CN104450595A - 谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，它是将来源于大肠杆菌E.coil JM109的谷氨酸脱羧酶基因导入进野生大肠杆菌NG-1中，所述的谷氨酸脱羧酶基因如SEQ ID No：1所示。本发明还公开了上述重组菌的构建方法与应用。本发明优点是：(1)酶活高，条件温和，反应时间短，仅需20h，底物DL型Glu浓度高达315g/L彻底反应完全，产物D-谷氨酸浓度达170g/L；(2)发酵起始调pH4.8后，发酵过程中不需要全程控制pH不变，也降低工艺成本；(3)细菌可重复15次利用；(4)工艺简便，绿色环保，且产品纯度99％以上。

Description

谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
D-谷氨酸是非天然型氨基酸，运用在医药及食品添加剂中。作为D-谷氨酸的制造方法，有例如生物酶拆分法，生物酶法等方法。生物酶拆分法制备D-谷氨酸，过程比较复杂，不易操作，并不适合工业化生产。栗更新等(精细石油化工，2005,6:44-47)采用生物酶拆分法制备D-谷氨酸，反应温度38℃，反应时间40h，m(酶)：m(底物)＝1:75.6，产物光学纯度达到99.3％，产率88.8％。利用酶催化法制备D-谷氨酸的报道中，因为具有L-谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌酶活相对较高，所以利用大肠杆菌制备的D-谷氨酸的产率和得率相对较高。吴晓燕等(化工进展，2005,8:889-892)转化DL-谷氨酸，15h转化DL-谷氨酸50g/L。1g菌体重复使用3次，转化DL-Glu 25g，生成D-谷氨酸和γ-氨基丁酸，使用的细菌是Escherichia coli AS1.505。使用野生大肠杆菌制备D-谷氨酸的普遍存在以下几个问题：1)酶活力低；2)反应周期长；3)底物转化量低。
随着分子生物学的发展，利用分子克隆和外源表达及基因过量表达技术可以大幅度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量。通过这种方法构建的基因工程菌株酶催化效率远远高于普通微生物。利用重组菌生产D-谷氨酸的工艺在国内报道尚少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种谷氨酸脱羧酶重组菌，该重组菌具有不需要额外添加辅酶5’-磷酸吡哆醛(PLP)，且底物DL型谷氨酸利用率高、反应时间短等优势。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌在制备D-谷氨酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种谷氨酸脱羧酶重组菌，它是将来源于大肠杆菌E.coil JM109的谷氨酸脱羧酶基因导入进野生大肠杆菌NG-1中，所述的谷氨酸脱羧酶基因如SEQ ID No：1所示。
上述谷氨酸脱羧酶重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号NF-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M 2014627，保藏日期：2014年12月4日。
上述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，它包括如下步骤：
(1)基因组DNA模板是以大肠杆菌E.coil JM109的基因组DNA作为模板，大肠杆菌属于原核微生物，一般L-谷氨酸脱羧酶来源是原核微生物，以包含HindIII和Nde I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，经限制性内切酶Hind III和Nde I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad；
引物1：5′-CGCCAAGCTTTCAGGTATGTTTAAAG-3′(下划线处为Hind III酶切位点)；
引物2：5′-CCAACGCCATATGCGATCCAATCATTT-3′(下划线处为Nde I酶切位点)；
PCR(聚合酶链式反应)的扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 5μL，10×Taq缓冲液(含Mg2+)7μL，Taq酶1μL，ddH2O 31μL；
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后45℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min；
(2)将重组质粒pET-gad转化至野生大肠杆菌NG-1感受态中，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)，37℃培养10～14h得到单克隆；
(3)抗性培养基筛选阳性克隆：挑取10个单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃、200rpm培养10h后提质粒，用限制性内切酶Hind III和Nde I酶切，根据电泳结果判断：含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的重组菌。
上述谷氨酸脱羧酶重组菌在制备D-谷氨酸中的应用。
具体的应用方法包括如下步骤：
(a)诱导表达：将重组菌NF-1接种于LB液体培养基中培养过夜(37℃、200rpm)，然后以1～10％v/v的接种量转接入发酵培养基中，30～40℃发酵培养2～3h，再加入终浓度0.5～1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或终浓度2～10g/L的乳糖诱导，并置于20～25℃下诱导表达18～20h；
(b)酶转化：将诱导表达后的发酵液，用2mol/L盐酸调pH 4.2～4.8，将DL-谷氨酸分批次加入到发酵液中，维持反应温度35～40℃，反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，继续加入下一批次DL-谷氨酸，待最后一批次反应完全后加入活性炭脱色，抽滤除去活性炭和细菌后，将上清液真空浓缩，再将浓缩后的母液调D-谷氨酸等电点3.22，即得D-谷氨酸粗品。
