JPH08501633A

JPH08501633A - Ｌｄｌの定量

Info

Publication number: JPH08501633A
Application number: JP6508290A
Authority: JP
Inventors: バラディ，ラズロ; ビー．アフェヤン，ナウバー; ランガー，ロバート; シェファー，シュミュエル
Original assignee: パーセプティブバイオシステムズインコーポレイテッド
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 1996-02-20
Also published as: WO1994007146A1; AU4924193A; CA2145389A1; US5417863A; EP0663073A1

Abstract

(57)【要約】低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬの迅速な定量方法が開示される。サンプルを先ずマトリックス中に通し、ＬＤＬを該マトリックスに結合させる。続いて、ＶＬＤＬおよびＨＤＬとは区別してＬＤＬをマトリックスから溶出させる。ＬＤＬが溶出している間中、マトリックスから排出される溶質の濃度を表すラメーターを続いて測定する。この場合該パラメーターは、サンプル中のＬＤＬの量と比例する。パラメーターは、例えば分光光度計によって検出された溶出ＬＤＬのピークに従って電子的積分を行うことによって測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ＬＤＬの定量発明の背景本発明は、血漿サンプル中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）の濃度測定方法に関する。低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルの上昇は、発達中の心冠状動脈疾患（ＣＨＤ）と直接的な関連を有している（S．Grundy JAMA ，266:3053(1990)）。多くの研究によって、ＬＤＬ−Ｃを低下させる薬剤または治療食はＣＨＤを減少させることが示された。ＬＤＬのアテローム発生特性はこれまで詳細に研究されてきた（steinbergら、JAMA266 :3047(1990)）。政府コレステロール教育プログラム（National Cholesterol Education Program (NCEP) ）は、２０才以上の成人の高コレステロール血症の治療用ガイドラインを設定した（検出に関するＮＣＥＰ専門家委員会報告：成人高コレステロール血症の判定と治療（Report of the NCEPExpert Panel in Detection，Evaluation & Tre atment ofHigh Blood Cholesterol in Adults):Arch. Intern.Med.，148:36(198 8)）。現在行われている臨床検査では、全コレステロール（ＴＣ）が少なくとも危険域境界（≧２００ｍｇ／ｄｌ）にあり、当該患者が２つまたはそれ以上のＣＨＤ危険因子を有している場合に限り、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）およびＬＤＬの測定が要求されている。ＬＤＬ−Ｃの望ましいレベルは＜１３０ｍｇ／ｄｌである。ＣＨＤに対するＬＤＬ−Ｃのハイリスク境界レベルは、１３０−１５０ｍｇ／ｄｌである。ＣＨＤに対するＬＤＬ−Ｃのハイリスクレベルは≧１６０ｍｇ／ｄｌである。中年のアメリカ人の７５パーセンタイルがＬＤＬ−Ｃの１６０ｍｇ／ｄｌ、それはまたＣＨＤのハイリスクレベルでもある、に対応する。（N. Rifai & R. Warnick編、脂質とリポ蛋白危険因子（Lipid & Lipoprotein Risk Fa ctor）、AAAC press、1991）。リポ蛋白は複雑な経路によって代謝される（N. Rifai &R.Warnick編、脂質とリポ蛋白危険因子（Lilid & LipoproteinRisk Factor）、AAAC press、1991）。脂肪は腸管で吸収されトリグリセリドに冨む大型の粒子（カイロミクロン）中に充填される。これは、ＨＤＬを含む成分に分解され、ＨＤＬは肝臓に取り込まれる。肝臓は超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を合成し、これはＬＤＬに分解される。