CS196263B2

CS196263B2 - Krmná směs pro zvířata

Info

Publication number: CS196263B2
Application number: CS773684A
Authority: CS
Inventors: Walter D Celmer; Walter P Cullen; Charles E Moppett; John Broderick Routien; Riichiro Shibakawa; Junsuke Tone
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1975-01-17
Filing date: 1977-06-03
Publication date: 1980-03-31

Description

Vynález se týká krmivá nebo nápoje pro zvířata, nebo premixů obsahujících antibiotikum.

V. literatuře zabývající se antibiotiky je rozsáhle popisován synergismus:

The Journal of Anfibiotics 25, č. 6, 371 (1972); J. Chem. Soc. 19C, 1653 (1966); Bull. Soc.Chim. Belg. 68, 716 (1959); J. Amer. Chem. Soc. 82, 4414 (1960); Tetrahedron Letters 2687 (1971); J. Anfibiotics, Ser. A 14 (1961); Nátuře 187, 598 (1960); J. Chem. Soc. 2286 (1960); Antimlcrobial Ágents and Chemotherapy 360 až 365 (1964); Tetrahedron Letters 4231 až 4238 (1966); Organic Mass Spectrometry, 6, 151 až 166 (1972); Tetrahedron Letters 369 až 372 (1966) a J. Chem. Soc. 190, 1669 až 1776 (1966).

Nové synergické směsi antibiotik připravené, podle tohoto vynálezu se připojují k jiným — již popsaným synergickým směsím: mikamycinu, pristinamycinu, ostrogrycinu, streptograminu, P. A. 114, vernamycinu a virginiamycinu.

Vynález se týká krmné směsi (včetně nápojů a premixů) pro zvířata, obsahující obvyklé složky krmiv. Podstata vynálezu je v tom, že taková krmná směs obsahuje 10 až 100 ppm antibiotik tvořených makrocykllckými laktony 36 926 a 37 277 nebo depsipeptidem 37 952, získaných kultivací mikro2 organismu Actinoplanes auraticolor ATCC 31 011, nebo jejich směsmi.

Vlastnosti výše uvedených makrocyklickýcb laktonů a depsipeptidu jsou podrobně popsány v popisu vynálezu čs. patentu čís. 196 262 téhož přihlašovatele; tamtéž je podrobně popsán i způsob kultivační výroby zmíněných látek, který se provádí kultivací mikroorganismu Actinoplanes auranticolor výhodně ve vodném živném prostředí při teplotách od 28 do 36 °C. Taková kultivace poskytuje směs sloučenin, přičemž většinové složky jsou označovány jako sloučeniny 37 277 (depsipeptidj a 36 926 (makrocyklický lakton) a menšinové složky jako sloučeniny 37 932 (depsipeptidj a 35 763 (makrocyklický lakton). Tyto směsi obsahující makrocyklické laktony a depsipeptidy mohou být odděleny a získány z fermentačního živného roztoku extrakcí rozpouštědlem, protiproudovým rozdělením, sloupcovou chromatografií nebo jejich kombinací. Jednotlivé antibiotické složky mají významnou antibiotickou účinnost. Surová antibiotícká směs nebo kombinace makrocyklického laktonu a čistého depsipeptidu získané ze surové směsi vykazují značnou synergickou antibiotiekou účinnost. Surová antibiotícká směs, čisté antibiotické složky a směsi čistých makrocyklickýcb laktonů a depsipeptidů jsou

198263 účinnými stimulátory růstu kuřat i vepřů.

