JPS62107785A - 新規酵素、その製造法およびｎ−（ｌ−アスパルチル−１）−ｌ−フエニルアラニンメチルエステル製造へのその応用 - Google Patents
新規酵素、その製造法およびｎ−（ｌ−アスパルチル−１）−ｌ−フエニルアラニンメチルエステル製造へのその応用Info
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- JPS62107785A JPS62107785A JP61260570A JP26057086A JPS62107785A JP S62107785 A JPS62107785 A JP S62107785A JP 61260570 A JP61260570 A JP 61260570A JP 26057086 A JP26057086 A JP 26057086A JP S62107785 A JPS62107785 A JP S62107785A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規酵素、その製造法およびＮ−（し−アスパ
ルチル−Ｉ Ｊ −Ｌ−７エニルアラニンメチルエステ
ルの製造へのその応用に関する。
ルチル−Ｉ Ｊ −Ｌ−７エニルアラニンメチルエステ
ルの製造へのその応用に関する。
酵素的方法が生理学的活性を有する吻Ａを得るため普通
に使用され、その程度はますます増大している。これら
の酵素的方法は便利なものであり、非常ｔこしばしばエ
ナンチオマーまｆこはジアステレオマーの分離を行なう
必要なしに、所望配置を有する目的生成物を直接的に提
供する。
に使用され、その程度はますます増大している。これら
の酵素的方法は便利なものであり、非常ｔこしばしばエ
ナンチオマーまｆこはジアステレオマーの分離を行なう
必要なしに、所望配置を有する目的生成物を直接的に提
供する。
普通にアスパルテームとして知られているＮ−（Ｌ−ア
スパルチル−ＩＪ−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルは、著しい甘味付与性を有する非常に良く知られたジ
ペプチドである（ジτ−ナル・オプ・ジ・アメリカン・
グミカル・ソサイエテイ１９６９年第９１巻に２６８４
頁参照ン。それはＤＬ−フエニルアラニンメチルエステ
ルおよびし一アスパラギン酸から出発して酵素的方法で
直接得ることができる（ヨーロッパ特許出願第００１５
４４７２号、第０１２４３１３号および第００７４０９
５号参照］、しかしながらこの方法の生産性は低い。こ
の化合物はまたＤＬ−フエニルアラニンメチルエステル
とＬ −＋（−ベンゾイルオキシ−カルボニルアスパラ
キン酸の酵素縮合から得られるそのＮ−ベンゾイルオキ
シ−カルボニル誘導体の水素化分断または通常の化学的
方法を用いて一般５こｇ！遺される。
スパルチル−ＩＪ−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルは、著しい甘味付与性を有する非常に良く知られたジ
ペプチドである（ジτ−ナル・オプ・ジ・アメリカン・
グミカル・ソサイエテイ１９６９年第９１巻に２６８４
頁参照ン。それはＤＬ−フエニルアラニンメチルエステ
ルおよびし一アスパラギン酸から出発して酵素的方法で
直接得ることができる（ヨーロッパ特許出願第００１５
４４７２号、第０１２４３１３号および第００７４０９
５号参照］、しかしながらこの方法の生産性は低い。こ
の化合物はまたＤＬ−フエニルアラニンメチルエステル
とＬ −＋（−ベンゾイルオキシ−カルボニルアスパラ
キン酸の酵素縮合から得られるそのＮ−ベンゾイルオキ
シ−カルボニル誘導体の水素化分断または通常の化学的
方法を用いて一般５こｇ！遺される。
本発明者等は、Ｉ、−Ｎ−ベンジルオキシ−カルボニル
