DE2231979B2 - Pllzbefallverhindernae antlbiotlsche Verbindung, Verfahren zu Ihrer Herstellung und fungicide Mittel - Google Patents

Description

NH,

CH, '

und deren Säureadditionssalze, mit einer spezifischen Drehung des Hydrochloridsalzes von

[„]» = 63,2" (c· = I, H₂O)

2. Verfahren zur Herstellung der pilzbefallverhinderndenantibiotischenVerbindung»F-1028« gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces kagawaensis nov. sp. (FERM-PNr. 953: ATCC 21 811) auf einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet unddie»F-1028«- Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert, indem man an einem Adsorbens adsorbiert und dann eluiert.

3. Fungicide Mittel, enthaltend die pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff.

Die »F-IO28«-Verbindung weist die folgenden Eigenschaften (i) (ix) auf.

(i) Sie besitzt ein Molekulargewicht von 219,
(ii) sie liegt in Form farbloser Kristalle vor,

(iii) der Schmelzpunkt des Hydrochlorids liegt über 195 C (Zersetzung),

(iv) die spezifische Drehung des Hydrochlorids beträgt [„]§> = 63,2 (c = I, H₂O),

ίο (ν) das UV-Spektrum einer wäßrigen Lösung des Hydrochlorids besitzt, wie in A b b. I dargestellt wird, keine besondere Absorption,
(vi) das IR-Spektrum einer Mischung des Hydrochlorids mit Kaliumbromid isl in Fig. 2 dargestellt,

(vii) sie besitzt einen Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel von 0,68, wenn man als Entwicklungslösungsmittel n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser in einem Verhältnis von I 5 : 10: 3 : 12 verwendet und einen Rf-Wert von 0,21, wenn man als Enlwicklungsmittel eine Mischung aus Butanol-Essigsäure-Wasser in einem Verhältnis von 3:1:2 verwendet,

(viii) es ist in Wasser leicht löslich und in Chloroform. Benzol und Äther unlöslich und
(ix) die Farbreaktion isl positiv mit Ninhydrihn, Ehrlieh-Reagens, Elson-Morgan-Reagens, ToI-lens- und Benedict-Reagens und negativ mit Molish-Reagens, Sakaguchi-Reagens, Maltol-Reagens und Eisen(lll)-Chloridreagens.

Die Verbindung »F-1028« mit diesen Eigenschaften (i) bis (ix) ergibt bei der wissenschaftlichen Bestimmung der chemischen Struktur die folgende Formel

Die Erfindung betrifft eine neue pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« und die Säureadditionssalze davon, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung durch Fermentation und fungicide Mittel, die in der Landwirtschaft und beim Gartenbau nützlich sind.

Es wurde gefunden, daß eine pilzbefallverhindernde anlibiotische Verbindung, die bis jetzt unbekannt war, hergestellt werden kann, wenn man Stämme, die »1-1028«-Verbindung liefern und die zu dem Genus Streptomyces gehören, in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet.

Vor der vorliegenden Erfindung war das Vorhandensein eines Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört und der die Substanz »F-1028« liefert, die starke pilzbefallverhindernde Wirkung und wachstuminhibierendc Wirkung bei verschiedenen Pilzen zeigt, insbesondere Schimmel, nicht bekannt.

Die neue pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung, die als »F-1028«-Verbindung bezeichnet wird, zeigt starke fungicide Aktivität gegen verschiedene Fungi, die Pflanzenkrankheiten verursachen und nur eine geringe antibakterielle Wirkung auf verschiedene Bakterien zeigen.

HCOH

HCNH₂
HOCH

CH^CHCON HCH

NH,

CH,

Diese als »F-1028« bezeichnete Verbindung besitzt Aktivität gegen Archimycetes, Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und Fungi imperfecti. Sie kann beispielsweise als Pflanzenschutzfungicid verwendet werden und weist sowohl vorbeugende als auch heilende Wirkungen bei einer großen Vielzahl von Pflanzenpathogenen auf, die solche Krankheiten verursachen wie Pesthauch, Mehltau, Verdorren, Scheidetrockenfäule bzw. Brand der Obstbäume, bakterielle Blatt-Trockenfäule oder helminthosporische (helminthosporium) Blattflecken bei Reis, Blattrost bei Weizen, bakterielle glatte oder klebearme Fäule bei Chinakohl, braune Fäule bei Pfirsich, Blattfäule bei Bananen, grauer Schimmel bei Erdbeeren und anderen erntetragenden Pflanzen, feinstflaumiger Schimmel bzw. Mehltau bei Trauben, Anthraknose von Trauben, Äpfeln und Birnen, Stammfäule bei Gemüse, Anthraknose bei Melonen und Gurken, Melanose bei Zitrusfrüchten, pulverartiger Schimmel bzw. Mehltau bei Weizen, Äpfeln, Gurken und gegen schwarze Flecken,

die durch Pilze verursacht werden, beispielsweise gegen braune Schwarzfleckenkrankheiten an Äpfeln oder frühen Tau bei Kartoffeln, Schorf, der durch Pilze verursacht wird, beispielsweise Schorf an Birnen und Äpfeln.

Es wurde nun erstmals der Stamm, der die Verbindung »F-1028« liefert, aus Erdboden isoliert, und er wurde als Streptomyces kagawaensis bezeichnet.

Streptomyces kagawaensis nov. sp. (FERM-P Nr. 953: ATCC 21 811) ist durch die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften charakterisiert:

I. Morphologische Eigenschaften

Nach mikroskopischen Untersuchungen ist das Luft-Mycelium auf einem synthetischen Agarmedium und einem Protamin- bzw. Proteinagarmedium unregelmäßig verzweigt. Die Sporangienträger (Sporangiophere) bilden geschlossene Spiralen mit kleinen Windungen. Die Spore ist eine Ellipse in einer Größe von 0,7 · 0,9 u und besitzt eine stachelige bzw. dornentragende Oberfläche.

II. Züchtungseigenschaften auf verschiedenen
Nährböden

I. Saccharose-Nitrat-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, schwachgelblichbraun bis hell schwachgelb.

Aerobes Mycelium: pulverartig, im Überfluß, gräulichbraun.

Anaerob: gelb.

Lösliches Pigment: schwachbraun.

2. Glucose-Asparagin-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, schwachgelb bis schwachgelblichbraun.

Aerobes Mycelium: pulverartig, im Überfluß, schwachrosa bis bräunlichweiß.

Anaerob: gelblichbraun.

Lösliches Pigment: schwachgelb.

