JPH04190790A - プロテアーゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するプ
ロテアーゼ生産菌を培養し、プロテアーゼを生産する方
法に関し、特に耐熱性アルカリプロテアーゼ生産菌によ
るアルカリプロテアーゼの生産に適したプロテアーゼの
生産方法に関するものである。

〔従来の技術〕

バチルス属の菌はその多くがプロテアーゼを生産するた
め、これらを培養して培養物または菌体からプロテアー
ゼを採取するプロテアーゼの生産方法が知られている。

バチルス属の菌によるプロテアーゼの生産方法において
、培地の窒素源としては、ポリペプトン、イーストエキ
ストラクト、カザミノ酸、大豆粉等が使用されており、
炭素源として可溶性デンプン、マルトース、シュークロ
ース等が使用されている。

しかしながら、生産菌によっては、酵素の生産性が低く
、耐熱性アルカリプロテアーゼ生産菌、特にバチルスｓ
ｐ、　Ｎｏ、＾Ｈ−１０１菌は、上記の窒素源を培地成
分として用いた場合、全くもしくはほとんどプロテアー
ゼを生産しない。

窒素源として、コーンステイープリカーを用いた場合は
、約１１００Ｕ／ａｎの生産性でプロテアーゼを生産す
る。しかしながら、コーンステイープリカーを用いると
、培地が着色しており、生産されたプロテアーゼの精製
プロセスにおける脱色に相当の手間を要する。またコー
ンステイープリカーを用いた場合の生産性では工業化す
るための生産性としては低く、コーンステイープリカー
の濃度を高めて培養すると、プロテアーゼの生産に悪影
響を及ぼすため、高濃度培養はできないなどの問題点が
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、上記のような従来のプロテアーゼの生
産方法における問題点を解決するため。

プロテアーゼ生産菌、特に耐熱性プロテアーゼ生産菌を
培養して、着色がなく高純度のプロテアーゼ、特に耐熱
性アルカリプロテアーゼを高生産性で生産することが可
能なプロテアーゼの生産方法を提案することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は次のプロテアーゼの生産方法である。

（１）バチルス属に属するプロテアーゼ生産菌を。

ゼラチンを含む培地で培養し、培養物からプロテアーゼ
を採取することを特徴とするプロテアーゼの生産方法。

（２）ゼラチンを含む培地が、さらにフェニルアラニン
、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、リジンおよびアルギニンよりなる群から選ばれ
るアミノ酸の少なくとも１種を含むことを特徴とする上
記（１）記載のプロテアーゼの生産方法。

本発明においてプロテアーゼの生産に用いるプロテアー
ゼ生産菌はバチルス属に属するものがすべて対象になる
が、本発明の生産方法は耐熱性アルカリプロテアーゼ生
産菌、特にバチルスｓｐ。

Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株による耐熱性アルカリプロテ
アーゼの生産に適している。

これらのプロテアーゼ生産菌の培養に用いる基本培地は
、それぞれの菌の培養に適したものを用いる。本発明で
は、このような基本培地に、窒素源としてゼラチンを添
加した培地を用いる。ゼラチンはアミノ酸組成が特殊で
、プロテアーゼ生産に悪影響を及ぼすセリン、システィ
ン、メチオニン等のアミノ酸含量が少なく、ゼラチンを
用いることにより、酵素を高い生産性で生産することが
できる。ゼラチンの使用量は炭素源２％（ｗ／ｖ）の培
地に対してＯ，Ｓ〜２％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは０．５
％（ｗ／ｖ）程度が適当である。

本発明では、このようなゼラチンを含む培地に、さらに
フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジン。

アルギニンから選ばれる１種以上のアミノ酸を添加して
培養を行うことにより、プロテアーゼの生産性を高くす
る。これらのアミノ酸は比較的資化されやすく、胞子形
成能を抑える機能を有し、これによりプロテアーゼが高
生産されるものと思われる。

上記アミノ酸の培地に対する添加量は０．０５〜０．２
％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）程度が適
当である。

以下１本発明をアルカリプロテアーゼ生産菌、特に耐熱
性アルカリプロテアーゼ生産菌であるバチルスｓｐ、　
Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株の培養によりアルカリプロテ
アーゼ、特に耐熱性アルカリプロテアーゼを生産する場
合を例にして説明する。

アルカリプロテアーゼはアルカリ領域において、タンパ
ク質の分解活性を有する酵素であって１例えば好アルカ
リ性バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　２２１菌（掘越、１９７
１）、ＮＫＳ−２１（上田ら、１９８６）、Ｂ−２１−
２（藤原、山水、１９８７）およびバチルスサーモルー
バＢＨ（Ｍａｎａｃｈｉｎｉら、１９８８）などの菌株
がアルカリプロテアーゼを生産する。特にバチルスｓｐ
、　Ｎｏ。

ＡＨ−１０１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　Ｎｏ、　Ａ
Ｈ−１０１）菌株は耐熱性アルカリプロテアーゼ（以下
、プロテアーゼＡＨ−１０１と呼ぶ）を生産する６ プロテアーゼＡＨ−１０１を生産するバチルスｓｐ。

Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株は、バチルスｓｐ、　Ｎｏ、
　ＡＨ−１０１菌株として、平成元年２月ｌＯ日通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており
、その受託番号は微工研菌寄第１０５３１号（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１０５３１）である。

次にプロテアーゼＡ）Ｉ−１０１を生産するバチルス属
に属するバチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株の
菌学的性質を以下に示す。なお菌学的性質のシ）組りよ
び分類方法は、下記の文献に基づいて行った。

エフ・アール・スミス（Ｎ、　Ｒ，Ｓｍ１ｔｈ）、アー
ル・イー・ゴートン（Ｒ，Ｅ、　Ｇｏｒｄｏｎ）、エフ
・イー・クラーク　（Ｆ、　Ｅ、　Ｃ１ａｒｋ）：［エ
アロビック・スポアホーミング・バクテリア（Ａｅｒｏ
ｂｉｃ　５ｐｏｒｅｆｏｒａ＋ｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａ
）　］ユナイトテッド・ステーツ・デパートメント・オ
ブ・アグリ力ルチュア（Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＤ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）
　Ｎｏｖ、　１９５７；およびバージニーズ・マニュア
ル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９５７）
。

（ａ）形態 １）細胞の形および大きさ： ０．１〜０．５ｍＸ１．５虜×４．０虜の桿菌で、べん
毛を有する。

２）細胞の多形性：単独または長鎖状。

３）運動性：あり。

４）胞　子： 細胞末端に胞子を形成する。胞子は０．５〜１．０／ａ
Ｘ　１　、Ｏｐｓ　Ｘ　１．５−の卵形で、胞子のうは
ふくらんでいる。

５）ダラム染色は陽性である。

６）抗酸性は陰性である。

（ｂ）生育状態（培地のｐＨは１０．０とした）１）肉
汁寒天平板培養： 円形、扁平状または隆起状で、縁はぎざぎざで光沢はな
く、不透明であり、うすい黄かっ色を呈する。

２）肉汁寒天斜面培養： 波帯状に生育し、縁はぎざぎざで光沢はなく、不透明で
、うすい黄かっ色を呈する。培地には色素を分泌しない
。

３）肉汁液体培養： 生育良好で、わずかに沈渣が認められ、菌膜を形成する
。

４）肉汁ゼラチン培養： 生育は良好で、肉汁ゼラチンを加水分解し。

培地上でハローを形成する。

５）リドマスミルク： 培地がアルカリ性であるためリドマスの変色は認められ
ない。

（ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：陰性。

２）脱窒反応：陰性。

３）ＭＲテスト： 培地がアルカリ性であるためメチルレッドの変色は認め
られない。

４）ＶＰテスト：陰性。

５）インドールの生成：陰性。

６）硫化水素の生成：陽性。

７）デンプンの加水分解：陽性。

８）クエン酸の利用： Ｋｏｓｅｒの培地；利用する。

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地；利用する。

９）無機窒素源の利用： 硝酸塩；陽性。

アンモニウム塩；陰性。

１０）色素の生成：陰性。

１１）ウレアーゼ：陰性。

１２）オキシダーゼ：陽性。

１３）カタラーゼ：陽性。

１４）生育の範囲： ｐＨニア　〜ｌｉテ生育。８．０〜８．５が最適。

温度；２０〜５５℃で生育、３７〜５０’Ｃが最適。

１５）酸素に対する態度二連性嫌気性。

１６）　Ｏ−Ｆテスト（）Ｉｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法
による）：好気性、嫌気性ともに生育。

１７）糖類からの酸およびガスの生成の有無：Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖
、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−マンニット、イノ
ジット、グリセリン、デンプンを利用し、酸を生成する
が、ガスの発生はデンプン以外は認められない、Ｄ−ソ
ルビットは利用しない。

（ｄ）その他の性質 ■）塩化ナトリウムの耐性ニ ア％塩化ナトリウム存在下でも生育する。

２）ＤＮＡのＧＣ含量：　４３．２モル％。

上記の菌学的諸性質から、前記した文献の分類方法に従
ってバチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株トパチ
ルス属の公知の菌種とを比較すると、バチルスｓｐ、　
Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株はバチルス・ズブチリスと類
似している。しかしながら、胞子の位置（バチルス・ズ
ブチリスは中央に対して本菌株は端）、アルカリ性下で
の生育および５０℃での生育という点で、両者は明らか
に相違している。

またクエン酸の利用（バチルスサーキュランスは利用し
ない）を除く他の形態的生理学的性質がほとんど同じで
あることから、バチルスサーキュランスと類似している
。しかしながら、ＤＮＡのＧＣ含量がバチルスサーキュ
ランスは３５．８モル％と低いという点で１両者は明ら
かに相違している。

また公知の菌株バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　２２１と比較
すると、バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　２２１は胞子を中央
付近に形成すること、バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　Ａ）ｌ
−１０１菌株はその栄養細胞が容易に長鎖状になること
、またバチルスｓｐ、　Ｎｏ、　２２１はバチルスｓｐ
、　Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株と異なり硝酸塩の還元性
を持つという点などから、両者は明らかに相違している
。

さらにバチルスｓｐ、　Ｂ　−２１−２と比較すると、
中性培地（ｐＨ６，８）である肉汁液体培地を用いた好
気的培養では、バチルスｓｐ、　Ｂ　−２１−２は増殖
できないのに対し、バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨ−１
０１菌株は増殖するという点で相違しており、またバチ
ルスｓｐ、　ＮＫＳ　−２１と比較すると、バチルスｓ
ｐ、　ＮＫＳ−２１の細胞はバチルスｓｐ、　Ｎｏ、　
ＡＨ−１０１菌株に比べて大きいという点で相違してい
る。

次に、前記バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨＩＯＩ菌株に
よって生産されるプロテアーゼＡＨ−Ｌｏｔの活性測定
法および理化学的性質について詳述する。

（活性測定法） 基質を含有するグリシン、ＮａＣＱ、　ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１０’、５）２，５諺Ｑを０．５ｔＲのプロテア
ーゼＡＨ−１０１の酵素溶液と混合し、３０℃で２０分
間反応させた後、２．５■Ｑのトリクロロ酢酸混液（０
，１１Ｍ）−リクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム
、０．３３Ｍ酢酸）を加え、さらに３０℃で３０分間放
置した後、東洋濾紙Ｎｏ、　５Ｃで濾過する。濾液０．
５ｖＱを２．５＋ｍＱの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液に
加え１次に２倍希釈したフェノール試薬を０．５ｍｆｌ
添加後添加口攪拌温にて３０分間放置した後、６６０ｎ
ｍでの吸光度を測定する。

１単位（ＩＵ）の酵素とは、上記測定方法において、基
質としてハンマーステンカゼイン（メルク社製）を使用
しく使用量は緩衝液中の濃度として０．６％）、１分間
に１マイクログラムのチロシンを生成する酵素量を言う
。

（理化学的性質） １）作用および基質特異性 カゼイン、ゼラチン、グルテン、ヘモグロビン、エラス
チン、ケラチン、コラーゲンなどのタンパク質に作用し
、ペプチド結合を加水分解する。

２）至適ｐ）ｌおよび安定ＰＨ範囲 前記の活性測定法に基づき、ＰＨに対する影響を調べた
。第１図に活性の最大値を１００とした各ｐＨでの相対
活性を示した。第１図から、プロテアーゼＡＨ−１０１
の至適ｐＨは、カゼインを基質とする場合、ＰＨ１２〜
Ｉ３であることがわかる。

またエラスチンを基質とする場合の至適ｐＨは１Ｏ０５
、ケラチンを基質とする場合の至適ｐＨは１１〜Ｉ３で
ある。

次にＰＨの安定性について第２図に示した。酵素を５ｍ
Ｍカルシウムイオン存在下に６０℃で１０分間保持した
後、ｐＨ１０，５，３０℃において測定した残存活性を
未処理の酵素活性を１００として示した。第２図から、
プロテアーゼＡＨ−１０１の安定ｐＨは、５ａ＋Ｍカル
シウムイオン存在下、６０℃において、ｐＨ５〜１３で
あることがわかる。なお緩衝液としては、ｐＨ４〜６で
は０．０２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ７〜８では０．０２Ｍ３
−　（ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｐ
Ｈ９〜１１．５では０．０２Ｍグリシン、ＮａＣＲ，’
Ｎａ０）Ｉ緩衝液、ｐＨ１２〜１３では０．０２Ｍ　Ｋ
Ｃ（１／ＮａＯＨ緩衝液を使用した。

３）作用適温の範囲 前記の活性測定法に従い、各温度で酵素反応を行った。

第３図は３０℃における活性を１としたときの各温度に
おける活性比を示す。図中、Ｏはカルシウムイオン不存
在下、は５ｄカルシウムイオン存在下を表わす。

第３図から、プロテアーゼＡＨ−１０１の作用最適温度
は７０℃であり、５鱈カルシウムイオン存在下では８０
℃であることがわかる。さらにカルシウムイオンの存在
により、耐熱性が増し、７０℃を越えると、不存在下と
比べて活性が上昇することがわかる。

４）熱安定性 ＰＨ１０，８で１０分間、各温度で熱処理した後、残存
活性を調べた。未処理の酵素活性を１００とした際の残
存活性を第４図に示した。図中、０はカルシウムイオン
不存在下、■は５肩阿カルシウムイオン存在下を表わす
。第４図から、プロテアーゼＡＨ−１０１は３０〜６０
℃で安定であり、７０℃でも５０％の活性を保持してい
る。また５ｍＭカルシウムイオン存在下では３０〜７０
℃で安定であり、８０℃でも６０％の残存活性を有する
ことがわかる。

このようにプロテアーゼＡＨ−１０１は耐熱性に優れて
いる。

５）失活の条件 第２図に示したようにＰＨ３，０において、５履阿カル
シウムイオン存在下に６０℃で１０分間処理すると、酵
素活性は完全に失われる。また第４図に示したようにｐ
Ｈ１０，８において、８０℃で１０分間処理すると完全
に失活し、５璽阿カルシウムイオン存在下でも９０℃で
１０分間処理すると完全に失活する。

６）阻害 第１表に示す薬品の存在下に３０℃で１０分間保持した
後残存活性を測定し、未処理の活性を１００として、残
存活性を百分率で示した。

注）ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ナトリウムＰＭ
ＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオリド第１表から
、プロテアーゼＡＩ（−１０１の活性はＥＤＴＡ、尿素
では阻害されず、ＰＭＳＦでは阻害されることがわかる
。ＰＭＳＦで失活するので、プロテアーゼＡＨ−１０１
はセリンプロテアーゼであることがわかる。

またハロメチルケトンインヒビター（トリペプタイド、
　ＺＧＧＰＣに）においては、カゼインに対しては１０
０％その酵素活性が阻害されたが、エラスチンでは３６
％の残存活性が認められた。

７）洗剤耐性 ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およ
びソディウムドデシルサルフェート（ＳＯ５）を用い、
それぞれ０．２％溶液となるように、ＰＨ７、ＰＨ１０
，５の各緩衝液に溶解し、これに最終濃度が１００　μ
ｇ／ｒｍｆｌとなるようにプロテアーゼＡＨ−１０１を
加え、　３０℃で所定時間放置した後、残存活性を測定
した。結果は第２表の通りである。

第２表 ８）等電点（ｐＩ） ＰＨ３〜１０のグラジェントポリアクリルアミドゲルを
用いてプロテアーゼＡ）Ｉ−１０１の等電点電気泳動を
行った結果、等電点はＰＨ９，２であった。なお標準物
質としては、チトクロームＣ（ｐＨ９，６）、鯨ミオグ
ロビン（ｐＨ８，１）、馬ミオグロビ’／　（ｐＨ７，
０）、ヒト炭酸脱水＃＃Ｂ　（ｐＨ５，５）、ウシ血清
アルブミン（ｐＨ６，０）を用いた。

９）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により１分子量２
９０００を得た。なお分子量マーカーとしてα−ラクト
アルブミン（分子量１４４００）、　　トリプシンイン
ヒビター（分子量２０１００）、炭酸脱水＃！ｌ（分子
量３００００）　、オボアルブミン（分子量４３０００
）、アルブミン（分子量６７０００）、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９４０００）を用いた。

１０）比活性 ｐＨ１０，５における比活性は２４００Ｕ／ｗｔｇ−タ
ンパク質である。

１１）アミノ酸組成 プロテアーゼＡＨ−１０１を４Ｎ−メタンスルホン酸を
用いて加水分解した後、液体クロマトグラフィーにより
アミノ酸組成を分析した。結果を第３表に示す。

アミノ酸分析の結果は、アルギニン残基数が他の酵素に
比べて多いほかは特に顕著な傾向は認められなかった。

アミノ末端から２０残基までの領域におけるアミノ酸配
列は、他の酵素との比較において高いホモロジーを示し
た。

第３表 上記各特性を示すプロテアーゼＡＨ−１０１と従来公知
のアルカリプロテアーゼとの比較を、第４表に示す。な
お耐熱性は熱処理により活性が５０％失われる時の温度
を示した。

第４表 文献 １）　Ｋ、　Ｉ（ｏｒｉｋｏｓｈｉ：　Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　３５．１４０７．　（１９７１）２）　Ｓ、
　Ｔｓｕｎｏ：神戸大学教育学部研究集録４０．４９゜
３）　Ｄ、　Ｔｓｕｒｕ：　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　
３０．１２６１．　（１９６６）４〕福本：特公昭４７
−４５０１号 ５〕村尾：特公昭４７−１８３２号 ６〕嶋村：特公昭４６−４２９５６号 ７〕八木：特公昭４６−２１７８６号 ８）　Ｋｕｎｄｕ　：　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　１６．１１．（１９６８）９〕磯野：特
公昭４６−５０３８号 １０〕八木：特公昭４６−４１５９４号１１〕掘越、池
田：特公昭５５−４６７１１号１２〕掘越、吉田：特公
昭５６−４２３６号１３〕藤原：特公昭６２−３１９１
１号このようなプロテアーゼＡＨ−１０１を生産するた
めの前記バチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨ−１０１菌株の
好ましい培養条件は次の通りである。まず培地としては
炭素源、窒素源、無機塩など、微生物の生育に必要な成
分を含むものに炭酸塩を加えたものを用いる。

炭素源としては可溶性デンプン、グルコースなどが使用
できる。

窒素源としては、従来のコーンステイープリカー、ポリ
ペプトン、イーストエキストラクト、大豆粉、魚肉エキ
スなどに代えて、ゼラチンを使用する。ゼラチンととも
に、前記フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン
等のアミノ酸を併用するのが好ましい、ゼラチンの添加
量は０．５〜２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％（ｗ
／ｖ）程度、アミノ酸の添加量は合計量で０．０５〜０
．２％（ｗ／ν）、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）程度
が適当である。

無機塩としてはリン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化亜鉛などが使用できる。

培地に加える炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウムなどが使用でき、添加する濃度としては、
０．５〜２％（ｗ／ｖ）程度とし、ｐＨ９，５付近にす
ることが望ましい。

上記の培地で、３７℃でバチルスｓｐ、　Ｎｏ、　ＡＨ
−１０１菌株を好気的に培養すれば、培養開始後約２４
時間でプロテアーゼＡＨ−１０１の生産量が最大となる
。

培養温度が低いと１例えば２０℃ではプロテアーゼＡ）
Ｉ−１０１は生産されず、また温度が高くてもその生産
量が低下する。またｐｌ（をアルカリ側にすることも重
要であり、プロテアーゼＡＨ−１０１を生産させるため
にはｐ）１９．５付近にすることが望ましい、さらに、
バチルスｓｐ、Ｎｏ、ＡＨ−１０１菌株は通性嫌気性菌
であるが、プロテアーゼＡＨ−１０１を生産させるため
には通気することが必要とされ、通気量は１．５ｖｖ閣
程度が好ましい。

このようにして得られた培養液は、遠心分離などで菌体
を分離して粗酵素液とすることができる。

粗酵素液は菌体から採取することもできる。粗酵素液は
当分野公知の分離精製手段１例えば限外濾過、ゲル濾過
、イオン交換、電気泳動、吸着剤などの手段によって精
製し、酵素標品（精製―素）を得ることができる。

アルカリプロテアーゼとしてプロテアーゼＡＨ−１０１
を使用した場合、プロテアーゼＡＨ−１０１はカルシウ
ムイオンの存在下、８０℃でも耐熱性があり、しかもそ
の８０℃で最大活性を示し、広範囲のｐ）Ｉで安定で、
かつ洗剤などに対しても安定である。

本発明では上記のようなプロテアーゼの生産方法におい
て、ゼラチンを含む培地により培養を行うため、プロテ
アーゼを高生産性で生産することができる。この場合前
記アミノ酸を併用することにより、さらに生産性は高く
なり、コーンステイープリカーを用いた場合に比べ、生
産性が約７０％向上する。

またゼラチンは培地由来の色がほとんどなく。

培養後の培養液の色も膚色がなく、コーンステイープリ
カーに比べ、格段にきれいであり、精製時における脱色
の手間も大幅に軽減される。さらにゼラチンは、きよう
雑物の比較的少ない天然タンパク質であるため、培地濃
度を濃くした高濃度培養が可能であり、高濃度培養を行
うことにより。

より高い生産性の向上が可能である。

〔実施例〕

次に本発明の実施例について説明する。

なお各例中、培地組成を表わす％はｖ／ｖ％である。

実施例１ 可溶性デンプン２％、Ｋ、ＨＰｏ、　０．１％、　Ｍｇ
５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０３％、ＺｎＣら０．０３％、Ｃ
ａＣＱ、　０．０３％および炭酸水素ナトリウム（２０
％水溶液として別殺菌して加えた）２％よりなる基本培
地に第５表に示す窒素源を加えて滅菌した液体培地にバ
チルスｓｐ、　Ｎｏ、　Ａｔ（−１０１菌株を接種し、
ロータリーシェーカを用いて３７℃で３６時間培養した
。この培養液を遠心分離して菌体を除去し、粗酵素液を
得た。

この粗酵素液のプロテアーゼ活性を測定した結果を第５
表に示す。

慎５裏　ｇ１源がプロテアーゼ生産に及ぼす影響第５表
の結果より、基本培地に０．５％のゼラチンを添加した
培地を用いると、コーンステイープリカーに比べ約３０
％生産性が増加することがわかる。

実施例２ 実施例１で用いた基本培地に０．５％のゼラチンを加え
、さらに第６表に示す各アミノ酸を０．１％添加した培
地を用い、ロータリーシェーカにより３７℃で７０時間
培養し、実施例１と同様に粗酵素液のプロテアーゼ活性
を測定した結果、およびゼラチンのみで培養した場合に
対する活性比を第６表に示す。

第６表の結果より、フェニルアラニン、トリプトファン
、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンお
よびアルギニンを添加した場合、ゼラチン単独の場合よ
りプロテアーゼの生産性が高くなり、プロリンを添加し
た場合は約３０％の生産性の増加がみられることがわか
る。

以上の結果から、ゼラチンとアミノ酸を組合せた培地を
用いることにより、コーンステイープリカーを用いた場
合と比べて、約７０％の生産性の増加が観察された。

実施例３ コーンステイープリカーおよびゼラチンの添加量を変え
て、実施例１と同様に培養を行い、培地の色（ＯＤ　４
２０ｎｍ）を測定した結果を第７表に示す。

第７表の結果より、コーンステイープリカーとゼラチン
の間では、明らかに色の濃さが異なり。

ゼラチンの方が着色が少なく、きれいである。コーンス
テイープリカーの場合は２％、ゼラチンの場合は０．５
％を窒素源として用いているが、この両者を比較すると
、色の濃さが約４０倍異なることがわかる。

実施例４ 高濃度培養の効果を見るために、以下に示す培地の濃度
を１から５倍に増加させて、実施例１と同様に２Ｑの発
酵槽により、３７℃、ｐＨ９，５で２日間培養を行い、
得られた菌体量（００）と酵素活性を測定した。

培地　　　　（％） ゼラチン　　　　　　　　０・５ 可溶性デンプン　　　　　２．０ に、　ＨＰＯ，Ｏ・１ Ｍｇ５０４・７Ｈ２００，０３ ＣａＣＩ２．　・２Ｈ２００、０３ ＮａＨＣＯ，２，０ 結果を第８表に示す。

第８表培地濃度の影響 Ｘｉ　　Ｘ２　　Ｘ５ 菌体量　　（００）　　　　７，０　　１９．０　　５
２．５酵素活性　ＣＵ／■１２）　　　２３００　　４
１００　　６２００第８表の結果より、高濃度培養によ
って菌体量および酵素活性の上昇が見られ、５倍濃度の
培養では約２．７倍の酵素活性の上昇が見られた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ゼラチンまたはゼラチンと特定のアミ
ノ酸を含む培地によりプロテアーゼ生産菌を培養するよ
うにしたため１着色のないプロテアーゼを、高生産性で
生産することができる６

【図面の簡単な説明】

第１図はプロテアーゼＡＨ−１０１の至適ＰＨを示すグ
ラフ、第２図はプロテアーゼＡＨ−１０１の安定ＰＨの
範囲を示すグラフ、第３図はプロテアーゼＡＨ−１ｏｔ
の作用適温の範囲を示すグラフ、第４図はプロテアーゼ
ＡＨ−１０１の熱安定性を示すグラフである。 代理人　弁理士　柳　原　　　成 第１図 ｐＨ（−） 第２図 ｐＨ（−） 残存法ａ（’／、） シ８性比（−）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属するプロテアーゼ生産菌を、ゼラ
   チンを含む培地で培養し、培養物からプロテアーゼを採
   取することを特徴とするプロテアーゼの生産方法。
2. （２）ゼラチンを含む培地が、さらにフェニルアラニン
   、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸、グルタ
   ミン酸、リジンおよびアルギニンよりなる群から選ばれ
   るアミノ酸の少なくとも１種を含むことを特徴とする請
   求項（１）記載のプロテアーゼの生産方法。