SU511027A3 - Способ получени антибиотика - Google Patents

Description

вещест-ва отфильтровывают центрифугируют , а из фильтрата или фугата а«тибиотими выдел ют методо,м акстракции адсорбции .

Дл  адсорбции используют такие адсорбенты , ,как уголь, силикагель, окись алюмини , .микрокристалличеокую целлюлозу или ионнообменные смолы.

АдсорбирОВанный антибиотик или его соль элюируют растворителем. При иопользова«ии 3 .качестве растворител  муравьинокнслого aMiMOHHH ,илИ ацетата натри  антибиотик выдел етс  в виде аммиачной или натриевой соли.

Микроорганизм Streptomyces clavuligerus .выдел ют из образцов верхнего сло  почвы при суспендировании их в стерильной дистиллированной воде с последующим распределением суспензий на агаре. После посева на агар культуру выдерживают при 25-35° С в течение нескольких дней. В -конце ивкубацион«ого периода колонии МИ1Кроорга;низ,ма, вырабатывающего ант1ибиотик А 16886, .перенос т стерильной платиновой петлей в косой агар. Затем его выдерживают -в термостате до образовани  .колоний дл  посева в оличестве, достаточном дл  получепи  антибиотика А 6886.

Использованный ал тиомицей трудно классифиц1иро ,зать в роде Streptomyces ввиду не типичной .морфологии. По этой причине микроорганизм считаетс  новой разноаи.диостью и получил название Streptomyces clavuligerus.

Этот вид .образует хорошо ;мицелий из коротких Симпоидально разветвленных воздушных лиф. Образуютс  булавовидные боковые ветви со опорами от одной до четырех в (каждой. Конидии в субстрате не образуютс .

Методом электронной микрографии были обнаружены с.поры с гладкими стевками. Препараты клеточной стенки содержат L-изомер диаминоп1имел1иновой кислоты и глицин, кроме основных составных частей, аопарпиновой и глутаминовой кислоты « алаии.на. В массе споры серого цвета, а первичный мицелий окрашен от светло-желтого до желтовато-коричневых тонов. Растворимый пигмент не образуетс . Оптимальна  температура 26-30° С. При 37° С роста нет. По Морфологии эта 1культура шохожа на некоторые штаммы Thermomonospora и Micnomonospora.

Новый микроорга.низм хранитс  в коллекции культур службы агрикультурных исследова1ний министерства сельского хоз йства США, Пеори , штат Иллинойс, 61604: под №. РР3585.

Характеристика Streptomyces clavuligerus 3585 да.на в приведенных н-иже табли.цах.

В таблицах цифры в скобках означают серии цветОВ Треснера и Бакуса, а также цветовые группы Моерца ж Пауле и подчер.кнуты табличные обозначени  цвета.

Таблица I

Наблюдавшиес 

Характеристика свойства А 16886

Морфологи 

Сгюрофоры получены на воздушном минелнн и состо т из сети коротких си.мноидально разветвленных гнф.

Обычно па коротких булавообразных ветв х образуетс  1-4 споры.

Размеры снор 0,34-0,85 X 0.85 - 1,5 мкм. Средине размеры снор 0.64 X 1,5 мкм.

На электронных микрограммах видны гладкостенные сиоры. Сиоры не образуютс  в мицелии субстрата .

Характеристика

Рост оби,1ьный, серовато-желтый культур по 1SP (I2K3); обильный воздушный минелпй , темно-серый (СЗ)Ь (21В1); .N 2 (агар, сорастворимый ингмснт отсутствует. держащш дрожжи и солодовый экстракт)

Умсре1Н1ЫЙ рост, светло-желтый

1SP № 3 (агар с овс ко мукой) (11С1), значительный воздушный .мицелий белого цвета (W) в (27А); растворимый пигмент отсутствует .

1SP Л9 4 (неоргаОбильный рост, серовато-желта  (12В2); у.меренный воздуи ный ническа  соль - крахмальный мицелий, серый (СУ)2 Fe (45А1); агар) растворимый иигмеит отсутствхет.

1SP Кч 5 (глицеХороший .рост, светлый желтоватозеленый (1DB1), хороший воздуи рино-аспаргипоаый агар) ный мицелий, белого цвета (V) а; растворимого иигмеита нет.

