädigung Schädigung,$ der Pflanze Unbehandelte

Vergle ixhsproben	—	87
Pentachlornitro-	xiooo	38
benzol (5O$iges Netzpulver)	X2OOO	17
	x1000	2
T-7545-A	5 ppm	21
	10 ppm	13
	20 ppm	6

40 ppm 0

Bei einer Konzentration von 10 ppm oder mehr war T-7545-A äußerst wirksam gegen Oorticium rolfsii und schädigte die Pflanzen nicht«

Versuch 8

Bekämpfung von Gurkenmehltau Versuchspflanze: gesunde Gurken (Sorte Suyo), die in a/5000-Wagnertöpfe gepflanzt wurden_e Gruppen von je 3 Topfen mit Sämlingen 60 !Gage nach dem Einpflanzen wurden verwendet. Diese Töpfe und weitere Töpfe mit Gurkenpflanzen, die bereits mit Shaerotheca fuliginea infiziert waren, wurden hintereinander aufgestellt, so daß eine natürliche Infizierung stattfand.

Anwendung des Präparats: Eine wie bei Versuch 2 hergestellte Lösung des Präparats wird in einer Menge von 100 ml/3 Töpfe aufgebracht.

Bewertung: Probeblätter, die vor dem Auftrag des Präparats gesund waren, aber dann krank wurden, wurden für diese Bewertung verwendet. Die Fläche der Läsion von 4 Blättern/Topf wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in

0Q9822/18Ö6

— 4ο -

Tabelle 15 angegeben.

Tabelle 15

Wirkung von T-7545-A ,"bei der Bekämpfung von Gurkenmehltau (mittlere spezifische Fläche der lasionen/Blatt ($)) Präparat Dosierung 12 Tage nach Schädigung

der Behänd- der Pflanze ' . lung

Unbehandelte Probe - 89,3 Karathane-Netzpulver
■ (5) ■ X2000 4,3 +

T-7545-A 12,5 ppm 6,5

25 ppm 3,8 50 ppm 1,9 -

(5) Enthält 19,5# 2-(1-Methylheptyl)-4,6-dinitrophenylcrotonat.

T-7545-A war wirksam bei der Bekämpfung von Mehltau und hatte keine schädigende Wirkung auf Gurken«,

Versuch 9 Bekämpfung der Braunfäule der Tomate

Versuchspflanzen: Tomatenpflanzen (Sorte Ponterosa) werden in Töpfe von 12 cm Durchmesser gepflanzt (1 Pflanze/Topf). Die Sämlinge werden 50 Tage nach dem Pflanzen verwendet· Je 6 Töpfe bilden eine Gruppe»

Das Präparat wurde wie bei Versuch 2 in einer Menge von 100 ml/6 Töpfe/Gruppe aufgebracht.

Impfmethode: Pathogene Pilze (Phytophthora infestans) wurden auf einer Kartoffelinfusions-Agarplatte 10 Tage bei 2O⁰C kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde zur Herstellung einer Suspension von Zoosporen in Wasser (etwa 10^ Zoosporen/ml) verwendet. 1 Tag nach der Anwendung des Präparats wurden die Pflanzen durch Besprühen mit 20 ml der Suspension pro Topf infiziert. Die Töpfe wurden

822/1896

24 Stunden bei 2O⁰G in einer Impfkammer gehalten und dann in ein Gewächshaus tiberführt.

Bewertung^ 7 Tage nach der Infizierung wurde die 3?läohe jeder Läsion gemessen. Die Ergebnisse sind in !Tabelle 16 angegeben.

Tabelle 16

Wirkung von T-7545-A bei der Bekämpfung der Braunfäule der Tomate. . _i . -

Präparat Dosis Verhältnis der Schädi-

PP^m durchschnittlichen gung der

Fläche der lasionen Pflanze pro Blatt zu derjenigen der Ver-

gleichsproben_t# ·

(76) 100 21,7

Unbehandelte Ver	250
gleichsproben	500
Daconyl-Netzpulver (6)	12,5
I-7545-A	25
	50

10,3

25,6

.25 18,2 -

11,4

(6) Enthält 75# Tetrachlorisophthalnitril (allgemein verwendeter Wirkstoff für Vergleichspräparate).

T-7545-A war wirksam gegen die Braunfäule der Tomate und hatte keine schädigende Wirkung auf die Pflanzen.

Versuch 10 Bekämpfung der Stengelfäule der Ilierenhohne

Versuchsaethode: Je eine Merenbohnenpflanze (Sorte Taisho Kintoki) wurde in'Töpfe von 12 cm Durchmesser gepflanzt. Die vollständig entfalteten obersten Blätter, die 40 Tage nach dem Einpflanzen abgeschnitten wurden, wurden verwendet» Je 6 Blätter bildeten eine Gruppe.

00 9 822/1896 SAD

Anwendung des Präparats: Jeder Lösung des Präparats wurde das Verlaufmittel "Dyne" "bis zu einer Endkonzentration von 0,05$ zugesetzt. Die oben genannten Blätter wurden eingetaucht und unmittelbar an der Luft trocknen gelassen.

Versuchsgefäß: Je 10 ml Wasser wurde in Petrischalen von 9 cm Durchmesser gegeben. In jedes dieser feuchten Gefäße wurde ein Ring aus Polyvinylchlorid gelegt. Die behandelten Blätter v/urden auf die Ringe gelegt, und zwar , 10. jeweils 1 Blatt pro Ring.

Impfmethode: Pathogene Pilze SULerotinaa sclerotiorum wurden auf einer Kartoffelinfusions-Agarplatte 5 Tage bei 20⁰C kultiviert. Nach dieser Zeit wurden einige Agarscheiben von 10 mm Durchmesser von einer Randkolonie aus-15, geschnitten. Je eine Scheibe wurde auf die Mitte jedes Blatts gelegt, worauf das Blatt in einem Gefäß bei 20⁰C gehalten wurde.