ＬＤＬは、超遠心によって１．００６−１．０６３ｋｇ／ｌの密度を基に区分される。ＬＤＬは、コレステロールエステルの疎水性脂質コアーと、エステル化されていないコレステロールおよびアポリポ蛋白（アポＢ−１００、アポＣＩＩＩおよびアポＥである）であるリン脂質の被覆によって囲まれたトリグリセリドを含む。平均重量を基にすると、ＬＤＬは３８％のコレステロールエステル、２２％のリン脂質、、２１％の蛋白、１１％のＴＧおよび８％の非エステル化コレステロールを含む（J. Chapman Methods inEnzymology，128:70(1986)）。ＬＤＬは血漿中でリポ蛋白を運ぶ主なコレステロールである。コレステロールのプロセシングおよびそのＣＨＤとの関連におけるＬＤＬの主要な役割から、ＮＣＥＰは、過コレステロール血症のための患者の治療を検討するに際して医師はＬＤＬ−Ｃを用いるべきであると推奨するに至った。このことは、そのような測定の正確さと信頼性をますます重要なものにしている。多くの技術が、個々のリポ蛋白同様、全コレステロールの測定のために利用可能である。これら技術の特異性、臨床における普及度、自動化、簡便さ、および迅速性は様々である。全コレステロールは酵素によって測定できる。先ず、コレステロールエステラーゼが用いられ、エステルを加水分解する。続いてコレステロールオキシダーゼによって、コレステロールがコレステノンと過酸化水素に変換され、最後に、ペルオキシダーゼを用いて、該過酸化物の存在下で色原体を、可視波長域の光を吸収することができる色素に変換する。発色の度合いは、サンプル中の全コレステロールの濃度に直接比例する。この測定を臨床で実施する自動装置、例えばレフロトロン^TM（Refrotron^TM、ベーリンガーマンハイムダイアグノスティクス、インジアナポリス、インジアナ）；コダックＤＴ６Ｄ^TM（イーストマンコダック、ロチェスター、ニューヨーク）；およびアボットビジョン^TM （Abbott Vision^TM、アボットラボラトリーズ、ノースシカゴ、イリノイ）が利用できる。高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールの測定は、血清リポ蛋白の残余からＨＤＬを分離してから実施される。この分離は、１．０６３ｋｇ／ｌで遠心（４００００ｒｐｍで１８時間、１０℃）により行うことができる。また別に、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでの電気泳動分離を用いることができるが、ただし定性分析用である。臨床検査室では、通常、選択的化学沈澱法が用いられるが、この場合、ヘパリン−塩化マンガン、硫酸デキストラン−塩化マグネシウムまたはポリエチレングリコールのような試薬が、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に沈澱させるために用いられる。遠心後の上清中のコレステロールは酵素によって測定されるが、これはＨＤＬ−Ｃに対応する。ＶＬＤＬコレステロールは、トリグリセリド濃度の測定によって算出される。トリグリセリド（ＴＧ）は、脂肪酸およびグリセロールからなる水溶性脂質であり、ＴＧは加水分解（グリセロールを遊離させるため）し色素に変換後に酵素によって測定される。ＶＬＤＬコレステロールはＴＧ濃度を５で割って求められる。ＬＤＬの正確な測定は、ＬＤＬ−Ｃの測定前に血清中のＬＤＬ粒子を他のリポ蛋白（すなわちＶＬＤＬおよびＨＤＬ）からどの程度分離するかに左右される（ N．Rifai & R. Warnick編、脂質とリポ蛋白危険因子（Lipid & Lipoprotein Ris k Factor ）、AAAC press、1991）。それにも拘わらず、ＬＤＬ−Ｃの臨床測定は、現在のどころ、フリードワルド法（Friedwaldら、Clinical-Chemistry，18:49 9(1972)）を用いて間接的に実施されている。ＬＤＬ−Ｃ値は、全コレステロール（ＴＣ）からＨＤＬ−ＣとＶＤＬＤ−Ｃ（ＴＧ／５）とを差し引いて算出される。したがって、この方法は、３種類の測定と算術計算を伴う。血漿からのＬＤＬの分離は、調製用超遠心によって実施できるが、これは時間のかかる面倒な方法である。さらに、サイズ排除クロマトグラフィー（Rudeら、Biochemistry Journal，139: 89 (1974)）、ＨＰＬＣゲル濾過（Williamsら、J.C hromatography 375: 233 (1985)）および化学的沈澱（ Wieland & Seidel J．