' Připojené obr.^: 1 až 4 znázorňují infračer-i vená spektra sloučenin 37 277, 36 926, 35 763 ' a 37 932. Tato spektra slouží pro identifikaci těchto sloučenin. ·

Základní komponenty - v- antibiotických směsích produkovaných Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 zahrnují různé makrocyklické laktony a depsipeptidové antibiotické komponenty. Složení těchto antibiotických směsí se mění od fermentace k fermentaci a je funkcí času, hodnoty pH, složení prostředí atd. Za podmínek uvedených v příkladech provedení jsou majoritními antibiotickými komponentami v antibiotických směsích sloučeniny 37 277 (depsipeptid) a 36 926 (makrocyklický lakton), zatímco minoritními antlbiotickými složkami jsou sloučeniny 37 932'(depsipeptid) a 35 763 (makrocyklický lakton),

Sloučeniny mohou být z antibiotických směsí odděleny a získány z vyfermentované živné půdy různými postupy, jako je extrakce rozpouštědlem, Cřaigova protiproudná extrakce, sloupcová chromatografie, nebo kombinace těchto metod. Pro extrakci áfltib iotik z živné půdy jsou použitelná různá... organická rozpouštědla, jako jé chloroform, ethylacetát a mothylisóbuťylketom Extrakce' rozpouštědlem se s výhodou provádí dvojnásobnou extrakcí živné půdy při pH 7, objemem rozpouštědla přibližně V3 až Vž objemu živné půdy, ze které je třeba získat směs antibiotik. Podle objemu živné půdy jsou pro extrakční účely použitelná extrakční zařízení, například dělicí nálevky, míchací tanky a mechanická extrakční zařízení, například odstředivky.·'' ·^; ·.'·Výhodná metoda oddělování a regenerace složek z 'antibiotických směsí je následující: celá nebo vyčeřená živná půda se upraví na hodnotu pH 7 a dvakrát se extrahuje 1/3 až V2 objemu methyllsobutylketonu. Extrakt se Zahustí ve vakuu a koncentrát se odtuční heptanem *’ nebo petroletherem. Odtučněný koncentrát se potom odpaří do sucha za vakua. Pevný odparek se podrobí Craigovu protíproudému dělení (6 pater) za použití směsi toluen, 5 dílů : ethanol, 2 díly : vodný fosfátový'pufr a hodnotě pH 4,5, 3 díly. Po rozdělení vrstev na horní a' dolní fázi v pr'otipr oudném. dělicím. postupu se' fáze sledů jí tenkovrstěvhou ' chromatografií. Oddělené frakce jsou odpařeny ve vakuu.

Pevné Odparky obsahující děpsipeptidy se rozpustí v-chloroformu, odbarví se aktivníiri uhlím a po filtraci se odpaří ve vakuu do sucha. Zbytek získaný odpařením chloroformu se rozpustí v acetonu. Pevná látka vysrážená přidáním heptann se rozpustí v malém množství chloroformu a nanese na sloupec pufrovaného silikagelu (hodnota pH 6) ve směsi chloroform: n-propanol (99:1 obj/obj). Sloupec se vyvíjí ve stejné směsi rozpouštědel pod tlakem 0,55 MPa. Jednotlivé odebrané frakce sě chromatografují na tenké vrstvě. Frakce obsahující, rozdělené depsipeptidy se spojí, odpaří ve vakuu a krystalují ze směsi aceton — heptam „ .

Frakce z protiproudé extrakce, které obsahují makrocyklické laktony, se spojí, odpaří za vakua a odparek je vyjmut ethylacetátem. Roztok se míchá se silikagelem, filtruje a rozpouštědlo se odstraní za vakua. Odparek se opět vyjme ethylacetátem a sráží přidáním hexanu. Pevné látky se rozpustí v malém množství chloroformu á chromatografují pod tlakem 0,55 MPa na sloupci púfrovaného silikagelu (hodnota pH 6 ) v ethylacetátu.; Vyvíjející se směs má složení ethylacetát — tetrahydrofuran — hexan (80:

: 20 : 20) a je nasycena vodným fosfátovým .pufrem (hodnota pH 6). Jednotlivé oddělené frakce se sledují chromatograficky na tenké vrstvě. Frakce obsahující” oddělené makrocyklické laktony se spojí a bdpaří ve vakuu. Jednotlivé frakce jsou děleny dalším Craigovým protiproudým dělením nebo/a sloupcovou chromatografií za použití různých vyvíječích soustav. Pečlivou identifikací v každé·' čisticí operaci se zajišťuje, že jednotlivé makrocyklické laktony jsou dostatečně izolovány tak, že kapalné frakce mohou být odpařeny a získány čisté sloučeniny. ’ ~A.-auřántičdIor ATCC 310100 produkuje nejméně čtyři depsipeptidy a nejméně čtyři makrocyklické laktony. Avšak primárními složkami jsou.-depsipeptidy: sloučeniny číslo 37 277 (majoritní) a 37 932 (minoritní), a makrocyklické laktony : sloučeniny 36 926 (majoritní) a 35 763 (minoritní).

