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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 29. April 1955 Bekanntgemacht am 19. Januar 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit antibiotischer Wirksamkeit. Das neue Produkt, das hier mit D-52 bezeichnet wird, erhält man durch Fermentation, Gewinnung und Konzentration aus Rohlösungen einschließlich der Fermentationsmassen und Reinigung.

Das neue Antibioticum ist gegen Bakterien, insbesondere gegen grampositive Bakterien wirksam, desgleichen seine Salze mit Säuren.

Es wurde gefunden, daß man durch Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen Art von Mikroorganismen, die aus einer in Utah entnommenen Bodenprobe stammt, Streptomyces caelestis, unter kontrollierten Bedingungen und auf geeigneten Kulturmedien ein neues Produkt, das Antibioticum D-52, erhalten kann. Der vorgeschlagene Name des neuen Mikroorganismus Streptomyces caelestis charakterisiert die himmelblaue Farbe (nach Ridgway, »Color Standards and Nomenclature«) seiner Conidien, wenn man denselben aus den verschiedensten unter erwähnten Medien kultiviert. Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus wurde bei der Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und wurde der permanenten Sammlung unter der Bezeichnung NRRL 2418 einverleibt.

Eine sorgfältige Unternehmung der Morphologie und Physiologie von S. caelestis zeigt, daß er deutlich verschieden ist von irgendwelchen früher in Bergey,

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»Manual of Determinative Bacteriology« 6. Auflage, S. 929 bis 977, und Waksman und Lechevalier, »Actinomycetes and their Antibiotics«, beschriebenen Streptomycesarten. Die Beschreibung erfolgt nachstehend in Form einer Tabelle. Alle Beimpfungen

erfolgten mit einer Sporensuspension. Die Reagenzgläser enthielten die verschiedenen Kulturmedien, und
die Bebrütung erfolgte bei 24 bis 28° C. Die Bestimmungen erfolgten am vierten, siebenten und vierzehnten Tag.

Tabelle I Kultureigenschaften von S. caelestis

IU — Medium	Wachstum	Farbe des der Luft aus gesetzten Mediums und der Sporen	Lösliches Pigment	Bemerkungen
¹⁵ Reine Gelatine	gut	Blaugrau	Braun	Verflüssigung bis zur Tiefe des Pig ments
o,5°/o Trypton —0,3% 20 Hefeextraktbrühe	schwach	Blauweiß	Braun
Tryptonbrühe	schwach	Grauweiß	Braun
Czapeks sucrose Agar ....	gut	Blaugrau-weiß	Gelb
.Waksmans Stärkeagar ...	keines	keine	keine
d-Glucoseagar ..	ent	Blauerau-weiß	Gelbbraun
Nähragar	ziemlich gut	Schwachrosa-weiß	Braungelb braun
	gut	' keine	Gelbbraun
d-Glucosenährbrühe	ziemlich gut	schwach	keine
Lakmusmilch ...	schräggut	Gräulich bis Blauweiß	Braun	keine Peptonisa- tion oder Reduk tion
	gut	schwach, Weiß mit Blaustich	keine	Scheibe wird dunkel
Kartoffelboden 35	gut	schwach, Blauweiß	tiefes Gelb braun
Rübenschrägboden	gut	keine	keine	keine Reduktion des Mediums
Nitratnährbrühe ₄₀ 0,1% KNO₃	gut	keine	. keine
Waksmans Tyrosinagar ..	gut	schwach, Weiß I	tiefes Gelb braun
wäßrige i-Tyrosin (1%) .	gut	keine	Schwarzbraun
45 Nährbouillon...	gut	schwach, Lavendelweiß	Braun
	gut	schwach, Rosalavendelweiß	Braun	H₂S-dunkel- werden
Pepton-Eisenagar	gut .	Blauweiß	Gelbbraun bis Braun
₅o Dorsetts Eierschrägboden.
Loefflers Serumschrägboden-
Bennetts Agar

Die Nutzbarmachung von Kohlenstoffverbindungen durch S. caelestis in einem synthetischen Medium wird in Tabelle II gezeigt. Man arbeitete nach der Arbeitsweise von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 107 bis 114.(1948), mit folgenden Abänderungen:

1. Schüttelkolben wurden mit Sporen von S. caelestis
beimpft und bei 28⁰ auf einem hin- und hergehenden
Schüttelapparat bebrütet.

2. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende 125 abgegossen, die Kultur mit 100 cm³ sterilem destil-

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liertem Wasser gewaschen und das Überstehende wiederum abdekantiert. Dann setzt man ioo cm³ steriles destilliertes Wasser zu und bebrütet bei 28° auf einem hin- und hergehenden Schüttelapparat. 3. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende abdekantiert, wie oben gewaschen und in einem Waring-Mischer 1 Minute mit 100 cm³ sterilem destilliertem Wasser vermischt.

