CS196262B2 - Method of producing antibiotics - Google Patents

Description

V literatuře zabývající · se ' . antibiotiky · je rozsáhle popisován synergismus: The Journal of Antibiotics 25, č. 6, 371 (1972), J. Chem. Soc. · 19C 1653 (1966); Bull. Soc. Chim. Belg. 68, 716 (1959); J. Amer. Chem. Soc. 82, 4414 (1960); Tetrahedron ' Letters · 2687 (1971); J. Antibiotics, · Ser. A · 14,' 14 (1961); Nátuře 187, 598 (1960), J. Chem. Soc. · 2286 (1960); Antimicrobial Agents and Chemotherapy 360 až 365 (1964); Tetrahedron Letters 4231 až 4238 (1966); Organic Mass

Spectrometry ·6, 151 až 166 (1972); Tetrahedron Letters 369 až 372 (1966) a J. Chem. Soc. 19C, 1669 až 1776 (1966).

Nové synergické směsi · antibiotik připravené podle tohoto vynálezu se připojují k jiným — již popsaným — synergickým směsím: mikamyclnu, pristinamycinu, ostreogrycinu, streptograminu, P. A. 114, vernamycinu a vlrglniamycinu.

Vynález se týká způsobu výroby směsi antibiotik produkovaných při submerzním aerobním pomnožování Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 ve vodném živném prostředí, jakož i izolace jednotlivých antibiotik z těchto směsí. Tyto směsi obsahující makrocyklické laktony -a depsipeptidy, mohou být odděleny a získány z fermentačního živného roztoku extrakcí rozpouštědlem, protiproudovým rozdělováním, sloupcovou chromatografií · nebo · jejich kombinací. Jednotlivé antibiotické složky mají významnou antibiotickou účinnost. Surová · antibiotická směs nebo kombinace čistého· makrocyklického · laktonu a čistého depsipeptidu získané ze surové směsi vykazují · značnou synergickou antibiotickou účinnost. Surová antibiotická směs, čisté jednotlivé antibiotické složky a směsi čistých makrocyklických laktonů a depsipeptidů jsou účinnými stimulátory růstu kuřat i vepřů a léčivem při potírání dysenterie· vepřů.

Způsob výroby těchto antibiotik podle přítomného vynálezu spočívá v tom, že se kultivuje mikroorganismus Actinoplanes auranticolor · ATCC 31011 za submerzních 'aerobních podmínek · ve vodném 'živném prostředí obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku a dusíku, s výhodou za teploty 28 · až 36 °C a s výhodou při pH kolem 7, a po skončení kultivace se antibiotická směs izoluje z filtrátu kultury nebo· z mycelia, například rozpouštědlovou extrakcí chloroformem, ethylacetátem nebo methylisobutylketonem, načež se odstraněním extrakčního činidla získává pevný zbytek antibiotické směsi.

Jejím popřípadě dalším zpracováním, například protiproudovým rozdělováním nebo/a chromatograficky se izolují jednotlivá

antibiotika, a· to ' makrocyklické laktonové . sloučeniny 36 926 a 35 763, a depsipeptidóvá sloučenina 37 277, popřípadě 37 932.

Mikroorganismus použitelný pro přípravu antibiotik podle tohoto vynálezu byl izolován ze vzorku půdy v Egyptě. · Rostl na bramborovém agaru s mrkví a bylo zjištěno, že náleží do· třídy aktinomycet vytvářejících sporangia, · jako je tomu u rodu Actinoplanes. Proto byl pěstován na četných prostředích užívaných pro studium tohoto rodu. Suspenze kultury byly připravovány rozmělněním kousků kultury, pocházejících · ze šikmých agarů, v malých zkumavkách obsahujících pokaždé asi 0,2 ml sterilní destilované vody, vypláchnutím · obsahu a spojením obsahu s dalším množstvím sterilní vody na objem asi 5 ml pro kulturu. Tyto suspenze · se užívají · k pěstování kultur v různých prostředích ve zkumavkách, v šikmých kulturách · nebo v Petriho miskách. Inkubační teplota byla 28 °C, pokud není uvedeno jinak. Odečítání · výsledků - u některých testů se provádělo po uplynutí · doby 22 dnů, ale většina výsledků se zaznamenávala po 14 dnech. Barvy · kultur jsou podle Maerze a Paula, Dictionary of Colors, 2. vydání 1950, stejně jako osobní popisné názvy. Tato nová kultura (Pfizer F. D. 24090] byla ··uložena v Americké sbírce typových kultur (ATCC) v Rockvilu {Maryland] 11. března 1974 a byla označena jako Actinoplanes auranticolor ATCC 31011. Stálé uložení a snadná dostupnost kultury pro veřejnost bude zajištěna v případě udělení patentu. Do rozhodnutí o přihlášce · vynálezu platí pro dostupnost kultury pravidla 14. a 35 USC 112. Všechna omezení dostupnosti · · kultury · pro veřejnost budou neodvolatelně - · zrušena po udělení patentu.

Identifika^c^e!- prostředí · užívaných · k · charakterizaci kultury a · odkazy na · jejich složení · jsou, následující:

1. ·2%· · vodný agar

- 2. · Bramborový · agar s mrkví Μ. P. Lechevalier, J. Lab. and Clin. Med. 71, 934—944 (1968). Používá se jenom 30 g · bramboru a 2,5 ,g· mrkve, ale 20 · g · agaru.