3. Glycerin-Asparagin-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, gelblichbraun, das vegetative Mycelum tritt in das Medium ein.
Aerobes Mycelium: weiß bis rosaweiß.
Anaerob: braun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

4. Stürke-anorganisches-Salz-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, schwachgelb.
Aerobes Mycelium: pulverartig, bräunlichweiß bis schwachbraun.
Anaerob: gelblichbraun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

5. Thyrosin-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: hellgelblichbraun bis dunkelbraun.
Aerobes Mycelium: weiß bis bräunlichweiß.
Anaerob: braun bis dunkelbraun.
Lösliches Pigment: schwarz.

6. Nähragarmedium (bei 27 C)

Wachstum: hellgelblichbraun.
Aerobes Mycelium: keines.
Anaerob: braun.
Lösliches Pigment, gelblichbraun.

7. Hefe-Malz-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gut, gelblichbraun, vegetatives Mycelium tritt ins Medium ein.

Aerobes Mycelium: baumwollartig, weiß bis schwachrosa.
Anaerob: braun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

8. Weizenmehl-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum, gut, gelblichbraun, vegetatives Mycelium tritt ins Medium ein.
Aerobes Mycelium: pulverartig,reichlich, hellbraun. Anaerob: braun.
Lösliches Pigment: gelblichbraun.

9. Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: glänzendgelblichweiß.
Aerobes Mycelium: keines.
Anaerob: graubraun.

Lösliches Pigment: dunkelbraun.

K). Loeffler-koaguliertes-Serum-Agarmedium
(bei 27' C)

Wachstum: glänzendbraun.

Aerobes Mycelium: knapp, farblos.
Lösliches Pigment: braun, kein Schmelzen, keine Verflüssigung.

11. Ei-Agarmedium (bei 27 C)

Wachstum: gebördelt bzw. gefaltet, gelblichbraun bis dunkelbraun.

Aerobes Mycelium: weiß bis Irübeweiß.

Anaerob: bräunlichbraun.

Lösliches Pigment: dunkelgelbbraun, kein Schmelzen.

12. Kartoffelstück (bei 27 C)

Wachstum; dick, erhaben, glanzendgelblichbraun. Aerobes Mycelium: schwach, weiß.

Lösliches Pigment: gelblichbraun bis dunkelbraun.

13. Karottenstück

Wachstum: dick, erhaben, glanzendgelblichbraun. Aerobes Mycelium: baumwollartig, weiß.
Lösliches Pigment: schwach, schwachgelblichbraun.

14. Glucose-Pepton-Gelatinemedium (bei 27 C)

Wachstum: gefaltet, schwachgraubraun.
Aerobes Mycelium: schwachgrau-farblos.
Lösliches Pigment: braun.

15. Magermilchmedium (bei 27 C)

Wachstum: Ring oder Membrane, schwachgelblichbraun.

Aerobes Mycelium: schwach, farblos.
Lösliches Pigment: schwachgelblichbraun.

I. Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Bedingungen zum Wachstum:
Temperatur: zwischen 25 bis 30 C.

pH: zwischen 6 und 8.
Aerobe Bedingungen.

2. Bedingungen, bei denen Wachstum auftritt:
Temperatur: zwischen 15 und 38 C.

pH: zwischen 4 und 9.

3. Bildung von Melamin: positiv.

4. Reduktion von Salpetersäure: schwach.

5. Milchkoagulation: schwach.

6. Milchpeptonisierung: mäßig.

7. Gelatineverflüssigung: schwach.

8. Zersetzung von Stärke: positiv.

9. Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv.
10. Lösung von koaguliertem Serum: negativ.

IV Assimilation von Kohlensloffqucllen

Die Assimilation von Kohlenstoffquellen wurde gemäß dem DG. Pridham-et-al.-Verfahren untersucht.

Gute Assimilation: Arabinose, Glucose, Galactose, Glycerin, Lävulose, Mannose, Maltose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, Inosit, Mannit.

Mäßige Assimilation: Lactose, Xylose.

Geringe Assimilation: Raffinose, Rhamnose, Salicin, Inulin, Sorbinol (Sorbit).

Keine Assimilation. Melezitosc, Sorbose, Adonit, Dulat.

Entsprechend diesen mikrobiologischen Eigenschaften nimmt man an, daßder»F-IO28«-Verbindung liefernde Stamm, der mit schwachrosa oder gräulichbraunem aerobem Mycelium wächst und der ein braunes oder gelblichbraunes lösliches Pigment auf einem Protein-Agarmedium liefert, zu den Streptomycen, insbesondere zu Streptomyces lavendulae gehört.

Unter bekannten Species von Streptomyces, die diese charakteristischen Eigenschaften besitzen, sind Streptomyces lavendulae, Streplomyces venezuclae und Streptomyces verginiae, die in Bergeys Mannual of Determinative Bacteriology, l'^h Edition, beschrieben werden, und die Actimomyceten von W a k s m a n. Vol. 2, ähnlich dem erfindungsgemäßen Stamm.

Jedoch sind die Sporenoberflächen dieser drei Stämme glatt, und im Gegensatz hierzu ist die des »F-IO28«-Verbindung liefernden Stamms stachelig. Ein Vergleich der kulturellen Eigenschaften zwischen dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm und diesen drei Stämmen zeigt, daß die drei Stämme kein lösliches Pigment ergeben, daß aber der »F-IO28«- Verbindung liefernde Stamm gelblichbraunes lösliches Pigment auf einem Rohrzucker-Nilrat-Agarmedium liefert. Weiterhin zeigen bei der Assimilation von Kohlenstoffquellen jeder dieser drei Stämme geringe oder keine Assimilation bei Merbiose, Saccharose, Inosit und Mannit. Dagegen assimiliert der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm diese Saccharide gut.

Durch die Unterschiede in den morphologischen, Wachstums- und physiologischen Eigenschaften kann der Stamm, der »F-1028«-Verbindung liefert, eindeutig von Streptomyces lavendulae, Streptomyces venezuelae und Streptomyces verginiae unterschieden werden. Der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm wurde als Streptomyces-lavendulae-Gruppe im Hinblick auf die Wachstums- und physiologischen Eigenschaften klassifiziert. Er ist aber ein neuer Stamm und unterscheidet sich von den bekannten Mikroorganismen. Er wurde daher mit dem Namen.Streplomyces kagawaensis nov. sp. versehen, entsprechend den Unterschieden der Sporenoberflächenslruktur und der Saccharid-Assimilation und der Fähigkeit, die neue antibiolische »F-IO28«-Verbindung zu liefern

Das erfind ungsgemäße Verfahren zur Herstellung der pilzbcfallverhindernden antibiotisch.cn Verbindung »F-1028« ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streplomyces kauawacnsis nov. sp. (FERM-P Nr. 953: ATCC 21 811) auf einem Kulturmedium, das eine Kohlcnstoffqucllc. cine Stickstoffquelle und ein Mineral enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet und die »F-1028«-Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert, indem man an einem Adsorbens adsorbiert und dann eluieri.

