DE2516020A1 - Antibiotische substanzen, synergistisches antibiotisches gemisch, verfahren zur herstellung derselben sowie dieselben enthaltende praeparate - Google Patents

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Antibiotische Substanzen, synergistisches antibiotisches Gemisch, Verfahren zur Herstellung derselben sowie dieselben enthaltende Präparate

Die vorliegende Erfindung betrifft antibiotisch wirksame Substanzen, synergistische antibiotische Gemische, Verfahren zur Herstellung derselben sowie dieselben enthaltende Präparate.

Das Synergismus-Phänomen wurde in der Antibiotika betreffenden Literatur ausführlich erörtert: The Journal of Antibiotics 25, Nr. 6, 371 (1972); J. Chem. Soc. 19C, 1653 (1966);
Bull. Soc. Chim. BeIg. 68, 716 (1959); J. Amer. Chem. Soc. 82, 441.4 (i960); Tetrahedron Letters 2687 (197D;
J. Antibiotics, Ser. A 14, 14 (196I);

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Nature I87, 598 (i960);

J.Chem. Soc. 2286 (196O)-J

Antimicrobial Agent & Chemotherapy 36O-365 (1964); Tetrahedron Letters 4231-4238 (1966); Organic Mass Spectrometry 6, 15I - I66 (1972); Tetrahedron Letters 369 - 372 (I966) und

J. Chem. Soc. I9C,. I669 - I676 (I966).

Die neuen synergistischen Gemische von Antibiotika der vorliegenden Erfindung schließen sich an die Familie von anderen erörterten synergistischen Gemischen an: Mikamycin, Pristinamycin, Ostreogrycin, Streptogramin, P.A. 114, Vernamycin und Virginiamycin.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch von Antibiotika das durch submerse aerobe Vermehrung von Actinoplanes auranticolor ATCC 3IOII in wässrigen Nährmedien produziert wird; Dieses Gemisch, das makrozyklische Lactone und Depsipeptide enthält, kann aus der Fermentationsbrühe durch Lösungsmittelextraktion, Gegenstromverteilung, Säulenchromatographie oder Kombinationen derselben abgetrennt und gewonnen werden. Die einzelnen antibiotisehen Komponenten weisen signifikante antibiotische Wirksamkeit auf. Das rohe antibiotische Gemisch oder Kombinationen eines reinen makrozyklischen Lactons und eines reinen Depsipeptides, die aus dem rohen Gemisch erhalten wurden, zeigen markante Synergistisehe antibiotische Wirksamkeit. Das rohe antibiotische Gemisch, die reinen einzelnen antibiotisehen Komponenten und die Gemische von reinen makrozyklischen Lactonen und Depsipetiden sind wirksame Förderer des Wachs-, turns von Küken und Schweinen und therapeutische Mittel bei der Bekämpfung von Schweine-Dysenterie.

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Der Mikroorganismus, der für die Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika nützlich ist, wurde aus einer Erdprobe in Ägypten isoliert. Der Mikroorganismus wurde an Kartoffel-Mohrrüben-Agar gezüchtet und es wurde gefunden, daß er zur Klasse von Actinömyceten gehört, die Sporangien produzieren, die ähnlich denen der Gattung Actinoplanes sind. Der Mikroorganismus wurde daher an einer Anzahl von Medien, die für das Studium dieser Gattung verwendet werden, gezüchtet. Suspensionen der Kultur wurden hergestellt, indem man Stücke der Kultur, die aus Agar-Schrägkulturen abgeleitet wurden, in kleinen Kolben, die jeweils etwa 0,2 ml steriles destilliertes Wasser enthielten, zerkleinerte, die Inhalte nachspülte und mit weiterem sterilen Wasser zur Herstellung eines Volumens von etwa 5 ml für die Kultur vereinigte. Diese Suspensionen wurden zum Anlegen der Kultur in Rohren, Schrägkulturen oder Petrischalen der verschiedenen Medien verwendet. Die Inkubationstemperatur betrug 28 C_} ausgenommen dort, wo andere Temperaturen angegeben wurden. Die Resultate wurden in Intervallen bis zu

bestimmte
22 Tagen für einige Tests^aber die meisten Resultate wurden nach lH Tagen bestimmt. Die Farben der Kultur waren jene von Maerz und Paul, Dictionary of Golors, 2. Auflage, 1950, ebenso wie die individuellen beschreibenden Ausdrücke. Diese neue Kultur ( Pfizer P.D. 24090) wurde am 11. März 197*1 der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland^ übergeben und erhielt die Bezeichnung Actinoplanes auranticolor ATCC 31011.

Die Identifikationsmedien, die zur Charakterisierung der Kultur verwendet wurden, sind folgende:

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1. 2 % Leitungswasser-Agar

2. Kartoffel-Mohrrüben-Agar. M.P. Lechevealier,

J. Lab. & Clin. Med. 71, 934-944 (1968). Verwendung von lediglich 30 g-Kartoffeln und 2,5 g Möhren^aber 20 g Agar.

3· Czapek-Saccharose-Agar. Waksman, S.A., The Actinomycetes 2, 328 (I96I) Medium Nr. 1, Seite 328.

4. Glucose-Asparagin-Agar. Waksman, wie vorstehend, Medium Nr. 2, Seite 328.

5. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar. Antibiotics Ann. 1956/ 1957, Seiten 9¹»7-953.

6. Hickey und Tresner Agar. J. Bact. 6*1, 89I - 892 (1952).

7. Kartoffel-Glucose-Agar. Schälen, Zerschneiden und Dämpfen von 100 g Kartoffeln in 500 ml Wasser, Filtrieren durch weitmaschige Gaze, Zusatz von 10 g Glucose, 20 g Agar und ausreichend Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter.

8. Stärke-Agar. J. Bact. 73, 15-27 (1957).

9. Gelatine, J.Bact. 73, 15-27 (1957).

10. Tyrosin-Agar, J. Bact. 69, 147-150 (1955).

11. Difco-Pepton-Eisen-Agar.

12. Difco-Magermilch.

13. Dextrose-Nitrat-Brühe. Waksman, S.A., The Actinomycetes 2, 328 (1961).

Medium Nr. 1 mit 3,0 g Glucose anstelle von Saccharose und ohne Agar.