Lipids．24:904-909(1983)）が、分離方法の選択肢として用いられてきた。クロマトグラフィーは、時間のかかる（２４時間）選択であり、一方、ＬＤＬ沈澱はＨＤＬ定量に用いられる方法より信頼性が低い（N．Rifai & R．Warnick編、脂質とリポ蛋白危険因子（Lipid & LipoproteinRisk Factor) 、AAAC press、1991）。普及しているフリードワルド法には幾つがの制限がある。３種の測定を実施しなければならないが、これは通常異なる装置、試薬、コントロールおよび誤差分析表を必要とする。３種の値の引き算は累積誤差を生じる。さらに、全コレステロール測定の相対的誤差は、ＬＤＬ−Ｃ／ＴＣ比に様々に左右されＬＤＬ算定の誤差に影響を与える。フリードワルド法を用いる場合、患者のＴＣ濃度は４００ｍｇ／ｄｌ未満、さらに高度な正確さのためには２００ｍｇ／ｄｌ未満でなげればならず、カイロミクロンは存在してはならない。血漿は絶食患者から採取しなければならない。計算に必要なＴＧレベルは、脂肪の消費を伴う食事後６時間で上昇するからである。さらに、ＩＩＩ型過リポ蛋白血症の患者は異常なＶＬＤＬ（ＴＧに比べてコレステロールが多い）を有し、正確に算出することができない。フリードワルド法は、測定された９０％（この場合ＴＣ＜２００ｍｇ／ｄｌ）の例において、超遠心測定値の１０％以内のＬＤＬ−Ｃ概算値を与えることが分かった（Warnickら、Clinical Chemistry，36;15(1990)）。２００−４００ｍｇ／ｄｌの間のＴＣ値の場合は、ＬＤＬ−Ｃ値は、７２％の測定で超遠心値の１０％内に入り、一方、４００ｍｇ／ｄｌ以上では、この数字は３９％に低下する。ＮＣＥＰのＬＤＬカットオフ標準値の１３０と１６０ｍｇ／ｄｌはフリードワルド型測定を基準にしている。したがって、沈澱法によって算定される“ＬＤＬ ”はまた中間密度リポ蛋白（ＩＤＬ）も含むので、疫学データを基にしたカットオフ標準値は、直接測定されたリポ蛋白値に適用できないかもしれない。ＬＤＬの主要蛋白成分であるアポ−Ｂの免疫的測定が開発された（Albersら、J．Lipid Reseavch, 30;1445(1989)）。このアッセーは、アテローム発生の可能性を知るうえで潜在的に有用であろうと思われる一方、ＬＤＬ−Ｃ直接測定に対して補足的であって取って代わるものではない。別の方法は、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル法による全てのリポ蛋白の直接測定を含む（Otvosら、（要約）AACC総会、ワシントン、D.C.,1991年７月）。発明の要旨本発明は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬを迅速に定量する方法を提供する。本発明の方法では、サンプルをマトリックス（例えばクロマトグラフィーマトリックスまたは毛細管）に通し、該マトリックスにＬＤＬを結合させる。続いて、マトリックスからＶＬＤＬおよびＨＤＬとは区分してＬＤＬを溶出させる。さらに、ＬＤＬが溶出している間中マトリックスから排出される溶質の濃度を表すパラメーターを測定するが、ここで、該バラメーターはサンプル中のＬＤＬの量に比例している。このパラメーターは、例えば分光光度計を用いて得られた溶出ＬＤＬの検出ピークに従って電子的に積分し、または既知の方法を用いて分離されたＬＤＬを酵素によって測定したりして求めることができる。１つの具体例では、ＬＤＬの濃度を表すパラメーターを標準物と比較する。ＬＤＬの測定を基に、ＬＤＬ−Ｃの含有量もまた測定することができる。マトリックスは陽イオン交換カラムのようなイオン交換カラムでもよい。好ましい具体例では、マトリックスは灌流陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスからなり、ＬＤＬの濃度を迅速に（例えば、１０分未満に、典型的には３分未満）定量することを可能にする。灌流クロマトグラフィーマトリックスは、米国特許第５０１９２７０号（1991年５月28日発行、この文献は参照により本明細書に含まれる）に開示されている。灌流クロマトグラフィーマトリックスは、極めて速い流速で能率的に操作できるようにデザインされている。灌流マトリックスは互に連結されている第一および第二のポアーセット、並びに第二のポアーセット部材と通じている液体中での溶質の相互反応のための広い表面積をもつ。