, · 3. Gzapkův sacharózový · agar. Waksman, S. A.; · The Actinomycetes 2, 328 (1961) Médium Č. ·1, str., 328. .

- 4. · · Glukózo-asparaginový agar. Waksman, viz předcházející bod,· Médium, č. 2, str. 328.

5. Agar · z kvasničného a sladového výtažku, Accinotics · Ann. 1956 · (1957), str. 947 až 953.

6. Hickeyův a Tresnerův agar. J. Bact. 64, 891 až 892 (1952).

7. Bramboro-glukózový · agar. Oloupe se, na · drobno · rozkrájí a · v páře uvaří 100 g brambor s 500 · ml vody, profiltruje tkaninou, přidá se 10 · g glukózy, 20 g agaru a doplní vodou na jeden litr.

8. Škrobový agar. J. Bact. 73, 15 až 27, (1957).. ......

9. Želatina J. Bact. 73, 15 až 27 (1957).

10. Tyrosinóvý agar. J. Bact. 69, 147· až 150 (1955).

11. Peptonový železitý agar Difco.

12. Sbírané mléko Difco.

13. Dextrózo-nitrátové živné prostředí. Waksman S. A., The Actinomycetes · 2, 328 (1961). Prostředí č. · 1 se 3,0 g glukózy namísto sacharózy a bez agaru.

14. Organické nitrátové živné prostředí. J. Bact., 73, 15 až 27 (1957).

15. ATCC prostředí 172. Katalog ATCC, 10. vydání, str. 235 (1972).

16. Využívání · uhlíku, J. Bact., 56, 107 až 114 (1948).

Popis této nové kultury je následující:

Vodný agar — .slabý růst, tenký, plochý blízký 9D2 (velmi bledá růžová), žádné vzdušné mycelium; substrátové mycelium bezbarvé podle 9D2, žádný rozpustný pigment.

Czapkův sacharózový · agar — růst mírný až dobrý, plochý, · blízký · 9G6 (bledá pomerančová), žádné · vzdušné mycelium, · substrátové mycelium blízké · 9G6, žádný · rozpustný pigment.

Glukózo-asparaginový agar — růst mírný, vystouplý, · drsný, blízký 9L9 (světle pomerančová), žádné vzdušné mycelium, žádný rozpustný pigment.

Agar s kvasničným a sladovým· výtažkem — žádný · růst. ’

Hickeyův a Tresnerův agar — růst mírný až · dobrý, · lehce vystouplý · a drsný, blízký 9F9 (mdlá · oranžová), slabý bělavý výkvět na povrchu, substrátové · mycelium · blízké 918, světle nahnědlý, · rozpustný pigment.

Bramboro-glukózový agar — · růst mírný, vystouplý, drsný, blízký · 9L9 (světle oranžový)·, žádné vzdušné mycelium, substrátové mycelium blízké 9L9, · žádný rozpustný pigment. . .

Tyrosinový agar — růst slabý až mírný, plochý, blízký 13A10 (mdlá načervenalá oranžová), žádné vzdušné , mycelium,· substrátové mycelium blízké 10D11, hnědý rozpustný pigment. :

Želatina — růst mírný, blízký 9K12 (načervenalá oranžová), stopy bělavého výkvětu, substrátové mycelium blízké 9K12, žádný rozpustný · pigment.

Škrobový agar · — růst mírný · až dobrý, vystouplý, blízko 9K10 (oranžová),· · lehký bělavý výkvět, substrátové mycelium · blízké 9K10, · bledě žlutý rozpustný pigment.

Škrob byl slabě hydrolyzován, zkapalnění želatiny bylo silné, dusičnany nebyly · redukovány v dusitany v žádném z nitrátových prostředí ani .. po · době 22 · dní . (růst byl velmi · slabý v · dextrózo-nitrátovém . živném prostředí, ale · dobrý v organickém · nitrátovém živném prostředí), . sirovodík vznikal · v malém množství, ,v peptonovém železitém agaru nebyl žádný . rozpustný · pigment, mléko se nesráželo ., a . . nehydroiy.žovalo · ani po . uplynutí doby 22· · dní, tý.rósin nebyl natráven, k růstu ·· na ATCC prostředí 172 došlo při teplotě · 28 . až ‘3.7 . . °C, . při '„'.teplotě . 45 °C nedocházelo · k · žádnému růstu. Byla · využívána arabinóza, fruktóza, glukóza, · manitol, . ráfinóza, rhamnóza,. sacharóza, inozitol .nebyl využíván. · Na žádném prostředí nevznikal zápach. · ’ ’ ' - .