14. Organische Nitrat-Brühe, J. Bact., 73, 15-27 (1957).

15. ATCC Medium 172, American Type Culture Catalogue, 10. Ausgabe, Seite 235 (1972).

16. Kohlenstoff-Verv/ertung, J. Bact., 56, 107-114 (1948).

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Die neue Kultur kann folgendermaßen beschrieben werden:

Leitungswasser-Agar: Wachstum schlecht, dünn, flach, nahe 9D2 (sehr blaß pinkfarben), kein Luftmycel, Substrat-Mycel farblos bis 9D2; kein lösliches Pigment.

Czapek-Saccharose-Agar: Wachstum mäßig bis gut, flach (flat), nahe 9G6 (blaß orange); kein Luftmycel, Substrat-Mycel nahe 9G6; kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum mäßig, steigend (raised), gerauht, nahe 9L9 (hell-orange); kein Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: kein Wachstum.

Hickey und Tresner-Agar: Wachstum mäßig bis gut, leicht steigend und gerauht, nahe 9?9 (matt orange), geringfügig weißliche Blume an der Oberfläche, Substrat-Mycel nahe 918, blaß-bräunliches lösliches Pigment.

Kartoffel-Glucose-Agar: Wachstum mäßig, steigend, gerauht, nahe 9L9 (hell orange), kein Luftmycel, Substrat-Mycel nahe 9L9, kein lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar: Wachstum schwach bis mäßig, flach, nahe 13A1O (matt rötlich-orange), kein Luftmycel, Substrat-Mycel nahe lODll, braun lösliches Pigment.

Gelatine: Wachstum mäßig, flach, nahe 9K12 (rötlich orange), Spuren von weißlicher Blume, Substrat-Mycel nahe 9K12, kein lösliches Pigment.

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Stärke-Agar: Wachstum mäßig bis gut, steigend, nahe 9KlO (orange), geringfügig weißliche Blume, Substrat-Mycel nahe 9K10, blaßgelb lösliches Pigment.

Stärke wurde schwach hydrolysiert, Gelatineverflüssigung war stark, Nitrate wurden selbst in 22 Tagen in keinem Nitratmedium zu Nitriten reduziert (das Wachstum war sehr schwach in Dextrosenitrat-Brühejaber gut in organischer Nitrat-Brühe), H_?S wurde schwach produziert, in Pepton-Eisen-Agar lag kein lösliches Pigment vor, selbst in 22 Tagen trat keine Coagulation oder Hydrolyse von Milch auf, Tyrosin wurde nicht verdaut, das Wachstum an ATCC-Medium 172 fand bei 21 bis 37°C statt, wobei das beste Wachstum bei 28 und 37°C erhalten wurde, es trat bei 45°C kein Wachstum auf. Arabinose, Fruktose, Glucose, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Saccharose und Xylose wurden verwendet; Inosit wurde nicht verwendet. An keinem Medium trat Geruch auf.

Sporangien wurdeftr*a*n Kartoffel-Mohrrüben-Agar produziert. Sie bildeten eine Palisadenschicht. Die Maße waren 5»5 bis 11 χ 4,5 bis 8 Mikron in Weite und Breite und 9 bis 12 Mikron in der Höhe. Sie waren sehr zahlreich, irregulär in der Form und setzten durch graduelles Erweichen Sporen frei. Sporangien aus Kartoffel-Mohrrüben-Agar setzten nach j&röchiger Inkubation in wenigen Stunden bei etwa 21 C Sporen frei, wenn Stücke der Kultur in eine kleine Menge einer Lösung von 1 g Glucose und 1 ml Tween 80 in 1 1 Wasser (eine Modifikation einer.Lösung, die von M.L. Higgins, J. Bact., 9¹I, ^95 - 498, I967 verwendet wurde) getaucht wurden. Die Sporen waren in den Sporangien in Ketten von irregulärer Form, wenn sie ,jedoch freigesetzt wurden, waren sie fast kugelförmig (subglobose) und 1,6

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Mikron groß bis klar ellyptisch, 1,6 bis 2,2 χ 1,1 bis 1,6 Mikron. Fast alle waren bewegungsfähig.

Eine Probeidentifikation führte zu einem Vergleich dieser Kultur mit A. auranticolor-ATCC 1533Q. Der neue Stamm A. auranticolor ATCC 31011 und A. auranticolor ATCC 15330 zeigten im wesentlichen an Bennett's-Agar, Nähragar, Hefeextrakt-Agar, Glucoseasparagin-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, Calciunvmalat-Agar und Tyrosin-Agar gleiche morphologische Merkmale, Farbe und lösliches Pigment.

Keine Kultur reduzierte Nitrat zu Nitrit, beide produzierten schwach H_?S und versagten bei der Produktion von Melanin an Pepton-Eisen-Agar. Beide hydrolysierten Stärke. A. auranticolor ATCC 15330 bewirkte keine Änderung in Magermilch-Rohren, während die neue Kultur in 3 der 6 Rohre eine Klärung der Milch bewirkte und nach 21 Tagen ein gelb bis cremefarbenes lösliches Pigment produzierte.

A. auranticolor ATCC 31011 verwendete Glucose, Arabinose, Fruktose, Mannit, Raffinose,Rhamnose, Saccharose und Xylose. A. auranticolor ATCC 15330 verwendete alle diese Zucker mit Ausnahme von Raffinose. Sporangien und Sporen der beiden Kulturen waren ähnlich, wobei die Sporen von A. auranticolor ATCC 15330 stabförmiger waren.

Am wichtigsten ist, daß A.auranticolor ATCC 15330 keine antibiotische Wirksamkeit unter den Fermentationsbedingungen produzierte, in welchen A. auranticolor ATCC 31011 das Gemisch der Antibiotika der vorliegenden Erfindung produzierte.

