JP2014524239A

JP2014524239A - リパーゼ活性が増大した両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体及びその用途

Info

Publication number: JP2014524239A
Application number: JP2014523877A
Authority: JP
Inventors: サンチャンキム; ボンヒュンサン; キュンソクヤン; ジュンヒョンリー; キジュンリム; ミュンクンパク
Original assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2014-09-22
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: EP2742069A2; KR20150132813A; CN103687880A; JP5933001B2; KR101677959B1; KR20130018202A; US20140162331A1; WO2013022320A3; CN106632685A; WO2013022320A9; EP2742069B1; KR101887732B1; US9527886B2; WO2013022320A2; EP2742069A4; CN103687880B

Abstract

本発明は、リパーゼ活性が増大した両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、前記結合体の製造方法、前記結合体を用いた脂質の分解方法、及び前記リパーゼを用いたバイオディーゼルの生産方法に関する。
【選択図】図５

Description

本発明は、リパーゼ活性が増大した両親媒性ペプチド（amphipathic peptide）とリパーゼが連結した両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、前記結合体の製造方法、前記結合体を用いた脂質の分解方法、及び前記リパーゼを用いたバイオディーゼルの生産方法に関する。

リパーゼ（triacylglycerol acylhydrolase, EC3.1.1.3）は、トリグリセリドを脂肪酸とグリセリド又はグリセリンにの加水分解を促進する酵素であり、アミラーゼ（amylase）、プロテアーゼ（protease）と共に食物を消化する３大消化酵素の一つとして必須の役割を果たす。リパーゼは、動物、植物、微生物などの自然界に広範囲に分布している。

前記リパーゼは、生体内で脂肪代謝の重要な役割を果たすだけでなく、チーズの風味向上、野菜発酵時の遊離脂肪酸増加、肉類熟成時の香り向上及び魚類脂肪の分解にも有用である。さらに、リパーゼは、高価な純粋光学異性体の合成にも用いることができるなど、幅広い活用範囲を有する。また、リパーゼは、産業的にも広く活用されている。具体的には、酪農産業において、乳脂肪分解によるチーズの製造、バターやクリームの脂肪分解のために用いられている。洗剤産業においては、洗濯洗剤又は洗浄器洗剤の製造に用いられている。酵素は、より低い温度で洗浄できるようにするので、エネルギーを節約することができるため、洗剤製品の環境負荷を減少させることができる。油化学産業におけるリパーゼの利用範囲は、不飽和脂肪酸の生産、石鹸の製造、安価なパーム油を用いたココアバターの生産など、非常に大きい。製紙産業においては、リパーゼは松脂や樹脂の除去、廃紙のインクの除去などに活用される。製薬産業においてリパーゼは、Ｒ-及びＳの光学異性体の区別、ラセミ体混合物の分離、医薬の製造などに用いられる。化粧品産業においてリパーゼは、ワックス、日焼け止めクリーム、入浴用品などをはじめとする皮膚化粧品の製造に用いられる。また、エネルギー産業においてリパーゼは、植物性油からバイオディーゼルを生産するのに活用されている。

特に、新再生エネルギーとして評価されているバイオディーゼルは、現在国内外で化学触媒を用いた方法で生産されている。しかし、これらの産業化は多量の有機溶媒の使用、環境処理の高コスト、高温の反応条件によるエネルギーの過剰使用などの問題から未だ成功に至っていない。よって、リパーゼを触媒として用いる工程が注目されている。前記工程には、低い反応温度によるエネルギーの節約と、副産物であるグリセリンを用いた収益の追加により、生産コストを低減することができ、環境汚染問題がほとんど発生しないという利点がある。しかし、酵素の安定性が低く、コスト効率が低いという欠点がある。上記欠点を解決するために酵素を固定化する方法が開発されたが、これは酵素の特徴を改善して問題を解決しようとする方法とかけ離れた方法である。よって、酵素の活性を直接増大させて産業的利用価値を増加させる方法を開発する研究が盛んに行われている。