Sporangia . vznikají-.· pouze . na. · . bramborovém agaru · s mrkví. LVy^tt^c^jřeíí · palisádovou vrstvu. · Rozměry jsou;·5,5 až · 11· x 4,5· ·až .8 mikronů (šířka) a 9 až · · 12 mikronů . · (výška). Jsou velmi početné, nepravidelného · tvaru a uvolňují spóry za postupného · . měknutí. Sporangia · z bramborového · agaru .s . mrkví · uvolňuíí · · p^o třídenní inkubaci během několika hodin · spory při teplotě asi-. 21 “C; . ponoří-li se kousky kultury do . malého množství roztoku 1 g glukózy , · .a · T· ml Tweenu 80 · · v jednom litru vody (modifikace . roztoku · používaného M. · L. Hig-ginsem, J. Bact.,-94, 495 až 498, (1967). · Spóry · jsou, v řetězcích nepravidelného tvaru ve · .sporangiích, . ale ·. po uvolnění jsou téměř kulovité a 1,6 mikronu široké až široce: eliptické, 1,6 až .2,2 x 1,1 až 1,6 mikronu. Téměř všechny jsou pohyblivé. . . ’ 7,--:

. · Pokus o identifikaci · · vedl ke srovnání této · kultury s · A. auranticolor ATCC · · 15300. Nový kmen A, · . auranticolor ATCC 31011 a A. · auranticolor ATCC 15330 mají v podstatě podobný · vzhled v morfologických vlastnostech, barvě a rozpustném pigmentu · na · Bennettově agaru, na živném · agaru, na agaru s kvasničným výtažkem, · na glukózo-asparaginovém agaru, glycerol-asparaginovém · agaru, kalciummalátovém agaru a tyrosinovém agaru. Ani jedna kultura neredukuje dusičnany v dusitany; obě produkují slabě sirovodík · a nemají schopnost vytvářet melanin na · pepton-železitém agaru; obě hydrolyzují Škrob. A. · auranticolor ATCC 15330 · nepůsobí žádnou změnu ve zkumavkách se sbíraným mlékem, . kdežto nová kultura . působí vyčeření ve třech ze šesti zkumavek použitého mléka a po uplynutí doby 21 dnů tvoří žlutě-krémový rozpustný pigment.

A. auranticolor aTcC 31011 využívá glukózu, · · arabinózu, fruktózu, manitol, rafinózu, · · rhomnózu, sacharózu a xylózu. A. auranticolor ATCC 15330 využívá všechny tyto cukry s výjimkou rafinózy. Sporangia a spóry těchto dvou kultur · ·mají. . podobně · jako spóry A. auranticolor 15330 spíše tyčovitý tvar. ,

Nejdůležitější je, že A. auranticolor ATCC 15330 nemá antibiotický účinek za podmínek · fermentace, při kterých A. auranticolor ATCC 31011 tvoří směs antibiotik: podle tohoto vynálezu. .

Kultivace A. auranticolor ATCC. 31011. s výhodou probíhá ve vodných živných prostředích při teplotě . 28 až 36 °C za submerzních aerobních podmínek a za třepání. · Živná prostředí, která . lze · · -používat · · pro tyto účely obsahují zdroj · asimilovatelného uhlíku, jako například jsou cukry, škrob a melasa, zdroj organického · dusíku · jako je například kasein, enzymaticky hydrolyzovaný kasein, mouka . ze sójových · bobů,· . · mouka z bavlníkového semene, . mouka ze semen · podzemnice olejně a pšeničný lepek. S příznivými výsledky mohou být rovněž využívány jako · zdroje · · růstových látek lihovarské · · výpalky, · · rybí moučka, · kvasničný . výtažek · ·a rovněž · tak soli · jako chlorid sodný a .. uhličitan vápenatý a stopové minerá.lie,.. . jako železo, · hořčík,, zinek, · kobalt, mangan. Dochází-li · během · fermentace k · přílišnému · pěnění, mohou být do· fermentačního prostředí přidány-protipěnicí činidla · j-ako . rostlinné oleje nebo · silikony. prostředí · v tancích,·, pro · submerzní . růst je s výhodou udržováno v · poměru asi % až 2 objemy vzduchu na objem živné půdy za minutu. Třepání může být prováděno pomocí třepaček běžně užívaných v kvasném průmyslu. Během přenosu organismu a po celou dobu jeho růstu musí být ovšem zachovány aseptické podmínky.

Inokulum pro přípravu antibiotické směsi se může získat použitím nárůstu . ze šikmých kultur v prostředí jako je například ATCC prostředí 172, ke kterému byl výše uveden odkaz. Nárůsty · mohou být použity buď k inokulaci třepacích lahví nebo očkovacích tanků, popřípadě očkovací tanky mohou být očkovány z třepacích · lahví. Maxima růstu v třepacích lahvích je . dosahováno asi · během čtyř dnů, zatímco inokulum v · submerzních očkovacích tancích · . je v nejvýhodnějším stavu během doby 2 až 3 dnů. Podstatného antibiotického účinku se dosahuje v závěrečném stadiu fermentace po uplynutí doby 20 až 30 hodin. - .

Tvorba antibiotik se pohodlně sleduje během fermentace . biologickými · testy živné půdy za použití citlivého kmene Sta-phylococcus aureus. Užívá se standardního zkoušení na miskách, při kterém inhibiční zóna obklopující disk · filtračního papíru nasyceného živnou půdou .se používá jako míra · antibiotické účinnosti. Když fermentační půda dosáhne žádané hladiny antibiotické účinnosti, izolují se produkty buď · z celé · živné půdy, nebo z filtrátu z . živné půdy. Ve · druhém případě se mycelium odstraní filtrací nebo odstředěním. Mohou být využívány ty7 py zařízení jako tlakové filtry, odstředivky atd. ·

Pro analyzování antibiotické směsí vytvořené ve fermentačních prostředích a pro analýzu složení surových a čištěných materiálů extrahovaných - z . vyfermentovaných živných půd ' se využívá chromatografie na tenké vrstvě užívající silikagelů. -Rozlišení složek antibiotické směsi je především závislé na antibiotické účinností systému. Příliš malá antibiotická účinnost - znemožňuje odkrytí . minoritních . antibiotických složek příliš velká antibiotická účinnost vede k závojování a tím k výsledku s malým rozlišením.