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Die Züchtung von A. auranticolor ATCC 31011 findet vorzugsweise in wässrigen Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis 36°C und unter submersen aeroben Bedingungen unter Rühren statt. Nährmedien, welche für solche Zwecke nützlich sind, umfassen eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, wie Zucker, Stärke und Melasse, eine Quelle von organischem Stickstoff, wie Casein, enzymatrischer Extrakt von Casein (enzymatic digest of casein), Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl und Weizengluten. Eine Quelle von Wachstumssubstanzen wie Brandweintrester, Fischmehl und Hefeextrakt ebenso wie Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat und Spurenmineralien, wie Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden. Wenn während der Fermentation übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie pflanzliche öle oder Silikone dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Die Belüftung des Mediums in Tanks für submerses Wachstum wird vorzugsweise in einem Ausmaß von etwa 0,5 bis 2 Volumina freie Luft pro Volumina Brühe pro Minute aufrecht erhalten. Das Rühren wird mittels Rührer, die im allgemeinen in der Fermentationsindustrie gebräuchlich sind, durchführt. Während des Transfers des Organismus und während dessen Züchtung müssen natürlich aseptische Bedingungen aufrecht erhalten werden.

Das Inokulum für die Herstellung des antibiotischen Gemisches kann durch Verwendung der Züchtung aus einer Schrägkultur auf einem Medium wie ATCC-Medium 172, welches vorstehend erläutert wurde, hergestellt werden. Die Kultur kann zur Inokulierung entweder von Schuttelflaschen oder Inokulum-Tanks verwendet werden oder alternativ können

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die Inokulunr-Tanks aus den Schüttel-Flaschen geimpft werden. In Schüttel-Flaschen wird das Wachstum sein Maximum im allgemeinen in etwa ¹I Tagen erreicht haben, während das Inokulum in submersen Inokulum-Tanks gewöhnlich am günstigsten in 2 bis 3 Tagen sein wird.. Wesentliche antibiotische Wirksamkeit wird in der End-Fermentor-Stufe in etwa 20 bis 30 Stunden erzielt.

Das Verfahren zur Herstellung der Antibiotika wird während der Fermentation geeigneterweise durch biologische Prüfung der Brühe, unter Anwendung eines empfindlichen Stammes von Staphylococcus aureus verfolgt. Es wird eine Standard-Platten-Untersuchungstechnik.angewandt, in welcher die Zone der Inhibierung, die eine Filterpapierscheibe, die mit der Brühe gesättigt ist, umgibt, als Maß für die antibiotische Wirksamkeit verwendet wird. Nachdem die Fermentationsbrühe einen gewünschten Grad an antibiotischer Wirksamkeit erreicht hat, werden die Produkte aus entweder der gesamten Brühe oder der filtrierten Brühe isoliert. Im letzteren Fall wird das Myeel durch Filtration oder Zentrifugati on entfernt. Verschiedene Arten von Vor*· richtungen, wie Filterpressen, Zentrifugen usw. können angewandt werden.

DünnschichtChromatographie, die Silikagel anwendet,ist ein nützliches Mittel zur Analysierung des antibiotischen Gemisches, das im Fermentationsmedium produziert wurde und des Gemisches aus rohen und gereinigten Materialien, die aus Parmentationsbrühen extrahiert wurden. Die Zerlegung der Komponenten des antibiotischen Gemisches ist wesentlich abhängig von der antibiotischen Belastung des Systems. Bei zu geringer antibiotischer Wirksamkeit werden kleinere antibiotische Komponenten nicht sichtbar, zu starke antibiotische Wirksamkeit führt zu einem Schlepp-Effekt mit resultierender schlechter Auflösung. .

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Das Entwicklungssystem für die Dünnschichtchromatographie ist Chloroform-Sthanol (9:1). Die Dünnschientchromatogramme können nach Entwicklung unter UV-Licht bei 25¹J niju und 366 ΐπμ beobachtet werden. Bioautographischer Nachweis der antibiotischen Komponenten kann mittels einer Auflage einer dünnen Schicht Nähragar, der mit einem empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus oder anderen empfindlichen Organismen geimpft ist, erreicht werden.

Die primären Komponenten in dem antibiotischen Gemisch, das durch A. auranticolor ATCC 31011 produziert wird, umfassen eine Anzahl von antibiotischen makrozyklischen Lacton- und Depsipeptid, -Komponenten. Das Auftreten oder Nicht-

die>
Auftreten oder ''prozentuale Zusammensetzung dieser anti-.

biotischen Komponenten variiert von Fermentation zu Fermentation und ist eine Funktion von Zeit, pH-Wert, Medienzusammensetzung, usw. Unter den in den η achstehenden Beispielen zusammengestellten Bedingungen sind die hauptsächlichen antibiotischen Komponenten in dem antibiotischen Gemisch Verbindungen 37,277 (Depsipeptid) und 36,926 (makrozyklisches Lacton), während die kleineren antibiotischen Komponenten Verbindungen 37,932 (Depsipeptid) und 35,763 (mak'rozyklisches Lacton) sind.

Die Komponenten des antibiotischen Gemisches können durch eine Anzahl von verschiedenen Verfahren,einschließlich Lösungsmittelextraktion, Craig-Gegenstromverteilung, Säulenchromatographie oder Kombinationen derselben aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und gewonnen werden. Verschiedene organische Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat und Methylisobutylketon sind bei der Extraktion der Antibiotika

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aus der Brühe nützlich. Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise durch zweimaliges Extrahieren der Brühe bei etwa pH 7 mit einem Volumen an Lösungsmittel, das etwa gleich bis etwa 1/3 bis 1/2 des Volumens der Brühe, aus welcher das antibiotische Gemisch gewonnen werden soll, ist, durchgeführt. Abhängig von den Volumina der Brühe sind verschiedene Arten von Vorrichtungen, wie Scheidetrichter, Rührtanks und mechanische Extraktionsvorrichtungen, wie Zentrifugen zu Extraktionszwecken nützlich.