Surové antibiotické směsi přímo získané z živné půdy a vyčištěné jednotlivé složky mají- široká 'antibakteriální' spektra. Jako mikroorganismy, které přestávají poninožovat v přítomnosti těchto antibiotik,' jsou Salmonella typhosa, Shigella ' dysenteriae, E-scherichia coli, Klebsiella,pneumoniae, Stáphýlococcus aúreus, Streptocočcus pyogenes, Streptococcu.s fecališ, Diplocočóus pneumoniae, Bacillus subtilisf Corýhebacterium. .dipteriaej Clostridium septicum, Brucella abortus, Neisseria sicca, Lactobacillus acidbphilus a Pasteurělla multocida.

Antibiotika připravená podle tohoto vynálezu, buď jako surové směsi, nebo ve formě . čištěných jednotlivých složek nebo .'jejích'směsí, mohou být používány při potírání různých infekcí u. lidí a zvířat. Všeobecně je u těchto antibiotik nejvhodnější podávání v denních perorálních dávkách 0,5 'až 1 g, nebo v parenterálních dávkách od. 100 do 500 mg v závislosti na typu a závažnosti infekce a' na váze léčeného organismu:'

Sloučeniny podle tohoto vynálezu, mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky použitelnými véhikulý, a takto mohou být podávány v jednotlivých nebo násobných dávkách. .

Tablety pro účely perorálního podávání obsahují různá plnidla, jako například citrát sodný, uhličitan vápenatý a střední fosforečnan vápenatý, a mohou být přidána ' ·’·8 různá rozvolňovadla, jako například škrob, kyselina alginóýá a komplexní křemičitany, společně š pojivý, jako; je 'například /polyviny lpyrrolidonj sacharóza, želatina a Arabská guma., Krpměí^ohp/se často používají i kluzné látky; jako'je stearát hořečnatý,' sodná sůl kyseliny laurylsulfonové a mastek pro tabletovací úpěly. Přípravky v tuhé formě podobného typu mohou být používány jako náplně do měkkých a tvrdých želatinových ?' kapslí; vhodnými materiály jsou laktóžá a také vysokomolekulární. póly ethy lenglykply. Vodné suspenze nebo/a elixíry jsou vhodné pro perorální-podávání; jejich základní složka -může být;· kombinována s různými, sladidly nebo chatovými látkami, dále také 5 ředidly, jako je například voda, ethanol, própylenglykol, giycerol a jejich směsi.

Roztoky těchto antibiotik v sezamovém a

B podzemnicovém oleji nebo ve vodném pro. pylenglykolu mohou být používány pro parentefáiní podávání.

. Je zajímavé, že jednotlivá antibiotika podle tohoto vynálezu vykazují antimikrohiální účinek, který fe velkou měrou bakteriostatické povahy. Však surové antibiotické směsi nebo směsi čištěných ďepsipeptidů a čištěných makrocyklických laktonů vykazuí. jí syneřgieký účinek, který je·'převážně baktericidní povahy.

Při zkoušení majoritního makrocyklického laktonů, sloučeniny 36 926 (Aj a majoritního dépsipeptidu, sloučeniny 37 277 (Bý jednotlivě a. ve směsi žřeďovací metodou ve zkumavkách proti následujícím mikroorga_rnísmům, byla zjištěna minimální inhibiční koncentrace v mikrogramech/ml/MIC:

Mikroorganismus A

Staph. aureus 005 1,56

Staph. aureus·400 3,12

Strept. faecalis.>. ' · 100

Neisseria siccas . 0,39

Treponemáhyodysenteriae '