Vyvíjecí -soustava pro chromatografii na tenké vrstvě je chloroform — ethanol (9 : : 1). Chromatogramy z chromatografie .na tenké vrstvě mohou být po vyvinutí pozorovány v ultrafialovém' světle při 254 ιημ a 366 mu. B^oí^i^toj^irafická detekce antibiotických složek může být ' provedena potažením tenké vrstvy živného agaru citlivým kmenem . Staphylococcus aureus nebo jiným citlivým organismem.

' Primárními komponentami v -antlbíotických Směsích produkovaných A.' auranticolor ATCC 31011 jsou různé makrocyklické laktony a - depsipeptidové antibiotické komponenty. Složení těchto antibiotických směsí se ' mění od fermentace - k fermentaci a je funkcí času, hodnoty pH, ' složení prostředí atd. Za podmínek uvedených v příkladech provedení jsou ' významnějšími antibiotickými komponentami v antibiotických směsích sloučeniny: 37 277 (depsipeptid) a 36 926 (makrocyklický . lakton), zatímco méně ' významnými antibíotickými složkami jsou sloučeniny 37 932 (depsipeptid) a 35 763 - (makrocyklický lakton).

Makrocyklické laktony jsou sloučeniny obsahující kruh s - více než 8 atomy uhlíku a také laktonové seskupení, depsipeptidy - jsou cyklické polypeptidy s laktonovým seskupením.

Složky antibiotických - směsí mohou ' být odděleny a - získány z vyfermentované živné půdy různými postupy, - jako je ' rozpouštědlová extrakce, - Craigova protiproudová extrakce, sloupcová chromatografie nebo kombinace těchto - metod. Pro extrakci antibiotik z živné půdy jsou použitelná různá organická rozpouštědla, jako je - chloroform, ethylacetát a methylisobutylketon. Extrakce' rozpouštědlem se s výhodou provádí dvojnásobnou extrakcí živné půdy při pH 7, objemem rozpouštědla ' rovnajícím se přibližně Vs až % objemu živné půdy, - ze které -se má získat směs antibiotik. Podle - objemu živné půdy jsou pro extrakční účely použitelná extrakční zařízení, například dělicí nálevky, míchací tanky a - mechanická extrakční zařízení, například' odstředivky.

Výhodný způsob oddělování a získávání složek antibiotických směsí je následující:

celá nebo vyčeřená živná půda - se upraví na hodnotu pH 7 a dvakrát se extrahuje Vs až

B

V2 objemu methylisobutylketcinu. Extrakt se zahustí ve vakuu a koncentrát se odtuční heptanem nebo p etroletherem. - Odtučněný koncentrát se potom odpaří do - sucha ' 'za vakua. Pevný odparek - se podrobí Craigovu protiproudému dělení (6 pater) za použití směsi toluen, 5 dílů : ethanol, 2 díly -: - vodný fosfátový pufr o hodnotě pH ' 4,5, 3 díly. Po rozdělení vrstev na horní a dolní fázi v -protipiOudném dělicím postupu se fáze sledují tenkovrstevnou chromatografii. Oddělené frakce se odpaří ve^vakuu.

Pevné - odparky obsahující depsipeptidy se rozpustí v chloroformu, odbarví se aktivním -uhlím a po filtraci se odpaří ve - vakuu do sucha. Zbytek získaný odpařením chloroformu se rozpustí v - acetonu. Pevná látka vysrážená přidáním héptanu se rozpustí v - malém množství chloroformu a nanese na sloupec pufrovaného silikagelů (hodnota pH 6) ve - směsi chloroform: n-propanol (9S9:1 % obj/obj). Sloupec - . se vyvíjí ve stejné - směsi rozpouštědel pod - -tlakem 0,55 MPa. Jednotlivé odebrané frakce se chromatografují na tenké vrstvě. - Frakce.- obsahující -rozdělené depsipeptidy se - spojí, odpaří ve ' vakuu a krystalují - -ze směsi .. '.aceton — heptan.

Frakce' z - protiproudů extrakce, které obsahují makrocyklické' - - laktony se spojí, - . odpaří za vakua a odparek je vyjmut - ethylacetátem. - Roztok - se ' ' míchá se silikagelem, filtruje a rozpouštědlo se odstraní ' za vakua. Odparek se opět ^: - vyjme - ethylacetátem - a sráží přidáním hexanů. - Pevné látky se rozpustí v- malém množství - chloroformu a chromatografují pod tlakem - 0,55 MPa. Na sloupci pufrovaného silikagelů (hodnota pH 6) v ethylacetátu. Vyýíjející směs má složení ethylacetát — tetrahydrofuran — hexan J80 : 20 : 20) a je nasycena vodným fosfátovým pufrem (hodnota - pH 6). Jednotlivé oddělené frakce se sledují chromatograficky na tenké vrstvě. Frakce obsahující oddělené makrocyklické laktony se spojí a odpaří ve vakuu. Jednotlivé - frakce jsou děleny Craigovým protiproudým- . dělením nebo/a sloupcovou chromatagrafií 'zá použití různých vyvíjecích soustav. Péčlivou identifikací v každé čisticí operaci se zajišťuje, že jednotlivé makrocyklické laktony jsou dostatečně - izolovány tak, že kapalné frakce mohou být odpařeny a získány čisté sloučeniny.