Das bevorzugte Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung der Komponenten des antibiotischen Gemisches wird wie folgt durchgeführt: entweder die ganze oder die geklärte Brühe wird auf etwa pH 7 eingestellt und zweimal mit etwa 1/3 bis 1/2 Volumen an Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird unter Vakuum konzentriert und das Konzentrat wird durch Extraktion mit Heptan oder Petrolather entfettet. Das entfettete Lösungsmittelkonzentrat wird anschließend unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Die Peststoffe werden der Craig-Gegenstromverteilung (6 Stufen oder Platten) unter ,Verwendung von 5 Teilen Toluol, 2 Teilen Äthanol, 3 Teilen wäßrigem Phosphatpuffer, pH 4,5,unterworfen.- Die abgetrennten Schichten liefern die oberen und unteren Phasen des Gegenstrom-Verteilungs-Systems. Nach Verteilung wurden die Schichten durch Dünnschichtchromatographie beobachtet. Die abgetrennten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet.

Die Feststoffe, die die Depsipeptide enthielten,wurden in Chloroform gelöst, mit Aktivkohle behandelt, filtriert und

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im Vakuum eingedampft. Der nach Abdampfen des Chloroforms erhaltene Rückstand wurde i-n Aceton gelöst. Die durch Zusatz von Heptan ausgefallenen Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und auf eine Säule von auf pH 6 gepuffertemSilikagel, hergestellt in Chloroformrn-Propanol (99:1 %₃ V/V)_? aufgebracht. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem unter einem Druck von 5,62 kg/cm entwickelt. Die aus der Säule entnommenen Fraktionen wurden durch DünnschichtChromatographie beobachtet. Die Fraktionen, die abgetrennte Depsipeptide enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum eingedampft und aus Aceton-Heptan kristallisiert.

Die Gegenstrom-Fraktionen, die die ma^.rozyklischen Lactone enthielten,wurden vereinigt, im Vakuum eingedampft und die Feststoffe wurden in A'thylacetat aufgenommen. Die Lösung wurde mit Silikagel gerührt, filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und mit Hexan ausgefällt. Die Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und unter einem Druck von 5,62 kg/cm an einer auf pH 6,0 gepufferten Silikagel-Säule, hergestellt in A'thylacetat, chromatographiert. Das Entwicklungssystem war Äthylacetat-Tetrahydrofuran-Hexan (80:20:20), das mit wässrigem Phosphatpuffer vonrpH 6,0 gesättigt war. Die Fraktionen der Säule wurden durch DünnschichtChromatographie beobachtet. Die Fraktionen, die abgetrennte makrozyklische Lactone enthielten, wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Die einzelnen Fraktionen wurden getrennt durch Craig-Gegenstromverteilung und/oder Säulenchromatographie unter Verwendung unterschiedlicher Entwicklungssysteme aufgearbeitet. Sorgfältiges Beobachten bei jeder Reinigungs-

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stufe lokalisiert die einzelnen makrozyklischen Lactone, die ausreichend isoliert sind, so daß die Lösungsmittelfraktionen zur Erzielung reiner Verbindungen getrocknet werden können.

A. auranticolor ATCC 31011 produziert mindestens 4 Depsipeptide und mindestens ¹I makrozyklische Lactone. Die hauptsächlichen Komponenten sind jedoch die Depsipeptide Verbindungen 37,277 (größer) und 37,932 (geringer) und makrozyklische Lactone Verbindungen 36,926-(größer) und 35,763 (geringer).

Rohe antibiotische Gemische, die direkt aus der Brühe er-. halten wurden»und gereinigte einzelne-Komponenten besitzen breite antibakterielle Spektren. Zu den Organismen, die sich in Gegenwart der Antibiotika nicht vermehren,gehören Salmonella typhosa, Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium septicum, Bruceila abortus, Neisseria sicca, lactobacillus acidophilus und Pasteurella multocida.

Die erfindungsgemäßen Antibiotika können entweder als rohes Gemisch oder in Form der gereinigten Einzelkomponenten oder Gemische derselben bei der Behandlung verschiedener Infektionen bei Mensch und Tier eingesetzt werden. Im allgemeinen werden diese Antibiotika überaus wünschenswert in uäglichen oralen Dosen von 0,5 bis 1 g oder parenteralen Dosen von 100 bis 500 mg, abhängig von der Art und der Schwere der Infektion und dem Gewicht des zu behandelnden Patienten verabreicht.

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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern verabreicht werden und eine derartige Verabreichung kann sowohl in Einzel- als auch in Mehrfachdosen durchgeführt werden.

Zum Zwecke der oralen Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Excipienten,wie Natriumzitrat, Calciumcarbonat und Dicalciumphosphat enthalten, zusammen mit verschiedenen Disintegrantien, wie Stärke, Alginsäure und bestimmten komplexen Silikaten zusammen mit Bindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und . . Akaziengummi angewandt werden. Zusätzlich sind Gleitmittel, wie Magnesiumatearat, Natriumlaurylsulfat und Talk häufig für Tablettierungszwecke nützlich. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Types können ebenfalls als Füllstoffe in weich"und hart-gefüllten Gelatinekapseln angewandt werden. Bevorzugte Materialien umfassen Lactose ebenso wie PoIyäthylenglycole mit hohem Molekulargewicht. Werden wässrige Suspensionen und/oder Elixire für die orale Verabreichung gewünscht, kann der Wirkstoff darin mit verschiedenen Süßstoffen oder Geschmacksmitteln sowie zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Äthanol, Propylenglycol, Glycerin und verschiedenen Kombinationen derselben kombiniert werden.

Lösungen dieser Antibiotika in Sesam- oder Erdnußöl oder in wässrigem Propylenglycol können für parenterale Verabreichung angewandt werden.

Es ist interessant, daß die einzelnen Antibiotika der vorliegenden Erfindung antimikrobiell Wirksamkeit, welche

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größtenteils bakteriostatischer Natur ist, aufweisen. Hohe antibiotische Gemische oder Gemische eines gereinigten Depsipeptides und eines gereinigten makrozyklischen Lactons weisen synergistische Wirksamkeit auf, welche größtenteils bakterizider Natur ist.