Tabelle II

Assimilation von Kohlenstoffverbindungen durch

S. caelestis im synthetischen Medium von Pridham

und Gottlieb

Medium	Er gebnis	Medium	Er gebnis
Blindversuch ....		lösliche Stärke	(+)
d-Xylose	+	Glycerin	+
i-Arabinose	-f-	Dulcit	(—)
Rhamnose	-f	d-Mannit	—
d-Fructose	-j-	d-Sorbit	(—)
d^-Galactose	-\|-	dl-Inosit	-f-
d-Glucose	-\|-	Na-Formiat	—
d-Mannose	-)-	Na-Oxalat	—
Maltose	I	Na-Tartrat
Sucrose	I	Na-Salicylat
Lactose	_j_	Na-Acetat
Cellobiose	_\|_	Na-Nitrat	(+)
Raffmose	-f	Na-Succinat	(+)
Dextrin ....	I
Inulin	(-)■

= positive Assimilierung
= negative Assimilierung
= positive Assimilierung, nur schwaches

Wachstum
(—) = schwaches Wachstum, keine Assimilierung.

In allen Fällen, wo Assimilierung stattfindet, war das Mycelium des S. caelestis durch eine pulverige blaugraue Farbe mit Spuren von Weiß gekennzeichnet.

Die Kultur des S. caelestis bildet lange fadenförmige Mycele, die sich üppig verzweigen. Die Conidien haben eine kugelige bis ovale Form und werden von locker gespiralten Sporophoren getragen, die sich aus dem Mycelium erheben. Kultiviert man S. caelestis auf Bennetts Agar, so hat das Mycelium eine blasse meergrüne Farbe. Ferner wird im Medium ein gelbbraunes Pigment entwickelt. Die Kolonien auf Bennetts Agar sind in der Mitte leicht erhoben mit glatten Rändern, die eine weiße Färbung aufweisen. Die günstigste Temperatur zur Sporenbildung von S. caelestis ist zwischen 28 und 30⁰.

Obschon S. caelestis in gewissen Beziehungen dem S. glaucus (Waksman und Lechevalier, »Actinomycetes and Their Antibiotics«, S. 91) und S. chartreusis (J. A. C. S. 75, 4011 [1953]) ähnlich ist, lassen sich diese Mikroorganismen leicht durch ausgesprochene Unterschiede in ihren Kultureigenschaften unterscheiden, die in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt sind.

Wie oben erwähnt, kann S. caelestis, NRRL 2418, auf einem Kulturmedium unter Bildung eines wirk-. samen antibiotischen Materials gezüchtet werden. Das Kulturmedium kann irgendeines von einer Anzahl verschiedener Medien sein, wie aus den obenerwähnten Versuchen hervorgeht. Der Organismus ist befähigt, viele Energiequellen zu assimilieren. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit der Produktion, maximalen Ausbeute an Antibioticum und der leichten Isolierung des Antibioticums D-52 werden aber gewisse Kulturmedien bevorzugt. So sind z. B. die zur Zeit bevorzugten Quellen für Kohlehydrat im Kulturmedium brauner Zucker, Lactose und Dextrin. Andere Quellen sind Stärke, Sucrose, Melassen u. dgl. Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Mais-Einweichflüssigkeit, Brauereihefe, löslicher Anteil von Schlempe, doch kommen auch andere Quellen, wie Sojabohnenmehl, Casein, Aminosäurengemische, Peptone (Fleisch und Soja) u. dgl. in Frage.

Die anorganischen Nährsalze, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind solche, die

Tabelle III Unterscheidende Eigenschaften von S. caelestis, S. chartreusis K-180 und S. glaucus

Reaktion	Medium .	S. caelestis	S. chartreusis K-180	S. glaucus
Kartoffel	Wachstum gut, gräulich bis blauweiß mit Dunkelwerden der Scheibe keine Peptonisierung keine Hydrolyse keine Reduktion auf	Wachstum ordentlich, Mitte der Kolonien blaugrau mit weißen Kanten langsame Peptonisierung gute Hydrolyse Reduktion	Wachstum¹ sehr stark, bedeckt mit samt artigen grünen Luftmycelien Peptonisierung langsam, mit vorheriger Koagulation durch einige Stämme rasche Hydrolyse , Reduktion
Milch	dem verwendeten Medium
Stärke
Nitrat

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Ionen liefern, z. B. Kalium, Natrium, Calzium, Phosphat, Chlorid, Sulfat u. dgl. Anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate oder Ammoniumsalze.

Im Kulturmedium für S. caelestis sollten auch wesentliche Spurenelemente enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den anderen Zusätzen als Verunreinigungen enthalten.

Für das optimale Wachstum und die Entwicklung von S. caelestis, NRRL 2418, sollte das Kulturmedium

ίο vor der Beimpfung mit dem Organismus auf ein p_H zwischen etwa 6,5 und 7,5 eingestellt werden, wobei das p_H 7 bevorzugt wird. Es wurde beobachtet, daß während der Wachstumsperiode des Organismus und der Produktion des Antibioticums das Medium allmählich alkalisch wird und eine Alkalinität vom p_H etwa 8 bis 8,5 oder höher erreicht. Das End-p_H hängt mindestens zum Teil vom Anfangs-p_H des Mediums, den vorhandenen Puffern und der Zeitdauer, während welcher der Organismus wachsen gelassen

.30 wurde, ab.