Actinoplanes aurWticolor ATCC 310100 produkuje nejméně - čtyři depsipeptidy a nejméně čtyři makrocyklické laktony. Avšak primárními složkami jsou depsipeptidy: sloučeniny 37 277 (významný) a 37 932 (méně významný), a makroč^ykllcké laktony: sloučeniny 36 926 (významný)' a 35 763 (méně významný).

Surové antibiotické ' --'směsi přímo získané z živné půdy a vyčištěné jednotlivé složky mají široká antibákteriální spektra. Jako . mikroorganismy, které .-'přestávají pomnožovat v přítomnosti těchto-· ' antibiotik, jsou Salmonella typhosa, ' -' ’·. Shigella dysenteriae,

Escherichia - coli, Klebsiella pneumoniae, Sta196262 phylocočcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus fecalis, Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium septicum^ Brucella abortus, Neiseria sicca, Lactobacillus acidophilus a Pasteurella multocida.

Antibiotika připravená podle tohoto vynálezu, buď jako surové směsi, nebo ve formě čištěných jednotlivých složek nebo jejich směsí, mohou být používány při potírání různých infekcí u lidí a zvířat. Všeobecně je u těchto antibiotik ,nejvhodnější podávání v denních perorálních dávkách 0,5 až 1 g, nebo v parenterálních dávkách od 100 do 500 mg v závislosti na typu a závažnosti infekce a na váze léčeného organismu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být , podávány samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky použitelnými vehikuly, a takto mohou být. podávány v jednotlivých nebo vícenásobných dávkách.

Tablety pro účely perorálního podávání obsahují různá plnidla, jako například citrát sodný, uhličitan vápenatý a střední fosforečnan vápenatý a mohou být přidána různá rozvolňovadla, jako například škrob, kyselina alginová a komplexní křemičitany, společně s pojivý, jako je například polyvinylpyrrolidon, sacharóza, želatina a arabská guma. Kromě toho se často používají i kluzné látky, jako je stearát horečnatý,* sodná sůl kyseliny laurylsulfonové a mastek pro tabletovací účely. Přípravky v tuhé formě podobného typu mohou být používány jako náplně do měkkých a tvrdých želatinových kapslí, vhodnými materiály jsou laktóza, dále také vysokomolekulární polyethylenglykoly. Vodné suspenze nebo/a elixíry jsou vhodné pro perorální podávání, jejich základní složka může být kombinována s různými sladidly nebo chuťovými látkami, jakož i s ředidly, jako je například voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a jejich směsi.

Roztoky těchto antibiotik v sezamovém a podzemnicovém oleji nebo ve vodném propylenglykolu mohou být používány pro parenterální podávání.

Je zajímavé, že jednotlivá antibiotika podle tohoto vynálezu vykazují antimikrobiální účinek, který je velkou měrou bakteriostatické povahy. Avšak surové antibiotické směsi nebo směsi čištěných depsipeptidů a čištěných makrocyklických laktonů vykazují synergický účinek, který je převážně baktericidní povahy.

Při zkoušení majoritního makrocyklického laktonu, sloučeniny 36 926 (A) a majoritního depsipeptidů, sloučeniny 37 277 [B] jednotlivě a ve směsi zřeďovací metodou ve zkumavkách proti následujícím, mikroorganismům byla zjištěna minimální inhibiční koncentrace v mikrogramech/ml/MIC:

MikroorganismusA

Štaph. aureus 0051,56

Staph. aureus 4003,12

Strept. faecalis100

Neisséria sicca0,39

Treponemahyodysenteriae—

Střep, pyogenes0,39

Bacteriodes fragilis 35 61425

Clostridium inocuum6,25

Lactobacillus cassi var. casei3,12

В	A + В	Surová směs
25	0,10 >	< 0,10
12,5	0,78 >	< 0,10
12,5	1,56	0,20
50	0,10	< 0,10
—	—	0,19
12,5	0,10	< 0,10
50	0,73	0,78
> 100	0,20	0,39
6,25	0,20	0,39

Srovnatelné výsledky byly získány při zkoušení minoritního makrocyklického laktonu, sloučenina 35 763 (A‘), a minoritního depsipeptidů, sloučenina 37 932 (B‘), jednotlivě nebo ve vhodných koncentracích, tj. A‘sA, B‘===B nebo (A‘ + B‘j = (A‘ + B‘) = ξ [A + B‘) = (A Η-B).

Maximální synergické účinnosti směsí čistých makrocyklických laktonů a depsipeptidů se dosahuje jejich poměr asi 1 až 2 :1. Přibližně takovýto poměr složek se vyskytuje ve vyfermentovaných živných půdách. A.

auranticolor ATCC 31011 a v surových antibiotických směsích z nich izolovaných. Toto zjištění je v rozporu s jinými popsanými synergickými směsmi, kde se synergické faktory jeví ve vyfermentovaných půdách a surových směsích při suboptimálních poměrech.