Wenn das hauptsächliche makrozyklische Lacton Verbindung 36,926 (A) und das hauptsächliche Depsipeptid Verbindung 37,277 (B) einzeln und in Kombination durch die Röhrenverdünnungsmethode gegenüber den folgenden Organismen getestet wurden, so wurden die folgenden minimalen Hemmkonzentrationen in Mikrogramm/ml (M.I.C.) gefunden:

Organismus

Staph. aureus OO5 Staph. aureus 400 Strep, faecalis Ne.isseria sicca Trepbnema hyodysenteriae Strep, pyogenes Bacteroides jfragilis 356lH Clostridium inocuum Lactobacillus casei var. casei

A	B	5	Ai-B	rohes
		5		Gemisch
1,56	25		0,10>	<0,10
3,12	12,		O,78>	<0,10
100	12,	5	1,56	0,20
0,39	50		0,10	<0,10
—	—		—	0,19
0,39	12,	0,10	<0,10
25	50	0,78	0,78
6,25	>100	0,20	0,39

3,12 6,25JO,2O 0,39

Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, wenn das geringere mak ro zyklisch e Lacton Verbindung 35,763 (A¹) und das geringere Depsipeptid Verbindung 37,932 (B') individuell oder in geeigneten Kombinationen, d.h» A¹ A, B' A während (A'+B¹) (A'+B') (A+B·) (A+B), untersucht wurden.

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Maximale synergistische Wirksamkeit von Kombinationen von gereinigten makrozyklischen Lacton und Depsipeptid wird über einen Bereich von etwa einem Verhältnis von 1 bis 2:1 erhalten. Ungefähr solche Verhältnisse liegen in Fermentationsbrühen von A. auranticolor ATCC 31011 und in rohen antibiotischen Gemischen, die aus denselben isoliert wurden, vor. Dies steht im Kontrast zu anderen berichteten synergistischen antibiotischen Gemischen, wo die synergistischen Faktoren in Fermentationsbrühen und rohen Gemischen bei sub-optimalen Verhältnissen auftreten.

In vi vo^-S chut ζ-Daten, die durch orale und subkutane Verabreichung bei Mäusen, die experimentell mit einem Stamm von Staphylococcus aureus infiziert wurden, erhalten wurden, sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

(mg/kg)

S. aureus 0IAOO5

oral subkutan

Verbindung 36,926 >200 >200

Verbindung 37,277 >200 >200

Verbindungen 36,926 + 37,277"

(1:1) 210 60 rohes antibiotisches
Gemisch (Anteil 1,
Seite 29) 150-200 72-120

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Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind besonders als Wachstumsförderer bei Geflügel und Lebewesen aufgrund ihrer breiten antibakteriellen Spektren und für die Behandlung von Schweinedysenterie aufgrund ihrer markanten Wirksamkeit gegenüber Treponema hyodysenteriae, einer anaeroben Spirochäte, der an dieser Krankheit beteiligt ist, interessant.

Die wachstumsfördernde oder beschleunigende Wirksamkeit eines rohen antibiotischen Gemisches (Anteil 1, Seite29) wurde in einem 40 Tage-Versuch an jungen Schweinen (young feeder pigs) untersucht. Die durchschnittliche tägliche Zunahme, Nahrungsaufnahme und -nutzeffekt oder -Wirksamkeit wurden gegenüber den nichtbehandelten Kontrolltieren signifikant verbessert (p<O,Ol).Die bei diesem Versuch erhaltenen Daten sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Behandlung durchschnittl. durchschnitt1. Nahrungs-

tägl. Zunahme tägl. Nahrung Wirksamkeit (kg) (kg)

nicht behandelt 0,35 0,91 2,57 Anteil 1, Seite 29

(Lot 1; p.2.5) 50 ppm 0,63 1,35 2,15

⁺kg Nahrung pro kg Gewichtszunahme (lbs of feed per Ib).

Vergleichbare Resultate werden mit den anderen rohen antibiotischen Gemischen der auf Seite 29 (nage 21) beschriebenen Zusammensetzungen über einen Bereich von 10 bis 100 ppm erhalten.

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Vergleichbare Ergebnisse wurden ebenfalls durch Verabreichung der einzelnen individuellen Verbindungen 36,926, 37,932 und 37,277 oder Gemische der reinen Verbindungen, die 'mit der Zusammensetzung jenen der rohen antibiotischen

Gemische, die auf Seite 29 (page 21) beschrieben sind,
ähneln, erhalten.

Die Wachstumsfördernde Wirksamkeit wurde in einem Küken-Batterie-Nahrungs-Versuch demonstriert. Signifikante Verbesserungen (p<0,01) in der Gewichtszunahme gegenüber den nicht behandelten Kontrolltieren wurde für die Küken nach einer antibiotischen Nahrungsdiät beobachtet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

	Tabelle III	durchschnittl. verbrauchte Nahrung,g	Nahrungs- wirksamkeit
Behandlung	durchschnittl. Gewichtszunahme, g	. 939 9^9	1,66 1,56
nicht behandelt Anteil 1, Seite 29 10 ppm	566 608

Vergleichbare Ergebnisse wtirden mit den anderen rohen
antibiotischen Gemischen der auf Seite 29 beschriebenen
Zusammensetzungen über einen Bereich von 10 bis 100 ppm
erhalten.

Vergleichbare Ergebnisse wurden ebenfalls durch Verabreichung der einzelnen reinen Verbindungen 36,926,
37,932 und 37,277 oder Gemischen der reinen Verbindungen die in der Zusammensetzung jenen der rohen antibiotischen Gemische, die auf Seite 29 beschrieben sind, ähnlich sind, erhalten.

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Die prophylaktische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Antibiotika wurde an Schweinen, die experimentell mit infektiösem Material, das die Schweinedysenterie bewirkt, infiziert wurden, bestimmt. Dickdarminhalt und Schleimhaut-Untersuchungsmaterial (abgeschabt) wurden aus einem klinisch diagnostizierten Gebiet, in dem Schweinedysenterie ausgebrochen ist, erhalten. Normale Schweine wurden mit diesem Material durch direkte Inokulation infiziert. Antibiotika enthaltendes Futter wurde über eine Periode von 28 Tagen verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

	Tabelle IV	)	0	Sterblichkeit (X)	durchschnittl. tägliche Zunahme (kg)
Behandlung	Morbidität (X)	0	HO	-0,13
nicht behandelt	100	0
Anteil 1 (Seite29	0	0	0,66
50 ppm	50	0	0,57
37,5 ppm		0	0,68
25 ppm	0	0,61
12,5 ppm	10	0,1*7
6,25ppm

Vergleichbare Ergebnisse wurden über einen Bereich von 10 bis 100 ppm mit den anderen antibiotischen Gemischen von Seite 29, den reinen einzelnen Verbindungen 36,926, 37,932 und 37,277 oder Gemischen der reinen Verbindungen, die in der Zusammensetzung .jenen der rohen antibiotischen Gemische, die auf Seite 29 beschrieben sind, ähnlich sind, erhalten.