Томатна  иаста -

Об-нльный рост, серовато-желтый агар с овс ной (11Е4); у.меренный воз.аушный мимукой , светлый, серовато-оливковый (GN, 1 -V2ig (21В1); растворимый пигмент отсутствует.

Агар Эмерсона

Обильный рост, светло-желтый (НС1); скудный воздушный мицелий , растворимый гшгмент отсутствует .

Агар Беннета

Обильный рост, светло-желтый (1112); обильный ;БОздушный мицелий , темный, серовато-зеленый (GN) 24-/2 ill (23АЗ); растворимый пигмент отсутствует.

Агар Чаиека

Скудный рост.

Глюкозо-аснаргнУмеренный рост, светлый желтовановый агар то-зеленый (10В1); хорошнй воздушный мицелий (N) b (27.Л1); растворимый пигмент отсутствует.

Тироизиновый

Умеренный рост, светло-желтый агар ( 10В2); у.ме.ренный воздушный мицелий , желтовато-серый (GI) 2dc (10.Л2); растворимый пигмент отсутствует .

Питательный

Хороший рост, светлый, желтоватоагар зеленый (10В1); разбросанный воздушный мицелий, белый; растворимый нигмент отсутствует.

Обильный рост, светлый; желтоватоЯблочно-кислый зеленый (10А1); хороший .возду икальцнй ный мицелий, белый (W) а. Продолжение табл Наблюдавшиес  Характеристика CBOiicTBa CBoiicTBa Не сверт)1в ет, ироисходит сс ленио через 17 дней. Нитраты Не восстанавливает. Желатин Не разжижает. Реакци  роста на рН 5,0-6,0 оптимальный преде изменение рН роста; при рН 7,5-8,5 ироис рост, но споры не образую Образоваиие мелаиииа Пелтоно-железный he ироисходит. агар и триптондрож/кевоГг экстракт Оптимальна  тем- Нрн те.миературе 26°-30° С хо рост н сиорообразоваиие, пература 37° С н выше рост не проис Основные комлоL , 1 - диамииоин.мелинова  ки ненты гидролитлицин , глуташиюва  кисло зата целых клеиартннова  кислота, алаиип ток. В табл. 2 показаны результаты опыто утилизации углерода, проведенных на низме NRRL 3585. В таблице применены дующие обозначени : - Рост и утилизаци  Рост и утилизаци  не происход т ( + ) Веро тна  утилизаци  ( -) Сомнительна  утилизаци . Таблиц Утилизаци  углерода NRRL3585 Соединенж Реакци  р Утилизаци  углерода: Ь-.,иноза Рамноза Фр кгоза D-Ксилоза Мелезитоза Раф.иноза Декстроза Целобиоза Л1альтоза Сахароза Целлюлоза Ннозит лишит Глута.мицат иатон  Как указывалось вы.ше, антибиотик А можло лолучать при выращивани  NRRL В .качестве .питательной среды дл  п ни  антибиотика А 16886 .можно исполь различные среды, однако ми.кроорган зм собен иапользовать только нем ногие ис ки углерода в искусственных услови х щивани . Специалиста в этой облас вестно, что микроорганизмы в сложной могут иапользовать та«ие источники у а, которые в Искусственных услови х не используютс . Дл  экономически выгодного олучени  ма коимального выхода антибиотика А 16886 и легкого выделени  его предпочТ1итель: о использовать простые 1питателы1ые среды, та,кие ка;К крахмал глю1козы, глицерин, мелассу, декстрин и т. п. При .культивировании Streptomyces clavuligeriis -образуютс  но.вые антибиололичеохпе вещества, названные ависорами А 168861 и у 1688611 или фактора.ми I ил.и II. Соли эглх антибиотиков легко -получаютс  при реакцлл их с соответствующими кислота.ми или основани .ми. Антиб1И.оти|К А 16886 и его соли обладают способностью разрушать баа терпи, а также глистог.он.нЫМ действием. Способ .получени  антибиотика А 16886 преду:матри-вает выращивание Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 в питательной среде, содержащей усво емые источни,ии углерода, азота И неорганических солей, в аэробных услови х глубинным методом до на.коилени  з питательной среде значительного (количества антибиотика. Аптибиотичеокое вещество А 168861 представл ет собой первич(Ную аммониевую соль- аморфное .вещество не совсем белого цвета, темиература разм гчени  которого 190 - 300° С. С повыщением температуры измен ет цвет до темно-коричневого. Легко растворим в воде, мало растворим в низших алканолах и нерастворим в ацетонитриле. Вещество амфотерное и имеющее тит.руемые груп.пы рКа, 41; рКа., 5,2; рКд, 9,3; -рКа. 10,5. Молекул рный Вес его равен .примерно 530. Примерный состав, %: углерод 40,26, водород 5,81, азот 33,37, кислород 7,2. Удельное вращение - (а) 153,6° ( вес/объем в воде). Смесь его с минеральным маслом имеет следующие характерные полосы поглощени  в .илфра.краспой области спектра: 3,10; 5,68; 6,30; 6,60; 7,20; 7,60; 8,33; 9,35; 9,60; 9,85; 11,60; 12,90-MOi. Антибиотическое вещество А 1688611 представл ет собой а.ммиачпую соль - пушистое аморфное вещество, ее совсем белого цвета с температурой разм гчени  190-300°С, с изменением цвета до темно-коричневого. Хорощо рВСтворим В ВОде. Малораст.ворцм в пизщих алка нолах И нерастворим s ацетонитриле. Это вещество амфотериое и имеет титруе-мые груп.аы рК,. 4,0; рКа, 5,3; рК,., 9,2; рКа 10,5. Мол. .вес 526. Химический состав, вес. %: углерод 41,01; водород 5,64, азот 15,75, кислород 29,28, сера 7,04. Удельное вращение (а)а25+:86,2° (С 1 % вес/Объем в воде). Смесь его с минеральным маслом имеет следующие xapaiKTepiHbie полосы поглощени  в инф.ра,крас1ной области Спектра: 3,15; 5,70; 6.30; 7,22; 7,64; 9,05; 9,4,0; 9,65; 11,60 мкм. Содержание фа ктора I в ан™би.от1И|Ке 16886 составл ет 1-99%, а фа.ктора II - 99-1%. Примеси составл ют 1%, поэтому они не были идеи ти фи.цир ОБ аи ы.