ίο Ein wichtiges Merkmal des eriindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß man einen »F-1(^«-Verbindung liefernden Stamm, der zu Streplomyces kagawaensis gehört, kultiviert und die antibiolische »F-1028«-Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert.

Bei der vorliegenden Erfindung wird der » F-1028«- Verbindung liefernde Stamm in einem Kulturmedium, das Nährstoffe, die im allgemeinen bei Mikroorganismen verwendet werden, enthält, kultiviert. Als Nährmittelquelle können alle bekannten Nährmittel für Aclimycen verwendet werden, beispielsweise im Handel erhältliche Glucose, Stärke, Glycerin, Saccharose, Maltose, Dextrin, Melasse und Fette als Kohlensloffquellen (vgl. Tabelle 1).

Beispiele von Stickstoffquellen sind im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Peplon, Hefe, Maiswasser, gepulverte Baumwollsamcn. gepulverte Erdnüsse, N-Z-Amin. Casein, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat (vgl. Tabelle 2).

Beispiele von Mineralien (oder anorganischen Salzen) sind Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphat, Magnesiumsulfat. Gewünschlenfalls kann eine Spur von Metallsalzen vorhanden sein. Jede Verbindung dieser Nährstoffe kann verwendet werden, wenn sie von dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm assimiliert wird und bei der Herstellung der »F-1028«-Verbindung nützlich ist.

Herstellung von »F-I()28«-Verbindung in einem

Kulturmedium, das verschiedene Kohlenstoffquellen

enthält

In ein Reagenzglas (20 mm Durchmesser) gibt man 13 ml eines flüssigen Kulturmediums, das ein basisches Medium enthält, das 0,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,3% getrocknete Hefe, 0,5% Natriumchlorid und 0,3% Calciumcarbonat enthält und die Kohlenstoffquelle, wie sie in der folgenden Tabelle (Tabelle 1) beschrieben wird. Dann wird die Saat- bzw. Impfkultur des »F-1028«-Verbindung liefernden Stamms auf dem Kulturmedium inokuliert. Das inokulierte Reagenzglas wird unter Schütteln in einer hin und hei" gehenden Schüttelvorrichtung bei 27''C inkubiert. Die Bildung der »F-1028«-Verbindung ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle I

	KohlcnstofTquellc	2,0%
I.	Glucose	2,0%
2.	Glycerin	2,0%
3.	Stärke	1.0%
4.	Glucose	1,0%
	Stärke

2	pH	Tage	3	pH
7,4 7,4 7,6	F-I02K meg/ml	7,6 7,4 8,0
7,4	632 452 548	8,0
538

I--I02X mcg/ml

Fortsetzung

KohlcnsUiffquclk·

5. Glycerin 1.0%
Stärke

6. Maltose 2,0%

7. Dextrin 2,0%

8. Saccharose 2,0%

2	pll	lage	3	pll
7.6	I -I02X mcg ml	8,0
8,2 7.8 8.4	590	8,4 7,8 8,4
78 284 36

ι-i«:x

met! ml

210

32 420

Die Herstellung der »F-1028«-Verbindung in einem Kulturmedium, das verschiedene Stickstoffquellen

enthält

Zu einem basischen Medium, das 2,0% Glucose, 0,5% Natriumchlorid, 0,3% Calciumcarbonat enthält, fügt man die in der folgenden Tabelle angegebenen Stickstoffquellen. Das Kulturmedium wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, sterilisiert, mit der Impfkultur des »F-1028«-Verbindung liefernden Stamms inokuliert und bei 27 C geschüttelt. Die Herstellung der »F-1028«-Verbindung ist in der Tabelle 2 beschrieben.

Tabelle 2

	2 Tage	pH	F-1028	r	pH	Page
Stickstoflquellc		7,6	mcg/ml		7,8	F-1028
	7,8	632	7,8	mcg/ml
I. Pepton 1,0%	7,4	1212	7,8	420
2. Fleischextrakt 1,0%		580		358
3. gepulverte 3,0%	7,4		7,8	322
Sojabohnen	6,8	368	6,4
4. Maiswasser 2,0%		.....		174
5. getrocknete 1,0%				116
Hefe	7.6		7,8
6. Pepton 0,5%		322
Fleischextrakt 0,5%				342
getrocknete
Hefe

Das beste Kultur- bzw. Züchtungsverfahren ist eine flüssige Kultur, insbesondere eine untergetauchte Kultur (d. h. eine Fermentationsmethode, wie Kulturverfahren, bei denen geschüttelt wird; Kesselfermentation; Tankkulturverfahren usw.) mit Belüftung bei Temperaturen im Bereich, bei dem der »F-1028«-Verbindung liefernde Stamm züchtbar ist und wobei die »F-1028«-Verbindung gebildet wird, bevorzugt bei 25 bis 35 C. Die praktische Kultur wird bei etwa 27 C durchgeführt und weitergeführt, bis sich ausreichend »F-1028«-Verbindung akkumuliert hat. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen 6 bis 9, vorzugsweise 6,2 bis 8,5, besonders bevorzugt 6,5 bis 8.

Die Konzentration an »F-1028«-Verbindung in dem Kulturmedium erreicht ein Maximum innerhalb 2 bis 5 Tagen, sowohl bei dem Kulturverfahren, bei dem geschüttelt wird, als auch bei dem Tankkulturverfahren. Da jedoch die Tage, die erforderlich sind, um die maximale Konzentration an »F-1028«-Verbindung zu erzielen, variieren können gemäß den Belüftungs- und Rührungsbedingimgen im gleichen Kulturmedium bei der gleichen Temperatur, ist es wünschenswert, den Gehalt an »F-1028«-Verbindung zu bestimmen. Wenn der maximale Gehalt erreicht ist, wird das Wachstum beendigt und die »F-1028«-Verbindung extrahiert. Um den Gehalt an »F-1028«-Verbindung zu bestimmen, wurde ein Verfahren verwendet, bei dem ein.Inhibitionszyklus bestimmt wird, wobei man Sclerotinia cjnerea (im folgenden als Sc bezeichnet) gemäßen bekannten Verfahren verwendete.