Bewertung: 6 Tage nach der Infizieiung wurde die Fläche der Läsion in jedem Blatt gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 genannt.

Tabelle 17 Wirkung von T-7545-A auf die Stengelfäule der Nierenbohne Präparat Konzen- Anteil der durchschnitt- Schädi-

tration liehen Fläche der Läsionen gung pro Blatt, # der

Pflanze

Unbehandelte Vergleichspro- ben	25 ppm	100
T-7545	100 ppm	18
	X1000	H
Earthcide- Netzpulver (7)	13

(7) Enthält 5096 2,6-Dichlor-4-nitroanilin (allgemein verwendetes Vergleiohspräparat).

009822/1806

T-7545-A war wirksam gegen die Stengelfäule der Nierenbohne und hatte keine schädigende Wirkung auf die Pflanze,

Versuch 11

Schädlingsbekämpfung mit Stäubemitteln

Versuchsmethode:

Blattscheidenbrand: wie bei Versuch 1 wurden Stäubemittel, die die Verbindung enthielten, mit einem Feinzerstäuber 3 Tage nach der Infizierung in einer Menge von 300 mg/ 6 Töpfe aufgebracht.

Bakterielle Welkekrankheit (Bacterial leaf blight):

wie oben, wobei jedoch die Sämlinge 25 Tage nach dem" Ein·* topfen behandelt wurden,

Pathogene Bakterien Xanthomonas oryzae wurde auf einem Saccharose-Bouillon-Medium 1 Tag bei 28⁰G kultiviert₀ Das oberste Blatt jedes Sämlings wurde mit einer Nadel angestochen, an der sich eine Suspension (10 ml) der Bakterienzellen befände Die Töpfe wurden 24 Stunden in einer Impfkammer bei 24 0 gehalten und dann in ein Gewächshaus überführt«, 2 Tage nach der Infiaierung wurden die Töpfe in der oben beschriebenen Weise bestäubte 10 Tage nach der Infizierung wurde die Länge jeder Läsion gemessene

Brusone-Krankheit: wie bei der bakteriellen Welkekrankheit.

Pathogene Pilze Piricularia oryzae wurden auf einem Reisstrohinfusions-Agarmedium 10 Tage bei 28⁰O kultiviert.

Die Töpfe wurden durch Besprühen mit einer Suspension der

/6 / geimpftο Konidien (10 /ml) in einer Menge von 2 ml/Topf ap*

Die Töpfe wurden 24 Stunden in einer Impfkammer bei 28⁰C gehalten, aus der Kammer genommen, in der oben beschriebenen Weise bestäubt und dann in ein Gewächshaus . überführt, 7 Tage naoh der Infizierung wurde das spezifi-

009822/18d6- '

sehe Verhältnis der durchschnittlichen Fläche der Läsionen nach der Okamoto-Methode gemessene

Reisstengerbohrer (Rice stem "borer) t Reispflanzen in Wagnertöpfen von 1/500Oa wurden 60 Tage nach dem Eintopfen und am vierten Tag nach dem Eindringen der Larven von Chilo suppressalis mit 5 g/5 Töpfe bestäubt. Am 8oTag nach dem Eindringen wurden die Stengel aufgeschnitten, worauf der Prozentsatz der überlebenden Larven berechnet wurde_e

Grrüne Reisblatt-Kleinzikaden (Green rice leafhopper):

Unmittelbar nach dem Bestäuben auf die vorstehend für den Reisstengelbohrer beschriebene Weise wurden die Reispflanzen mit Netzen bedeckt. In den Netzen wurden ausgewachsene Kleinzikaden (Naphotettix Oindceps) ausgesetzt. Nach 1 Tag wurde das Ergebnis festgestellt und der Prozentsatz der überlebenden Tiere ermittelt.

Alle Präparate zeigten hohe Wirkung gegen Blattscheidenbrand und alle Testschädlinge. Kein Präparat hatte eine schädigende Wirkung auf die Reispflanzen. Die Ergebnisse und die Vergleichsergebnisse mit verschiedenen Vergleichspräparaten sind nachstehend in Tabelle 18 genannt.

009822/ 1896

Tabelle

T-7545-.Ä Zugemisclie Wirk-Konz. stoffe

0,296

Konz. Pellicularia Xanthomosasakii, nas oryzae Läaionsver- Länge der größerung,^ Läsion, (8) J₀ (8)

12

Μ·	2-Amino-1,3,4- thiadiazoi-5- thiol	5*	12
0,296	2-Amino-1,3,4- thiadiazol-5- thiol		9
0,3*	-	—	■ ^
-	2-Formamido- 1,3,4-thiazol	496	8
0,39*	2-Formamido- 1,3,4-thiazol	4*	_
-	2-Amino-1,3,4- thiadiazol	396	3
0,2*	2-Amino-1,3,4- thiadiazol	3*
	3rBenzyliden- amino-4-phenyl- thiazolin-2-thion	596	2
0,3*	3-Benzyliden- amino-4-phenyl- thiazolin-2-thion	5*	15
0,1*	-	-	28
—	Als Polyoxin B 1000 PS-Einhei- ten/g		4
0,1*	Als Polyoxin B 1000 P8

1 0 0 0

8 8

(8) In Prozent, "bezogen auf die linbehandelten Vergleichsproben = 100 .

009822/1896

T-7545
Konz.