При проведении качествеиного анал.иза смеси моноаммиачной соли фактора I и II дали ПОложИтельиые результаты € |И:И|Нгидрином, ло ПаН-Дутшеру, Бенедикту, Молиту, Фелингу, С дансилхлориаам, йодом, хлоридом железа. Отрицательные результаты были .-получены с биуретОМ и реагентом СакагушИ. Смесь моноамм:иачных солей факторов I ti II, высушенных ари .комнатной температуре в вакууме над безводйым хлоридом кальци  в течение 15 ч, обладала способностью вращать плоскость лол р«зации (а)в2 + 110,Г (С 1% sec/объем IB воде). Омесь аюноаммиачных солей факторав I и II стабильна при рН 3-8 и тем пературе 6° С в течевие 8 длей. Относительно стабильна при рН 3-8, температуре 25° С в течение 2 дней. Биологичес,ка  активность смеси медленно тер лась при рН 3-8 и темлературе 25° С. Налоловилу а ктивность уме: ьшалась через 4 дн .

Элементарный анализ моноамМ1иачных солей А 168861, высушенных в над п тиакисыо фосфора лрл темлер атуре 80° С показал , что эта соль содержит 5,02% Метоксила . Присутствие .метоксильной группы подтвердилось синглетом лри 3,53 мг/л cneicrpa  дерно- магнитного резонанса. Прл определении методом Ван-Слойка установили, что моноаМмиа Ч;на  соль фа1ктора I содержит 5,3% азота aiMHHa. По спектру  дерно-магнитного резонанса дл  фактора I в DjO установили следующие характеристики: 5,19 мг/л (1Н, синглет); 4,94, 4,74 (2Н, АВ квартет, Гц); 4,0---4,2 мг/л (1Н, .мультиплет); 3,68, 3,32 мг/л (2Н, АВ квартет, Гц); 3,53 мг/л. (ЗН, .синглет); 2,6-2,4 мг/л (2Н, мультиплет); 2,1 -1,6 мг1л (4Н, мультиплет).