アスパラギン酸およびＤＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルから出発してＮ−ペンジイルオキシ−力ルボニル
アスバルテームヲ得ルため、ミクロコツカス 力セオリ
テイカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓＪの培養液から抽出した蛋白分解系（ＳＦと称
する）を用い、この種の方法も開発した。
アスパラギン酸およびＤＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルから出発してＮ−ペンジイルオキシ−力ルボニル
アスバルテームヲ得ルため、ミクロコツカス 力セオリ
テイカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓＪの培養液から抽出した蛋白分解系（ＳＦと称
する）を用い、この種の方法も開発した。
牛乳から分離した微生物、ミクロコッヵス力セオリティ
カス（この菌株は１９８２年４月２８日付にてＡ１１９
４として、パリ市インステイテユーツ・パスツールのザ
・コレクション・ナショナル・ド・三りローオルガニス
゛ムに寄託されている）は事実として一定の培養条件下
（こ蛋白分解系ｓｐを提供し、これから、蛋白分解系ｓ
ｐの殆ど完全な蛋白分解活性を示す分子量３５０００〜
４１０００を有する単個中性細胞外蛋白分解プロテアー
ゼ（以″ＦＰと称するンを抽出することができる（ Ｍ
、Ｄｓｓｍａｚｅａｕｃｌ 等のＡｎｎ、 Ｂｉｏ、Ａ
ｎｉｍ。
カス（この菌株は１９８２年４月２８日付にてＡ１１９
４として、パリ市インステイテユーツ・パスツールのザ
・コレクション・ナショナル・ド・三りローオルガニス
゛ムに寄託されている）は事実として一定の培養条件下
（こ蛋白分解系ｓｐを提供し、これから、蛋白分解系ｓ
ｐの殆ど完全な蛋白分解活性を示す分子量３５０００〜
４１０００を有する単個中性細胞外蛋白分解プロテアー
ゼ（以″ＦＰと称するンを抽出することができる（ Ｍ
、Ｄｓｓｍａｚｅａｕｃｌ 等のＡｎｎ、 Ｂｉｏ、Ａ
ｎｉｍ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１９６８年第８巻第
４１９頁〜第４２９頁および第５６５頁〜＠５７７頁お
よびＥｕｒｐ（ａｎ Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １９７
１年第１９巻第５１頁〜第５５頁参照ノ。
４１９頁〜第４２９頁および第５６５頁〜＠５７７頁お
よびＥｕｒｐ（ａｎ Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １９７
１年第１９巻第５１頁〜第５５頁参照ノ。
本発明者等はこの蛋白分解系ｓｐ中に新規酵素（以後Ｅ
と称するノをここに見出した。これはカゼインについて
の蛋白分解活性を有せず、ある条件の五にＬ−アスパラ
ギン酸とＤＬ−７二二ルアラニンメチルエステルとの直
接縮合をしてアスパルテームを得ることができる性質を
有するＯ 従って本発（７）はこの新規酵素およびその製造法に関
する。
と称するノをここに見出した。これはカゼインについて
の蛋白分解活性を有せず、ある条件の五にＬ−アスパラ
ギン酸とＤＬ−７二二ルアラニンメチルエステルとの直
接縮合をしてアスパルテームを得ることができる性質を
有するＯ 従って本発（７）はこの新規酵素およびその製造法に関
する。
酵素Ｅは２０００００より大まにはそれ（こ等しい分子
量を有する蛋白質であり、変性条件ドアクリルアミドゲ
ルの段階的ｉｌｌ気ｆｌｙ、動により。
量を有する蛋白質であり、変性条件ドアクリルアミドゲ
ルの段階的ｉｌｌ気ｆｌｙ、動により。
それは重合体酵素（ｐｏＬｙｍｅｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅ
）であることが１４認された（約４００（ＪＯの一つ