安価で強力な活性を有するリパーゼを開発するのではなく、例えば、ｓｐ〜従来のリパーゼの反応条件の変更や酵素の固定化などの間接的方法によりリパーゼに関する問題を解決してきた。あるいは、メタジェノミクスにより新たなリパーゼを開発する研究が行われたが、特に成果は得られなかった。また、リパーゼの活性、その基質特異性、耐熱性、熱安定性を改善するために、様々なリパーゼのＸ線結晶のデータを分析して酵素の作用部位とその周辺のアミノ酸残基を置換し、特に部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutagenesis）などのタンパク質工学を用いてリパーゼを改良する研究が多く行われている。これらの研究がリパーゼの活性を増加させたとはいえ、リパーゼの活性を部分的に増加させることしかできなかった。

韓国登録特許第１０−３１４７２１号公報韓国登録特許第１０−３３０１３６号公報韓国登録特許第１０−８３６５９６号公報

Eom, GT, et al., Applied Environ. Microbiol., 71:3468-3474, 2005 Yang KS, et al., J. Biosci. Bioeng., 107:599-604, 2009

こうした背景の下、本発明者らは、リパーゼの基質が不溶性であるため前記基質に対する接近性が低いということに着目し、従来のリパーゼに親水基と疎水基を有する両親媒性のペプチドを融合することにより、両親媒性ペプチドとリパーゼとを含む融合ポリペプチドを作成し、前記融合ポリペプチドを用いると基質接近性、結合性及び反応性が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、リパーゼより活性の大きい両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体の製造方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を用いた脂質の分解方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を用いたバイオディーゼルの生産方法を提供することを目的とする。

本発明の融合ポリペプチドは、従来のリパーゼに基質の反応性を増加させる両親媒性ペプチドが融合された形態であり、リパーゼの酵素活性を大幅に増加させるので、バイオディーゼル生産などのリパーゼが必要な分野において少量を用いても十分な脂質の転換収率が得られるだけでなく、リパーゼの活性を増加させるための別途の界面活性剤を用いなくてもよいので、リパーゼの経済的な使用に広く活用することができる

また、本発明において前述された又は他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に関連し以下の詳細な説明により明確に理解されるであろう。

両親媒性ペプチドをＳｃｈｉｆｆｅｒ−Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎｗｈｅｅｌｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎで示す図であり、１番はペプチドの１番目の残基を示し、黒丸は疎水性アミノ酸を示し、白丸は親水性アミノ酸を示す。活性が増大したリパーゼを発現するベクターの遺伝子構造を示す概略図である。本発明のペプチド−リパーゼＴｌｉＡ結合体の発現様相を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。、本発明により両親媒性ペプチドで融合されたＴｌｉＡリパーゼの脂質分解活性を、リパーゼ反応時に発色するパラニトロフェニルパルミテート（para-Nitrophenyl palmitate）を用いて比色分析法で測定した結果を示すグラフである。本発明により製造されたＴｌｉＡリパーゼの脂質分解活性をｐＨ−ＳＴＡＴで測定した結果を示すグラフである。本発明により両親媒性ペプチドで融合されたＭ３７リパーゼの脂質分解活性を、パラニトロフェニルパルミテートを用いて、比色分析法で測定した結果を示すグラフである。本発明により製造されたＭ３７リパーゼの脂質分解活性をｐＨ−ＳＴＡＴ法で測定した結果を示すグラフである。ＮＫＣ−融合Ｍ３７リパーゼの脂質粒子の位置を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。カンジダアンタークティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼＢ（ａ）、野生型Ｍ３７リパーゼ（ｂ）及びＮＫＣ−融合Ｍ３７リパーゼ（ｃ）の酵素活性を示す図であり、４０℃で１２時間の培養で所定の回数で測定した結果を示す図である。カンジダアンタークティカリパーゼＢ、野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−融合Ｍ３７リパーゼの加水分解活性を０％、３．３％、５％及び１０％のメタノール水溶液で測定した。野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いて、オリーブ油によるバイオディーゼル生産を確認した図である。バイオディーゼルはガスクロマトグラフィーで定量的に分析し薄層クロマトグラフィーを用いて定性的に分析し、図１０ａは３段階のエステル交換反応を経時的に行った結果を示す図であり、野生型Ｍ３７リパーゼは白丸、ＮＫＣ−融合Ｍ３７リパーゼは黒丸で示す。また、野生型Ｍ３７リパーゼ（左）及びＮＫＣ−Ｍ融合３７リパーゼ（右）を用いたエステル交換反応における反応混合物のＴＬＣ分析を示す。図１０ｂは野生型Ｍ融合３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いてオリーブ油の２段階のエステル交換反応を経時的に行った結果を示す図である。図１０ｃは野生型Ｍ融合３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いてオリーブ油の１段階のエステル交換反応を経時的に行った結果を示す図である。