Střep, pyogenes 0,39

Bacteriodes fragilis 35 614 25

Clostridium inocuum 6,25

Lactobacillus easei var. casei 3,12

B A + B Surová směs

25	0,10 >	< 0,10
'·· - 12,5	0,78 >	< 0,10
' 12,5	1,56	0,20
< : 50	0,10	< 0,10
—	, -	~ 0,19
12,5	0,10 .	<0,10
50	0,73	0,78
> 100	0,20	0,39
6,25 ·	0,20 .··	> 0,39

.Srovnatelné 'výsledky byly získány při zkoušení minoritního makrocyklického lak; tonu, sloučenina: 35 763 (A‘j, á iňihorltnííig depsipeptidu, 'Sloučenina 37 9.32 (B‘), jednotlivě! nebo ,ve vhodných koncentracích, tj. Á‘ =ŤÁ, B‘ Φ Β nebo ,(A‘ B‘J Φ (A‘ +. B‘ j 'Φ •Φ (A + B ) Φ' (A,+’ B);

Maximální syhergické účinnosti směsí čistých makrocyklických laktonů a depsipeptidů se dosahuje; jejich poměr asi 1 až 2 :1,· Přibližně takovýto poměr složek se vyskytuje ve’ vyfeřmentovaných živných/ půdách

A. auranticolor ATCC 31011 a v' surových antibiotických směsích z nich izolovaných. Toto zjištění, je v rozporu s. 'jinými popsanými sýjíěrgickými směsíhi, kde se synergičké faktořy jeví ve vyfeřmentovaných půdách a surových’ směsích při suboptimáliiich'poniě^ rech. _ ··''· ,· ’ '--y O*·'

Údaje zjištěné ’in 'vivó o ochranném účinku dosaženém při perorálním a suhkután ním podávání u myší pokusně infikovaných kmenem Stahpylococcus aureus jsou podány v tabulce I. ' ,...... .·

TABULKA I

Hodnoty PDóo (mg/kg) -S. aureus 01A005 . Perorálně Subkutánně

Sloučenina 36 996

Sloučenina 37 277

Sloučenina 36 926 + 37 277 (1: 1)

Surová antibiotická směs

Antibiotika vyrobená podle tohoto vynálezů inohou být .pokládána za zvláště zajímavá jako růstové faktory u· drůbeže a zvířat vzhledem k jejich širokému antibakteriálnímu spektru, a dále pro léčení dysenterie prasat vzhledem k význačnému účinku proti Treponema hyodysenteriae, což je anaerobní spirocheta, která tuto nemoc způsobuje.

·'-* > 200 >200 > 200 > 200

210' 60 150 až 200 '/ ‘ . 72 až 120 ‘ ' Účinek na stimulaci růstu u surových antibiotických směsí byl zjišťován u mladých krmných selat ve 40denním pokusu. Průměrný denní přírůstek, spotřeba krmivá a krmná účinnost se význačně zlepšily (p < < 0,01) ve srovnání s kontrolou bez antibiotika (tabulka II).

198143 . β'^1.

TABULKA II

Skupina

Průměrný denní přírůstek (kg)

Průměrná denní spotřeba krmivá (kg)

Krmná účinnost*) kontrola bez antibiotika 0,35 0,91 2,57 surová antibiotická směs ppm 0,63 1,35 2,15 * ) hmot. díly krmivá na hmot. díl váhového přírůstku

Srovnatelné výsledky mohou být získány s jinými antibiotickými směsmi přesahujícími rozsah 10 až 100 ppm.

Srovnatelné výsledky mohou být získány také podáváním jednotlivých čistých sloučenin 36 926, 37 932 a 37 277 nebo směsí těchto čistých sloučenin, které se složením blíží složení surových antibiotických směsí.

Účinek na stimulaci růstu hospodářských zvířat byl demonstrován na slepicích v bateriovém pokusu. Význačné zlepšení (p < < 0,1) váhových přírůstků proti kontrole bez antibiotika bylo pozorováno na antibiotické dietě. (Tabulka III. j

TABULKA III

Skupina

Průměrný váhový přírůstek (g)

Průměrná spotřeba krmivá (g)

Krmná účinnost kontrola bez antibiotika 566 surová antibiotická směs ppm 608

Srovnatelné výsledky mohou být získány také s jinými surovými antibiotickými směsmi nad rozsahem 10 až 100 ppm.