大きなバンドと約ａｏｏｏｏの二つの小さなバンド几更
にそれはカゼインを加水分解しない。
）であることが１４認された（約４００（ＪＯの一つ
大きなバンドと約ａｏｏｏｏの二つの小さなバンド几更
にそれはカゼインを加水分解しない。
それ１ま、１．５ｍＭの塩化力ルシクムを含有し。
ｐＨ７，５で、２０ｍＭのトリス−（ヒドロキシエチル
ノーアミノメタンバソファ（以後ＴＲ工Ｓと称する）塩
酸塩で緩衝したゲル（フランス国のファルマシア＋１フ
ランス―ニス・ニーＩこよって市販されているセファク
リル５２００スーパーフアインノ上で、このバッファの
溶離と同じバ７ア中の蛋白分解系ｓｐの溶液を濾過する
ことζこよって容易に得ることができる。
ノーアミノメタンバソファ（以後ＴＲ工Ｓと称する）塩
酸塩で緩衝したゲル（フランス国のファルマシア＋１フ
ランス―ニス・ニーＩこよって市販されているセファク
リル５２００スーパーフアインノ上で、このバッファの
溶離と同じバ７ア中の蛋白分解系ｓｐの溶液を濾過する
ことζこよって容易に得ることができる。
濾過に続いて２８０ｎｍで溶出液の光学密度の測定を行
ない、２０００００以上の分子量に相当する初期画分を
一緒番こし、次いで凍結乾燥する。かくして酵素Ｅが単
離される。
ない、２０００００以上の分子量に相当する初期画分を
一緒番こし、次いで凍結乾燥する。かくして酵素Ｅが単
離される。
蛋白分解系ｓｐは知られており、それは前述したＭ、Ｄ
ｅ日ｍａｚｅａｕｄ ｌこよって発表された方法に従
って、 ｐＨ７，０でミクロコツカス 力セオリｔイカ
スの培養液をば酸アンモニウムの水性溶液で処理し、そ
れから剣法を遠心分離で除去し１次いで形成された沈澱
を塩化ナトリウムの水性溶液中【こ溶解し、それを超濾
過処理をした後この溶液を最後ｔＣ凍結乾燥することｉ
こよって作ることができる。この蛋白分解系は商標名Ｒ
ＵＬＡＣＴＩＮＢでパリ市の会社ルセル・ククラフから
通常入手できる。
ｅ日ｍａｚｅａｕｄ ｌこよって発表された方法に従
って、 ｐＨ７，０でミクロコツカス 力セオリｔイカ
スの培養液をば酸アンモニウムの水性溶液で処理し、そ
れから剣法を遠心分離で除去し１次いで形成された沈澱
を塩化ナトリウムの水性溶液中【こ溶解し、それを超濾
過処理をした後この溶液を最後ｔＣ凍結乾燥することｉ
こよって作ることができる。この蛋白分解系は商標名Ｒ
ＵＬＡＣＴＩＮＢでパリ市の会社ルセル・ククラフから
通常入手できる。
本発明はまた酵素法によりアスパルテームの製造をする
ためこの酵素Ｅの応用にも関する。
ためこの酵素Ｅの応用にも関する。
本発明によれば、その性質およびそれを製造できる方法
によって特徴づけられる酵素Ｅは。
によって特徴づけられる酵素Ｅは。
Ｌ−アスパラギン酸とＤＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルの混合物中で、通常の酵素方法の条件″Ｆ、それ
を反応させるとき、アスパルテームを経済的番こかつ容
易に得ることができる驚くべき特長を有する。
ステルの混合物中で、通常の酵素方法の条件″Ｆ、それ
を反応させるとき、アスパルテームを経済的番こかつ容
易に得ることができる驚くべき特長を有する。
本発明擾こよれば、１０〜４５°Ｃ１好ましく４０°Ｃ
の温度で、ｐＨ４〜８．有利には５〜７で、同じｐＨ値
に調整したバッファ混合物の存在下に、酵素ＥをＬ−ア
スパラギン酸およびＤＬ−７二二ルアラニンメチルエス
テルの溶液中で反応させ。
の温度で、ｐＨ４〜８．有利には５〜７で、同じｐＨ値
に調整したバッファ混合物の存在下に、酵素ＥをＬ−ア
スパラギン酸およびＤＬ−７二二ルアラニンメチルエス
テルの溶液中で反応させ。
次いで形成されたアスパルテームを既知の方法を用いて
分離する。これらの反応条件丁番こ、酵ＸＩはＬ−アス