上記目的を達成するための本発明の一実施様態によると、両親媒性ペプチド（amphipathic peptide）とリパーゼが連結された両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を提供する。本発明で使用される「両親媒性ペプチド」とは、極性アミノ酸と非極性アミノ酸とを含み、前記極性アミノ酸と前記非極性アミノ酸が部分的に互いに密集して極性部分と非極性部分を示すペプチドを意味する。前記極性アミノ酸の例としてはシステイン、グルタミン、トレオニン、チロシン、セリン及びアスパラギンが挙げられ、前記非極性アミノ酸の例としてはフェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン及びアラニンが挙げられる。本発明における前記両親媒性ペプチドは、リパーゼとその基質である脂肪成分の結合及び反応性を増加させる媒体として用いられる。両親媒性ペプチドは、アミノ酸配列において極性アミノ酸と非極性アミノ酸が互いに密集した形態であってもよい。あるいは、アミノ酸配列においては極性アミノ酸と非極性アミノ酸が互いに密集していないが、前記アミノ酸を含むペプチドが３次元構造を形成する際に前記３次元構造により極性アミノ酸と非極性アミノ酸が互いに密集する形態であってもよい。

本発明の目的上、前記両親媒性ペプチドは、リパーゼと結合してリパーゼの基質接近性又は反応性を向上させることのできるペプチドであれば制限なく用いられる。両親媒性ペプチドの例としは、ブフォリンＩＩｂ（Buforin IIb, 配列番号１）、Ｂ０（配列番号２）、パラシンＩ（Parasin I, 配列番号３）、ＮＫＣ（配列番号４）、及びＮＲＣ（配列番号５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記両親媒性ペプチドは、リパーゼと結合してリパーゼの基質接近性又は反応性を向上させることのできるペプチドであれば、その長さは特に限定されるものではない。本発明の好ましい一実施例においては、ブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ及びＮＲＣを用いた。

前述したように、本発明に有用な両親媒性ペプチドは、配列番号１〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。それだけでなく、配列番号１〜５のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的にリパーゼの活性を増進させることのできる生物学的活性を有するタンパク質であればいかなるものでもよい。また、このような類似性を有する配列であり、実質的に前記両親媒性ペプチドと同一の又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、修飾、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド変異体も本発明に含まれることは自明である。

本発明で使用される「リパーゼ（lipase）」とは、脂肪を分解する酵素を意味する。具体的には、リパーゼは中性脂肪に作用してトリグリセリドからジグリセリドとモノグリセリドを経て脂肪酸とグリセリンに分解する酵素を意味する。概してリパーゼは動物の膵液に豊富に含まれており、植物では小麦、トウゴマ、豆などの種子に含まれている。前記リパーゼは、脂肪を分解する生物学的活性を有する酵素であれば、その種類は特に限定されることなく用いられている。例えば、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来のリパーゼＴｌｉＡ（耐熱性リパーゼ）やフォトバクテリウムリポリチカム（Photobacterium lipolyticum）由来のリパーゼＭ３７を用いても良い。前記リパーゼに関する情報は、米国国立衛生研究所のジェンバンクなどの公知のデータベースから得ることができ、例えば、受託番号がＡＡＤ０９８５６のＴｌｉＡ又はＡＡＳ７８６３０のＭ３７であってもよい。前記ＴｌｉＡリパーゼは配列番号６のアミノ酸配列を含むリパーゼであるか、又は、Ｍ３７は配列番号７のアミノ酸配列を含むリパーゼであるが、これらに限定されるものではない。また、前記リパーゼは、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むリパーゼだけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を有するアミノ酸配列であり、実質的に脂質を分解する生物学的活性を有するタンパク質であればいかなるものでもよい。また、このような類似性を有する配列であり、実質的に前記リパーゼと同一の又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、修飾、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明に含まれるものと認識される。

本発明で使用される「両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体」とは、両親媒性ペプチドがリパーゼの生物学的活性を阻害しないようにリパーゼに連結された形態を意味する。前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体において、両親媒性ペプチドはリパーゼに化学的に連結されてもよく、少なくとも２種類のポリペプチドが酵素作用により連結されてもよく、遺伝子の操作により少なくとも２種類の異なるポリペプチドが１つのポリペプチドとして発現した形態で連結されてもよい。