Srovnatelné výsledky mohou být získány také podáváním jednotlivých čistých sloučenin 36 926, 37 932 a 37 277 nebo směsí čistých sloučenin, které se složením přibližují složení surových antibiotických směsí.

Profylaktický účinek antibiotik vyrobených podle tóhoto vynálezu byl stanoven na

939 1,66

949 1,56 prasatech pokusně infikovaných infekčním materiálem způsobujícím dysenterii prasat. Obsah tlustého střeva a výškraby ze sliznicé byly získány z epizootie klinicky diagnostikované dysenterie prasat. Zdravá prasata byla tímto materiálem infikována přímým očkováním. Krmivo obsahující antibiotikum bylo podáváno po dobu 28 dní. Výsledky jsou shrnuty v tabulce IV.

Skupina

TABULKA IV

Nemocnost Úmrtnost (°/o) (°/o)

Průměrný denní přírůstek (kg) kontrola 100 surová antibiotická směs ppm 0

37,5 ppm ; 0 , 25,0 ppm 0 . 12,5 ppm 0

6,25 ppm 50

Srovnatelné výsledky mohou být získány u dávek nad rozsahem dávek 10 až 100 ppm 1 u jiných antibiotických směsí s jednotlivými čistými sloučeninami 36 926, 37 932 a 37 277 nebo směsmi surových antibiotických směsí.

—0,13

0,66

0,57

0,68

0,61

0,47

Příklad 1

Antibiotický premlx, kterého má být použito k přidávání do krmných směsí pro zvýšení využitelnosti potravy u nepřežvýkavců, lze vyrobit na základě předpisu následujícího složení: ·

190283

Složky: Procento kukuřice 78,40 só'jová mouka, 49 % ' 18,50 fosforečnan vápenatý 1,50 vápenec , 0,50 jodidová sůl 0,50 vitaminový premix^(a'^b) 0,50 premix se stopovými prvky^(b) (a) Odpovídá následujícím hladinám vitaminu v poměru na 453 g; vitamin A 2000 m.

vitamin D 200 m. j.; vitamin E 5 m. j.; vitamin Κ. 1 mg; niacin 12 mg; rlboflavln

1,5 mg; kyselina panthothenová 7 mg; cholinchlorid 500 mg; vitamin B12 10 /tg.

(b) Odpovídá následujícím koncentracím stopových prvků v poměrů k 1 miliónu: mangan 120, železo 40, měď 4, jod 2,4, kobalt 0,4, zinek 100.

Množství antibiotika obsaženého v každém 0,5 kg lze měnit podle přání. Výhodný antibiotícký premix obsahuje 22,6 g antibiotika

PŘEDMĚT

Krmná směs pro zvířata, obsahující obvyklé složky krmlv, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 100 ppm antibiotik tvořených makrocykllckými laktony 36 926 a na .kg, který může obsahovat antibiotickou směs zahrnující sloučeninu 35 763, 36 926, 37 277 a 37 932 produkovaných fermentačně pomocí Actinoplanes auranticolor ATCC 31011, nebo sloučeninu 37 277 nebo sloučeninu 36 926 nebo sloučeninu 37 932. 0,5 kg premixu na 1000 kg kompletní dávky poskytuje konečnou koncentraci antibiotika 11 ppm.

Claims

Tekutý antibiotický premixový koncentrát vhodný k přidání do pitné vody za účelem zvýšení účinnosti krmívá u nepřežvýkavců o žádané koncentraci lze připravit rozpuštěním ántibiotické směsi obsahující sloučeninu 35 763, 36 926, 37 277 a 37 932 produkované za fermentačních podmínek pomocí Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 nebo sloučeninu 37 277 nebo sloučeninu 36 926 nebo sloučeninu 37 932.

VYNALEZU

37 277 nebo depsipeptidem 37 932, získaných kultivací mikroorganismu Actinoplanes auranticolor ATCC 31 011, nebo jejich směsmi.