Zur Herstellung großer Mengen des Antibioticums D-52 bevorzugt man die submerse aerobe Kultur. Will man nur beschränkte Mengen des Antibioticums erhalten, kann man Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Kolben anwenden. Bei der Züchtung in großen Tanks empfiehlt es sich, die vegetative Form des Organismus zur Beimpfung zu verwenden, um eine Verzögerung in der Herstellung des Antibioticums und die damit verbundene ungenügende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Dementsprechend ist es erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Organismus beimpft, und nach Ausbildung des jungen aktiven, vegetativen Inokulums dieses aseptisch in die großen Tanks zu geben. Das Medium, in welchem das vegetative Inokulum hergestellt wird, kann das gleiche sein wie das, in welchem das Antibioticum erzeugt wird, oder von diesem verschieden.

S. caelestis, NRRL 2418, läßt sich bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 32⁰ gut kultivieren. Die besten Ausbeuten werden erhalten, wenn das Kulturmedium zwischen etwa 24 und 28° gehalten wird.

Die Bildungsgeschwindigkeit des Antibioticums D-52 und die Konzentration der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium kann während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus leicht verfolgt werden, indem man Proben des Kulturmediums auf ihre Wirksamkeit gegen Organismus prüft, von denen man weiß, daß sie gegen das Antibioticum empfindlich sind, wie z. B. B. subtilis. Für diese Bestimmungen empfiehlt sich die Anwendung eines Tests, bei welchem serienweise Verdünnungen der Kulturproben hergestellt, dem geschmolzenen Nähragar zugesetzt werden, wonach man den Agar in einer Petrischale erstarren läßt, mit einer jungen Kultur von B. subtilis beimpft und die größte Verdünnung ermittelt, die das Wachstum des Organismus auf dem Nähragar noch vollständig verhindert.

Die. Bildung des Antibioticums D-52 kann auch durch Trübungsmessungen, wie sie bei der Herstellung anderer Antibiotica üblich sind, verfolgt werden.

Im allgemeinen findet die größte Produktion des Antibioticums zwischen etwa 2 und 6 Tagen nach der Beimpfung statt, wenn die Kultur submers aerobisch erfolgt, und zwischen etwa 4 und 8 Tagen, wenn man Oberflächen- oder Schüttelflaschenkulturen anwendet.

Die antibiotischen Stoffe können aus dem Kulturmedium durch extraktive oder adsorptive Arbeitsmethoden gewonnen werden. Für die technische Produktion werden erstere bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und kostspielig sind. Zur Extraktion eignen sich vorzugsweise wasserunlösliche polare. organische Lösungsmittel, wie chlorierte Kohlen-Wasserstoffe, z. B. Methylenchlorid, Äthylendichlorid, Chloroform u. dgl.; Alkohole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Butanol, Amylalkohol u. dgl.; Alkylester von Fettsäuren wie Äthylacetat, Propylacetat, Butylacetät, Amylacetat u. dgl.; wenig wasserlösliche Ketone wie Methyl-isobutylketon, Methylamylketon u. dgl. Andere Lösungsmittel mit ähnlichem Charakter können ebenfalls verwendet werden. Der Extrakt aus der Kulturflüssigkeit kann vorzugsweise im Vakuum zur Trockne eingedampft werden, wobei man das Antibioticum in roher Form erhält.

Andererseits kann man das Antibioticum D-52 aus dem Kulturmedium gewinnen, indem man die filtrierte Lösung mit einem adsorbierenden Mittel zusammenbringt. Hierzu eignen sich aktivierte Tonerde, Silikagel, Magnesiumaluminiumsilikat u. dgl. Diese eignen sich auch zur Reinigung des Produktes auf chromatographischem Wege. Desgleichen kann man Aktivkohle verwenden, da diese das Antibioticum kräftig adsorbiert. Es empfiehlt sich jedoch, die Kohle mit einem Mittel wie Essigsäure vorzubehandeln, um die starke Bindungsaffinität des Kohlenstoffs für das Antibioticum herabzusetzen und dessen nachherige Elution zu erleichtern. Die Elution erfolgt leicht mit einem polaren organischen Lösungsmittel, in welchem das Antibioticum löslich ist. '

Verwendet man zur Gewinnung des Antibioticums D-52 ein Extraktionsverfahren, so kann man das Lösungsmittel auf ein relativ kleines Volumen einengen und das Antibioticum daraus durch Zusatz eines mischbaren Lösungsmittels, in welchem es nur wenig löslich ist, ausfällen. Das antibiotische Material fällt in Form der freien Base in roher, aber fester Form aus.