0,3$

0,35*

Zugemischter Bestandteil

Tabelle

Konz. Pellicularia Piricularia

Ο,3?6

Blasticidin-S-Benzylaminobenzolsulfonat 0,2

Kasugamycin 0,2 Kasugamycin 0,2

0,O-Diisopropyl-S-benzylthiophosphat 1,5

0,0-Diisopropyl-S-benzylthiophosphat 1,5

O-Ä-thyl-S,S-diphenyldithiophosphat

O-Äthyl-S,S-diphenyldithiophosphat t sasakii,

Läsionsirer

größerung,

(8)

10

10
8

oryzae, spez»Fläche der Läsion (8)

0,3

0,3 0,4 0,3

2,7 2,5 Q,3 0,2

bezogen auf die unbehandelten Vergleichsproben 00.

009822/1Ö98

Tabelle 20

T-7445t Zugemischter Be- Konz« Pellicularia überlebens-KonZo standteil sasakii, rate von

Läsionsver- Chilo · größerung,?6 suppressa-{§} lia (8)

0,2$ - - 12

- · 1,3-Bis(carba-

moylthio)-2-

'10 (NjN-diinethyl-

amino)-propanhydroChlorid 2$ - 1

0,2^6 dto. 296 8 0

Dirne thyl(3-niei;hyl-4-nitro-

phenyl)thio—
phosphat 296 " — 3

0,29ε dto. Z$> 9 3

(8) $>, bezogen auf unbehandelte Vergleichsproben = 100„

!Tabelle 21

T-7545, Zugemischter Be- Konz« Pellicularia überlebens-Konz. standteil sasakii, rate von

Läsionsver- Uaphotettix größerung,> cinoliceps, (8) % tsr

1-Naphthyl-F-

methylcarbamat 1,5$ - 4

0, % dto. 1, 5$ 7 · 2

(8) fi, bezogen auf unbehandelte Vergleichsproben = 100·

009822/1898

Versuch 12 Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate

Testpflanzen: wie bei Versuch 9
Anwendung des Präparats: wie oben

Impfmethode: Pathogene Pilze Cladosporium fulvum wurden auf einer Kartoffelinfusions-Saccharoseplatte 14 Tage bei 20⁰C kultiviert. Eine Suspension der Konidien (10V ml) wurde aus der Kultur hergestellt. Die Pflanzen wurden mit der Suspension 3 Tage vor der Anwendung des Präparats in einer Menge von 5 ml/Topf besprüht. Die Töpfe wurden 24 Stunden in einer Impfkammer bei 25⁰O gehalten und dann in ein Gewächshaus überführt.

Bewertung: 14 Tage nach der Infizierung wurde das spezifische Verhältnis der durchschnittlichen Läsionsfläche ■ in den Blättern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 genannt.

Tabelle 22

Wirkung von T-7545-A bei der Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate

20 Präparat 25

Dosis Spezifische ppm Fläche der Iäsion,?£

Schädigung der Pflanze

Unbehandelte Vergleichs pflanzen	12,5	98,9
T-7545-A	25,0	6,1
	50,0	3,4
	1,7

T-7545-A war wirksam gegen die Braunfleckigkeit der Tomate und hatte keine schädliche Wirkung auf die Pflanzen.

009822/1896

Versuch 13 Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises

Testpflanzen: wie "bei Versuch 3

Anwendung des Präparats: wie bei ^ersuch 3» jedoch unter Verwendung von T-7545-B an Stelle von T-7545-A.

Bewertung:

14 Tage nach der Behandlung wie bei Versuch 1.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 genannt.

Tabelle 23

Wirkung von T-7545-B bei	Länge	der Bekämpfung des	Schädigung der Pflanze
brandes	Dosis ppm
(durchschnittliche		3 Blattscheiden	-
Präparat	10		-
Unbehandelte Ver gleichspflanzen	20	'der Läsionen/Stengel in cm)	-
T-7545-B	40	Heilwirkung nach 21 Tagen	_
	80	32,5
	' 14,5
	12,6
	12,6
12,6

Bei einer Konzentration von 20 ppm oder mehr war T-7545-B äußerst wirksam bei der Behandlung nach dem Auftreten der Krankheit. Es unterdrückte die Bildung neuer Läsionen mehr als 2 Wochen nach der Einwirkung. Keinerlei Schädigung der Pflanzen wurde selbst bei einer Konzentration von 80 ppm festgestellt.

Versuch 14

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises mit dem Gemisch der Antibiotika T-7545-A und T-7545-B

Versuchsmethode:

Testpflanzen: wie bei Versuch 1
Impfemthode: wie bei Versuch 1
Anwendung des Präparats: wie bei Versuch 3 mit dem ünter-

009822/1896

schied, daß T-7545-A und T-7545-B oder deren Gemische an Stelle von T-7545-A verwendet werden.

Bewertung: wie "bei Versuch

Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 24 genannt»

Tabelle

Wirkung eines Gemisches von T-7545-A und T-7545-B bei der Bekämpfung des Blattscheidenbrandea

Dosierung des Präparats (ppm) Durchschnittliche Länge des befallenen Bereichs. * L

Unbehandelte Vergleichspflanzen

T-7545-A (2,5 ppm)

T-7545-A (5 ppm>

T-7545-E (6,25 ppm)

T-7545-B (12,5 ppm)

T-7545-A (2,5 ρρπΟ+ϊ-7545-Β

(6,25 ppm)

T-7545-A (5 ppm) + T-7545-B (12,5 ppm) 1

Tabelle

Wirkung eines Gemisches von T-7545-A und T-7545-B bei der, Bekämpfung des Blattscheidenbrandes

(27,8 cm) 23 11 65 47

- 1

Dosierung des Präparats,(ppm) Durchschnittliche Länge des befellenen Bereichs,$

Unbehandelte Vergleichspflanzen T-7545-A (5) T-7545-A (10) T-7545-A (20) Ϊ-7545-Β (10) T-7545-B (20) T-7545-B (40) ϊ-7545-Α(8)+2-7545-B{2) 2-7545-A(5)+2?-7545-B(5) Τ~7545-Α(2)+!Ε-7545-Β(θ) (30,1 cm)

25 21

2 76

5 42

009822/1898

I-7545-B "bekämpfte äußerst wirksam den Blattacheidenbrand. Insbesondere war bei Gemischen von T-7545-B und Ϊ-7545-Α die Wirkung um ein Vielfaches verstärkt.