Das Verfahren wurde folgendermaßen durchgeführt:

I kg Kartoffeln und 15 1 Leitungswasser wurden

30 Minuten gekocht, und dann wurden die Kartoffeln durch ein Gazetuch abfiltriert. Man fügte dann zu dem Filtrat 5 I Wasser und dazu 2% im Handel erhältliche Saccharose, wobei man ein Kulturmedium für Sc erhielt. Zu diesem flüssigen Medium fügte man Agar in einer Menge von 1,5% und gab das Medium in ein Reagenzglas, wobei man ein eine schräge Fläche bildendes Kulturmedium herstellte. Sclerotinacinerea-Stämme wurden auf dem eine schräge Fläche bildenden Medium inokuliert und 4 bis 7 Tage bei 27 C inokuliert. Zwei oder drei Platinösen voll Sc-Stämme des eine schräge Fläche bildenden Kultur-

zj mediums wurden auf 100 ml Sc-Kulturmedium, das 0,3% Agar enthielt, in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert. Nachdem der Kolben 4 Tage bei 27 C geschüttelt worden war, wurde das Kulturmedium 2 Minuten bei 9000 rpm homogenisiert. Es wurde dann zum Impfen verwendet. Danach wurden 10 ml Sc flüssiges Medium, zu dem man I bis 1,2% Agar zugefügt hatte, in eine Petrischale gegeben, verfestigt und mit 4 ml des gleichen Agarmediums, das mit 10% kultiviertem Medium vermischt war, bedeckt. Das Plattenkulturmedium wurde in einem üblichen Schalenverfahren verwendet. Die Kultur wurde 2 Tage bei 27°C fortgeführt. Bei diesem Verfahren bildet eine 200-mcg/ml-Lösung der reinen »F-1028«-Verbindung eine Inhibitionszone mit einem Durchmesser von ungefähr 35 mm.

Die »F-1028«-Verbindung kann gemäß ihren im folgenden beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften extrahiert und gereinigt werden. Die »F-1028«-Verbindung wird in einer Kulturflüssigkeit gebildet. Die Mycelien werden durch Zentrifugier- oder Filtrationsverfahren mit Hilfsfilterstoffen, wie Kieselgur, im sauren oder neutralen Medium entfernt. Dann wird die »F-1028«-Verbindung an einem Kationenaustauscherharz, beispielsweise schwachsaures Kat ionenaustauscherharz vom Na⁺-Ty ρ oder schwachsaures Kat ionenaustauscherharz vom H⁺-Typ, adsorbiert, wobei man ansatzweise oder kontinuierlich, beispielsweise auf Säulen, arbeiten kann, und mit angesäuertem oder basisch gemachtem Wasser eluiert.

Die »F-1028«-Verbindung ist eine starke basische Verbindung, die an schwachsaurem Kationenaustauscherharz vom H ⁺-Ty ρ nicht wesentlich adsorbiert wird, die aber an Harzender Na⁺-An absorbiert wird. Beispielsweise kann man das Filtrat der Fermentationsmischung mit Oxalsäure behandeln und an schwachsaurem Kationenaustauscherharz vom Na ⁺ Typ adsorbieren und das Antibiotikum schnell mit 1 n-HCI eluieren. Verwendet man aktivierten Kohlenstoff, so kann die »F-I028«-Verbindung an dem

Kohlenstoff adsorbiert und mit wäßrigem Aceton und wäßrigem Methanol eluiert werden, jedoch nicht vollständig.
Nachdem das Eluat, das die »F-1028«-Verbindung

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enthält, unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann das Konzentrat gewünschtenfalls mit Methanol, Äthanol entsalzt werden. Man kann dann eine überschüssige Menge an Methanol, Äthanol und Aceton zufügen, wobei die »F-1028«-Verbindung in Form eines Pulvers ausfällt. Das Eluat von dem Harz zersetzt sich leicht und verfärbt sieh braun, wenn man direkt unter vermindertem Druck trocknet. Es ist daher erforderlich, die »F-1028«-Verbindung schnell zu behandeln, da ihre Aktivität schlechter wird und sie sich gelb verfärbt, wenn sie längere Zeit steht. Die Mischung, die die »F-1028«-Verbindung enthält, zersetzt sich unter Braunfärbung durch Ausfällen mit Methanol, Äthanol und Aceton und Trocknen. Jedoch ist die »F-1028«-Verbindung sehr stabil in Form einer wäßrigen Lösung. Das Rohpulver, das man erhält, kann durch solche Verfahren wie Chromatographie an Kohlenstoff oder Dextran-Gel gereinigt werden, wobei man ein farbloses Pulver erhält.

Das Eluat wird als Hydrochlorid dann durch eine Säule von schwachbasischem Anionenaustauscherharz geleitet, wobei es in die freie Form überführt wird und danach in das Sulfat, indem man mit Schwefelsäure eluiert. Wenn die Menge an schwachbasischem Anionenaustauscherharz nicht ausreicht und man die Eluate aus der Säule mit schwachbasischem Anionenaustauscherharz über eine Säule aus Dextran-Gel leitet, werden zwei Fraktionen aus der Dextran-Gel-Säure eluiert. Die erste Fraktion war das Sulfat der »F-1028«-Verbindung, und die zweite Fraktion war das Hydrochlorid. Die letztere Fraktion wurde erneut durch eine Säule von schwachbasischem Anionenaustauscherharz geleitet und mit Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wurde der Dextran-Gel-Säule unterworfen, wobei man ein Sulfat erhielt. Die gemäß den oben beschriebenen Verfahren isolierte und gereinigte »F-1028«-Verbindung besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.

1. Farblose nadelartige oder blättchenartige Kristalle.

2. Schmelzpunkt (Hydrochlorid), Zersetzung über 195 C.

■3. Elementaranalyse (als Hydrochlorid): gefunden: C 30,94, H 6,58, N 13,39, O 25,91, Cl 23,18%.

4. Summenformel: QH₁₇N₃O₄ (Molekulargewicht: 219, durch Elementaranalyse, Titration und NMR-Spektrum).

5. Äquivalent: 122,5 (durch Titration).

6. Spezifische Drehung (Hydrochlorid) f_a]S*= 63.2 (C=I₁H₂O)

7. 7. PKa': 7,02 und 8,16.