Eine z. Z. bevorzugte Art zur Isolierung des Antibioticums D-52 in Form seiner Base besteht darin, das p_H des filtrierten Mediums auf etwa 7 bis 10 einzustellen, vorzugsweise auf etwa 7,5 bis 8, und dann mit einem in Wasser unlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Amylacetat, Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid od. dgl., zu extrahieren. Der Extrakt wird dann zur Trockne verdampft und der Rückstand zu einem flüssigen, gesättigten Kohlenwasserstoff mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 Kohlenstoffatomen, wie Hexan, gegeben, um einen amorphen Niederschlag zu erzeugen. Der Niederschlag wird filtriert und getrocknet, wobei man das Antibioticum als freie Base erhält.

Die Salze des Antibioticums D-52 mit Säuren kann man erhalten, indem man eine Lösung desselben in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol,

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Äthylacetat, Methylenchlorid od. dgl., mit einer äquivalenten Menge Säure, wie z. B. gasförmigem Chlorwasserstoff, Oxalsäure, Salicylsäure, Citronensäure od. dgl., versetzt und die Lösung zur Trockne verdampft. Ferner kann man eine Lösung des Antibioticums D-52 in einem organischen Lösungsmittel mit einer ausgewählten Säure oder eine Lösung derselben behandeln und das Salz des Antibioticums D-52 direkt aus der Lösung ausfällen.

Beispiele für Salze, die hergestellt wurden, sind das Hydrochlorid, Oxalat und Salicylat. Andere Salze, wie das Citrat, Benzoat, Sulfat u. dgl., können nach der oben erwähnten Arbeitsweise leicht erhalten werden. Für therapeutische Zwecke " sollte das gewählte Salz natürlich nicht toxisch sein.

Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Herstellung des Antibioticums D-52 mittels S. caelestis oder eines Organismus der voll und ganz der oben gegebenen Beschreibung entspricht, die lediglich zu Zwecken der Erläuterung angeführt wurde. Es versteht sich; daß das Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung auch andere das Antibioticum D-52 erzeugende Abarten von S. caelestis umfaßt, die leicht durch routinemäßige Isolierungs- und Modifikationsverfahren, wie Auswahl des kultivierten Organismus und Behandlung desselben mit modifizierenden Mitteln, wie Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht, und chemischen Mitteln, wie z. B. Stickstoff-Senfölen, erhältlich sind.

Das Antibioticum D-52 und seine Salze mit Säuren haben eine große antibakterielle Wirkungsbreite, insbesondere gegen graue positive Bakterien. Die Wirksamkeit des Antibioticums D-52 im Vergleich zu Streptomycin gegen verschiedene Organismen ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle IV

Antibakterielles Spektrum
Kleinste wachstumshindernde Konzentration
(mcg/cm³)

Organismus	Antibioticum D-52	Strepto mycin
₄₅ D. pneumoniae	0,3Q	25,0
S. viridans 25-11		50,0
S. viridans L-17	6,2	100,0
S. hemolyticus C 203 ...	o,i9	0,19
S. hemolyticus L-2 .....	0,78	3,1
S. agalactiae 7077 ......	!,5	100,0
M. pyogenes var. ,		> ·
aureus L 40	o,39	100,0
M. pyogenes var.
aureus M-I	1,5	3.¹
M. pyogenes var.
aureus 284	0,78	1,5
S. albus	2,5	0,05
S. fecalis	2,5	1,0
, B. anthracis DO	2,5	0,05

Die antibiotische Wirksamkeit wurde durch Abstrichverdünnungs- oder Nährbouillonverdünnungsproben ermittelt. Im ersten Fall wurden die zu prüfenden Organismen auf eine Reihe von Agar ^ platten, die verschiedene Konzentrationen des Antibioticums enthielten, abgestrichen, um die kleinste Menge Antibioticum D-52 in msg/cm³ Substrat zu bestimmen, welche das Wachstum 40 Stunden verhinderte. Bei der zweiten Prüfung werden die zu prüfenden Organismen in einer Nährbouillon, die verschiedene Mengen des Antibioticums D-52 enthält, gezüchtet.

Das Antibioticum D-52 ist wirksam gegen Nocardia asteroides, den Organismus der bei Tieren und Mensehen Actinomycose hervorruft und ist ebenfalls wirksam gegen Xanthomonas pruni, Phytomonas fasciculata und Phytomonas stewartii, welche Bakterien in Pflanzen von wirtschaftlicher Bedeutung Krankheiten verursachen. Da Giftigkeitsprüfungen ergaben, daß bei Konzentrationen von 1000 Teilen pro Million des Antibioticums D-52 Apfel- und Birnenlaub nicht schädigen, ist das Antibioticum auch wertvoll zur Bekämpfung des Meltaus von Apfel- und Birnbäumen.