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Beispiel 1

Es wurde ein steriles wässriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

g/Liter

Glucose	pH	(digest) von Casein	10,0
lösliche Stärke			20,0
Hefeextrakt		7,0	5,0
Enzymatischer Extrakt		5,0
CaCO-,	1,0

Zellen einer Schrägkultur von A. auranticolor ATCC 31011 gezüchtet auf ATCC-Medium 172 wurden in eine Reihe von 300 ml fassenden Erlenmyer-Kolben, die .jeweils 50 ml dieses Mediums enthielten, gebracht und auf einer Rotations· Schüttelvorrichtung 3 bis H Tage bei 28 bis 30⁰C geschüttelt. Aliquote Teile von 5 ml des gezüchteten Inokulums wurden in 300 ml fassende Erlenmyer-Kolben, die jeweils 100 ml des vorstehend beschriebenen sterilen Mediums enthielten, transferiert. Nach 3 bis 4tägigem Schütteln bei 28 bis 30⁰C wurden 5 bis 10 % (V/V) des gezüchteten Inokulums in einen 4 Liter-Permentor, der 2 des folgenden sterilen Mediums enthielt, transferiert:

	Extrakt	von Casein	g/Liter
Hefeextrakt			2,0
Glucose	pH	7,0	10,0
Maiswasser		1 ml
enzymatischer		5,0
Kobaltchlorid		0,002

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ι t

ι t ι

* I I ■

Die Fermentation wurde 20 bis 30 Stunden bei 28 bis 36⁰C unter Rühren bei 1.700 Umdrehungen pro Minute und Belüftung von etwa 1 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute durchgeführt.

Die gesamte Brühe wurde auf pH 7, falls nötig, eingestellt und zweimal mit 1/3 bis 1/2 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wurde unter Vakuum konzentriert und durch Extraktion mit Petroläther entfettet. Die Aktivität der Brühe, des Lösungsmittelextraktes und der nachfolgenden Fraktionen wurde durch Silikagel-DttnnschichtChromatographie unter Verwendung von Chloroform-Äthanol (9:1) als Entwicklungssystem und Beobachtung unter UV-Licht bei 25¹I und 366 m,u verfolgt.

Das entfettete Lösungsmittelkonzentrat wurde unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Die Feststoffe wurden einer 6-Stufen-Craig-Gegenstromverteilung unter Verwendung von 5 Teilen Toluol, 2 Teilen Äthanol, 3 Teilen wässrigem Phosphatpuffer vom pH M, 5 unterworfen. Die abgetrennten Schichten liefern die oberen und unteren Phasen des Gegenstromverteilungs-Systems. Nach Verteilung wurden die Schichten durch DünnschichtChromatographie beobachtet.

Das Depsipeptid, Verbindung 37,277, ist in der unteren Schicht, hauptsächlich in Stufe 0 konzentriert. Ein zweites Depsipeptid, Verbindung 37,932, wird aus den oberen Schichten der Stufen 1, 2 und 3 gewonnen. Das mak.rozyklische Lacton, Verbindung 35,763 wird hauptsächlich in den unteren Schichten der Stufen 0 und 1 gefunden. Verbindung 36»926 ist in den unteren Phasen der Stufen 2, 3> *♦ und 5 konzentriert.

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Die obere Phase von Stufe O, die die Verbindung 37,277 enthält, wird unter Vak.uum getrocknet, in Chloroform gelöst und etwa 30 Minuten mit Aktivkohle gerührt. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Aceton gelöst und die Peststoffe werden durch Zusatz von Heptan ausgefällt. Die ausgefällten Peststoffe werden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und an einer Säule von auf pH 6 gepuffertem Silikagel in Chloroform:n-Propanol (99:1 58,V/V) chromatographiert. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem unter

2
einem Druck von 5,62 kg/cm entwickelt. Die Säulenschnitte bzw. Fraktionen werden durch DünnschichtChromatographie beobachtet. Die Fraktionen, die die abgetrennte Verbindung 37,277 enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum eingedampft und die Verbindung wurde aus Aceton-Heptan kristallisiert.

Die Verbindung 37,277 weist keinen bestimmten Schmelzpunkt auf. Die Zersetzung beginnt bei l40 bis 150°C. Sie ist unlöslich in Diäthylather, Hexan, Hept.an und Wasser. Sie ist gering löslich in Aceton und Benzol und leicht löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid.

Die Analyse von Verbindung 37,277 gibt die folgenden durchschnittlichen Anteile:

Kohlenstoff 60,91

Wasserstoff 5,98

Stickstoff 10,45

Sauerstoff(durch Differenz) 22,66

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Verbindung 37,277 ist optisch aktiv und weist eine Rotation von

LaJ^ =+11° (c = 1,0, Äthanol) auf. Seine UV-Absorptionsmaxima in Äthanol treten auf bei 225,274, 282, 303 und 355 mp mit E^ J_n -Werten von 309,3, 36,67, 45,01, 70 bzw. 20.

Das IR-Spektrum der Verbindung 37,277 ist aus Figur 1 ersichtlich. Eine Chloroformlösung zeigt charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen (in Mikron): 3,05, 3,40, 5,70, 5,77, 5,93, 6,07, 6,62, 6,82 und 7,67.