8. Ultraviolettes Absorptionsspektrum: keine besondere Absorption, wie es in F i g. I dargestellt ist.

9. IR-Spektrum: wie in F i g. 2 dargestellt ist.

10. Rf-Wert: Wurde Dünnschichtchromatographie an Silicalgel mit einem Entwicklungsmittel durchgeführt, das Butanol, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 3:1:2 enthielt, so zeigte die Verbindung einen Rf-Wert von 0,25. Verwendete man als Lösungsmittel n-Propanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15: !0: 3 : 12, so betrug der Rf-Wert 0,68.

11. Löslichkeit: leicht löslich in Wasser; löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; wenig löslich in Äthanol: unlöslich in Chloroform, Benzol und Äther.

12. Farbreaktion:

positiv: Ninhydrin-, Ehrlich-, Elson-Morgan-, Tollens- und Benedict-Reaktionen negativ: Molisch-, Sakaguchi-, Maltol- und Eisend I I )-chlorid-Reak tionen.

13. Sie behält ihre Aktivität in saurer Lösung. Die Aktivität wird jedoch vermindert, wenn die Lösung in neutralen oder alkalischen Zustand überführt wird.

Biologische Eigenschaften der »F-1028«-Verbindung I. Antimikrobiell Aktivität

Die minimale Inhibitorkonzentration (MIC) der »F-1028«-Verbindung für verschiedene Mikroorganismen wurde untersucht gemäß dem Agar-Verdünnungsverfahren, und die Ergebnisse sind in Tabelle angegeben.

Tabelle

Mikroorganismen

Staphylococcus aureus FDA 209 ρ

Sarcina lutea PCI KX)I

Bacillus subtilis PCI 219 ...

Mycobacterium ATCC 607 . Escherichia coli NIHJ

Vibrio comma 904

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae ... Holmodendrum pedrosei ...

Trichophyton rubrum

Ophiobolus miyabianus ....

Aspergillus niger

Xanthomonas oryzae

Xynthomonas citri

Alternaria japonica

Alternaria kikuchiana

Sclerothinia cinerea

Sclerotinia sclerotiorum ....

Botorytis fabae

Botorytis cinerea

Toxizität

i) Keine Abnormalitäten.

Mäuse (intravenöse Injektion).... 125 mg/kg (orale Verabreichung)..... 500mg/kg Junge Karpfen: keine negativen Beobachtungen mit 250 ppm,

ii) Mäuse (intravenöse Injektion) LD₅₀ 160 mg/kg (orale Verabreichung) LD₅₀ 750 mg/kg

24 Stunden	48 Stunden	>	ncg ml
mcg/ml	t		K)O
>!()()	>	3,12
3,12	>	KK)
>H)0	>	KK)
>100		100
100	72	KK)
12,5	>	Stunden
4X Stunden	>	K)O
> 100		100
>IOO	>	25
25		100
100		25
25		KK)
> 100		100
50		100
> 100	>	50
50		100
>IOO		25
12,5		3.12
1.56		25
6,25	12,5
6.25

Die »F-IO28«-Verbindung besitzt somit eine sehr niedrige Toxizität. Da diese physiologischen, chemischen und biologischen Eigenschaften der »F-1028«- Verbindung nicht denen bekannter zahlreicher Antibiotika entsprechen, zeigt sich auch hier, daß die antibiotische »F-IO28«-Verbindung eine neue anlibiotische Verbindung ist.

Die erfindungsgemäße »F-1028«-Verbindung kann wirksam bei Pathogenen angewendet werden, die

auf den Pflanzenteileii. die über dem Boden sind, leben, Pathogenen. die in die Pflanzen durch den Boden eindringen und Tracheomycos verursachen und bei Paihogenen, die die Samen infizieren und bei Pathogenen, die den Boden infizieren.

Wie zuvor erwähnt, hat die erfmdungsgemäße »F-I()28«-Verbindung überlegene Kontrollwirkungcn gegen Palhogene, die Reis, Pflanzen und andere erntetragende Pflanzen befallen, und sie hat eine gute Verträglichkeit mit höheren Pflanzen. In gewöhnlichen Dosen trilt gegenüber erntetragenden Pflanzen keine Phytotoxizität auf, und gegenüber Haustieren und Fischen zeigt die erfindungsgemäße Verbindung kaum toxische Wirkungen. Die Verbindung kann daher gegen Pflanzenpathogene als landwirtschaftliches und gartenbauliches Fungicid sehr zweckdienlich verwendet werden, und sie ist praktisch sehr wertvoll, um die landwirtschaftliche Produktivität zu erhöhen.

Bei der Anwendung der erfindungsgemäßen »F-H)28«-Verbindung als landwirtschaftliches und gartenbauliches Fungicid kann die erfindungsgemäße Verbindung nach der Verdünnung mit Wasser oder in verschiedenen Formulierungen, hergestellt gemäß bekannten Verfahren, wie sie bei der Herstellung von landwirtschaftlichen Chemikalien üblich sind, wobei man landwirtschaftliche chemische Hilfsmittel verwenden kann, eingesetzt werden. Diese verschiedenen Formulierungen können als solche oder nach Verdünnung mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen angewendet werden.

In der vorliegenden Anmeldung werden als landwirtschaftliche und gartenbauliche Hilfsmittel beispielsweise inerte Lösungsmittel und/oder Verdünnungsmittel (Streckmittel oder Trägerstoffe) (diese werden verwendet, um den aktiven Bestandteil zu den pathogenen Fungi und/oder dem Ort des Vorkommens der pathogenen Fungi zu transportieren) verstanden. Verschiedene oberflächenaktive Mittel und/oder organische Materialien, wie Stabilisatoren, Verteilungsmittel (Festhaltemittel [stickers]). Treibmittel für Aerosole oder synergistische Mittel (diese werden verwendet, um die Wirkung der aktiven Verbindung in stärkerem Maße zu ermöglichen, aufrechtzuerhalten oder zu aktivieren) können ebenfalls mit in den Formulierungen enthalten sein.

Beispiele von Lösungsmitteln umfassen Wasser und organische Lösungsmittel, beispielsweise aliphatische oder alicyclische Kohlenwasserstoffe, wie η-Hexan, industrielle bzw. technische Gasoline (Petroläther. Lösungsnaphtha usw.), Petroleumfraktionen (Paraffinwachs, Kerosin, leichtes öl, Mittelöl, Schweröl usw.), aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylole oder aromatisches Naphtha, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chlormethylen, Chloräthylen, Kohlenstofftetrachlorid, Trichloräthylen, Äthylendibromid oder Chlorbenzol, Alkohole, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol oder Äthylenglykol, Äther, wie Äthyläther, Äthylenoxyd oder Dioxan, Alkoholäther, wie Äthylenglykol oder Monomethylälher, Ketone, wie Aceton und Isophoron, Ester, wie Äthylacetat oder Amylacetat, Amide, wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid und SuIfoxyde, wie Dimethylsulfoxyd.