パラギン酸の１位のカルボニルと、Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルのアミン官能基とのペプチド縮合を急
速薔こ生ぜしめてアスパルテームを提供する。有利な条
件番こおいては、使用するし一アスパラギン酸１ｍＭに
ついて、０１ダ〜１００岬、好ましくは０．５〜１０ダ
の量の酵素Ｅ（カルカー法番こより測定しに蛋白質で表
わす〕が反応を生ぜしめる。
分離する。これらの反応条件丁番こ、酵ＸＩはＬ−アス
パラギン酸の１位のカルボニルと、Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルのアミン官能基とのペプチド縮合を急
速薔こ生ぜしめてアスパルテームを提供する。有利な条
件番こおいては、使用するし一アスパラギン酸１ｍＭに
ついて、０１ダ〜１００岬、好ましくは０．５〜１０ダ
の量の酵素Ｅ（カルカー法番こより測定しに蛋白質で表
わす〕が反応を生ぜしめる。
反応媒体中でのアスパルテームの形成は高圧液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）で試料を周期的番こ分析するこ
と番こよって追求できる。アスノぐルテームの濃度が反
応媒体中でもはや著しい程度番こ増大しナクナつにとき
、反応媒体を通常の方法で処理して形成されたアスパル
テームを分離する。
トグラフィ（ＨＰＬＣ）で試料を周期的番こ分析するこ
と番こよって追求できる。アスノぐルテームの濃度が反
応媒体中でもはや著しい程度番こ増大しナクナつにとき
、反応媒体を通常の方法で処理して形成されたアスパル
テームを分離する。
本発明の改変例によれば、酵素Ｅをそれが抽出される蛋
白分解系ｓｐの酵素Ｅの等量で置換できる。事実この系
中に存在する別の酵素特番こ蛋白分解酵素Ｐは酵素Ｅを
妨害しない。
白分解系ｓｐの酵素Ｅの等量で置換できる。事実この系
中に存在する別の酵素特番こ蛋白分解酵素Ｐは酵素Ｅを
妨害しない。
下記実施例は例示のにめ番こ示し、本発明を限定するた
めのものではない。
めのものではない。
実施例 １
１．１ 公告番号＠２５２５８６５号として公告され
たフランス特許第８２．０７８８３号に記載された如き
操作方法による蛋白分解系の製造。
たフランス特許第８２．０７８８３号に記載された如き
操作方法による蛋白分解系の製造。
７５０ｋＱの水、２０ｋＱのコーンスチーブリカー、２
０ｋｇのカゼインペプトン、１０ｋＱのイースト自己溶
解物および９０６ｙの塩化カルシクムから作り、そのｐ
Ｈを苛性ソーダを加えて７に調整した溶液を発酵容器中
で１２０°Ｃで滅菌する。無歯媒体の温度を３０℃にし
、次いで３０％ガキストロースの無萌溶液１５１および
ミクロコツカス 力セオリデイカス（Ａ１１９４株）の
培養からのプロス沈澱物１０１を導入する。
０ｋｇのカゼインペプトン、１０ｋＱのイースト自己溶
解物および９０６ｙの塩化カルシクムから作り、そのｐ
Ｈを苛性ソーダを加えて７に調整した溶液を発酵容器中
で１２０°Ｃで滅菌する。無歯媒体の温度を３０℃にし
、次いで３０％ガキストロースの無萌溶液１５１および
ミクロコツカス 力セオリデイカス（Ａ１１９４株）の
培養からのプロス沈澱物１０１を導入する。
攪拌しつつ無菌空気中で３０℃で２４時間培養し、最初
の１０時間はｐＨを一定（こ保った。２４時間後に１０
５０１の粗培養液を回収し、これを遠心分離して細菌を
除去する。かくして１０００１の透明遠心分離媒体を得
る。この遠心分離媒体ｌこ５６０ ｋｇの硫酸アンモニ
ウムを加え１次いで３０分攪拌した後、）・イア０スー
・く−セル（Ｈｙｆｌｏｓｕｐｅｒｃｅｌンを加える。
の１０時間はｐＨを一定（こ保った。２４時間後に１０
５０１の粗培養液を回収し、これを遠心分離して細菌を
除去する。かくして１０００１の透明遠心分離媒体を得
る。この遠心分離媒体ｌこ５６０ ｋｇの硫酸アンモニ
ウムを加え１次いで３０分攪拌した後、）・イア０スー