Das Antibioticum D-52 kann entweder für sich allein oder zusammen mit anderen Antibiotica wie Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Penicillin, Strepto^- mycin, Actidion u. dgl. zur Behandlung von Pflanzenkrankheiten wie bakterielle Flecken auf Tomaten und Pfefferpflanzen, Nußbaummeltau, Bohnenmeltau, verschiedene Rasenkrankheiten, Pfefferminzbrand, Kirschhlattflecken u. dgl. verwendet werden.

Außerdem kann man wegen der geringen Giftigkeit des Antibioticums D-52 und dessen Aktivitäten in vivo dieses sowohl gegen Streptokokken als auch gegen Staphylokokken, dasselbe zur Behandlung von Scharlachfieber, Streptokokken-Brustinfektionen, Oberflächeninfektionen u. dgl. einsetzen. Demzufolge ist das Antibioticum D-52 von therapeutischer Bedeutung in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Antibiotica wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bacitracin, Circulin, Penicillin, wie PenicillinO, Procain-penicillin, Chlorprocainpenicillin u. dgl. Chloramphenicol Tyrothricin, Polymixin B, Endomycin, Amicetin, Fumagillin, Erythromycin u. dgl. Sulfaverbindungen, wie Sulfadiazin, Sulfamerazin, ■ Sulfamethazin u. dgl., Steroidhormone, wie Cortison Hydrocortison und Estern desselben, Halogen-Cortisone, wie 9-a-Chlorcortison, 9-a-Fluorcortison u. dgl. und deren Ester, Halogenhydrocortison, wie 9-a-Chlorhydrocortison, 9-a-Fluorhydrocortison und deren Ester, ; oestrogene Stoffe u. dgl. Analgetica wie Salicylate u. dgl. Antihystamine wie Pyrrolazote (Pyrrollidinäthyl-phenothiazin-Chlorhydrat), Pyribenzamin-

(N' - pyridyl - N' - benzyl - N - dimethyläthylendiaminmonochlorhydrat) u. dgl. Das Antibioticum D-52 kann auch als Nahrungsmittelergänzung zur Förderung des Wachstums von Tieren und Geflügel allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren der vorgenannten antibiotischen Stoffe verwendet werden. Es kann auch mit fungiziden Stoffen wie Caprylsäure, Undecylensäure, p-Oxybenzoesäure u. dgl. An-Wendungen finden.

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Die folgenden Beispiele beschreiben die Bildung, Gewinnung, Konzentration, Reinigung und Indentifizierung des Anlibioticums D-52 und dessen Salzen.

Beispiel 1 -

Bildung des Antibioticums D-52. ■ In eine Anzahl von 500 cm³ Erlenmeyerkolben gibt man je 100 cm³ des folgenden Mediums:

Bactopepton (Difaco) ,. 7,5 g

Hefeextrakt (Difaco) 2,5 g

. Glucose 5,o g

Destilliertes Wasser auf 1000 ecm

. Die Kolben werden 20 Minuten im Autoklav bei I2i° sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Kolben mit einer wäßrigen Sporensuspension, die erhalten wurde, auf den üblichen Casein-StärkerAgar-Schrägstücken beimpft, worauf man etwa 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 24 und 28° auf einer hin und her gehenden Schüttelmaschine bebrütet. 5 cm³ dieses vegetativen Impf mediums wurden verwendet, um eine Reihe von 500 cm³ Erlenmeyer-. kolben, die je 100 cm³, des folgenden Mediums enthielten, zu beimpfen.;■;

Rohzucker ...... . ? .- 10 g

Glycerin ν. 5 g

Lacton . 5 g

Dextrin 5 g

Brauereihefe 2 g

SVP¹) 5 g

NH₄NO₃ 2 g

Maiseinweichflüssigkeit 2 g

GaCO₃ .....::.. 4 g

NaCl .......·. 5 g

Wasser bis 1000 cm³

1) SVP = Lösliches pflanzliches Proteingemisch der Glenmore Distelleries, Inc.

Vor der Beimpfung wurden die Kolben im Autoklav 20 Minuten bei 121⁰ sterilisiert und abgekühlt. Die Kolben bei 24 bis 28° auf einem Schütteltisch bebrütet. Nach 120 Stunden enthielt eine Probe des fermentierten Kulturmediums 87 M.-avium-Einheiten pro cm³ und 180 B.-sübtilis-Einheiten pro cm³.

Die Gehaltsbestimmung erfolgte nach · dem . Verfahren von Loo und Mitarb. (J. Bact., 50, S. 701 bis 709 [1945]) und wird als M.-avium-Einheiten bezogen auf den Streptomycinsulfatstandard ausgedrückt und in.B.-subtilis-Einheiten bezogen auf den Neomycinsulfat Standard. Jede M.-avium-Einheit entspricht einem Mikrogramm Streptomycinbase auf Grundlage der Plattenaktiyität und jede B.-subtilis-Einheit einem Mikrogramm Neomycinbase auf Grundlage der Plattenaktivität.