Beispiele von Verdünnungsmitteln (Streckmittel oder Trägerstoffe) umfassen pflanzliche Pulver, Mineralpulver, Tonmineralien, wie Kaolinite, Montmorillonitc oder Attapulgitc. Talk. Pyrophyllitc. Glimmer.

Gips, Calcit, Muscovit, Vermiculit, Dolomit, Apatit, Löschkalk, Magnesiumkalk, Kieselgar, anorganische Salze, wie Calciumcarbonate Schwefel, Bimsstein, synthetische Mineralpulver, wie hochdispergierte Kie?

seisäure oder synthetisches Aluminiumoxyd, syn» thelische Harze, wie Phenolharze, Harnstoffharze oder Phenylchloridharze.

Beispiele von oberflächenaktiven Mitteln umfassen anionische oberflächenaktive Mittel, wie Alkylschwe^

ίο felsäurcesteribeispiel.sweiseNatriurnlaurylsulfaO.Arylsulfonsäuren (beispielsweise Alkylarylsulfonsäuresalze oder Natriumalkylnaphthalinsulfonat), kationische oberflächenaktive Mittel, wie Alkylamine (beispielsweise Laurylamin. Slearyltrimethylammoniumchlorid oder Alkyldimethylbenzylammoniumchloride), oder Polyoxyäthylcnalkylamine, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyäthylenglykoläther (beispielsweise Polyoxyäthylenalkylaryläther oder PoIyoxyäthylenalkylphenylälher), mehrwertige Alkohol· ester (beispielsweise Polyoxyäthylensorbilmonolaural) oder Polyoxyäthylenglykolester (beispielsweise PoIyoxyäthylenfeUsäureestcr) und amphotere oberflächenaktive Mittel.
Als Beispiele von organischen Materialien können erwähnt werden Stabilisatoren, Verteilungsmittel (wie Festhaltemittel), wie landwirtschaftliche Seifen, Cumaron- oder Indenharz.e oder Polyvinylbutyläther, Treibmittel für Aerosole, wie halogenierte Kohlenwasserstoffe (Freon usw.), Verbrennungsmittel für Räuchermittel, wie Salze der salpetrigen Säure, Zinkpulver oder Dicyandiamid, Mittel, die Sauerstoff ergeben, wie Perchlorate oder Bichromate, Mittel, die die Phytotoxizität vermindern, wie Zinksulfat, Eisen(III)-chlorid oder Kupfernitrat, Mittel, die die Wirkung verlängern, wie chloriertes Terphenyl, Dispersionsstabilisatoren, wie Casein, Tragacanth, Carboxymethylcellulose oder Polyvinylalkohol.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann in verschiedenen Formulierungen verarbeitet werden, gemaß Verfahren, die im allgemeinen auf dem Gebiet der Herstellung von landwirtschaftlichen Chemikalien verwendet werden.

Beispiele von Formulierungen sind flüssige Präparationen, wie emulgierbare Konzentrate, benetzbare Pulver, Tabletten, lösliche Pulver oder Lösungen, Staube, Granulate, Räuchermittel oder Aerosole.

Das erfindungsgemäße Fungicid kann den obigen aktiven Bestandteil in einer Menge von 0,1 bis 95 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,5 bis 90 Gewichtsprozent enthalten.

Bei der tatsächlichen Anwendung liegt die geeignete Menge an aktivem Bestandteil, der in den obenerwähnten verschiedenen Formulierungen oder in den fertigen Präparationen vorhanden ist. im allgemeinen im Bereich von 0,0001 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise im Bereich von 0,005 bis 10 Gewichtsprozent.

Der Gehalt des aktiven Bestandteils kann entsprechend den Formulierungen, den Verfahren, dem Zweck, der Zeit und dem Ort der Anwendung und dem Zustand der Infektion usw. in geeigneter Weise gewechselt werden.

Verschiedene Formulierungen oder fertige, d. h. sofort zu verwendende Präparationen, die den erfindungsgemäßen aktiven Bestandteil, wie oben beschrieben, enthalten, können gemäß Verfahren, die üblicherweise auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen Chemikalien verwendet werden, eingesetzt werden.

wie Versprühen (beispielsweise ein Versprühen von flüssigen Präparationen, Vernebeln. Atomisieren, Versprühen, von Staub, Versprühen von Granulaten, Anwendung auf Wasseroberflächen oder Verstreuen), durch Vernebeln, Anwendung auf den Boden (bei- s spielsweise durch Versprühen, Verdampfen oder Vergießen), Anwendung auf die Oberfläche des Bodens (beispielsweise überziehen. Verteilen [banding], Verteilen von Staub oder Bedecken) oder durch Imprägnieren. Sie können ebenfalls durch das Ultra-niedrig-Volumensprühverfahren verteilt werden. Bei diesen Verfahren kann der aktive Bestandteil in einer Menge bis zu 95% oder selbst 100% vorhanden sein.

Die Menge, die pro Flächeneinheit an erfindungsgemäßem Fungicid aufgebracht wird, beträgt ungefähr 3 bis 1000 g, vorzugsweise 30 bis 600 g, pro 10 Ar, berechnet als aktive Verbindung. In speziellen Fällen kann die Menge jedoch entweder über oder unterhalb dieses Bereichs liegen und manchmal, wenn erforderlieh, kann sie von diesem Bereich abweichen.

Gegenstand der Erfindung ist eine fungicide Zusammensetzung, die die Verbindung der Formel I als aktiven Bestandteil und/oder ein Lösungsmittel und/oder ein Verdünnungsmittel (Streckmittel oder Trägerstoff) und/oder ein oberflächenaktives Mittel.

Die Erfindung betrifft somit fungicide Mittel, enthaltend die pilzbefallverhindernde antibiotische Verbindung »F-1028« als Wirkstoff; dieser ist vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 95 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, vorhanden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

In F i g. 1 ist das UV-Spektrum einer wäßrigen Lösung des Hydrochlorids der erfindungsgemäßen antibiotischen »F-1028«-Verbindung dargestellt.

In F i g. 2 ist das IR-Spektrum des Hydrochlorids der »F-1028«-Verbindung vermischt mit Kaliumbromid dargestellt.