第一および第二のポアーセットは、例えば粒子間間隙として及び、粒子内貫通孔として具体化される。ポアーの寸法は、達成可能な高速の液流速度において、対流が両ポアーセットで生じ、該対流速度が第二のポアーセットにおける溶質拡散速度を越えるようなものである。この技術によって、活性表面へ、および活性表面からの拡散による物質輸送の制約が克服され、バンドを拡張させることなく液体速度を増加させることができる。１つの具体例では、灌流マトリックスのｐＨを７未満、例えばｐＨ６．２に調整する。本明細書で開示するＬＤＬの分離および定量方法は、沈殿法を含むこれまでの技術を越える操作上の幾つかの利点をもたらす。ここで開示するＬＤＬ測定方法は、直接的で非常に迅速（例えば１０分未満、典型的には３分未満）である。さらに、ＶＬＤＬは物理的に分離され測定を妨害しないので、患者の絶食は必要でない。測定は直接的であるので、フリードワルド法を用いる３種の異なる測定値を引き算する場合における、通常の誤差増幅が避けられる。最後に、自動ＨＰＬＣ装置に関しては、本発明のアッセーは、オペレーターの関与を殆ど必要とせず、容易に自動化される。本アッセーはまた、試薬のピペットによる吸引も希釈も必要としないので、正確さと信頼性を高めることができる。図面の簡単な説明図１は、ＮａＣｌの直線濃度勾配と４．５から７．５の範囲の異なる緩衝液ｐＨ値を用いて、血漿サンプル中からＬＤＬをＨＤＬおよび他の血漿蛋白から分離することを示すグラフである。図２は、調製用ＬＤＬ沈澱およびサイズ排除クロマトグラフィーにより得られたＬＤＬ標準物のクロマトグラムである。図３は、超遠心によって精製されたＬＤＬのクロマトグラムである。図４−７は、ヒト血漿サンプルのクロマトグラムである。図８は、表３の血漿サンプルの臨床的に測定した（フリードワルド法）ＬＤＬ −Ｃ値と実験的に予想されたＬＤＬ−Ｃ値との相関性を示すグラフである。図９は、表４のデータの臨床的に測定（フリードワルド）したＬＤＬ−Ｃ値と、ＬＤＬに対応するピークの積分面積との一致を示すグラフである。図１０は、表５のサンプルの臨床的に測定（フリードワルド）したＬＤＬ−Ｃ値と、ＬＤＬに対応するピークの積分面積との一致を示すグラフである。図１１は、表５のサンプルの実験的に予想されるＬＤＬ−Ｃ値と、臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との相関性を示ずグラフである。図１２は、表６のサンプルの臨床的に測定（フリードワルド）したＬＤＬ−Ｃ値と、ＬＤＬのピークの積分面積との間の相関性を示すグラフである。図１３は、表５および６のデータを用いて得られた最適直線に沿う、表６のサンプルのＬＤＬのピークの積分面積と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との間の相関性を示すグラフである。図１４は、表５および６のデータを用いて実験的に予想されたＬＤＬ−Ｃ値と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との間の相関性を示すグラフである。図１５は、臨床的に相関する状況において、表６のデータを用いて実験的に予想された値と、臨床的に測定されたＬＤＬ−Ｃ値との相関性を示すグラフである。図１６および１７は、ヘパリンによる沈澱の前後における血漿サンプルからのＬＤＬの溶出像をぞれぞれ示すクロマトグラムである。詳細な説明本発明は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、．超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬを迅速に定量する方法を提供する。先ず、サンプルをマトリックスに通し、マトリックスにＬＤＬを結合させる。マトリックスは、例えばクロマトグラフィーマトリックスまたは毛細管でもよい。続いてマトリックスからＶＬＤＬおよびＨＤＬとは区分してＬＤＬを溶出させる。その後、ＬＤＬが溶出している間中マトリックスから排出される溶質の濃度を表すパラメーターを測定する。このパラメーターはサンプル中のＬＤＬの量に比例している。このパラメーターは、例えば電子的に、または別な方法で溶出ＬＤＬの検出ピークに従って積分することによって求めることができる。ＬＤＬのピークは、例えば分光光度計によって検出できる。ＬＤＬ−Ｃの量はまた、既に測定されたＬＤＬの量を基に決定することができる。