На спектре логлощени  -в ультрафиолетовой области антибиотика А 168861 в водном растворе В-идны максимумы поглощени  при 242 мкм (, 132) « лри 264 мкм ( 1см 65); измер ли также круговой дихроизм в водном растворе .и установлен лоложительный эффект Коттона пр:И 263 мкм и отрицательный эффект Коттона при 236 мкм.

При хроматографи  на бумаге амМиачной соли антибиотич а А 168861 (с лрименением бумаги Ват.мал № 1) лолучили значение R/ 0,41 в системе р:астворител  лропанол - ацетонигрлл - вода при объемно отношении 1:1:1.

Биоавтографы были лолучены при помещении хроматограм1мы ла агаровые пластин1кл, на которые был посе н Salmonella gallinarum в :качестве испытуемого микроорганизма.

При хроматографии в тонком слое антибиотика на силикагелевых лластилках в 70%-ном водно-м ацетон триле с опрыскиванием нингидрином ,в качестве индикатора, Rf 0,51; ла .целлюлозных лластиеках в системе ацетонитрилмзолроланол--вода R.- 0,36.

Аминокислотный анализ .антибиотика А 168861, проведенйый по методу Спакмава - Мура и Штейна локазал два лика, соответствующме реа1кции нингидрина; один из них элюировали идентично глицино.м (0,61 ммоль/ мг), другой элю ровади непосредственно перед применением глицина и иденпифицироваЛи ка.к а-ам,иноадилиновую (КИСлоту (1,97 ммоль/мг).

При электро.метричеоком титровании моноам .миачной соли антибиотика А 16886 Id в 66%-iHOM .водном растворе диметилформамида

при значении рН 7,7 установили лрисутствие четырех титруемых гру.пл: рКа, 4,4; рКаг 5,7; рКаз 9,6 и рК%., 10,4.

При значении рН равном 6,8 получили соответствующие значени  рКа, 4,0; рКа, 5,3;

рК,, 9,2; рК ., 10,5.

Анализ фактора II .в системе  дерно-магнитного резонанса показал отсутствне сигналов , характерных мета:ксильных грулп в :противололожность фа,ктору I.

CneiKTp  дерно го мапн итно-резонанса А 1688611 В D2O дал следующие характеристики: 5,75лг/л (1Н, дублет, / 5 Гц); 5,15мг/л (Ш, дублет, 1 5Гц); 4,90-4,68 мг/л (2Н, АВ квартет, ); 3,9-3,7 мг/л (1Н,

мультиплет); 3,69-3,39 мг/л (2Н, АВ квартет , Гц); 2,6-2,3 (2Н, мультиплет); 2,1 -1,5 (4Н, мультиплет).

При анализе методом Ван-Слай.ка установили , что в антибиотике А 168861 содержитс  5,1 % азота.

Ультрафиолетовый спектр юоглощепи  антибиотика А 1688611 tB водном растворе аоказал Ма;ксимум поглощени  при 260 мкм

№}см 148). При измерении .вого дихроизма в водном растворе установили лоложительный эффект Коттона при 258 мкм и отрицательный эффект лри 228 мкм.

В результате хро.матографи.и на бумаге

(ватман № 1) фактора II лолучили значение R/ 0,33 в системе растворител  пропанол - ацетонитрил - вода, при объемном отношении 1:1:1. Биоавтогр.афы получ.или при HOLM ещении бумажной хроматографии .на агаровые лла.стинки, засе .нные Salmonella gallinarum )В качестве испытуемого организма.

При хроматографии в тонком слое моноаммиачной соли антибиотнка .на .сили1кагелевых лластинках в 70%-ном .водном ацето нитриле с

опрыскиванием пингидрином лолучили значение Rr 0,42; на целлюлозных лластин.ках в системе ацетонитрил : изолропанол : в-ода 1 : 1 : 1, R/ 0,29.