Beispiel I

40

Ein Kulturmedium, das 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid,0.3% Hefeextrakt, 2% Glucose. 0,5% Pepton und Calciumcarbonat enthielt, wurde mit einer öse voll Mycelium von Streptomyces kagawaensis, dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm, inokuliert. Nachdem das inokulierte Medium unter Schütteln 2 Tage gezüchtet worden war, wurde es in einen IOO-1-Fermentationstank mit 75 1 des gleichen Kulturmediums gegeben. Dieses inokulierte Medium wurde bei 27°C mit Belüftung von IO l/Min., Rühren von 250 rpm und einem inneren Druck von 0,5 kg/cm² während 2 Tagen inkubiert. Es hatten sich dann 400 mcg/ml in der Lösung »F-l028«-Substanz gebildet. 70 1 des gezüchteten Mediums wurden mit gesättigter Oxalsäurelösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit einer Konzentration von Celit von 0,5% filtriert. Das Filtrat wurde dann mit 2n-NaOH auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und zusammen mit 2,8 I schwach saurem Kationenaustauscherharz vom Na⁺-Typ während 30 Minuten gerührt. Danach wurden die Harze durch Filtration abgetrennt und das Filtrat erneut auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und mit 1,4 1 schwach saurem Kationenaustauscherharz vom Na⁺-Typ vermischt, gerührt und filtriert. Die gesammelten Harze wurden vereinigt Nach zwei solchen Behandlungen waren 95% der »F-1028«-Verbindung im Filtrat von dem Harz adsorbiert. Danach wurde das Harz, das die »F-l028«-Substanz adsorbiert enthielt, ausreichend mit Wasser gewaschen und in eine Säule gefüllt. Die »F-l028«-Verbindung wurde mit 1 n-HCI eluiert, und ungefähr 5 I des Eluats, das die aktive Verbindung enthielt, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf H)OmI konzentriert. Nach Abfiltrieren des Natriumchlorids, das sich bei dieser Stufe gebildet hatte, wurde zu der Lösung die dreifache Menge an Methanol zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter kalten Bedingungen aufbewahrt. Es bildete sich weiteres Natriumchlorid, das abfiltriert wurde, und dann wurde die zehnfache Menge an Aceton zugefügt. Es bildete sich ein Niederschlag an »F-IO28«- Verbindung, dieser wurde abfiltriert. Man erhielt 95 g der »F-1028«-Verbindung als rohes Pulver (Ausbeute: 60 bis 70%), nachdem man den Niederschlag getrocknet hatte.

Beispiel 2

125 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 3% Sojabohnenmehl, 0,5% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat enthielt, wurden in einen 500-ml-Sakaguchikolben gegeben, sterilisiert und mit 2 ml vorgezogenem Medium von Streptomyces kagawaensis, dem »F-1028«-Verbindung liefernden Stamm, inokuliert. Der Kolben wurde dann bei 27 C unter Rühren mit 120 rpm und mit einer 8 cm Amplitude inkubiert. Nach 48 Stunden betrug die Konzentration an »F-1028«-Verbindung 580 meg ml. Die Lösung wurde gesammelt, und die aktive Verbindung wurde gemäß den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel I beschrieben sind, extrahiert, wobei man das rohe Pulver erhielt.

Beispiel 3

6 g der rohen gepulverten »F-1028«-Verbindung, die man im Beispiel I erhalten hatte, wurden in 10 ml Wasser gelöst und an einer Säule, die mit 60 g aktiviertem Kohlenstoff für die Chromatographie gefüllt war (hergestellt von Wako Seiyaku Co., Ldt.) adsorbiert und mit Wasser entwickelt. Die »F-1028«-Verbindung wurde als farblose, wäßrige Lösung (Ausbeute: 91,5%) eluiert. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und mit der 20fachen Menge Äthanol vermischt. Der Niederschlag wurde getrocknet, wobei man 4 g der rohen »F-1028«-Verbindung als Pulver erhielt. Nacheinander wurden 2 g des Pulvers in 4 ml Wasser gelöst, in eine Dextran-Gel-Säule (2,5· 150 cm) gegeben und mit Wasser entwickelt. Die aktive Fraktion wurde im Vakuum konzentriert, wobei man 1,25 g farbloses Pulver erhielt. Eine Methanollösung des farblosen Pulvers wurde stehengelassen, wobei Kristalle ausfielen. 170 mg blättchenartige oder nadelartige Kristalle der »F-l028«-Verbindung wurden als Hydrochlorid erhalten.

B e i s ρ i e I 4

Eine wäßrige Lösung des Hydrochlorids der »F-1028«-Verbindung, eluiert aus einer Säule mit aktiviertem Kohlenstoff gemäß dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, wurde durch eine Säule gegeben, die mit schwachbasischem Anionenaustauscherharz in der OH "-Form gefüllt war. Die Lösung, die aus der Säule abfloß, wurde mit Schwefelsäure neutralisiert, konzentriert und mit der lOfachen Menge Äthanol oder Aceton vermischt. Man erhielt ein Sulfat der »F-1028«-Verbindung als Pulver. Das Pulver wurde dann auf eine Dextran-Gel-Säule gegeben und in zwei Fraktionen geteilt. Die erstere

Fraktion war das Sulfat, und die letztere Fraktion war das Hydrochlorid. Die letztere Fraktion wurde erneut über eine Dextran-Gel-Säule gegeben, wobei man das Sulfat erhielt. Eine wäßrige Lösung des Sulfats wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man ein farbloses Pulver erhielt.

Die ausgezeichneten Eigenschaften und die besondere Wirkung der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung als landwirtschaftliches und gartenbauwirtschaftliches Fungicid ist aus den Ergebnissen der folgenden Untersuchungen erkennbar, wobei es in diesen Versuchen gegen verschiedene pathogene Pilze verwendet wurde.

Beispiel S

Versuche an Sclerotinia-Fäule von Bohnen und grauem Schimmel an Gemüsen (Vorbeugungsversuch):

Das Hydrochlorid der »F-1028«-Verbindung in einer vorgegebenen Konzentration wurde auf Bohnen versprüht (Art: Taisho Kintoki), und zwar im Zustand, in dem die Pflanzen zwei bis drei Blätter hatten und in einer Menge von 15 ecm pro Topf. Einen Tag nach dem Versprühen wurden die Blätter abgeschnitten,

und die Hyphen liefernden Teile eines grauen Schimmelpilzes und eines Sclerotinia-Fäulepilzes, die zuvor in einem PDA-Plattenkulturmedium gezogen worden waren, wurden in einer Größe mit einem Durchmesser von 7 mm und einer Dicke von 2 mm ausgestampft,

ίο und damit wurden die Blätter inokuliert. Die inokulierten Blätter wurden in ein Gefäß mit konstanter Temperatur (20'C, Feuchtigkeit mehr als 98%) gcgeben,und nachdem 3 Tage vergangen waren, wurden die Durchmesser der vergrößerten Krankheitsflecken bestimmt. Dann wurde das Inhibitationsverhäftnis bei den Krankheitsflecken berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.