步骤(a)中，所述的发酵培养基包含碳源、氮源和盐离子；其中，所述的碳源为乳糖、葡萄糖或果糖，碳源量为0.5～15g/L；所述的氮源为酵母粉或蛋白胨，氮源量为20～40g/L；所述的盐离子为氯化钠、硫酸镁或磷酸二氢钾，浓度为5～10g/L；发酵培养基为自然pH值。所述的发酵培养基优选配方如下：蛋白胨40g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁0.25g/L。
步骤(b)中，每一批次DL-谷氨酸的添加浓度为10～50g/L。
步骤(b)中，每一批次的反应时间为0.5h～1h。
步骤(b)中，底物DL-谷氨酸共添加2～32批次，优选32批次。
步骤(b)中，活性炭的加入量为5wt‰，脱色温度为70～100℃，脱色时间为15～30min。
有益效果：本发明选择一株从自然界筛选得到的大肠杆菌Escherichia coli NG-1(本实验室自主保存)作为分子生物学操作的出发菌株。通过PCR技术从E.coil JM109菌株的基因组上扩增得到了L-谷氨酸脱羧酶的编码基因(gad基因)，利用野生大肠杆菌NG-1作为宿主，成功构建了能够高效过量表达L-谷氨酸脱羧酶的基因工程菌。该重组菌不需要添加辅酶5’-磷酸吡哆醛(PLP)，不需全程调控pH在4.8左右，底物DL型谷氨酸添加量达到315g/L，反应时间仅20h左右，产物D-谷氨酸浓度达170g/L，转化率接近100％，产品纯度达到99.5％以上。具有酶活高，反应时间短、底物添加量大，转化率高，原料来源广，条件温和，经济等优点。可以多批次重复利用细胞，每次反应结束，离心收集菌体，添加发酵液，加入底物DL-Glu，又可以重新进行转化反应，15次重复利用后，酶活力降低较多，不适合继续使用。1g细菌细胞可15次重复使用，可以转化DL-Glu的量达到150g。有效解决了使用野生菌制备D-谷氨酸出现的问题，有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为Escherichia coli JM109基因组的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：Escherichia coli JM109基因组DNA的提取。
用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)提取处于对数生长期的Escherichiacoli JM109的基因组DNA，并用2％(20g/L)的琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进行检测，结果见图1。
实施例2：L-谷氨酸脱羧酶基因(gad基因)的克隆和基因工程菌的构建。
2.1 PCR扩增L-谷氨酸脱羧酶基因(gad基因)。
根据Genbank上已报道的Escherichia coli JM109来源L-谷氨酸脱羧酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计下列两条引物：
引物1：5′-CGCCAAGCTTTCAGGTATGTTTAAAG-3′(下划线处为Hind III酶切位点)
引物2：5′-CCAACGCCATATGCGATCCAATCATTT-3′(下划线处为Nde I酶切位点)
以实施例1获得的Escherichia coli JM109的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。
PCR体系：基因组DNA 2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 5μL，10×exTaq缓冲液(含Mg2+)7μL，exTaq酶1μL，ddH2O 31μL；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，然后50℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；
2％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论：与预期分子量(1758bp)大小相符。因为无杂带，所以用DNA纯化试剂盒回收。
2.2限制性酶切反应，纯化及连接反应。
对实施例2.1获得的PCR产物用对应的酶进行双酶切反应。本实验中，所用的限制性内切酶是Hind III和NdeI。酶切体系为：PCR产物50μL，Hind III 2.5μL，NdeI 2.5μL，10×缓冲液10μL，ddH2O 35μL，总体积100μL。将DNA纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物。
同样的用限制性内切酶是Hind III和Nde I对pET-28a质粒进行酶切，因为pET-28a质粒的多克隆位点上Hind III和Nde I相距很近，大约65bp，所以线性化后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒纯化即可。
连接经过纯化后的PCR产物和pET-28a线性化质粒进行。连接体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的pET-28a质粒4μL，T4连接酶1μL，10×T4连接酶缓冲液1μL。在37℃过夜连接获得重组质粒pET-gad。
2.3重组质粒pET-gad的转化
氯化钙法制备野生大肠杆菌NG-1感受态细胞。
(1)取10μL重组质粒pET-gad于50μL野生大肠杆菌NG-1感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上5min。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45～60min。
(4)取200μL菌体涂布于含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基表面。37℃培养12～16h至单菌落出现。
2.4阳性克隆筛选
将单菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养12h，提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用HindIII和Nde I对重组质粒pET-gad进行单-双酶切，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
实施例3：L-谷氨酸脱羧酶的诱导表达。