Beispiel 2

Bildung des Antibioticums D-52. 100 cm³ Portionen des folgenden Mediums: ■ . . ■ _:

Dextrose ;.............:... 20,0 g :

Sojamehl lojo g

Brauereihefe ..... ...... 2,5 g

(NHJ₂SO₄ 5,0 g

KCl .,.. 3,0 g

CaCO₃ 4,0 g,

Wasser bis zu 1000 cm³

werden in 5oo-cm³-Koiben gefüllt, die dann 20 Minuten bei I2I^P im Autoklav sterilisiert wurden. Die abgekühlten Kolben wurden mit 5 cm³ der 48stündigen Kultur, wie sie im Beispiel 1 beschrieben wurde, beimpft und dann¹ bei 24 bis 28° auf dem Schütteltisch bebrütet. Nach 120 Stunden enthielt eine Probe des fermentierten Kulturmediums einundzwanzig M.-avium-Einheiten pro cm³ und mehr als achtzig B.-subtilis-Einheiten pro cm³. _v _

Beispiel 3

■ Bildung und Gewinnung des Antibioticums D-52

Ein Tank aus rostfreiem Stahl von 378,51 Inhalt wurde mit 2401 des folgenden Nährmediums beschickt.

Rohzucker 10 g/l

Glycerin.... 5 g/l g₅

Lactose 5 g/l

Dextrin . 5 g/l

Brauereihefe 2 g/l,

NH₂NO₈ 2 g/l

Maiseinweichwasser 2 g/l

* CaCO₃ .« 4 g/l

NaCl · ,5 g/l

Dann wurde 30 Minuten bei 121° sterilisiert und abgekühlt. Hierauf wurde mit 121 einer wie folgt hergestellten Kultur beimpft: Man verwendete Sporen von S.-caelestis, die von einer Casein-Stärke-Agar-Schrägkultur erhalten wurden, zur Beimpfung eines 5oo-cm³-Kolbens, der 100 cm³ des folgenden Saatmediums enthielt:

Dextrose ' 20,0 g/l

Sojamehl \ . ■ 10,0 g/l

Brauereihefe 2,5 g/l

(NHJ₂SO₄..... 5,0 g/l

KCl 3,0 g/l

CaCO₃ 4,0 g/l

Dieser Kolben wurde auf einem hin und her gehenden Schütteltisch 48 Stunden bei 28° bebrütet. 25 cm³ dieser Kultur wurden zur Beimpfung eines etwa 191 fassenden Fermentiertanks aus rostfreiem Stahl, der 12 1 des obengenannten Saätmediums enthielt, benutzt. Er wurde vorgängig ¹I¹Z₂ Stunden bei 121° sterilisiert und dann abgekühlt. Dann wurde bei 28⁰ 2 Tage fermentiert. Während dieser Zeit wurde mit einem Rührer gerührt und mit 6 1 pro Minute belüftet. Das ergab das Saatmedium.

Der 378,5-l-Tank wurde mittels eines verkleideten Flügelrads mit Saugrohrschikane in Bewegung gehalten, die Drehzahl des Propellers betrug 280 U/min. Luft wurde in einer Menge von 0,0849 m³/min. zugeführt. Der Kultur setzte man 100 cm³ eines Antischaummittels, bestehend aus Specköl und 1 % Octadecanol zu.

Nach 67 Stunden wurden. 1500 cm³ der Kultur filtriert und zweimal mit je 500 cm³ Methylenchlorid

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extrahiert. Das p_H der Probe war 7,8. Der Extrakt wurde im Vakuum auf 2 cm³ eingeengt und dann zu 10 cm⁸ Skellysolve B gegeben, einem Lösungsmittel, das größtenteils ein Gemisch von Hexankohlenwasserstoffen enthält. Man erhielt einen flockigen Niederschlag. Nach dem Waschen mit Skellysolve B und Trocknen erhielt man 38 mg (43% Ausbeute) an Antibioticum D-52 mit 2700 B.-substilis-Einheiten pro cm³ und 720 M.-awium-Einheiten pro cm³.

Das Antibioticum D-52 besitzt im p_H-Bereich zwischen 2 und 7 eine gute Stabilität (3 Stunden bei 80°), und die Stabilität scheint geringer beim p_H 10, wenn man 3 Stunden bei 25° hält.

Das Antibioticum D-52 ist in Wasser löslich im p_H-Bereich von 1 bis 7, Unlöslich zwischen 7,5 und 9 und löslich im Bereich zwischen 10 und 13/ Dieses Löslichkeitsverhalten zeigt, daß das Antibioticum amphoter ist. Es ist unlöslich in 6 N NaOH. Seine Salze mit Säuren sind wasserlöslich. Es ist löslich in Methanol, Chloroform, Äthylacetat und Methylenchlorid aber Unlöslich in Äther und Ligroin.