一つの具体例では、分離されたＬＤＬの濃度は、既知の方法を用いて酵素アッセーを実施して決定できる。一つの具体例では、例えば陽イオン交換カラムマトリックスのようなイオン交換カラムからなる。別の例では、マトリックスは、固定ヘパリンからなる。このマトリックスは、例えばマトリックス上に固定ヘパリンを有する、灌流クロマトグラフィーマトリックスであってもよい。好ましい具体例では、血漿サンプル中のＬＤＬは、陽イオン交換灌流クロマトグラフィーマトリックスを用いて測定できる。灌流マトリックスの使用によって、ＬＤＬの迅速な測定（例えば１０分未満、典型的には３分未満）が可能になる。灌流クロマトグラフィーマトリックスは、米国特許第５０１９２７０号（1991年５月28日発行、この文献は参照により本明細書に含まれる）に開示されている。灌流クロマトグラフィーマトリックスはパーセプティブバイオシステム社（PerSeptive Biosystem、ケンブリッジ、マサチトリックスという商標名で販売されている。灌流クロマトグラフィーマトリックスは極めて速い流速で操作できるようにデザインされている。灌流マトリックスは、互に連結されている第一および第二のポアーセット、並びに第二のポアーセット部材と通じている液体中での溶質の相互反応のための広い表面積をもつ。第一および第二のポアーセットは、例えば粒子間間隙として、および粒子内貫通孔として具体化される。ポアーの寸法は、達成可能な高速の液流速度において、対流が両ポアーセットで生じ、、該対流速度が第二のポアーセットにおける溶質拡散速度を越えるようなものである。この技術によって、活性表面へ、および活性表面からの拡散による物質輸送の制約が克服され、バンドを拡張させることなく液体速度を増加させることができる。本発明の１つの具体例では、クロマトグラフィーマトリックスは、ＰＯＲＯＳＨＳ／Ｍ４．６×１００ｍｍカラム（パーセプティブバイオシステム社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）からなり、これは強陽イオン交換灌流クロマトグラフィーカラムで、これを用いて血漿サンプル中のＬＤＬ量を迅速かつ容易に測定することができる。この具体例では、ｐＨは７以下が好ましい。ＬＤＬの最適分離はｐＨ６．２で実施できる。図１は、灌流ＰＯＲＯＳＨＳ／Ｍカラム上で食塩の直線濃度勾配を用いてｐＨ４．５とｐＨ７．５の間で０．５ｐＨ単位で増加させて、血漿サンプルからＨＤＬとＬＤＬの分離を比較したグラフである。ｐＨ７以下で、ＨＤＬおよび他の血漿蛋白からＬＤＬが明瞭に分離されている。表１は好ましいクロマトグラフィー条件の１式を要約したものであるが、これを用いて、血漿サンプルでＬＤＬをＨＤＬと他の蛋白から分離することができ、その後、血漿サンプル中のＬＤＬ量の決定が可能である。カラム、カラム寸法、粒子サイズ、ｐＨ、勾配、組み合わせ方法およびカラム通過時間をまた別に選択することも本発明の範囲内で可能なことは、本明細書の開示から当業者には明白であろう。表１の条件を一連のサンプルからＬＤＬを分離するために用い、クロマトグラフィー操作にはサンプル手動注入の半自動システム（SSI-PA、サイエンティフィックシステムズ社、ステートカレッジ、ペンシルバニア）を用いた。図２は、調製用沈澱およびサイズ排除クロマトグラフィーによって得られたＬＤＬ標準物質（シグマ、セントルイス、ミズリー）のクロマトグラムである。ＬＤＬのピークは１．６分と２．５分の間で溶出する。図３は、超遠心で精製されたＬＤＬのより均質な調製物のＬＤＬプロフィルを示すクロマトグラムである。図４は、ヒト血漿サンプルの分析クロマトグラムである（２０μｌ注入）。１．６分と２．５分の間のビークがＬＤＬに対応する。１．５分後のＬＤＬのピークは幾つかの異なるが、しかし部分的に重なり合う成分ピークから成る。これは、塩濃度勾配の異なる点で溶出が生じる表面荷電の非均質性によるか、またはサイズ排除効果によるものであろう。サイズ排除または超遠心サイズ勾配によって、大きさの異なる幾つがのＬＤＬ亜種が明らかとなった（McNa maraら、Arteriosclerosis，7;483(1987)）。ＰＯＲＯＳＨＳ／Ｍは、ＬＤＬサブフラクションを分離する広いポアーサイズ排除カラムとしてあるレベルで機能することができる。１．６分と２．５分の間のＬＤＬに対応するクロマトグラムのピークの面積は電子積分によって得られる。該ピークの面積はＬＤＬ−Ｃ濃度に相関しているであろう。ＵＶ吸収は本来蛋白含有量を測定する。しかしながら、ＬＤＬに対応する吸収ピークの面積はまた、ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の量を提供する。なぜならば、ＬＤＬのコレステロール含有量は、蛋白含有量と比例するからである。平均重量を基にした場合、ＬＤＬは３８％のコレステロールエステル、８％の非エステル化コレステロールおよび２１％の蛋白を含む（J. Chapman M ethods in Enzymology, 128:70 (1986)）。図５から７は、７日以上冷凍保存されたさらに別の３人の患者の血漿サンプルのクロマトグラムである。１．６分と２．５分の間のピークはＬＤＬに対応する。図４−７の各血漿サンプルのＬＤＬに対応するピークの面積は（任意の単位区分）、電子積分によって求められた。これらサンプルのＬＤＬ−Ｃもまた、フリードワルド法を用いて臨床的に測定した。表２で、各ＬＤＬピークの積分面積とこれら患者のＬＤＬ−Ｃの臨床的測定（フリードワルド）との対応が要約する。新鮮血漿サンプルの第二セットのクロマトグラムは、表１の灌流陽イオン交換クロマトグラフィー条件を用いて得られた。４つのサンプルについて２０μｌの注入を行った。各サンプルについて、ＬＤＬに対応ずるクロマトグラムのピーク面積を電子積分で得た。表３は、これらサンプルについて臨床的に得られた対応するＬＤＬ−Ｃ値とともに、ＬＤＬピークのこれら面積を示す。表３のデータから０．９７の回帰係数が得られた。図８は、表３のデータに関する、臨床的に測定されたＬＤＬ−Ｃ値と予想ＬＤＬ−Ｃ値との対応を示すグラフである。予想ＬＤＬ−Ｃ値は、表３のデータによる実験的相関を用いて面積を基に得られた（予想ＬＤＬ−Ｃ（ｍｇ／ｄｌ）＝２０．０４（面積×１０⁶））。さらに、計測プロットは、表３のサンプル１３０ｍｇ／ｄｌの４０および８０ μｌ注入物をクロマトグラフィーで分析することによって得られた。計測データは表４に要約する。０．９９の回帰係数が得られた。定数（２１．６１）は、表３のサンプルから実験的に得られたもの（２０．０４）と８％異なる。図９は、表４のデータおよび最適適合直線を示すグラフである。上記に述べた実験は、ＨＰ１０９０自動分析システム（ヒュレットパッカード、アボンデール、ペンシルバニア）および表１のクロマトグラフィーシステムを用いて再分析した。各実験は５、１０、２０ μｌ注入で実施した（表５）。図１０は、表５のデータのＬＤＬピークの積分面積と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との間の相関性を示すグラフである。このグラフにはまた、最適回帰直線が含まれる。図１１は、表５のサンプルについて、臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値と相関する実験的定数（０．０７０×面積）に基づく予想ＬＤＬ−Ｃ値を表すグラフである。図１０および１１で、２００ｍｇ／ｄｌ以下の点は５μｌ注入を表し、２００から４００ｍｇ／ｄｌの間の点は１０μｌ注入を表し、４００ｍｇ／ｄｌ以上の点は２０μｌ注入を表す。この技術の再現性を調べるために、二個一組としてもう一度サンプルを流した（表６）。図１２は、表６のデータのＬＤＬピークの積分面積と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との対応を示すグラフである。０．９９の回帰係数が得られた。図１３は、表６のデータにおける相関性および表５と６のデータから得られた最適直線をそれぞれ示すグラフである。２本の回帰線は互いの３％以内の概算を与える。図１４は、表５と６のデーターを用いた実験的相関によって予想されるＬＤＬ−Ｃ値と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との相関性を示すグラフである。図１５は、臨床的に相関する状況、すなわち１００−２００ｍｇ／ｄｌにおいて、表６のデータを用いた、実験的に予想される値と臨床的に測定された（フリードワルド）ＬＤＬ−Ｃ値との相関性を示すグラフである。最後のピーク同一性のまた別の証明として、クロマトグラフィーの後でＬＤＬの特異的沈澱を実施した。図１６および１７は、ヘパリンと沈澱させることによって最後のピークを差し引いた後および前の血漿サンプルの溶出像をそれぞれ示している。沈降剤であるヘパリンは他の幾つかの蛋白にも同様に結合するので、他の幾つかの蛋白の排除もまた生じる。本明細書で開示したＬＤＬの分離および定量のための方法は、これまでの技術を越える幾つかの利点をもたらす。ここで開示した方法は、直接的かつ極めて迅速（例えば１０分未満、典型的には３分未満）であり、容易に自動化できオペレーターの関与を殆ど必要としない。さらに、ＶＬＤＬは物理的に分離され測定を妨害しないので、患者の絶食も必要としない。サンプルの希釈も酵素や他の試薬の添加も必要としないので、本発明のアッセーの正確さは高められる。前述の記載は説明のためのものであり、ここで述べた構造および方法の範囲内で他の形態を取りえることは理解されよう。当業者には変更や修飾は可能で、そのような変更の全ては請求の範囲に規定された通り、本発明の部分であると考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年２月２３日【補正内容】請求の範囲１．低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬを迅速に定量する方法であって、当該方法が、（ａ）当該サンプルを吸着クロマトグラフィーマトリックスに流し、ＬＤＬをそれに結合させ；（ｂ）溶離液を該マトリックスに流してＶＬＤＬおよびＨＤＬから区分してＬＤＬを溶出ざせ；（ｃ）工程（ｂ）でＬＤＬがマトリックスから溶出している間中、マトリックスから排出される溶質の濃度を表し、当該サンプル中のＬＤＬ量と比例するパラメーターを測定する；（ａ）から（ｃ）の工程からなり、さらに、工程（ａ）および（ｂ）が１０分未満で完了するＬＤＬの迅速な定量方法。２．当該マトリックスが、イオン交換カラムである請求の範囲第１項の方法。３．当該マトリックスが、陽イオン交換カラムである請求の範囲第２項の方法。４．当該マトリックスが、灌流クロマトグラフィーマトリックスである、請求の範囲第１項または３項の方法。５．工程（ｃ）が溶出ＬＤＬの検出ピークに従って電子的に積分することによって実施される請求の範囲第１項の方法。６．削除７．当該定量工程が分光光度計を用いて実施される請求の範囲第１項の方法。８．工程（ａ）の前に、当該マトリックスおよび当該サンプルをｐＨ７未満に調整する請求の範囲第４項の方法。９．当該マトリックスおよびサンプルを約ｐＨ６．２に調整する請求の範囲第８項の方法。１０．工程（ｃ）で、濃度を表すパラメーターを標準物と比較ずる請求の範囲第１項の方法。１１．さらに、（ｄ）ＬＤＬの測定量に基づいて当該サンプルのＬＤＬ−Ｃ含有量を定量する工程を含む、請求の範囲第１項の方法。１２．工程（ａ）が毛細管で実施される請求の範囲第１項の方法。１３．当該マトリックスが固定ヘパリンを含む請求の範囲第１項の方法。１４．当該マトリックスが灌流クロマトグラフィーマトリックスである請求の範囲第１３項の方法。１５．当該パラメーターを酵素によって測定する請求の範囲第１項の方法。１６．低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む水性生物学的サンプル中のＬＤＬコレステロールを迅速に定量する方法であって、当該方法が、（ａ）当該ザンプルを吸着クロマトグラフィーマトリックスに流し、ＬＤＬをそれに結合させ；（ｂ）溶離液を該マトリックスに流してＶＬＤＬおよびＬＤＬがら区分してＬＤＬを溶出させ；（ｃ）工程（ｂ）でＬＤＬがマトリックスから溶出している間中、マトリックスから排出される溶質の濃度を表し、当該サンプル中のＬＤＬ量と比例するパラメーターを得て；さらに、（ｄ）工程（ｃ）で得られたパラメーターを標準物と比較ずることによって、サンプル中のＬＤＬコレステロールの濃度を定量するという（ａ）から（ｄ）の工程からなる、ＬＤＬの迅速な定量方法。１７．該パラメーターが、溶出ＬＤＬの検出ピークに従って電子的に積分することによって得られる請求の範囲第１６項の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月７日【補正内容】英文明細書第１８頁第６行から同頁末行（明細書翻訳文第１８頁第５行から同頁末行）本明細書で開示したＬＤＬの分離および定量のための方法は、これまでの技術を越える幾つかの利点をもたらす。ここで開示した方法は、直接的かつ極めて迅速（例えば１０分未満、典型的には３分未満）であり、容易に自動化できオペレーターの関与を殆ど必要としない。さらに、ＶＬＤＬは物理的に分離され測定を妨害しないので、患者の絶食も必要としない。サンプルの希釈も酵素や他の試薬の添加も必要としないので、本発明のアッセーの正確さは高められる。請求の範囲１．低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬコレステロールを迅速に定量ずる直接的定量方法であって、当該方法が、（ａ）当該サンプルを溶質が相互に作用し合う領域を有するクロマトグラフィーマトリックスに流し、当該サンプル中のＬＤＬを溶質が相互に作用し合う領域に対流によって輸送し、それにＬＤＬを結合させ；（ｂ）溶離液を該マトリックスに流してＶＬＤＬおよびＨＤＬから区分してＬＤＬを溶出させ；（ｃ）工程（ｂ）でＬＤＬがマトリックスから溶出している間中、マトリックスから排出されるＬＤＬの濃度と比例するパラメーターを得て；さらに、（ｄ）工程（ｃ）で得られたパラメーターを基に、当該サンプル中のＬＤＬコレステロールの含有量を定量するという（ａ）から（ｄ）の工程からなり、工程（ａ）および（ｂ）が１０分未満で完了する、ＬＤＬの迅速な定量方法。２．当該マトリックスが、イオン交換カラムである請求の範囲第１項の方法。３．当該マトリックスが．、陽イオン交換カラムである請求の範囲第２項の方法。４．当該マトリックスが、灌流クロマトグラフィーマトリックスである、請求の範囲第１項または３項の方法。５．工程（ｃ）が溶出ＬＤＬの検出ピークに従って電子的に積分することによって実施される請求の範囲第１項の方法。６．工程（ｃ）が分光光度計を用いて実施される請求の範囲第１項の方法。７．工程（ａ）の前に、当該マトリックスおよび当該サンプルをｐＨ７未満に調整する請求の範囲第４項の方法。８．当該マトリックスおよびサンプルを約ｐＨ６．２に調整する請求の範囲第７項の方法。９．工程（ｄ）で、該パラメーターを標準物と比較する請求の範囲第１項の方法。１０．当該マトリックスが固定ヘパリンを含む請求の範囲第１項の方法。１１．当該マトリックスが灌流クロマトグラフィーマトリックスである請求の範囲第１０項の方法。１２．当該パラメーターが酵素的に得られる請求の範囲第１項の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アフェヤン，ナウバービー. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッツ，ブルックライン，ジョンストリート 19 (72)発明者ランガー，ロバートアメリカ合衆国 02158 マサチューセッツ，ニュートン，ロンバードストリート 77 (72)発明者シェファー，シュミュエルアメリカ合衆国 02146 マサチューセッツ，ブルックライン，アパートメント１, ジャマイカロード 46

Claims

【特許請求の範囲】１．低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、および高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を含む生物学的液体サンプル中のＬＤＬを迅速に定量する方法であって、当該方法が、（ａ）当該サンプルをマトリックスに通し、ＬＤＬをそれに結合させ；（ｂ）ＶＬＤＬおよびＨＤＬから区分してＬＤＬを溶出させ；（ｃ）工程（ｂ）でＬＤＬが溶出している間中、マトリックスから排出される溶質の濃度を表し、当該サンプル中のＬＤＬ量と比例するパラメーターを測定する、ＬＤＬの迅速な定量方法。２．当該マトリックスが、イオン交換カラムである請求の範囲第１項の方法。３．当該マトリックスが、陽イオン交換カラムである請求の範囲第２項の方法。４．当該マトリックスが、灌流クロマトグラフィーマトリックスである、請求の範囲第１項または３項の方法。５．工程（ｃ）が溶出ＬＤＬの検出ピークに従って電子的に積分することによって実施される請求の範囲第１項の方法。６．該方法が１０分未満で完了する請求の範囲第４項の方法。７．当該定量工程が分光光度計を用いて実施される請求の範囲第１項の方法。８．工程（ａ）の前に、当該マトリックスおよび当該サンプルをｐＨ７末満に調整する請求の範囲第４項の方法。９．当該マトリックスおよびサンプルを約ｐＨ６．２に調整する請求の範囲第８項の方法。１０．工程（ｃ）で、濃度を表ずパラメーターを標準物と比較する請求の範囲第１項の方法。１１．さらに、（ｄ）ＬＤＬの測定量に基づいて当該サンプルのＬＤＬ−Ｃ含有量を定量する工程を含む、請求の範囲第１項の方法。１２．工程（ａ）が毛細管で実施される請求の範囲第１項の方法。１３．当該マトリックスが固定ヘパリンを含む請求の範囲第１項の方法。１４．当該マトリックスが灌流クロマトグラフィーマトリックスである請求の範囲第１３項の方法。１５．当該パラメーターを酵素によって測定する請求の範囲第１項の方法。