・く−セル（Ｈｙｆｌｏｓｕｐｅｒｃｅｌンを加える。
２４時間放置後、上澄媒体を除去し、？Ｏｆの塩化カル
シウム溶液中で得られた不溶性画分を導入し、１５分攪
拌した後、得られた溶液即ち８２Ｉ！を濾過し。
シウム溶液中で得られた不溶性画分を導入し、１５分攪
拌した後、得られた溶液即ち８２Ｉ！を濾過し。
超ｐ過で濃縮する。１２時間後暑こ、１ｄについて５０
５００Ｕの蛋白分解活性間を有する酵素の濃縮溶液１０
．５１！を得る。次いでこのｇ液を凍結乾燥する。５３
０Ｕ／岬の蛋白分解活性を有する蛋白分解系ＳＰ１ｋｇ
が分解される。
５００Ｕの蛋白分解活性間を有する酵素の濃縮溶液１０
．５１！を得る。次いでこのｇ液を凍結乾燥する。５３
０Ｕ／岬の蛋白分解活性を有する蛋白分解系ＳＰ１ｋｇ
が分解される。
１．２ 蛋白分解活性の測定
酵素系の蛋白分解活性は、標準条件下、酵素系（トリク
ロロ酢酸で沈澱できない画分Ｊによって加水分解された
カゼインの量を測定することにより（２８０ｎｍでの光
学密度での変化）ｌｉｌｔ！１定する。これは二つの反
応媒体の１ｐ液の２８０ｎｍでの吸光度の比較測定によ
って得られる、その一つは塩化カルシウム１．５ｍＭを
含有し、ｐＨ７，５で、５０ｍＭＴＲ工Ｓ −１（Ｃｌ
バッファ中の１％カゼインＳ ｄ ５ ｙｔｌを、３０
℃で１０分間涜袢しつつ。
ロロ酢酸で沈澱できない画分Ｊによって加水分解された
カゼインの量を測定することにより（２８０ｎｍでの光
学密度での変化）ｌｉｌｔ！１定する。これは二つの反
応媒体の１ｐ液の２８０ｎｍでの吸光度の比較測定によ
って得られる、その一つは塩化カルシウム１．５ｍＭを
含有し、ｐＨ７，５で、５０ｍＭＴＲ工Ｓ −１（Ｃｌ
バッファ中の１％カゼインＳ ｄ ５ ｙｔｌを、３０
℃で１０分間涜袢しつつ。
１．５ｍＭの塩化カルシウムを含有し、 ｐＨ７，５で
。
。
５０ｍＭＴＲ工Ｓバッファ中２９／ｌでの蛋白分解系ｓ
ｐの溶液５０μｌで処理し、続いて処理終了時に２０％
トリタロロ酢酸水溶液５ ｍｌを加えて得る、他の一つ
は参考として用いるもので、始めからトリクロロ酢酸を
含有する同じ試薬を混合して得る。蛋白分解活性の一単
位（Ｕで表わす〕は０、 ＯＯ１単位／分の吸光度の増
大に相当する。
ｐの溶液５０μｌで処理し、続いて処理終了時に２０％
トリタロロ酢酸水溶液５ ｍｌを加えて得る、他の一つ
は参考として用いるもので、始めからトリクロロ酢酸を
含有する同じ試薬を混合して得る。蛋白分解活性の一単
位（Ｕで表わす〕は０、 ＯＯ１単位／分の吸光度の増
大に相当する。
１．３ 酵素Ｅの製造
５３０ Ｕ／ＩＩＦの蛋白分解活性を有し、２７０’ｆ
の全蛋白質（カルカ一式で測定）８含有する蛋白分解系
５ｐｌｙを１．５ ｍＭの塩化カルシウムを含有し、ｐ
Ｈ７，５の２０ｍＭ ＴＲｌ５−ＨＣＩバッファｌｌ中
に溶解し１次いでこの溶液を、１．５ｍＭの塩化カルシ
ウムを含有し、 ｐＨ７，５で２０ ｍＭ ＴＲ工５−
ＨＣＩバッファ中で調製したセファクリル５２００スー
パーフインゲル（７アルマシア社市％） ３１！Ｌで、
断面１７のカラムで７．５ ｇ／／ｈｒの速度でろ過す
る。
の全蛋白質（カルカ一式で測定）８含有する蛋白分解系
５ｐｌｙを１．５ ｍＭの塩化カルシウムを含有し、ｐ
Ｈ７，５の２０ｍＭ ＴＲｌ５−ＨＣＩバッファｌｌ中
に溶解し１次いでこの溶液を、１．５ｍＭの塩化カルシ
ウムを含有し、 ｐＨ７，５で２０ ｍＭ ＴＲ工５−
ＨＣＩバッファ中で調製したセファクリル５２００スー
パーフインゲル（７アルマシア社市％） ３１！Ｌで、
断面１７のカラムで７．５ ｇ／／ｈｒの速度でろ過す
る。
濾過に続いて２８０ｎｍで溶出液の吸光度を測定し１分
子ｔｈｉ１２０００００以上を有する蛋白質Ｅに相当す
る第１画分を回収し、次いで溶離を続けてＭ、Ｄｅｓｍ
ａｚｅａｕｄ ｉこよって発表された分子ｆｉ３５０