Аминокислотный анализ 1кислого лидролизата антибиотика -методо-м Спа.кмана - Мура - Штейна обнаружили в начале только оди.н niHiK, соответствующий реакции нингидрина , его элюировали непосредствен.но леред ,прим.энением глицина и идентифицировали

как а-аминоа.дипиновую кислоту (2,1 ммоль мг). Однако имелись такнсе другие маленькие niHKH, (Которые элю-ировали глицином. Следующий образец анализировали та.ким же методом и установили величчгну 2,1 лглоль/лг и

0,13 ммоль/мг соответственно. Иоследовадаи  .моноаммиачной сэлгл антибиотика .методами хроматографии на бу-маге и хрОМатогр.афии в тонком слое в разных системах растворител  дал1И следующие результаты . Значени  R, Система растворител  Хроматографии на бумаге Фактор I Фактор II Этанол - вода (80 : 20) п 1,5% хлорида натри ; бумага, пропитанна  1 н. раствором сульфата натри . 0,33 Бутанол, насыщенный воИеподвижНепрдвиждой . ный Бутанол, насыщенный водой и 2% п-толуолсульфОКИслоты Л1етплнзобутплкетон, насыНеподвижНеподвижщенный водой ный 1ный Метилизобутилкетон, насыщенный водой и 2% НеподвижНеподвижп-толуолсульфокислоты ный Мети л изобутилкетон, насыщенный водой п 2% пиКгподвкжНеподвижперидина Неподвиж- НеподвижАцстонитрил Проианол-ацетон итрил- метанол-вода (4:3:2:1) Пронанол-пиридин-уксусиа  кислота-вода (15: 10:3: 12) Проианол-нирндин-уксусна  кислота-ацетонитрил-вода (45 : 30 : 9 : 40 : 36) Бутанол-уксусна  кислота-вода (3:1:1) Этил ацетат-уксусна  кислота (3:1: 1) Проианол-вода (70 : 30) . цетонитрил-вода (70 : 30) Вода-этанол-уксусна  кислота (70 : 42 :б) Хроматографи  в тонком слое Ацетонитрил-вода (7 : 3) на целлюлозных пластинках Антибиотик и его соли задерживают рост iKaiK грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Прекращение роста микроорганизмов при минимальной концентрации (наблюдалось в тече .ние примерно 24 ч. Антибиотик и его соли иригодны дл  борьбы € инфе1кцией. Оии обладают а.ктивностью в ни во в а Д в ю щ пе р в в 40 1 с п т м н а 4 р ж п м в отнощении бач терий, патогенных дл  растей . Пример 1. Приготовление антибиотика встр хиваемых скл нках. Культуру Streptomyces clavuligerus 3585 форме спор выращивают «а твердо.м косом аре, имеющем следующий состав, г: Декстрин10,00 Дрожжевый экстракт1,00 Гидролизованиый ,казеи,и ( «Н-Z типа амина «А фирмы Шеффилд Кэмикал Компани)2,00 М сной экстракт1,00 Агар Меера (иромытый трижды)20.00 Де--гон;изированна  вода 10,00 оба,злением гидроо1ки,си натри  устанавлиют рН среды 7,0. ВыращиВапие осуществл т в течение 4-б дней при 30° С. 1 мл выраенной Культуры ввод т в виде .водной суснзии в 100 мл вегетативной среды при Н 6,7 следующего состава, г: Глюкоза15 Соева  .мука15 Твердые вещества вымоченной кукурузы5 Карбонат кальци 2 Хлорид натри 5 Деионизированна  вода, л1 Вегетативный посевной материал встр хиют в течение 24-28 ч при 30° С, при одноеменном вращении аппарата со скоростью 08 обмин. На 100 мл приготовлениой среды става, г: Соева  мука Казеин Нитрат натри  Гликозный сироп (50% глюкозы) Водолро.водна  вода, л редварительно стерилизованной при 120°С в ечение 30 мин, по,мещеи1иой в колбе Эрленейера е:М|КОСтью 500 мл, высевают полученый 5%-ный вегетативный посев;ной материл , после чего колбу встр хивают в течение 8-72 ч при одновременном вращении аппаата со скоростью 250 об/мин. Во врем  броени  среду аэрируют стерильньгм воздухом ри его расхаде 0,4 об /мин. Пример 2. Антибио-лик получают по приеру 1, использу  среды следующего состаа , г: Раст-воримые вещества отходов винокуренного завода (Нардисел)

Соева  мука

(Нутр.исой 200 Д) Арахисова  мука Меласса с патокой Овс на  мука Глицерин Водопроводна  вода,