Versuch 15

Bekämpfung der Wurzelfäule (Damping-off) bei der Gurke Versuchsmethode: wie bei Versuch 5

Tabelle 26

Wirkung von T-7545-B bei der Bekämpfung der Wurzelfäule der Gurke .

Präparat Dosis Grad der Schädigung, Schädi-

i> gang der

- ■ . -- - Pflanze

Unbehandelte Ver-15

gleiohspflanzen	x 1000	too
Pentaehlornitro- benzol	x 500	1Q
5Obiges Mtetzpulver Ve rglei cha präparat	5 ppm	0
T-7545-B	10 ppm	25
	20 ppm	9
	40 ppm	3
	1

Bei einer Konzentration von 20 ppm oder mehr war T-7545-B äußerst wirksam gegen die durch Rhizoctonia verursachte Wurzelfäule und hatte keine schädigende Wirkung auf die Keimung des Samens und das Wachstum der Sämlinge.

Versuch 16

Bekämpfung von Rhizoctonia der Gurke durch Umhüllung des Samens .

Impfmethode: wie bei Versuch 15

Anwendung des Präparats: wie oben beschrieben Versuchspflanze: wie bei Versuch 15 Bewertung: wie oben beschrieben

009822/1806

Tabelle 27

Wirkung von T-7545-B bei	der Bekämpfung von Rhizoctonia	3	Schädigung der Pflanze	Pentachlornitro- benzol-Stäubemittel
durch Umhüllen des Samens	T-7545-B-Stäubemittel	_	Grad der Schädigung Schädi- der Pflanze gung,#
Gehalt an Wirkstoff	Grad der Schädi gung,^	-
*	100	-	100
O(Vergleichs- pflanzen)(4)	22	mm	88
0,625	8		25
1,25	2		18 + :
2,5	O		10 +
5	O
10

(4) Nur mit dem Hilfsstoff (Talkum) umhüllt.

T-7545-B ist auch gegen Rhizoctonia wirksam, wenn ee als Stäubemittel zum Umhüllen des Samens verwendet wird. Bei diesem Verfahren wurde ebenfalls keine schädigende Wirkung auf die Pflanzen festgestellt.

Versuch 17
Bekämpfung von Rhizoctonia bei der Gurke mit einem Ge-

misch von T-7545-A und T-7545-B

Rhizoctonia solani wurde 5 Tage bei 28⁰C auf Gerstenmedium kultiviert. 10 kg der Bodenprobe des Feldes wurden mit Wasserdampf sterilisiert und mit 1,2 kg des kultivierten Häcksels gemischt, der in die obere Schicht bis zu einer Tiefe von etwa 5 cm eingearbeitet wurde. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 28⁰C und 100$ relativer Feuchtigkeit stehen gelassen. Es wurde dann bei Raumtemperatur 2 Tage getrocknet, worauf das kultivierte Häcksel abgeliebt, wurde. Der mit Rhizoctonia solani geimpfte Boden wurde in Töpfe von 12 cm Durchmesser in einer Menge

009 822/1896

von 450 g/Topf gefüllt.

Anwendung des Präparats: wie "bei Versach 3 wurde das Präparat in einer Menge von 40 ml/2 Töpfe/Gruppe auf den Boden gesprüht. Bewertung: wie bei Versuch

Tabelle

Bekämpfung von Rhizoctonia solani bei	der Gurke mit einem
Gemisch von T-7545-A und T-7545-B
Wirkstoffgehalt^ppm	Schädiflung, #
Unbehandelte Vergleichspflanzen	100
T-7545-A (10)	69
T-7545-A (20)	24
T-7545-A (40)	11 ■
T-7545-B (10)	88
T-7545-B (20)	32
T-7545-B (»0).	16
I-7545-A(5)+ T-7545-B (5)	56
T-7545-A(1O)+T-7545-B(1O)	16
T-7545-A(2O)+T-7545-B(2O)	3
Pentachlornitrobenzol (500)	16
Pentachlornitrobenzol (1000)	3

009 8 22/1896

Tabelle 29 Bekämpfung von Rhizootonia solani "bei der Gurke

Wirkstoff und
Konzentration

Anwendungsmethode

Durchschnitt der Sämlinge

Unbehandelte
Vergleichspflanzen

Ungeimpft

T-7545-A

5 ppm

13 ppm

26 ppm
0,62596..

■ 1,2596

2,55έ
.' 5,O?6 ■

Verwendung im Boden dto.

Umhüllung des Samens mit Pulver

dto β dto. dto. dto.

0 90

20 63 88

63 75 97 95 92

Nach 14 Tagen von Rhizoctonia solani nicht befallen

Ο96 90

16 53 82

12

37

83 95 92

T-754-5-B war äußerst wirksam bei der Bekämpfung von Rhizoctonia solani der Gurke. Insbesondere zeigte ein Gemisch von T-7545-B und T-7545-A eine hohe Wirksamkeit 25 bei Umhüllung des Samens.