Die Gegenstrom-Fraktionen die die Verbindungen 35*763 und 36,926 enthielten wurden im Vakuum abgedampft, der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung wurde mit Silikagel gerührt. Die filtrierte Lösung wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und die Feststoffe wurden durch Zusatz von Hexan ausgefällt. Die ausgefällten Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und an einer Säule von auf pH 6,0 gepuffertemSilikagel, hergestellt in Äthylacetat, chromatographiert. Die Säule wurde mit Äthylacetat:Tetrahydrofuran: Hexan (80:20:20),-gesättigt mit wässrigem Phosphatpuffer, pH 6,0,unter einem Druck von 5,62 kg/cm entwickelt. Die erstei17-Säulen-Fraktionen, jeweils 20 ml, enthielten ein gelbes öl, welches verworfen wurde. Fraktionen 26 bis 40 sind reich an Verbindung 36,926. Fraktionen 41 sind größtenteils ein Gemisch von Verbindungen 36,926 und 35,763. Fraktionen 26 bis 40 wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und erneut an Silikagel chromatographiert,

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- 2k - ■

wobei 20 ml Fraktionen aufgefangen wurden. Die ersten 15-Fraktionen enthielten ein gelbes öl, welches verworfen wurde. Fraktionen 16 bis 30 waren hauptsächlich Verbindung 36,926. Fraktionen 31 - 40 enthielten ein Gemisch von Verbindungen 36,926 und 35,763. Fraktionen 16 bis 30 wurden im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und auf eine Säule von auf pH 6,0 gepuffertem Silikagel, hergestellt in Chloroform, gebracht. Die Säule wurde mit ChloroformtÄthanol

(95,5:^,5 %t V/V) unter einem Druck von 9,14 kg/cm entwickelt und 160 Fraktionen von 6 ml wurden aufgefangen. Die Fraktionen 60 bis 90 enthielten nur Verbindung 36,926. Sie wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in dem minimalen Volumen Äthanol gelöst und mit Äther ausgefällt, wobei die reine amorphe Verbindung 36,926 erhalten wurde.

Verbindung 36,926 ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Diäthylather, Hexan und Heptan.

Verbindung 36,926 weist keinen bestimmten Schmelzpunkt auf. Die Zersetzung beginnt bei etwa 100 C. Die Analyse ergibt die folgenden durchschnittlichen Anteile:

Kohlenstoff 57,89

Wasserstoff 6,78

Stickstoff 8,04

Sauerstoff (durch Differenz) 27,29

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Das Molekulargewicht, bestimmt durch hochauflösendes Massenspektrum,beträgt 501 und die Summenformel ist ^C26^H35^N3°7·

Verbindung 36,926 ist optisch aktiv mit einer Rotation von

/ajjp = - 130° (c = 1,0, Äthanol).

Sein UV-Absorptionsmaximum in Äthanol ist 21¹I πιμ mit

^Ei tm ^von 723,8.
ι cm

Das IR-Spektrum der Verbindung 36,926 ist aus Figur ersichtlich. Ein KBr-Pressling zeigt charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen (in Mikron): 2,95, 3,¹K), 5,75, 5,98, 6,23, 6,58, 6,87, 7,45, 8,25, 8,38, 8,80, 9,08, 10,15, 10,35, 11,10 und 13,30.

Diese Verbindung ist ähnlich oder ununterscheidbar von dem Antibiotikum A 2315 B, von dem auf der 14. Interscience Conference on Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 11. - 13. September 1974 berichtet wurde.

Verbindung 35,763 wurde in fast der gleichen Weise wie Verbindung 36,926 isoliert und gereinigt. Die reine Verbindung ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Diäthylather, Hexan und Heptan. Es liegt kein bestimmter Schmelzpunkt vor. Die Zersetzung beginnt bei etwa 100⁰C. Die Analyse ergiht die folgenden durchschnittlichen Anteile:

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Kohlenstoff 6l,29

Wasserstoff 6,73

Stickstoff 8,83

Sauerstoff (durch Differenz) 23,15

Das Molekulargewicht, das durch hochauflösendes Massenspektrum bestimmt wurde, ist 503 und die Summenformel ist C₃^H₅₇N₅O₇.

Die Verbindung 35,763 ist optisch aktiv mit einer Rotation von

CoJ^ - - 111° (c = 1,0, Äthanol). .

1 % Das UV-Absorptionsmaximum in Äthanol ist 218 ΐημ mit E. von 668,9.

Das IR-Spektrum der Verbindung 35,763 ist aus Figur 3 ersichtlich. Ein KBr-Pressling zeigt charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen (in Mikron): 2,95, 3,38, 5,73, 6,00, 6,23, 6,60, 6,88, 7,23, 8,25, 8,38, 8,83 und 10,20.

Verbindung 35,763 ist ähnlich oder ununterscheidbar von dem Antibiotikum A-2315, das in der holländischen Patentschrift 7 310 613 geschrieben ist.

Die Gegenstromfraktionen, die die Verbindung 37,932 enthielten, wurden unter Vakuum zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde mit Petroläther trituriert und an einer Silikagelsäule wie vorstehend beschrieben chromatographiert

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Die zugehörigen Fraktionen wurden vereinigt und aus Aceton:Heptan kristallisiert, wobei die Verbindung 37,932 erhalten wurde.

Die Verbindung 37,932 ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Diäthyläther, Hexan, Heptan und Wasser. Die Verbindung weist keinen bestimmten Schmelzpunkt auf. Die Zersetzung beginnt bei etwa l85°C. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden durchschnittlichen Anteile:

Kohlenstoff 59,¹Jl

Wasserstoff 6,01

Stickstoff 10,66

Sauerstoff (durch Differenz) 23,92

Verbindung 37,932 ist optisch aktiv mit einer Rotation von [CtJ²Jj⁰= + 5,0° (c = 0,25, CHCl₃). Die UV-Absorptionsmaxima in Äthanol liegen bei 226, 276, 283,305 und 355 mu mit E ^-Werten von 304,4 36,8 43,49 70,25 bzw. 20,07.