００〜４１０００を有する中性細胞外蛋白分解蛋白質Ｐ
に相当する＠２画分を得る。
子ｔｈｉ１２０００００以上を有する蛋白質Ｅに相当す
る第１画分を回収し、次いで溶離を続けてＭ、Ｄｅｓｍ
ａｚｅａｕｄ ｉこよって発表された分子ｆｉ３５０
００〜４１０００を有する中性細胞外蛋白分解蛋白質Ｐ
に相当する＠２画分を得る。
続いて二つの酵素のカゼインの蛋白分解活性を測定し、
酵素Ｅが何ら蛋白分解活性を有しないが、酵素Ｐにおい
ては全面的シこ見出されることが証明された。
酵素Ｅが何ら蛋白分解活性を有しないが、酵素Ｐにおい
ては全面的シこ見出されることが証明された。
溶出液を凍結乾燥後、５３１１Ｆの蛋白質Ｅおよび２１
３１１ｇの蛋白質Ｐを分離する（カルカ一式１．４
アスパルテームの製造 ｐＨ５，８で％ １００１１１の１００ｍＭ ＭＥＳ−
ＮａＯＨバッファ中ｌこ２０ｍＭのし一アスパラギン酸
、２０ｍＭのＤＬ−フエニルアラニンメチルエステルび
２ ６． ５ Ｗｇの先に単離した蛋白質Ｅを含有する
溶液を４０°Ｃで２時間放置し，次いで５ Ｉ＋／の２
Ｎ塩酸を導入して縮合を停止し、Ｂｏｎｄａｐａｃｋ
Ｃ １８マイクロカラム（フランス国のミリボアークオ
ーターズより販売されている）上での高圧液体クロマト
グラフィ、２５４ｎｍでのＵＶ検出および３０ｍＭリン
酸カリクム（ｐＨｆ３．８）とアセトニトリル（８５／
１５Ｊの混合物での溶離によって１２岬のアスパルテー
ム即ち０．０４１ｍＭを反応媒体中で測定した。
３１１ｇの蛋白質Ｐを分離する（カルカ一式１．４
アスパルテームの製造 ｐＨ５，８で％ １００１１１の１００ｍＭ ＭＥＳ−
ＮａＯＨバッファ中ｌこ２０ｍＭのし一アスパラギン酸
、２０ｍＭのＤＬ−フエニルアラニンメチルエステルび
２ ６． ５ Ｗｇの先に単離した蛋白質Ｅを含有する
溶液を４０°Ｃで２時間放置し，次いで５ Ｉ＋／の２
Ｎ塩酸を導入して縮合を停止し、Ｂｏｎｄａｐａｃｋ
Ｃ １８マイクロカラム（フランス国のミリボアークオ
ーターズより販売されている）上での高圧液体クロマト
グラフィ、２５４ｎｍでのＵＶ検出および３０ｍＭリン
酸カリクム（ｐＨｆ３．８）とアセトニトリル（８５／
１５Ｊの混合物での溶離によって１２岬のアスパルテー
ム即ち０．０４１ｍＭを反応媒体中で測定した。
註： ＭＥＳ ハモルホリノー２ーエタンスルホン酸を
表わす。
表わす。
実施例 ２
実施例１で酵ＡＩをこの酵素Ｅを抽出する蛋白分解系Ｓ
Ｐの当」で置換して実施例１８−繰返して前述したのと
同じくアスパルテームを辱に。
Ｐの当」で置換して実施例１８−繰返して前述したのと
同じくアスパルテームを辱に。
実施例 ３
実施例１で酵素Ｅを当量の酵素Ｐの蛋白質で置換して実
施例１を繰返し，アスパルテームは得られなかった。
施例１を繰返し，アスパルテームは得られなかった。
本発明を例によって示しただけで、こＡｔこ限定されな
いこと，均等である限り，本発明の範囲を逸脱せず）こ
改変をなしうることは理解すべきである。
いこと，均等である限り，本発明の範囲を逸脱せず）こ
改変をなしうることは理解すべきである。
特許出願人 ソシエテ・フランセーズ・ヘキスト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ミクロコツカス カセオリテイカスの培養から誘導
され、カゼインに蛋白分解活性を示さず、２０００００
より大かそれに等しい分子量を有する重合体酵素。 ２、インステイテユート・パスツールに寄託された株Ｎ
ｏ．１１９４によつて示されるミクロコツカス カセオ
リテイカスの培養から誘導される特許請求の範囲第１項
記載の酵素。 ３、硫酸アンモニウムにより微生物培養液の上澄液から
沈澱した酵素系を、塩化カルシウムの水性溶液中に溶解
して得られた溶液の超ろ過によつて形成された水性濃縮
液の凍結乾燥により作つた酵素系の水性バッファで緩衝
したゲルでろ過して特許請求の範囲第１項記載の酵素を