Die Analyse des Antibioticums D-52 führt zur versuchsweisen Formel C₂₃H_{36 b},_{s 40}O₉N₂S.
. Bestimmt man das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibioticums D-52 in wäßriger Lösung unter Verwendung eines Beckman-Quarz-Spectrophotometers, Modell DU, oder eines Cary-Registrier-Spectrophotometers, werden Maxima von E J"';, == 182 bei 239 Millimikron und E }°/£ = 74 bei 307 Millimikron beobachtet. Das Antibioticum D-52 besitzt eine optische Drehung [α] ο =+121,5° (o,5% in Chloroform).

Eine Suspension des Antibioticums D-52 in flüssigem Petrolatum zeigt folgende charakteristische Absorptionsbanden im Infrarot, ausgedrückt in cm-¹: 3340, 3210, 1900, 1672, 1655, 1615, 1570, 1545, 1488, 1090 und 758. Dies ist in Fig. 1 dargestellt. Die Banden bei 3340 und 3210 sind charakteristisch für O—H- und/oder N—Η-Gruppen. Die Bande bei 1900 ist charakteristisch für ein Salz und zeigt an, daß das Antibioticum wahrscheinlich als Zwitterion vorliegt. Die Banden bei 1672, 1655, 1570 und 1545 sind charakteristisch für die Carbonylgruppe. Die Banden bei 1615, 1488 und 758 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Die Bande bei 1090 ist charakteristisch für die C—Η-Gruppe oder die C--O-Gruppe.

Beispiel 4

Herstellung des Chlorhydrats von

. Antibioticum D-52

Eine Lösung von 750 mg Antibioticum D-52 (Beispiel 3) wurde mit trockenem Chlorwasserstoff behandelt. Beim Eindampfen erhielt man einen harzigen Rückstand. Nach Verreiben desselben mit wasserfreiem Äther erhielt man 435 mg eines weißen, halbkristallinen Pulvers, das als Hydrochlorid des Antibioticums D-52 identifiziert wurde. Dieses Produkt enthielt 1650 M.-avium-Einheiten pro mg und 2200 B.-subtilis-Einheiten pro mg.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer Probe des Chlorhydrats des Antibioticums D-52 zeigt Maxima von E {'£ = 188 bei 240 Millimikron und E }°'°, = 67 bei 305 Millimikron.

Eine Suspension des Chlorhydrats in flüssigem Petrolatum zeigt folgende charakteristische Absorptionsbänder im Infrarot, ausgedrückt in cm;-¹: 3290, 3065, 1671, 1613, 1583, 156.6, 1485, 1088 und 755. Das Einzelband bei 3290 ist charakteristisch für die OH- und/oder NH-Gruppe. Die Bänder bei 1671, 1583 und 1566 sind charakteristisch für die C=O-Gruppe. Die Bänder bei 1613, 1485 und 755 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Das Band bei 1088 ist charakteristisch für die C—O-Gruppe. Das ,_; Band bei 3065 ist charakteristisch für die = C—H-Gruppe. ;

Das Hydrochlorid des Antibioticums D-52 besaß eine optische Drehung von '[α]|* = + 96,7° (0,5% in Wasser). ·

Beispiel^ .

80 Oxalat des Antibioticums D-52

Zu 120 cm³ wasserfreiem Äther gibt man eine Lösung von 40 mg Oxalsäuredihydrat in 20 cm³ Methanol sowie 200 mg Antibioticum D-52 (Beispiel). Nach Umkristallisieren des erhaltenen Niederschlags aus Methanol erhielt man 70 mg Oxalat des Antibioticums' D-52 als weiße, zwischen 149 und 154⁰ schmelzende Nadeln. Das Produkt enthielt 900 M.-avium-Einheiten pro mg und 4000 B.-subtilis-Einheiten pro mg.

Die Analyse ergibt eine versuchsweise empyrische Formel von C₂₅H_{36 bis 40}O₁₃N₂S. ,' .■

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Oxalats in wäßriger Lösung ist durch folgende Maxima charakterisiert: E Ja,== 155,9 bei 240 Millimikron und EH= 61,8 bei 305 Millimikron.

Eine Suspension des Oxalats in flüssigem Petrolatum zeigt folgende charakteristische Absorptionsbänder im Infrarot, ausgedrückt in cm-¹:. 3600, 3460, 3265, 2540, 2206, 1935, 1720, 1689, 1674, 1625, 1589, 1545, i486, 1085 und 756. Dies ist in Fig. 2 dargestellt.

Die Einzelbänder bei 3600, 3460, 3265, 2540 und 2206 sind charakteristisch für die O—H- und/oder N—Η-Gruppe. Das Band bei 1935 ist charakteristisch für das Salz. Die Bänder bei 1720, 1689, 1674, 1625, und 1545 sind charakteristisch für die C—O-Gruppe. Die Bänder bei 1589, i486 und 756 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Das Band bei 1085 ist charakteristisch für die C—O-Gruppe.

Das Oxalat des, Antibioticums D-52 besitzt eine optische Drehung von [α] |* = + 106,4° (°>5 °/o ^m Wasser). ' ■ .