Das IR-Spektrum der Verbindung 37,932 ist aus Figur 4 ersichtlich. Ein KBr-Preßling zeigt charakteristische Absorption im IR-Bereich bei folgenden Wellenlängen:(in Mikron): 2,96, 3,05, 3,38, 5,68, 5,73, 5,93, 5,98, 6,13, 6,50, 6,58, 6,88,7,40, 7,65, 8,08, 8,45, 8,60, 9,03, 9,45, 9,70, 9,98, 10,55, 11,00^ 11,25, 11,60, 12,35 und 13,25.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen unter Anwendung eines Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt:

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g/Liter

Glucose	8,0
Tryptose	3,0
Enzymatischer Extrakt von Casein	1,0
Glutaminsäure	1,0
Soj amehl	0,5
NaCl	8,3
K2HPO11	2,4
KH2PO1,	2,0
MnCl2	0,02
Beispiel 3	-

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen unter Anwendung eines Permentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt:

g/Liter

Glucose 10,0

Sojamehl 10,0

Maiswasser 1 ml

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Erzielung vergleichbarer Ergebnisse bei Anwendung eines Fermentations· mediums der folgenden Zusammensetzung wiederholt:

	g/Liter
Melasse	10,0
Enzymatischer Extrakt von Casein	1,0
Hefeextrakt	2.0
Maiswasser	1 ml
Casein	3,0

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Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt. Der Methylisobutylketon-Extrakt der fertigen Permeηtationsbrühe wurde unter Vakuum getrocknet und der Rückstand wurde mit Petroläther trituriert. Das bröckelnde Material wurde gemahlen und die antibiotischen Komponenten wurden durch HochdruckflüssigkeitschroHiatographie quantitativ bestimmt. Repräsentative Anteile des rohen antibiotischen Gemisches wurden aus getrennten Fermentationsversuchen untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden(i):

Anteil Nr.	35,763	36,926	37,932	37,277	geringere Kom
					ponenten
1	8,5	32,0	8,7	19,3	1,3
2	3,1	39,5	7,8	15,9	1,2
3	6,0	38,6	10,7	25,5	2,4
i|	9,1	47,8	0,9	26,9	0,5
5		31,9	2,2	20,3	M

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Synergistisches antibiotisches Gemisch enthaltend Verbindungen 35,763,36,926,37,277 und 37,932 und verschiedene geringere antibiotische Komponenten, erhalten durch Kultivierung von Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen

   «...,- j· _Λ · ... und* enthält,,

   Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlen-fiStickstoffquellei bis wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten wird, und Abtrennung des antibiotischen Gemisches aus demselben.

   2/ Antibiotikum Verbindung 37,277, welche in kristalliner

   Form eine optische Drehung [⁰Q₀ = + 11° bei einer Konzentration von 1 % in Äthanol, Absorptionsmaxima in Äthanol im UV-Bereich des Spektrums bei 225, 274, 282, 303 und 355 πιμ mit E**_m -Werten von 309,3, 36,67» 45,01,70 bzw. 20, die durchschnittliche Gewichtszusainmensetzung von 60,91 % Kohlenstoff, 5,98 % Wasserstoff, 10,45 % Stickstoff und 22,66 % Sauerstoff (durch Differenz) und gelöst in Chloroform charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den Wellenlängen 3,05, 3,40, 5,70, 5,77, 5,93, 6,07, 6,62>6,82 und 7,67 Mikron aufweist.

   3.Antibiotikum Verbindung 36,926 mit der durchschnittlichen

   Gewichtszusammensetzung von 57,89 % Kohlenstoff, 6,78 % Wasserstoff, 8,04 % Stickstoff und 27,29 % Sauerstoff (durch Differenz) und der Summenformel C₂₆H₅₅N₃O₇, einer optischen Drehung von \SQ^° = -130° bei einer Konzentration von 1 Si in Äthanol, Absorptionsmaxima in Äthanol im UV-Bereich des Spektrums bei 214 πιμ mit E₁J_1n von 723,8 und charakteristische Absorption im IR-Bereich in KBr-Preßling bei den Wellenlängen 2,95, 3,40, 5,75, 5,98, 6,23, 6,58, 6,87, '

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   10,35 7,45, 8,25, 8,38, 8,80, 9,O3, 10,15>Tll,10, und 13,30

   Mikron.

   4. Antibiotikum Verbindung 37,932, welche in kristalliner Form eine optische Drehung von fcl-Q ^{= +} 5,0 bei einer

   Konzentration von 0,25 % in Chloroform, Absorptionsmaxima in Äthanol im UV-Bereich des .Spektrums bei 226, 276, 283 305 und 355 πιμ mit E^_m-Werten von 304,4, 36,8, 43,49, 70,25, bzw. 20,07, die durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 59,41 % Kohlenstoff, 6,01 % Wasserstoff, 10,66 % Stickstoff und 23,92 % Sauerstoff (durch Differenz) und in KBr-Preßlingen charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den Wellenlängen 2,96, 3,05, 3,38, 5,68, 5,73, 5,93, 5,98, 6,13, 6,50, 6,58, 6,88, 7,40, 7,65, 8,08, 8,45, 8,60, 9,03, 9,45, 9,70, 9,98, 10,55, 11,00, 11,25, 11,60, 12,35 und 13,25 Mikron aufweist.

   5. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, insbesondere eines synergistischen antibiotischen Gemisches, enthaltend Verbindungen 35,703, 36,926, 37,277 und 37,932 und verschiedene geringere antibiotische Komponenten, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes auranticolor ATCC 3IOII in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten wird, und das Antibiotikum oder das antibiotische Gemisch aus demselben abtrennt.

   6. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum gemäß -Anspruch 2 abtrennt.

   7· Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum nach Anspruch 3 abtrennt.

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   8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum nach Anspruch 4 abtrennt.

   9- Futtermittelzusammensetzung, enthaltend von etwa 10 bis etwa 100 ppm des antibiotischen Gemisches nach Anspruch 1 oder Verbindung 37,227 oder Verbindung 36,926 oder Verbindung 37,932 als Wirkstoff zur Erhöhung des Wachstums und Verbesserung der Futterleistung.

   10. Futtermittelzusammensetzung für Schweine, enthaltend

   von etwa 10 bis etwa 100 ppm des antibiotischen Gemisches nach Anspruch 1 oder Verbindung 37,277 oder Verbindung 36,926 oder Verbindung 37»932 als Wirkstoff zur Bekämpfung von Dysenterie bei Schweinen.

   Für: Pfizer.Inc.

   New York, N.Y., V.St.A.

   (Dr. HlChr. Beil)

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   Sl

   Leerseite