Versuch

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises (Pellicularia sasakii) ;

Versuchspflanzen: Reis wie bei Versuch 3 30 Impfmethoäe: wie bei Versuch 3

Anwendung des Präparats: wie bei Versuch 3 Bewertung: wie bei Versuch 3, außer daß 1 Stunde nach der Anwendung des Präparats mit 22 mm/30 Minuten künstlich beregnet wurde. . '

009822/1896

Tabelle 30

Bekämpfung von Pellicularia sasakii des Reises mit T-7545-A

Wirkstoff Konzentration Mittlere Länge' des

erkrankten Bereichs, cm

Unbehandelte Ver gleichspflanzen	—	46,2
Polyoxin PS emulgierbares Konzentrat (3$)*.	x3OO	45,8
Monzet-Eetzpulver	x2000	11,4
T-7545-A	12,5 ppm	18,1
	25 ppm	11,4
	50 ppm	12,3
	100 ppm	10,2

^-Einheiten der wirksamen Fraktion von Polyoxin B/g gegen Pellicularia sasakii_o

Versuch 19

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes des Reises (Pelli-

cularia sasakii) im Freilandversuch

Versuchsort: Fukuchiyama, Japan

Versuchspflanzen: Reispflanzen (Sorte Gohyakumankoku), die auf dem Reisfeld am 1„Mai gepflanzt worden waren_e Sämlinge vom 18»Juli wurden für diesen Versuch verwendet« Impfmethodet Pathogene Pilze Pellicularia sasakii wurden auf Reisstroh einer mittleren Länge von 2 om 5 üage bei 28°0 kultivierte Das Häcksel wurde dann in den Innenraum der Blattscheide in der Nähe der Wasseroberfläche des Reisfeldes am 4«Juli eingesetzte

Anwendung des Präparats: Jedes Präparat wurde gleichmäßig mit der Spritzpistole in einer Menge von 200 1/10 a (wässrige Lösung) gleichmäßig am 11„Juli über das Reisfeld gesprüht. Am 17.Juli wurden 3 kg/10 a als Stäubemittel angewendet.

009022/1898

Bewertung: Die Ergebnisse wurden nach den folgenden Bewertunesziffern der Läsion jedes Stengels "bewertet. Der Grad der Schädigung wurde berechnet. Bewertungsziffern:

3s Ausbildung der Krankheit an der unteren Blattscheide (flag leaf sheath) 2: Ausbreitung der Krankheit auf die zweite Biatt-

scheide

1: Ausbreitung der Krankheit auf dritte bis vierte ■jO Blattscheide,

Grad der Schädigung =

3 x(Zahl der Pflanzen mit Ziffer 3) + 2 χ (Zahl der

Pflanzen mit Ziffer 2) + 1 χ (Zahl der Pflanzen mit Ziffer 1)

3 x Gesamtzahl der Pflanzen

Tabelle 31

Wirkstoff Konzentra- Mittlere Länge Schädigung der tion des erkrankten Pflanzen in i<> Bereichs, cm

Unbehandelte
Vergleichspflanzen - 88,2 100,0

Emulgierbares
Konzentrat von
Polyoxin (3$)PS χ 600 48,0 84,4

Monkit-Lösung(9) x 2000 19,8 41,1

T-7545-A-Lösung 28 ppm 19,2 45,2

T~7545-A-Stäu-

bemittel Ο₉285& 16,8 40,3

(9) Enthält 6,5$ Eisenammonium-Methanarsensäure.

009822/1 386

Beispiel 11 - Uetzpulver

T-7545-A 1,0$

Natriumligninsulfonat 0,1$

Polyoxyäthylenalkylaryläther 0,1?έ

Weißkohle 0,1$

Ton 98, 7$

Je nach Anwendungazweck und -methode wird das vorstehende Präparat auf 1 bis 200 ppm Antibiotikum verdünnt*· Das verdünnte Präparat wird mit Sprühvorrichtungen auf den Boden aufgebracht, oder das oben beschriebene Pulver wird unverdünnt zum Umhüllen des Samens verwendet.

Beispiel 12 - Tabletten

T-7545-A-hydrochlorid 15,0$

Polyoxyäthylenalkylaryläther 2,0$

Lactose 83,0$

Vor der Anwendung wird dieses Präparat auf die in Beispiel 11 genannte Konzentration verdünnt. -

Beispiel 13 - Wässrige Lösung

T-7545-A 40,0$

Methanol 5_f0$

Aminstearat . 5,0$

Wasser 50,0$

Dieses Präparat wird auf 500 bis 100000 ppm verdünnt. Das verdünnte Präparat wird beispielsweise vom Flugzeug aus versprüht.

Beispiel 14 - Emulgierbares Konzentrat

T-7545-A 10,0$

Polyoxyäthylenalkylaryläther 5,0$

Methanol 20,0$

Methylnaphthalin 40,0$

Dimethylformamid 25,0$

009822/1896

Vor der Anwendung wird dieses Gemisch auf die in Beispiel 1 genannte Konzentration verdünnte

Beispiel 15 - Stäubemittel

T-7545-A 0,1$

Aluminiumstearat , 0,02$

Talkum 99,88$

Je nach Anwendungszweck und -methode wird dieses Gemisch als solches in einer Menge von 1 Ms 8 kg/10 a auf den Boden gestäubt oder zur Umhüllung des Samens verwendet«

Beispiel 16 - Gemischtes Stäubemittel A

T-7545-A 0,2$

2-Amirio-1,3,4-thiadiazol-5-thiol 5,0$

Aluminiumstearat 0,02$

Talkum 94,78$

Das vorstehende Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 "beschrieben.