Údaje zjištěné in vivo o ochranném účinku dosaženém při perorálním a subkutánním podávám u myší pokusně infikovaných kmenem Staphylococcus aureus jsou podány v následující tabulce.

TABULKA

Hodnoty PDso (mg/kg)

S. aureus 01A005

	perorálně	subkutánně
sloučenina 36 926	200	200
sloučenina 37 277	200	200
sloučenina 36 926 + sloučenina 37 277 (1:1)	210	60
surová antibiotická směs	150 až 200	72 až 120

6'29 2

Příklad 1

Sterilní vodné prostředí má následující složení a připravuje . se:

gramy/litr glukóza10,0 škrobový roztok20,0 kvasničný extrakt5,0 enzymatický kaseinový hydrolyzát 5,0· uhličitan vápenatý ·1,0 pH — 7,0

Buňky ze šikmého agaru Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 narostlé na ATCC prostředí 172 se přenesou do série 300mililitrových Erlenmeyerových baněk, ' z nichž· každá obsahuje 50 ml tohoto prostředí a míchá se na rotační třepačce po dobu 3 až 4 dnů při teplotě 28 až 30 °C. Alikvotní část o objemu 5 ml vzrostlého inokula se přenese do 300 ml Erlenmeyerových ' baněk, z nichž každá obsahuje 100 ml sterilního prostředí popsaného výše. Po· 3- až 4denním míchání při teplotě 28 až 30 °C se. 5 až 10 objemových % vzrostlého inokula přenese do čtyrlitrového fermentačního tanku, který obsahuje dva litry sterilního prostředí následujícího složení: .

gramy/litr kvasničný extrakt ,2,0 glukóza10,0

Corn steep · liquor 1ml enzymatický kaseinový hydrolyzát 5,0 chlorid kobaltnatý0,002 pH — 7,0

Fermentace se provádí po dobu 20 až 30 hodin při teplotě 30 °C za míchání při 1700 otáčkách/minuta a prρvzCušňování asi jedním objemem vzduchu na jeden objem živné půdy za minutu.

Celá živná půda se upraví, jestliže je toho třeba, na hodnotu pH 7 a dvakrát se extrahuje Us až ¥2 svého objemu methylisobutylketonem. Extrakt se zahustí za sníženého tlaku a odmastí extrakcí petroletherem. Účinnost v živné půdě, extraktu a následujících frakcích se sleduje chromatógrafií na tenké vrstvě silikagelu v systému chloroform—ethanol (9:1) a pozorováním pod ultrafialovým světlem pří 254 a 366 ταμ.

Odtučněný koncentrát se za sníženého tlaku odpaří do sucha. Pevná látka se podrobí Craigovu protiproudému dělení na 6patrové aparatuře za použití toluenu, 5 dílů ethanolu, 2 díly: vodný fosfátový pufr, hodnota pH 4,5, 3 díly. Oddělené vrstvy poskytují horní a dolní fáze protiproudého rozdělovacího systému. Po rozdělení jsou vrstvy sledovány chromatografii ná ' tenké vrstvě.

Depsipeptid, sloučenina 37 277 se koncentruje v horní vrstvě, výhodně na 0. patře. Druhý depsipeptid, sloučenina 37 932 se získá z horní vrstvy na patře 1, 2, 3. Makrocyklický lakton, sloučenina 35 763 se přednostně nalézá v nižších vrstvách pater 0 a 1. Sloučenina 36 926 ' je obsažena ve .vyšší koncentraci v nižších fázích pater ' 2, 3, 4 a 5.

Vyšší fáze na patře 0, která obsahuje sloučeninu 37 277, se za sníženého tlaku odpaří dó sucha, rozpustí v Ohloroformu a míchá asi 30 minut s aktivním uhlím. Roztok se zflltruje a odpaří za sníženého, 'tlaku. Zbytek se rozpustí v acetonu a pevná látka se vysráží přidáním heptanu. Sraženina se rozpustí v malém množství chloroformu a chromatografuje se na sloupci silikagelu pufrovaném na hodnotu pH 6 směsí rozpouštědel chloroform : n-propanol (99 :.l % . objem/ /objem). Sloupec se vyvíjí ve stejném systému rozpouštědel pod tlakem 0,55 MPa. Jednotlivé frakce jsou sledovány ' chromatografií na tenké vrstvě, Frakce obsahující oddělenou sloučeninu 37 277 se spojí, odpaří za sníženého tlaku a sloučenina se krystaluje ze směsi aceton — heptan.

Sloučenina 37 277 nemá definovanou teplotu tání. Rozklad nastává při teplotě 140 až 150 °C. Tato sloučenina je nerozpustná v diethyletheřu, hexanu, heptanu a benzenu a snadno' rozpustná v methanolu, ethanolu, chloroformu a methylenchlóridu.

Průměrná analýza sloučeniny 37 277 : 60,91 procenta uhlíku, 5,98 Vo vodíku, 10,45 % dusíku, 22,66 % kyslíku (z rozdílu).

Sloučenina 37 277 je' opticky aktivní a vykazuje optickou otáčivost [a]o25° - + 11° (c = 1,0, EtOH). Ultrafialová ' absorpční spektra byla pořízena v ethanolu a vykázala maxima při 255, 274, 282, 303, 355 ταμ s hodnotami E ' 309,3, 36,67, 45,01, 70 a 20.