製造する方法であつて、酵素は、１．５ｍＭの塩化カル
シウムを含有し、ｐＨ７．５で２０ｍＭのＴＲＩＳ−Ｈ
Ｃｌバッファで緩衝され、５０００〜２００００の分子
量を有する蛋白質に対して検量されたゲル上に保有され
ず、酵素系が上記ミクロコツカス カセオリテイカスの
培養液から誘導されることを特徴とする方法。 ４、Ｌ−アスパラギン酸とＤＬ−フエニルアラニンメチ
ルエステルの縮合によるアスパルテームの製造への特許
請求の範囲第１項記載の酵素の応用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8516365A FR2589479B1 (fr) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | Nouvel enzyme, son procede d'obtention et son application a la preparation de n-(l-aspartyl-1)l-phenylalaninate de methyle |
| FR8516365 | 1985-11-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62107785A true JPS62107785A (ja) | 1987-05-19 |
Family
ID=9324505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61260570A Pending JPS62107785A (ja) | 1985-11-05 | 1986-10-31 | 新規酵素、その製造法およびｎ−（ｌ−アスパルチル−１）−ｌ−フエニルアラニンメチルエステル製造へのその応用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4916062A (ja) |
| EP (1) | EP0224412B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62107785A (ja) |
| DE (1) | DE3670308D1 (ja) |
| FR (1) | FR2589479B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW409035B (en) * | 1997-06-04 | 2000-10-21 | Gist Brocades Bv | Starch-based enzyme granulates |
| KR100329018B1 (ko) * | 1999-04-14 | 2002-03-18 | 신철수 | 알리탐 전구체의 제조방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1985
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-
1986
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- 1986-11-03 DE DE8686402453T patent/DE3670308D1/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4916062A (en) | 1990-04-10 |
| FR2589479A1 (fr) | 1987-05-07 |
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| DE3670308D1 (de) | 1990-05-17 |
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