Beispiel 17 - Gemischtes Stäubemittel B T-7545-A 0,3.;

2-Pormamid-1,3,4-thiadiazol 4,0$

Talkum 95,

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 18 - Gemischtes Stäubemittel C

T-7545-A 0,2$

2-Amino-1,3,4-thiadiazol 3,0$

Talkum 96,8$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

009822/Ί 89 6

Beispiel 19 - Gemischtes Stäubemittel· D

T-7545-A 0,3$

3-Benzylidenamino-4-phenylthiazolin-

2-thion 5,0$

' Talkum 94,7$

Dieses Präparat wird angewendet, die in Beispiel 15 beschriebene

Beispiel 20 - Gemischtes Stäubemittel· E

T-7545-A . 0,3$

Blasticidin-S-benzylaminobenzolsulfonat 0,2$

Talkum 99,5$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschriebene

Beispiel 21 - Gemischtes Stäubemittel ff

T-7545-A 0,3$

Kasugamycin 0,2$

Talkum 99,5$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 22 - Gemischtes Stäubemittel G

T-7545-A 0,3$

0,0-Diisopropyl-S-benzylthiophosphat 1,5$ Talkum > 98,2$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 23 - Gemischtes Stäubemittel H
T-7545-A -0,3$

0-Äthyl-S,S-diphenyldithiophosphat 2,0$ Talkum 97,7$

Dieses Präparat wird angewendet, die in Beispiel 15 be-

009822/1898

-■66 -

Beispiel 24 - G_Pniisch,te3 Stäabemittel I

T-7545-A 0,196

Polyoxin (B 1000 PS-Einheiten/g) 0,1$

Ealkum ' 99

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 25 - gemischtes Stäubemittel· J
T-7545-A 0,2$

1,3-Bis(carbamoylthio)-2(N,N-•jQ dimethylamine)propanhydroChlorid 2,0%

Talkum 97,8%

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschriebene

Beispiel 26 - gemischtes Stäubemittel K
-15 T-7545-A 0,2%

Dirnethyl(3-methyl-4-nitrophenyl)-

thiophosphat · 2,0%

Talkum 97_t8%

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.»

Beispiel 27 - gemischtes Stäubemittel L
T-7545-A 0,3%

i-Naphthyl-lT-methylcarbamat 1,5%

Talkum 98,2%

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben»

Beispiel 28 - Hetzpulver

T-7545-B 1,0%

Natriumligninsulfonat 0,1%

Polyoxyäthylenalkylaryläther 0,1%

Weißkohle 0,1%

Ton 98,7%

^- 1fu9 8 2 2/1896

Je nach '"'nwendungszweok und -methode wird dieses Gemisch auf 2 bis 400 ppm Antibiotikum verdünnt. Das verdünnte Präparat wird auf den Boden gestäubt oder das Pulver unverdünnt zur Umhüllung des Samens verwendet«

Beispiel 29 - Tabletten

I-7545-B-hydroChlorid 15,0$

Polyoxyäthylenalkylaryläther 2,00

lactose 83,

Vor der Anwendung wird das Gemisch auf die in Beispiel 1 genannte Konzentration verdünnt.

Beispiel 30 - Wässrige Lösung

T-7545-B -40,00

Methanol 5,00

Aminstearat 5,00

Wasser 50,00

Das Gemisch wird auf 1000 bis 200000 ppm verdünnt. Das

verdünnte Präparat wird beispielsweise vom Plugzeug aus versprüht« .

Beispiel 31 - Emulgierbares Konzentrat

T-7545-B 10,00

Polyoxyäthylenalkylaryläther 5,00

Methanol '- 20,00

Methylnaphthalin 40,00

Dimethylformamid 25,00

Vor der Anwendung wird dieses Gemisch auf die in Beispiel 10 genannte Konzentration verdünnt.

Beispiel 32 - Stäubemittel

T-7545-B · 0,20

Aluminiumstearat O,C20

Talkum 99,780

009822/ 189 S SAD

Sie nach Anwendungazweck und -methode wird dieses Gemisoh als solches in einer Menge von 1 bis 8 kg/10 a verstäubt oder zum Umhüllen des Samens verwendet.

Beispiel 33 - Gemischtes Stäubemittel M

T-7545-B 0,2$

2-Amino-1,3,4-thiadiazol 3,

Talkum 96,

Beispiel 34 - Gemischtes Stäubemittel N

T-7545-B 0,4$

Blasticidin-S-benzylaminobenzolsulfonat 0,2$

Talkum 99,4$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 be-

schrieben.

Beispiel 35 - Gemischtes Stäubemittel 0
T-7545-B 0,4$

Kasugamicin 0,2$

Talkum 99,4$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschriebene

Beispiel 36 - Gemischtes Stäubemittel P

T-7545-B 0,4$

0,0-Diisopropyl-S-benzylthiophosphat 1,5$

Talkum 98,1$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

00 9822/1896

Beispiel 37 - Gemischtes Stäubemittel· Q

T-7545-B 0,4*

0-Ithyl-S,S-diphenyldithiophosphat 2,0*

Talkum 97,6$

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben·

Beispiel 38 - Gemischtes Stäubemittel R
T-7545-B ₀,2*

Polyoxin (B; 1000 PS-Einheiten) 0,1*

Talkum 99,7*

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 59 - gemischtes Stäabemittel S
T-7545-B 0,4*

1_t3-Bis(oarbamoylthio)-2(N,N-dimethyl-

amino)propanhydrochlorid 2,0*

Talkum 97,6*

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben.

Beispiel 40 - Gemischtes Stäubemittel· T

T-7545-B 0,3*

Dimethyl(3-methyl~4-nitrophenyl·)-

thiophosphat ²

Talkum 99,7*'

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben«

Beispiel 41 - - Gemischtes Stäubemittel· TJ .
T-7545-B - 0,4* 1-Naphthyl·-N-methylcarbamat 1,5*-

Talkum 98,1*

Anwendung des Präparats wie in Beispiel 15 beschrieben·

009822/1896

Beispiel 42 - Gemischtes Stäubemittel V

T-7545-A O,2#

T-7545-B . . 0,1Ji

Talkum ' 99,79^

5- Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben,

Beispiel 43 - Gemischtes Stäubemittel W Gefriergetrocknetes Pulver der Kulturbrühe von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus 100#

Dieses Präparat wird angewendet, wie in Beispiel 15 beschrieben·

009 822/18 96

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum T-7545 und dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm, der T-7545 bildet und zur Öattung Streptomyces gehört, kultiviert und das Antibiotikum aus der erhaltenen Kulturbrühe isoliert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces hygroscopicus als T-7545 bildender Stamm der Gattung Streptomyces verwendet wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces hygroscopicus var. limoneus oder seine Mutanten als T-7545 bildende Stämme der Gattung Streptomyces verwendet werden.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces hygroscopicus var.limoneus I]PO-12703 oder IPO-12704 als T-7545 bildende Stämme der Gattung Streptomyces verwendet werden·

S\5^Antibiotikum T-7545-A, Antibiotikum T-7545-B, Salze

^ dieser Antibiotika und deren Gemische, wobei T-7545-A die folgenden Eigenschaften hat:

a) schwach basisches, weißes hygroskopisches Pulver, das keinen scharfen Schmelzpunkt hat und sich bei 100 bis 135⁰O zersetzt;

b) leicht löslich in Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln, schwer löslich in Aceton und Äthanol und unlöslich in Äthylacetat, Äther und Petroläther;

o) Farbreaktionen:

Molish-Reaktion positiv

3f_ehlingsche Reaktion "

009822/18 96

Anthron-Reaktion positiv Phenol-Sulfonsäure-Reaktion "

Orcinol-Sulfonsäurereaktion "

Naphthoresorcin-Sulfonsäurereaktion " Benzidin-Perjodat-Reaktion "

Peptid-Nachweisreagens-Reaktion " (tert«-Butylhypochlorit)

Alkalisches Kalimnpermanganat reduziert Ninhydrinreaktion schwache Purpurfarbe

10* d) pK'a-Wert 6,2

e) durch Titration ermitteltes Molekulargewicht:

510 + 25;

f) oberhalb von 210 mti wird keine charakteristische Absorption festgestellt;

15, g) deutliche Infrarotabsorptionsbanden:

3450 (stark), 2900 (mittel), 1640 (mittel), 1450 (mittel), 1410 (mittel), 1370 (mittel), 1160 (mittel), 1120-1000 (stark), 920 (schwach), 900 (mittel), 855 (mittel); h) optische Drehung: /a_7 ^² = 110 + 15° (0=1, H₂O)

110+15° (C=1,Pyridin)

92,5+ 10° (C=!,Dimethylformamid)

i) Elementaranalyse:
C 47,6 + 1,596; H 7,17 * 0,5#; N 3,01 + 0,5$

j) durch Papierenromatographie und Dünnschichtchromatographie an Kieselgel ermittelte Rf-Werte:

009 8 22/1896

Lösiingsmittelsystem PapierhcromatocraOhie
I-7545-A T-7545-A-

hydrοchlorid

0,44 0,37-0,44

n-Butanol:Äthanol: Wasser:konz.wässriges

Ammoniak 00:10:49:1.) 0,11-0,12 0,11-0,12

Äthylacetat Essigsäure: Wasser (3:1:3)

Ä"thylacetai;:Pyridin: Wasser (2:1:2)

n~Butanol:Pyridin: Wasser (4:2:1$

n-Butanol:Pyridin: Wasser (4:3:7) 0,01 0,01 0,01-0,02 0,01-0,02 0,05 0,05

0,46-0,48 0,46-0,48 80^iges Phenol(NH₃) 0,55 0,55

n-Butanol: Äthanol: Wasser:Pyridin (35:15:40:10)

n-Propanol:V/asser: konz»wässriges Ammoniak (70:29:1)

n-PropanolEssigsäure: . Wasser (4:1:1) 0,35-0,39 0,35-0,39 0,06-0,07 0,06

Dünn-

schicht-

chromato-

graphie

T-7545-A

n-ButanolEssigsäure:

Wasser (4:1:2) 0,10-0,12 0,10-0,12

70$iges wässriges Aceton

0,10 0,53

0,08 0,00 0,01 0,18

0,27 0,38

0,44

0,07 0,30

k) Papierelektrophorese unter Verwendung von Borsäurepuffer (p_H 10) bei einer Potentialdifferenz von 2 kV für 2 Stunden: +1,5 cm;

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Papierelektrophorese unter Verwendung von Pyridin-Essigsäure (p_H 6,0) bei einer Potentialdifferenz von 2 kV für 3 Stunden: -8,5 cm; l) antibiotisches Spektrum (in vitro):

Testorganismus 28°C,40 Std. Hemmende Mindest
konzentration 't-7545-3 28⁰C,40 Il γ/πυ
T-7545-A >100 Pyricularia oryzae 28⁰C, 40 It >100 >100 Pellicularia sasakii 28⁰C₁40 Il >100 >100 Colletotrichum
lagenarium 28⁰C,40 N >100 >100 Alternaria kikuchiana 28°C,40 η >100 >1OO Aspergillus niger 28⁰C,40 It >100 >100 Penicillium chryso-
genum 28⁰C,40 Il >100 >100 Saccharomyces
cerevisiae 28⁰C,40 η >100 >100 Candida albicans 28⁰C,40 Il >100 >100 Irichophyton menta-
grophytes 37⁰C,14 Il >100 >100 Xanthomonas oryzae 37⁰C,14 Il >100 >100 Bacillus subtilis 37⁰C,H Il >100 >100 Staphylococcus
aureus 37⁰C,14 Il >100 >100 Sarcina lutea 37⁰C,14 Il >100 > 100 Escherichia coli 37⁰C,40 Il >100 >100 Proteus vulgaris 37⁰C,40 Il >100 >100 Mycobacterium avium >100 >1OO Mycobacterium ATCC 607 >100