Infračervené spektrum sloučeniny 37 277 je na připojeném obr. 1. Chloroformový roztok vykazuje charakteristické absorpce v infračervené oblasti při následujících vlnových délkách v mikronech: 3,05, 3,40, 5,77, 5,93, 6,07, 6,62, 6,82 a 7,67.

Frakce z protiproudového roztřepávání obsahuje jsloučeniny 35 763 -a 36 926, se odpaří za sníženého tlaku, zbytek se vyjme do ethylacetátu a roztok se míchá se silikagelem. Přefiltrovaný roztok se odpaří za sníženého tlaku, zbytek se vyjme ethylacetátem a pevné látky se vysrážejí přídavkem hexanu. Vysrážené pevné látky se rozpustí v malém množství chloroformu a chromatografují na sloupci silikagelu v ethylacetátu pufrovaném na hodnotu pH 6,0. Sloupec se vyvíjí směsí ethylacetát : tetrahydrofuran : hexan (80:20:20) nasycenou vodným fosfátovým pufrem (pH ' 6,0) při tlaku 0,55 MPa. Prvních 17 frakcí, každá po 20 ml, obsahuje žlutý olej, který se odloží. Frakce 26 až 40 obsahují převážně sloučeninu 36 926. Frakce 41 až 50 jsou směsí sloučenin 36 926 a 35 763. ' Frakce '26 až 40 se spojí, zahustí za sníženého tlaku

1ЙВ262 á opět' chromatografují na silikagelu, přičemž se odebírají 20milllitrové frakce. Prvních 15 frakcí obsahuje žlutý olej, který se odloží. Frakce 16 až 30 obsahují především sloučeninu 36 926, Frakce 31 . až 40 obsahují směs ' sloučenin 36 926 a 35 763, frakce 16 až 30 se . odpaří za sníženého tlaku, zbytek se rozpustí v malém množství chloroformu a nanese na sloupec pufrovaného silikagelu (pH 6,0) v chloroformu. Sloupec se vyvíjí směsí chloroform: ethanol (95,5:4,5 % objem/objem) při tlaku 0,9 MPa a odebere se 160 frakcí po 6 ml. Frakce 60 až 90 ' obsahují pouze sloučeninu 36 926. Tyto frakce se spojí a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v minimálním množství ethanolu a vysráží etherem, čímž poskytne amorfní čistou sloučeninu 36 926.

Sloučenina 36 926 je rozpustná ' v methanolu, ethanolu, chloroformu a methylenchloridu. Je nerozpustná .v diethyletheru, hexanu a heptanu.

Sloučenina 36'926 nemá definovanou teplotu tání. Rozklad začíná okolo tepoty 100° Celsia.. Průměrná analýza sloučeniny:

uhlík 57,,89 % vodík 6,78 % dusík 8,04 % kyslík ' (z . rozdílu) 27,29 %

Molekulová váha zjištěná z hmotových spekter s vysokým rozlišením je 501 a sumární vzorec C35H36N5O7.

Sloučenina 36 926 je opticky aktivní, a vykazuje otáčivost [a]n25° = —130° (c . = 1,0, EtOH). Její ultrafialová’ absorpční spektra v ethanolu vykazují ' maxiníum 214 ταμ s hodnotami E 1 * 723,8. ,

Infračervené spektrum sloučeniny 36 926, obrázek 2, je připojeno. Spektra · získaná KBr technikou vykazují charakteristickou absorpci ' V infračervené oblasti při následujících vlnových délkách v mikronech: 2,95, 3,40, 5,75, 5,98, 6,23, 6,58, 6,87, 7,45, 8,25, 8,38, 8,80, 9,08, 10,15, 10,35, 11,10 a 13,30.

Tató sloučenina může být podobná. nebo nerozeznatelná od . antibiotika A2315B popsaného na . čtrnácté Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 11 až 13, září 1974. .

Sloučenina 36 763 se izoluje a čistí velmi podobným způsobem jako sloučenina 36 926. Čistá sloučenina je rozpustná v methanolu, ethanolu, chloroformu a methylenchloridu. Je nerožpustná v dimethyletheru, hexanu a

heptanu. Nemá definovanou	teplotu	tání.
Rozklad začíná okolo teploty	100 °C.	Prů-
měrná analýza sloučeniny je:
uhlík	61,29	%
vodík	6,73	%
dusík	8,83	%
kyslík (z rozdílu)	23,15	%

ností a je 503 a sumární vzorce C26H37N3O7.

Sloučenina 35 763 je opticky aktivní a 'vykazuje otáčivost [a]_D-25° = —114° (c ~ 1,0, EtOH). Její ultrafialové absorpční spektrum v ethanolu vykazuje maximum při 218 τημ s hodnotou E*^ 668,9.

Infračervené spektrum sloučeniny 35' 763, obrázek 3, je připojeno. Spektrum · získané KBr technikou vykazuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti při náslesledujících vlnových délkách v mikronech: 2,95, 3,38, · ' 5,73, 6,00, 6,23, · 6,60, 6,88, 7,23, 8,25, 8,38, 8,83, 10,20.