Die Untersuchung zur Aufklärung der Struktur des Oxalats des Antibioticums D-52 zeitigte folgende

Ergebnisse:

Nitroprussid .... negativ

Ferrichlorid .... negativ (braun)

Millons Reagens weißer Niederschlag

Bariumchlorid . . weißer Niederschlag, säurelöslich (kein Sulfat)

Jodoform negativ

Benzolsulfonyl-

chlorid ....... unbestimmt

Br₂ in CCl₄ negativ

509 629/205

U 3327 IVa/30 h

Br₂—Ή₂0 weißer Niederschlag (Arylamin

oder Phenolgruppe)

NaN₃—1₂ Entwicklung von N₂-GaS

(C-SH oder C=S)
H₂- PtCyKata-

lysator keine Reduktion. Behält das UV-Spektrum.

1,15 g des Oxalats des Antibioticums D-52 wurden zu 10 cm³ 6NNaOH gegeben. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur ging das Antibioticum in Lösung und man erhielt einen Niederschlag, der als Nafriumoxalat identifiziert werden konnte. Die überstehende Schicht wurde mit Methylenchlorid gewaschen und angesäuert, wobei man einen neuen Niederschlag erhielt. Das feste Produkt wurde dann aus heißem Wasser umkristallisiert. Man erhielt 80 mg eines weißen kristallinen Produktes, das bei ioo° sublimierte und zwischen 154 und 158° schmolz. Bei der Infrarotanalyse erwies sich dieses Produkt als Salicylsäure.

Die intraperitonealen Toxizitäten des Antibioticums D-52, dessen Oxalats, des Chlortetracyclins und Tetracyclins sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle V

Akute Toxizität (mg/kg bei Mäusen)

Antibioticum LD₅₀ (mg/kg)

D-52 freie Base 167

D-52 Oxalat 233

Chlortetracyclin 192 (im Mittel)

Tetracyclin 190 (im Mittel)

• Beispiel 6

Gewinnung des Antibioticums D-52 als freie Base aus

dessen Salzen

2 g Oxalat des Antibioticums D-52 · (Beispiel 5) wurden in 20 cm³ Wasser gelöst. Das p_H der Lösung wurde durch Zusatz von 6 N NaOH auf 8,5 eingestellt, wobei sich ein öliger Niederschlag bildete, der mit 20 cm³ Methylenchlorid extrahiert wurde. Der Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt 750 mg eines amorphen, praktisch farblosen Produktes, das als Antibioticum D-52 in Form der freien Base identifiziert wurde. Sie enthielt 900 M.-avium-Einheiten pro Milligramm und 2700 B.-subtilis-Einheiten pro Milligramm.

Beispiel 7

Salicylat des Antibioticums D^52

Nach Zusatz von 60 cm³ wasserfreiem Äther zu einer Lösung von 1 g Antibioticum D-52 (Beispiel 3) und 0,27 g Salicylsäure in 10 cm³ Methanol schied sich ein harzartiger Niederschlag aus. Nach Umkristallisieren aus heißem Äthylacetat erhielt man das Salicylat des Antibioticums D-52 vom Schmelzpunkt 136 bis 138⁰, das 720 M.-avium-Einheiten pro mg und 3800 S.-subtilis-Einheiten pro mg enthielt.

Das UV-Spektrum des Salicylate ist gekennzeichnet durch Maxima von E \°£ = 227 bei 236,5 Millimikron und E \°£ = io6,7 bei 301,5 Millimikron. Seine optische Drehung [et] |* = + 90,2° (0,5 % in Wasser).

Elektrometrische Titrationsstudien am Salicylat bei Verwendung einer Mischung von Wasser und 95 % Äthanol als Lösungsmittel zeigen eine basische Funktion mit einem pKa 7,80 und eine saure Gruppe mit dem pKa 9,90. Das Äquivalentgewicht dieses Salzes ist 680 ± 20 g.

Eine Suspension des Salicylate in flüssigem Petrolatum zeigt folgende charakteristische Absorptionsbänder im Infrarotgebiet, in" cm-¹ ausgedrückt: 3540, 3260, 3070, 1950, 1677, 1625, 1614, 1584, 1546, 1488, 1096, 1089, 766 und 764, was in Fig. 3 dargestellt ist.

Die Einzelbänder bei 3540, 3260 und 3070 sind charakteristisch für die O—O- und/oder N—H-Gruppe. Das Band bei 1950 ist charakteristisch für das Salz. Die Bänder bei 1677, 1625, 1614, 1548 und 1546 sind charakteristisch für die C=O-Gruppe und die Bänder bei 1488, 776 und 764 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Die Bänder bei 1096 und 1089 sind charakteristisch für die C—O-Gruppe.

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung eines Stammes von Streptomyces caelestis NRRL 2418 zur Herstellung des Antibioticums D-52 durch Züchtung des Mikroorganismus in üblichen Nährmedien unter submersen Bedingungen und Isolierung des Antibioticums durch Extraktion des Nährmediums, gegebenenfalls Überführung des Antibioticums in seine Salze.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen