JPH0325157B2

JPH0325157B2 -

Info

Publication number: JPH0325157B2
Application number: JP57142743A
Authority: JP
Inventors: Shintoreru Yoahimu; Barutoniku Furiitoherumu; Shumitsuto Rorufu; Uaisu Aruburehito
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1981-08-20
Filing date: 1982-08-19
Publication date: 1991-04-05
Also published as: JPH0322970A; DE3272012D1; DE3132936A1; EP0072978B1; DK340882A; JPS5856682A; ATE20761T1; US4473644A; EP0072978A1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明の対象は、土壌試料より分離されたリゾ
プス・リゾポデイホルミス（Rhizopus
rhizopodiformis）種の菌株の培養による広い作
用範囲をもつ酸性プロテアーゼの製造方法であ
る。この菌株はBaarn（オランダ国）のCentraal
Bureau voor Schimmel−Culturesの寄託番号
CBS227.75をもつ。本発明はリゾプス属の菌株のプロテアーゼ収量
の増加を目的とする。この目的はこの菌株を変異
させ、そして適当な変異株を選択することにより
達成される。それ故に、本発明の対象は、リゾプス
（Rhizopus）属の出発菌株を変異させ、より高い
プロテアーゼ生産性をもつ変異株を選択し、これ
を、同化可能な炭素源および窒素源を含有する培
地で、３と７の間のPH値および25℃と50℃の間の
温度で培養し、生産された酵素を分離することを
特徴とする、リゾプス属の菌株の好気的培養によ
り広いPH−作用範囲をもつ酸性プロテアーゼを高
収量で製造する方法である。変異は好適には紫外線照射で行なわれる。この
変異処理は選択した菌株を用いて１回または数回
くり返される。また本発明の対象は、下記の条件のもとに振盪
培養で＞10ｍTU／mlの蛋白質分解活性を生成す
る限り、そしてこの生成されたプロテアーゼが下
記のテスト（等電点分画電気泳動及び免疫学的試
験）に基いて野生株リゾプス・リゾポデイホルミ
スCBS225.75のそれと同じである限り、上記の方
法で単離された出発菌株の変異株である。特に次
の変異株が挙げられる。リゾプス・リゾポデイホルミス−34
（CBS219.80）リゾプス・リゾポデイホルミス−46
（CBS220.80）リゾプス・リゾポデイホルミス−59
（CBS221.80）リゾプス・リゾポデイホルミス−65
（CBS222.80）上記変異株の単離は次の方法で行なわれる。麦芽汁肉汁寒天で胞子着生した野生菌株の斜面
培養物を殺菌した0.005％ナトリウムラウリルサ
ルフエート溶液で洗い出し、菌糸破片を分離する
ため胞子懸濁液を殺菌したガラスフリツト（Ｄ−
３）により過し、ついで6000U／分で15分遠心
分離する。沈降した胞子を殺菌した0.1M酢酸緩
衝液（PH4.5）中に入れ、顕微鏡下で胞子の濃度
を約10⁸個／mlに調整する。ついでこのように調
整した胞子溶液を紫外線ランプ（波長254nｍ、
13ワツト）で99.9％の殺滅率まで照射する。この
ように照射した胞子を次の組成のカゼイネート寒
天平板に添加する。大豆粉 0.10％コーン・ステイーブ・リカー 0.10％グルコース 0.50％ゼラチン 0.50％麦芽エキス 0.50％デソキシコール酸ナトリウム 0.10％ KH₂PO₄ 0.24％ MgCl₂・6H₂O 0.10％ MnSO₄・4H₂O 0.05％ CaCl₂・2H₂O 0.02％カゼイン 0.40％寒天 1.60％ PH値 5.5 この平板を30℃で２〜３日間培養する。ついで
強いカゼイン分解の環形成をもつコロニーだけを
菌株培養物として分離し、さらに検査をする。この新規な菌株を、その蛋白質分解効率を検査
するために30℃で振蘯培養する（邪魔板をもつ
500mlエルレンマイヤ−フラスコ、振動数Ｕ／
分）。この培地の組成は次の如くである。 KH₂PO₄ 0.25％ NaNO₃ 0.06％カゼイン 2.00％ゼラチン 0.80％大豆粉 0.50％麦芽エキス 0.50％トウモロコシでんぷん（でんぷん加水分解した）
2.00％ 20％ふすまエキス 10.00％（容量％） 10％オートフレークエキス 10.00％（容量％） PH5.5 これにより野生菌株から一連の変異株−これら
は明かにより高いプロテアーゼ活性を生成する−
が単離される。最も活性の高い菌株から出発し
て、更に上昇した活性のもつ菌株に導く変異試験
が開始される。この試験は結局３回行なわれ、総
計で次の菌株が分離され、そしてプロテアーゼ収
量が決定された。

【表】これらの菌株のうち、次の菌株がBaarn（オラ
ンダ国）のCentraal Bureau voor Schimmel−
Cultures（CBS）に寄託されている。

【表】第１表の菌株により生成されたプロテアーゼは
野生株CBS227.75のそれと同じ性質を所有する。
これらのプロテアーゼはPH2.5と6.5の間の弱い酸
性領域における特に広い作用スペクトルによつて
卓越する。作用の最適PHはPH4.5であり、80％最
大活性の領域はPH3.3〜5.9であり、60％最大活性
の領域はPH3.0〜6.4である。このプロテアーゼは
特に飼料への添加物、特に家禽、豚、仔牛、有用
魚の飼育および肥育における結果の改良のための
添加物として適する。しかし、その上にまたこの
プロテアーゼは、酸性プロテアーゼが使用される
ことのできる他の使用目的、例えば食品加工工場
における使用、病院および家庭における酸性の洗
浄剤および清浄剤、特にカツヘル、床、およびテ
ーブルの清浄剤としての使用、製革における皮革
用補助剤としての使用、さらに高度に精製した形
で医薬の使用領域において消化剤としての使用な
どのような使用目的に用いられる。本プロテアーゼの製造方法は、液体あるいは固
体の培地に上記の選択した変異株を培養すること
により行なわれ、その場合、一般に液体の培地が
好適である。栄養溶液での培養では、通常の好気
的振蘯培養法または醗酵法にしたがつて培養が行
なわれる。本発明で使用される培地は通常の方法で製造さ
れ、そして炭素源、窒素源、および他の微生物に
とつて必要な栄養物質や成長物質を含有する。適
当な炭素源としては、でんぷん、デキストリン、
蔗糖、グルコース、フラクトース、マルトース、
および糖含有廃物が挙げられる。窒素源として
は、アンモニウム塩、尿素、カゼイン、ゼラチ
ン、コーン・ステイーブ・リカー、および大豆粉
もしくは大豆粕が問題となる。さらに、例えば燐
酸水素ナトリウム、燐酸水素カリウム、燐酸水素
アンモニウム、カルシウム塩、マグネシウム塩の
ような無機塩を培地に添加することができる。さ
らにまた、例えば酵母エキスやビタミンのような
成長物質を培地に添加することも好ましいことで
ある。醗酵温度は25〜50℃の範囲内にあるが、27〜32
℃の間の温度を選ぶのが有利である。培地のPH値
は3.0〜7.0であることができ、好ましくは4.0〜
6.0である。培養は一般に20〜96時間行なわれる。本発明方法により製造されたプロテアーゼは、
通常の方法で過しあるいは遠心分離した培養液
から、有機溶剤の添加あるいは例えば硫酸ナトリ
ウムまたは硫酸アンモニウムでの塩析により沈澱
させ、そして濃縮することができる。精製は透析
法あるいはイオン交換樹脂での処理により行なう
ことができる。本プロテアーゼの蛋白質分解活性の確認はアン
ソン（Anson）の測定の公知の原則にしたがつて
行なわれる。すなわち、適当に希釈した量の酵素
溶液を、同容量の1.2％カゼイン溶液とともに40
℃で20分間恒温保持し、この場合これに0.6％乳
酸、６モル尿素、および0.1モルクエン酸または
酢酸を含有させる。カゼイン溶液のPH値は2Nの
苛性ソーダの添加により4.5に調整する。上記の
恒温保持後、容量比１：１で0.4Nのトリクロル
酢酸を添加し、生成した消化されないカゼインの
沈澱を別し、液中に分解で生じた蛋白質分解
物を任意の蛋白質測定方法によつて調査する。こ
れに対しては、例えばMethods of
Enzymology3（1957）448頁以下にLaneにより記
載された方法が適する。各試料に対し、ブランク値をつくることが必要
であり、これには第１にトリクロル酢酸が添加さ
れ、つぎにカゼイン溶液が添加される。このブラ
ンク値は、試薬−ブランク値のほかに、消化前に
酵素溶液中にすでに存在している低分子のペプチ
ドを示す。主値（Hauptwert）とブランク値と
の間の差が上記した方法で吸光度で比較され、こ
れがこの測定ではチロシンの一定量を与える。こ
のチロシンの量が存在する酵素の蛋白質分解活性
に対する尺度となる。酵素単位（TU）は、毎分
主値とブランク値の間の酵素溶液の代りに使用す
る１モルチロシン溶液と同じ吸光差異を生ぜしむ
る酵素量である。蛋白質分解活性の測定は、4.5より高いPH値お
よび低いPH値では、カゼイン溶液の適切な調整に
よりそのまま可能であるが、その場合酢酸添加を
クエン酸で取り替えることが有利である。例１培地の調製のために、１の水に大豆粉３ｇ、
コーン・スチーブ・リカー３ｇ、カゼイン15ｇ、
ゼラチン７ｇ、KH₂PO₄2.4ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.5ｇ、MnCl・4H₂O0.1ｇ、CaCl₂・
2H₂O0.1ｇ、およびトウモロコシでんぷん20ｇを
溶解もしくは分散した。この栄養溶液のPH値を
5.3とした。上記のトウモロコシでんぷんはアミ
ラーゼにより最高に分解されたものである。この
殺菌した栄養溶液に変異株−34の胞子を接種
し、振蘯培養器中で最適な通気のもとに30℃で約
50時間培養を行なつた。この培養時間後、菌体を
別し、そして菌体を含まない培養液を上記し
た方法によるプロテアーゼ活性の測定のために使
用した。この場合、この培養液は37ｍTU／ml
の酵素活性に達することが判明した。例２培地の調製のために、１の水道水に大豆粉
（脱脂した）10ｇ、コーン・ステイーブ・リカー
５ｇ、カゼイン12ｇ、ゼラチン５ｇ、穀物原料の
酒精蒸留残滓５ｇ、KH₂PO₄2.4ｇ、NaNO₃1ｇ、
NH₄Cl1ｇ、FeSO₄0.01ｇおよび生のトウモロコ
シでんぷん30ｇを溶解もしくは分散した。この栄
養溶液のPH値をオートクレーブ処理後に5.3に調
整した。この栄養溶液を入れた１のエルレンマ
イヤーフラスコに、10mlのツアペツク−ドツク前
培養物（でんぷん５％および酵母エキス0.5％を
加えた）−この前培養物は変異株−59の胞子を
接種し、30℃で24時間振蘯培養したものである−
を添加し、通気のもとで約72〜96時間、PH値が
6.8〜7.0に上昇するまで培養した。その後、菌体
を別し、透明な培養液を上記した方法による
プロテアーゼ活性の測定のために使用した。この
場合、この培養液は28ｍTU／mlの酵素活性に
達することが判明した。 Mansville社のフイルター・セル（Filter Cel）
５ｇおよびスタンダード・スーパー・セル
（Standard Super Cel）５ｇの添加のもとにおけ
る10個の１振蘯フラスコの混合物からの培養
液の清澄過、50トールの出発容量の1/3の濃縮、
そして撹拌下における水分を包まない硫酸ナトリ
ウム39％の添加での沈澱−この場合38〜40℃の温
度を用いた−によりプロテアーゼを分離した。し
かしまた、このプロテアーゼは−３〜５℃の温度
で２容量のエタノール、メタノール、アセトン、
または他の水と混合し得る溶剤の滴下により沈澱
させることもできる。この沈澱物を吸引過し、
そして真空乾燥した。例３上述した測定方法の使用のもとに、例１および
例２により分離したプロテアーゼの活性をPH値の
関係において調査した。第３表には、最適の活性
ないし最適PH値において測定された活性の50％の
活性が存在するPH値が示される。この値から認め
られるように、例１および例２で使用した変異株
のプロテアーゼは、野生株CBS227.75から分離さ
れたプロテアーゼと同様に広いそして上記した使
用領域に有利なPH作用範囲を所有する。

【表】例４変異株リゾプス・リゾポデイホルミス−34、
−46、−59、および−65から得たプロテア
ーゼを、等電点分画電気泳動法もしくは
Ouchterlonyの交叉反応法（Kreuzreaktion）に
したがつて、野生株CBS227.75から得たプロテア
ーゼと比較した。この場合、全部のプロテアーゼ
の完全な同一性が明らかになつた。

【表】等電点分画電気泳動法装置：マルチホール（Multiphor）2117、 LKBインストラメンツ LKB2103パワー・サプライ材料：LKBアンホラインPAGプレート、LKB インストラメンツ PH3.5−9.5 陽極液：1MH₃PO₄ 陰極液：1MNaOH 等電点分画電気泳動水冷した装置にポリアクリルアミドゲルを置い
た後、電極液を浸した紙の電極片をゲルの縁に置
く。陰極と陽極との間のゲルの中央線上に５mmの
幅の紙片をおき、そして10μの塩を含まない
試料溶液（５mg／ml蛋白質）を滴下する。装置の
閉鎖後、10ｍＡの電流の強さでPH勾配を形成さ
せ、30分後に試料紙片を除去し、そして15ｍＡ
の電流の強さに高める。２〜2.5時間後には分離
は終了する。 PH勾配の決定 PH勾配は、度盛りをした表面−PH電極により、
陰極と陽極の間のPHの経過をいくつかの線上に捕
足し、そしてPH／cm−図をつくり上げるというよ
うにして決定される。固定および着色固定液：トリクロル酢酸57.5ｇとスルホサリチル
酸17.25ｇに蒸留水を加えて500mlにする。脱色液：エタノール500mlと酢酸160mlからなる混
合物を蒸留水で希釈して2000mlにする。着色液：脱色液400ml中にコオマジ−・ブル−
（Coomassie Blue）Ｇ−250を0.46ｇ PH−図の調製後、蛋白質沈澱およびアンホライ
ン除去のためにゲルを１時間撹拌している固定液
中に放置し、５分間脱色液で洗浄し、続いて60℃
で10分間着色液中に置く。このゲルを脱色液で数
回洗浄することにより、青色に着色した蛋白質バ
ンドを背景から明瞭に目立たせるまで脱色する。 PH−図に基いて蛋白質の等電点を決定する。 Ouchterlonyの交叉反応材料交叉反応に対しては、フランクフルトのミルス
社（Firma Miles）の免疫拡散板
（Immundiffusionsplatten）を使用する（コード
No.64−276−１）。この既製の板は、硼酸塩／食塩
緩衝液（PH7.5−イオン強度0.175％）中に0.9％の
アガロースを含有する。この板はさらに静菌剤と
して0.01％のチオメルサール（Thiomersal）お
よび蛋白沈澱線に対する指示薬としてトリパンブ
ルー（Trypanblue）を含有する。プロテアーゼCBS227.75に対する抗体は家兎か
ら得られたものである。正の対照として、プロテアーゼCBS227.75−そ
れで免疫が実施された−を使用した。実施上記拡散板の中央に25μの抗血精をピペツト
でおき、その外側にある凹所に５mg／mlないし10
mg／mlの濃度で各25μの蛋白質溶液をおいた。拡散時間：４℃で72時間である。沈澱線はアガロース中に含有されているトリパ
ンブルー指示薬により検出される。免疫学的交叉
反応は、抗体を生成するプロテアーゼが試験した
プロテアーゼと同じであるときにだけ正の結果と
なる。これは沈澱線の溶解により確かめられる。

Claims

【特許請求の範囲】１野性株リゾプス・リゾポデイホルミス
CBS227.75を変異させ、より高いプロテアーゼ生
産生をもつ変異株：リゾプス・リゾポデイホルミ
ス−34（CBS219.80）、リゾプス・リゾポデイホ
ルミス−46（CBS220.80）、リゾプス・リゾポデ
イホルミス−59（CBS221.80）、リゾプス・リゾ
ポデイホルミス−65（CBS222.80）を選択し、
これを、同化可能な炭素源および窒素源を含有す
る培地で、３と７の間のPH値および25℃と50℃の
間の温度で培養し、生産された酸素を分離するこ
とを特徴とする、リゾプス属の菌株の好気的培養
により広いPH−作用範囲をもつ酸性プロテアーゼ
を高収量で製造する方法。２変異が紫外線照射により行われることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。３変異手段および選択手段が１回または数回く
り返えされることを特徴とする特許請求の範囲第
１項又は第２項記載の方法。