Sloučenina 35 763 může být podobná nebo nerozeznatelná od antibiotika A-2315 popsaného v nizozemském patentovém spise. číslo 7 310 613.

Frakce z protiproudového rozdělování obsahující sloučeninu 37 932 se odpaří do sucha · za sníženého tlaku, zbytek se trituruje s petroletherem a chro-matografuje na sloupsi. silikagelu, jak je popsáno výše. ' Frakce vhodného složení se spojí a překrystalují ze směsi aceton : heptan, .čímž . poskytnou sloučeninu . 37 932. .

Sloučenina 37 932 je rozpustná v methanolu, ethanolu, chloroformu a methylenchloridu. Je nerozpustná v diethyletheru, hexanu, heptanu a vodě. Sloučenina nemá definovanou teplotu tání. Rozklad začíná při ' přibližně 185 °C. Elementární analýza poskytla následující hodnoty:

uhlík 55,41 ^lO/o vodík 6,01 % dusík . 10,,6 % kyslík (z rozdílu) ' 22,,2 %

Sloučenina 37 932 je opticky aktivní s · optickou otáčivostí [a]_D ²50 = +5,0° (c= 0,25, CHCls). V jejím ultrafialovém spektru pořízeném v ethanolu se vyskytují maxima pří 226, 276, 283, 305 a 335 ταμ s hodnotami E . . 304,4,36,8,43,49,70,25, 20,07.

Infračervené . spektrum sloučeniny 37 932, obrázek 4, je připojeno. Spektrum získané KBr technikou vykazuje charakteristickou absorpci v infračervené oblasti . při · následujících vlnových délkách v mikronech: 2,96, 3,05, 3,38, 5,68, 5,73, 5,93, 5,98, 6,13, 6,50, 6,58, 6,88, 7,40, 7,65, 8;08, 8,45, 8,60, 9,03, 9,45, 9,70, 9,98, 10,53, 11,0, 11,23, 11,60, 12,33, 13,25.

Příklad 2

Postup . podle příkladu 1 může být opakokován s porovnatelnými výsledky s použitím fermentačního prostředí následujícího složení:

glukóza8,0 tryptóza .3,0 enzymatický kaseinový hydrolyzát 1,0 kyselina glutamová1,0 sójová mouka0,5 chlorid sodný8,3

Molekulová váha byla zjištěna z hmotových spekter · s vysokou rozlišovací schop196262 gramy/litt1S

K2HPO4 . · . · 2,4

7KH2PO4 - η·'·.2.fl . , .chlorid manganatý0,02

Příklad . 3.

.Postup. podle příkladu 1 může být opakováp,s porovnatelným výsledkem s použitím /.ermentačního prostředí následujícího -složení: ,, ;· . gramy/litr glukóza í^O^.O sójová mouka . 10,0 voda z máčení kukuřice (Gorn steep líquor) 1 ml

P ř ík la alPostup podle příkladu . 1 může být opakován. s porovnatelnými výsledky s použitím fermentačního prostředí následujícího složení:

melasa .	10,0
enzymatický kasein^ový hydrolyzát	1,0
kvasničný extrakt	2,0
voda z máčení kukuřice
(Corn steep liquor)	1 ml
kaseín	3,0···
Příklad.5 - -

Postup podle příkladu 1 se opakuje.· Methylisobutylketonový extrakt konečné fermentační živné půdy se odpaří do sucha zá sníženého tlaku a zbytek se triturujé petroletherem. Sypká- látka se rozmělní a antibiótické složky se kvantitativně ' určí vysokotlakou kapalinovou chromatografií Reprezentativní celkové podíly surových . ' antibiotických směsí z jednotlivých fermentací -byly (v procentech) stanoveny takto:

Podíl č.	35 763	. 36 926	37 932	37 277	Ostatní sl.
1	8,5	32,0	8,7	19,3	1,3 .
2	3,1	39,5	7,8	15,9	1,2
3	6,0	38,6	10,7	25,5	2,4 .
4	9,4	47,8	0,9	26,9	0,5 -
5	. - 8,4	. 31,9 :	2,2	20,3	. 1,4 .

PŘEDMĚT VYNALEZU

Claims (4)

1. Způsob výroby antibiotik . zahrnujících makrocyklické laktony a. depsipeptidy, vyznačující se tím, že se kultivuje, mikroorganismus Actinoplanes . auranticolor ATCC 31011 za submerzních aerobních podmínek ve vodném živném prostředí obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku a dusíku, s výhodou za teploty 28 až 36 °C a s výhodou při pH kolem 7, a po skončení kultivace se antibiotická směs izoluje z filtrátu kultury nebo .z mycelia, například .rozpouštědlovou extrakcí chloroformem, ethylacetátem . nebo methylisobutylketonem, načež se odstraně ním extrakčního -činidla získává pevný zbytek antibiotické směsi.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že protiproudovým rozdělováním nebo/a chromatograficky se izolují jednotlivá antibiotika, a to makrocyklické laktonové sloučeniny 36 926 a 35 763, a depsipeptidová sloučenina 37 277. .

3, Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že protiproudovým rozdělováním nebo/a chromatograficky se izoluje ahtibiotická depsipeptidová sloučenina 37 932.

4 lístyvýkresů

Severografia, n. p., závod 7, Most

Obr. i 37,277

3β,&26