Das Inhibitationsverhältnis der Krankheitsflecken wurde folgendermaßen bestimmt:

Krankheitsfleckeninhibitationsverhältnis (%)

Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blattes - Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des behandelten Blattes Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blattes

Tabelle 4

	Konzentration an aktivem Bestandteil	Grauer Schimmelpilz	Inhibitations- verhaltnis	Sclerotinia-Faulepilz	Inhibilions- verhallnis
Verbindung	50 ppm	Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle	67	Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle	100
F-1028-Verbindung	25 ppm	10	23	0	71
Hydrochlorid	ursprüngliche	23	63	10	100
F-1028-Verbindung	Flüssigkeit 8 χ	Il	40	0	100
Kulturflüssigkeit	χ 1000	18		0
Allisan (50%)*) (im Handel	(500 ppm)		67		91
erhältlich, Vergleich)	χ 1000	10		3
Polyoxyn**) (5%) (im Han	(50 ppm)		37		57
del erhältlich, Vergleich)		19	0	20	0
Nicht behandelt	30	35

*) Allisan: 2.6-Dichlor-4-nitroanilin.

*) Antibiotische Substanz, hergestellt durch Streptomyces cacaoi var. asoensis.

Beispiel 6

Versuch an grauem Schimmel und Sclerotinia-Fäule von Bohnen (Heilungsversuch)

Bohnenblätter (Art: Taisho Kintoki) wurden abgeschnitten und grauer Schimmelpilz und Sclerotinia-Faulepilz, die in einem PDA-Plattenkulturmedium gezogen worden waren und in einer Größe mit einem Durchmesser von 7 mm und einer Dicke von 2 mm ausgestanzt worden waren, wurden auf den Blättern inokuliert. Die inokulierten Blätter wurden 24 Stunden in einer feuchten Kammer bei 20⁰C gegeben. Die Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stellen wurden bestimmt.

Die » F-1028«-Verbindung, die auf eine vorgegebene Konzentration verdünnt war, wurde auf die Blätter in einer Menge versprüht, so daß sie von den Blättern abtropfte. Die Blätter wurden in Luft getrocknet und erneut in eine Kammer mit konstanter Temperatur bei 20 C gegeben. Nachdem 48 Stunden vergangen waren, wurden die Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stellen gemessen. Der Grad des Fortschreitens der Krankheit an den verschiedenen Stellen, verglichen mit den vor dem Versprühen mit den Chemikalien befallenen Stellen, wurde bestimmt und so ausgedrückt als Inhibitationsverhältnis der mit Krankheit befallenen Stellen:

Inhibitationsverhältnis der mit
Krankheit
befallenen Stellen

((Ic₂-(Jc₁)-

de 2 — dc_{

de,: Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blatts vor der Anwendung

der Chemikalien.

dc₂ : Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle des nicht behandelten Blatts nach der Anwendung der Chemikalien.
dt,: Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle

vor der Anwendung der Chemikalien.
dt₂ : Durchmesser der mit Krankheit befallenen Stelle nach der Anwendung der Chemikalien.

409584/342

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt:

Tabelle 5 A. Testergebnisse beim grauen Schimmel

	100 ppm	Durchmesser	Durchmesser	Inhibitutions-
	50	der mit Krankheil	der mit Krankheit	verhällnis der
Verbindung	25	befallenen Stelle	befallenen Stelle	mit Krankheil
	χ 1000 (500 ppm)	vor dem Versprühen	nach dem Versprühen	befallenen Stellen
		(mm)	(mm)	(%)
F-1028-Verbindung	χ 1000 (200 ppm)	14,0	16,3	81
		14,0	17,0	75
		14,0	19.3	59
Allisan (50%) (technisch im	12,6	18,0	43
Handel erhältlich, Vergleich)
Sclex*) (20%) (technisch im	14,0	17,7	61
Handel erhältlich, Vergleich)
Nicht behandelt '.»	11,0	23,3	0

*) Sclex: 3-(3,5-Dich)orphenyl)-5,5-dimelhyl-oxazolidindk>n-2,4.

Tabelle 5 (Fortsetzung) B. Testergebnisse bei Sclerotiniafäule

Verbindung

F-1028-Verbindung

Allisan (50%) (technisch im
Handel erhältlich, Vergleich)

Nicht behandelt

Konzentralion an aktivem Bestandteil

100 ppm 50 χ 1000 (500 ppm)

Durchmesser

der mit Krankheil

befallenen Stelle

vor dem Versprühen

(mm)

11,3
11,3
13,6

12,0

Durchmesser

der mit Krankheit

befallenen Stelle

vor dem Versprühen

(mm)

16,3
19,6
26,6

Inhibilionsverhällnis der mit Krankheit befallenen Stellen

76 62 62

Beispiel 7

Versuch an brauner Fäule (Sclerotinia cineria) bei Pfirsichen (Feldversuch)

Eine wäßrige Lösung der »F-1028«-Verbindung

mit einer gleichen Konzentration wurde zweimal bei 45 Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6 Testversuche bei brauner Fäule

einem Zwischenraum von 7 Tagen auf Pfirsichbäume 4«> aufgesprüht (Art: Kurakata frühreifend, im 5. Jahr Wachstum). Sowohl die Infektion beim Ernten als auch die Infektion von den gepackten Früchten in einem Pappkarton bei Lagerung bei Zimmertemperatur wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden

	Konzen tration beim	Infektion	Infektion,
Verbindung der	Sprühen	beim Ernten	nachdem man 7 Tage
verwendeten Probe			verpackt gelagert
	50 ppm	0	hatte
F-1028-Verbin			0
dung	χ 1000	0,3
Benlat (50%) (im			46,1
Handel erhält
lich, Vergleich)	X1500	0,03
Sclex (20%) (im			7,7
Handel erhält
lich. Vergleich)	—	38,5
Nicht behandelte			61,6
Probe

Bemerkung:

Benlat = Methyl-l-(butyl-carbamoyl)-2-bcnzimidazolcarbamat. Sclex = 3-(3,5-Dichlorphcnyl)-5,5-dimclhyl-oxazolidindion-2,4.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Pilzbefallverhindernde antibiolische Verbindung »F-IO28« der Formel

HCOH
HCNH₂
HOCH
Ch₁CHCONHCH