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m) maximale Verdünnung, die zu anomaler Verzweigung der Hyphenspitzen führt:

Pellicularia sasaKii 1OOOOO

Rhizoctonia solani 50000

Oorticium rolfsii < 100

Phytophttna infestans < 2000

und wobei !H545-B die" folgenden Eigenschaften hat:

a) schwach basisches_f weißes hygroskopisches Pulver, das keine scharfen Schmelzpunkt hat und sich bei 95 bis 140⁰C zersetzt;

b) leicht löslich in Wasser, polaren organischen Lösungsmitteln, schwer löslich in Aceton und Äthanol und unlöslich in Äthylacetat, Äther und Petroläther;

c) Farbreaktionen:

Molish-Reaktion positiv

Fehlingsche Reaktion «

Anthron-Reaktion "

Orcinol-Sulfonsäurereaktion ^M

Naphthoresorcin-Sulfonsäurereaktion ^H

Benzidin-Perjodat-Reaktion ^M

Peptid-Nachweisreagens-Reaktion , (tert.-Butylhypochlorit) "

Alkalisches Kaliumpermanganat reduziert Ninhydrinreaktion schwache Purpurfarbe

d) pK'a-Wert: 5,0;

e) durch Titration ermitteltes Molekulargewicht: 520 +25;

f) keine charakteristsiche Absorption oberhalb von 210 mu.;

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g) deutliche InfrarotabsorptionslDanden bei 3400 (stark), 2910 (mittel), 1638 (mittel), 1415 (mittel), 1080 (stark), 1025 (stark), 900 (mittel), 840 (mittel);

h) optische Drehung: /ä_7^³ ■ 102 + 10° (0=1, H₂O)

i) Elementaranalyse:

C 46,46 + 1,5#; H 7,06 + 0,5#ί N 2,44 + 0,5*.

j) Rf-Werte auf "spot"-Filmen für Dünnschichtchroma-.

tographie an Kieselgel: 0,43 (n-Propanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:1);

k) Elektrophorese:

Papierelektrophorese unter Verwendung von Borsäurepuffer (p„ 10) bei einer Potentialdifferenz von 2 kV für 2 Stunden: +6,0;

Papierelektrophorese unter Verwendung von Pyridin-Essigsäure (p_H 6,0) bei einer Potentialdifferenz von 2 kV für 3 Stunden: -4,0;

l) antibiotisches Spektrum (in vitro):

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lestOrganismus 28⁰C,40 Std. Hemmende Mindest
konzentration
γ/ml
T-7545-A T-7545-3 >100 5 Pyricularia oryzae 28⁰C,40 Il >100 >100 Pellicularia sasakii 28⁰C, 40 Il >100 >100 Colletοtrichum
lagenarium 28⁰C,40 Il >100 >100 Alternaria kikuchiana 28⁰C,40 Il > 100 >100 10 Aspergillus niger 28⁰C,40 Il >100 >100 Penicillium. chryso-
genum 28⁰C,40 It >100 >100 Saccharomyces .
oerevisiae 28⁰C,40 Il >100 >100 15 Candida albicans 28⁰C,40 Il >100 >100 Trichophyton menta-
grophytes 28⁰C,40 . Il >100 >100 Xanthomonas oryzae 37⁰C,14 Il >100 >100 Bacillus subtilis 37⁰C,14 Il >100 >100 20 Staphylococcus
aur e us 37⁰C,14 Il >100 » >100 Sarcina lutea 37⁰C,14 It >100 >100 Escherichia coli 37⁰C,14 Il >100 >100 • Proteus vulgaris 37⁰C,40 It >100 >100 »5 Mycobacterium avium 37⁰C,40 It >100 >100 Mycobacterium ATCC 607 >100

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m) maximale Verdünnung, die zu anomaler Verzweigung an den Hyphenapitzen führt:
Pellicularia sasakii 1500

Rhizoctonia solani . ^ 20

Oorticium rolfsii ' < 100

Phytophthora infestans <2000

6) Hydrochloride, Sulfate und organische Sulfonate der Verbindungen nach Anspruch 5.

7) Kulturbrühe, hergestellt durch Kultivierung eines Stammes, der T-7545 bildet und zur Gattung Streptomyces gehört.

8) Schädlingsbekämpfungsmittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, enthaltend als Wirkatoff das Antibiotikum T-7545-A, das Antibiotikum T-7545-B, ein Salz dieser Antibiotika oder ein Gemisch dieser Wirkstoffe.

9) Schädlingsbekämpfungsmittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, enthaltend eine Kulturbrühe, die durch Kultivierung eines T-7545 bildenden Stammes der Gattung Streptomyces erhalten worden ist.

10. Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch.7, enthaltend Antibiotikum T-7545 als Wirkstoff.

11. Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch 7, enthaltend Antibiotikum T-7545-B als Wirkstoff.

12o Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch 7, enthaltend Antibiotikum T-7545-A und. T-7545-B als Wirkstoff.

15. Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch 7 bis 11 in flüssiger Form, enthaltend den Wirkstoff in einer Menge von etwa 0,0001 bis 1 Gew.-^ό, bezogen auf das Präparat.

14. Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch 7 bis 11 in Pulverform, enthaltend etwa 0,01 bis 30 Gew.-$ Wirkstoff, bezogen auf das Präparat.

15. Schädlingsbekämpfungsmittel nach Anspruch 7 bis 11 in . Konzentratform, enthaltend etwa 0,5 bis 80 Gew.-^ Wirkstoff, bezogen auf das Konzentrat.

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