Пример 3. Антибиотак получают, как в римере 1, но используют следующую питаельную среду, г:

Мука ИЗ сем н хлолчатлика 20,0

Глицерин10,0

Глюкоза5,0

Водопроводиа  вода, л1,0

П р и м е р 4. Приготовлениеаптибиотика а среде следующего состава, г:

Глюлоза20,0

РаствОримый крахмал10,0

Пептоп ВильсОПа 15930,0 Гидролизованный казеан («Н-Z типа амина «А фирмы Шеффилд Кэмикал

Комша и)4,0 Шестиводный сульфат эд.агни  5,0

Меласса с латокой5,0

Карбонат натри 2,0

Водопроводна  вода, мл1100

Пример 5. Приготовлениеантибиотдака а среде следующего состава, г:

Гл/ИЦерин20,0

Соевый лептон5,0

Нитрат .кальци 2,0

Х.лор(Цд натри 0,5

Падрисол3,0

Водоправодна  вода, л1

6. На косой агар следующего

Пример cocTaiBa, г:

Декстрин10,0

Дрожжевой экстракт1,0 Гидролизованный казеин

(«Н-Z TiHwa амина «А,

Шеффилд

Компани)2,0

М сной э,кстра кт1,0

Шестн-водный хлорид кальци 0,01

Агар Меера ,20,0

Деиониэираванна  вода, л1

при рН 7,0 установленного с помощью гидроокиси натри , засевают культуру Streptomyces clangligerus 3585 « выдерживают при 30° С в течение 7-10 дней. Выращенную таким обра.зО(М культуру по,мещают в 2,0 мл стерильной .быньей сыворопкги. Затем 1 мл полученной суалензии перенос т в лиофиловую трубку .и высущивают лри низкой темлературе до образовани  таблеток. Полученные таблет12

ки помещают н,а питательную щего состава, г:

Глицерин

Сахароза

Зерна сои

Янтарь BYF 300

Тр иптон

Диофосфат кали 

Водопроводна  вода,л

при рН

среды, установленной гидроокисью натри .

При м е р 7. Приготовление антибиотика на опытной установке.

В бродильный чан из нержавеющей стали ем.костью 40 л з агрузили 24 л среды следующего состава, г:

Антифом А (присадка, лр&п тствующа  вспениванию , фирмы Дау Корнинг Комлани)

КрахМ.ал

Надрисол

Мука

Глицерин

Амин А

Шестиводный сульфат железа Хо л од Н а   водоп р.ово д н а  

вода, л

Пер/воначальное рН 5,9 довод т до 6,5 добавлением 20 мл 5 н. раствора гидроо-киси натри  лри 120° С и давлении 1,05-1,26 /сг/сж в течение 30 мин. На приготовленную таким образоМ среду высевают культуру, полученную по лримеру 6. Процесс брожени  протекает лри 30° С -в течение 66 ч при аэрации стерильным воздухом, подаваемым со скоростью 0,35 объем/объем/. и перемещивании механической мешалйой со скоростью вращени  420 об1мин. Конечное зн ачение рН 6,3.

При/мер 8. При.мерно 75 л бульона, (полученного ло примеру 7, Профильтровывают через Гифле Супер-Цел (диатомова  земл , выпускаема  /в продажу фирмой Джонс-Манвилл Продактс), в количестве 5 г/100 мл.

Фильтрат лропускают через колонну размером 9,5 X 130 см, наполненную 8 л угл  (Питтобурт 12 X 40), со скоростью 60 мл/мин. Колонну лрО|Мыв.ают 10 л деиоцизирован«ой воды (рН 5,2) л 50%-ны.м водным ацетоном . Полученные отдельные фракции объедин ют и в вакууме отгон ют ацетон. Затем снова ;пропус.кают через колонну, натолненную да уэксом i-XI. Коломну тромывают 10 л даионизировапной щоды и 0,1 М раствора .м муравьинокислого а.М.мони . Фракции объедин ют и пролускают через колонну 9,5 X 100 см, наполненную углем, со скоростью 60 мл/мин. Колонну промывают водой |И элюируют смесью ацетона и воды в отношевии I : 4 со скоростью 60 мл/мин.