配制种子液100mL，培养基为LB液体培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，pH7.0)，经121℃高压湿热灭菌15min后装入500mL广口三角瓶中。用接种环向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有蛋白胨40g/L、葡糖糖10g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁0.25g/L的发酵培养基1L分装于容量1L的广口三角瓶中，每瓶的装液量为250mL；将上述发酵培养基于121℃高压湿热灭菌15min。待培养基冷却后，按1％v/v的接种量接入种子液，将三角瓶置于37℃摇床以200rpm的转速培养，约2h后，加终浓度2g/L的乳糖诱导，置于30℃的摇床，以200rpm转速进行诱导大约18h，经检测酶活力40.5U/mL。
酶活的定义：在25℃下，1min内转化1mM DL-Glu所需的酶量。
实施例4：利用基因工程菌生产D-谷氨酸
将实施例3诱导后的基因工程菌发酵液，2mol/L盐酸调pH 4.8，底物DL-谷氨酸浓度为10g/L，反应温度37℃，摇床转速200rpm。待无气泡时继续添加底物，继续反应。连续添加32次底物(保持相同的底物添加量)后，待反应无气泡释放时，离心除去菌体，加入活性炭至上清液中，用5wt‰活性炭在80℃加热30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到D-谷氨酸粗品。整个转化反应过程仅需20h，DL-谷氨酸累积添加量高达315g/L，取样走液相，计算得D-谷氨酸浓度约为170g/L，转化率100％，纯度99.5％。
实施例5：基因工程菌的多次重复利用
将诱导完全的基因工程菌发酵液离心，收集10g菌体，溶于pH4.8的乙酸缓冲液中。以底物DL-谷氨酸浓度100g/L的量添加进行转化反应，仅需10h即反应完全。经过滤离心，重新获得菌体。菌体重复使用第二次时，反应时间也在10h左右。直至菌体重复使用15次的时候，转化反应时间为20h。重复使用15次后，转化反应超过30h，不太适合工业化生产。所以1g菌体细胞可以转化150g DL-谷氨酸。

Claims (10)

1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，它是将来源于大肠杆菌E.coil JM109的谷氨酸脱羧酶基因导入进野生大肠杆菌NG-1中，所述的谷氨酸脱羧酶基因如SEQ IDNo：1所示。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号NF-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2014627，保藏日期：2014年12月4日。
3.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)基因组DNA模板是以大肠杆菌E.coil JM109的基因组DNA作为模板，以包含HindIII和Nde I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，经限制性内切酶Hind III和Nde I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad；
引物1：5′-CGCCAAGCTTTCAGGTATGTTTAAAG-3′；
引物2：5′-CCAACGCCATATGCGATCCAATCATTT-3′；
(2)将重组质粒pET-gad转化至野生大肠杆菌NG-1感受态中，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养10～14h得到单克隆；
(3)抗性培养基筛选阳性克隆：挑取10个单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养10h后提质粒，用限制性内切酶Hind III和Nde I酶切，根据电泳结果判断：含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的重组菌。
4.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌在制备D-谷氨酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)诱导表达：将重组菌NF-1接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以1～10％v/v的接种量转接入发酵培养基中，30～40℃发酵培养2～3h至OD600达0.6～0.8后，再加入终浓度0.5～1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或终浓度2～10g/L的乳糖诱导，并置于20～25℃下诱导表达18～20h；
(b)酶转化：将诱导表达后的发酵液，用盐酸调pH 4.2～4.8，将DL-谷氨酸分批次加入到发酵液中，维持反应温度35～40℃，反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，继续加入下一批DL-谷氨酸，待最后一批底物反应完全后加入活性炭脱色，抽滤除去活性炭和细菌后，将上清液真空浓缩，再将浓缩后的母液调D-谷氨酸等电点3.22，即得D-谷氨酸粗品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，所述的发酵培养基包含碳源、氮源和盐离子；其中，所述的碳源为乳糖、葡萄糖或果糖，碳源量为0.5～15g/L；所述的氮源为酵母粉或蛋白胨，氮源量为20～40g/L；所述的盐离子为氯化钠、硫酸镁或磷酸二氢钾，浓度为5～10g/L；发酵培养基为自然pH值。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，每一批次DL-谷氨酸的添加浓度为10～100g/L。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，每一批次的反应时间为0.5～10h。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，底物DL-谷氨酸共添加2～32批次。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，活性炭的加入量为5wt‰，脱色温度为70～100℃，脱色时间为15～30min。
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