前記両親媒性ペプチドとリパーゼは、両親媒性ペプチドとリパーゼが直接連結された形態であってもよく、リンカーにより連結された形態であってもよい。

本発明で使用される「リンカー」とは、基本的には２つの異なる融合パートナー（例えば、生物学的高分子など）を水素結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合、塩架橋、疎水性相互作用、共有結合などで連結することのできる連結体を意味する。生理学的条件又は他の標準的なペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与し得る少なくとも１つのシステインを有することが好ましい。それぞれの融合パートナーを連結する役割以外に、融合パートナー間に所定の大きさの間隔を与える役割を果たすこともでき、融合体に柔軟性又は剛直性を提供するヒンジの役割を果たすこともできる。前記リンカーは、非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーであり、ペプチド結合、ジスルフィド結合などにより直接連結されるものも含まれる。

本発明で使用される「非ペプチドリンカー」とは、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性リンカーを意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合でない任意の共有結合により互いに連結される。

本発明に用いることができる非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸又はそれらの組み合わせを挙げることができ、ポリエチレングリコール単独重合体であることが好ましい。当該分野で公知のこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明に含まれる。分子量が１〜５ｋＤａであるポリエチレングリコール単独重合体であることがより好ましく、分子量が３．４ｋＤａ程度であり、両末端に二官能性アルデヒド（bifunctional aldehyde）形態でポリペプチドＮ末端のアミノ基と結合し、両親媒性ペプチドとリパーゼを互いに連結させることができるものが最も好ましい。特に、両末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑えるのに効果的である。

また、前記両親媒性ペプチドとリパーゼの結合形態は、特にこれらに限定されるものではない。よって、リパーゼのＮ末端に両親媒性ペプチドが結合した形態であってもよく、前記リパーゼのＣ末端に両親媒性ペプチドが結合した形態であってもよく、前記リパーゼのＮ末端とＣ末端に両親媒性ペプチドがそれぞれ結合した形態であってもよい。例えば、リパーゼＴｌｉＡのＮ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号８〜１２）、リパーゼＭ３７のＮ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号１３〜１７）、リパーゼＴｌｉＡのＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号１８〜２２）、リパーゼＭ３７のＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号２３〜２７）、リパーゼＴｌｉＡのＮ末端とＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号２８〜３２）、リパーゼＭ３７のＮ末端とＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態（配列番号３３〜３７）などであってもよい。

本発明の一実施例においては、両親媒性ペプチドとしてブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣを用い、リパーゼとしてＴｌｉＡ又はＭ３７を用いた。前記両親媒性ペプチドをリパーゼのＮ末端に連結した両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を製造し、前記両親媒性ペプチド−リパーゼがリパーゼの脂質分解活性を最大１０倍まで増大させたことを見出した（図４〜７）。よって、本発明の両親媒性ペプチドを連結したリパーゼが優れた脂質分解活性を示し、脂質分解が求められる様々な分野に用いることのできる経済的で優れたリパーゼであることが観察された。また、両親媒性ペプチドをリパーゼに結合した場合、脂質粒子に対する接近性も向上した（図８）。さらに、本発明の代表的な両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体であるＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼの場合、バイオディーゼルの生産に用いられるメタノールの存在下でも野生型リパーゼのＭ３７に比べて優れた安定性及び脂質分解活性を示すことから（図９及び１０）、本発明の両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体がバイオディーゼルの生産に有用であることを示唆する。

また、本発明の他の実施様態は、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。

本発明で使用される「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチド重合体分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）で区別された生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。したがって、本発明のポリヌクレオチドは結合体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。

本発明によるポリヌクレオチドは、特にこれらに限定されるものではないが、リパーゼＴｌｉＡのＮ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号４５〜４９）、リパーゼＭ３７のＮ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５０〜５４）、リパーゼＴｌｉＡのＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５５〜５９）、リパーゼＭ３７のＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号６０〜６４）、リパーゼＴｌｉＡのＮ末端とＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号６５〜６９）、リパーゼＭ３７のＮ末端とＣ末端にブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ又はＮＲＣが融合された形態の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号７０〜７４）である。

本発明の結合体をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記結合体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現する結合体のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができ、コード領域を除く部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲で様々な改変又は修飾を行うことができる。当業者であれば、このような修飾又は改変遺伝子も本発明に含まれることを理解するであろう。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、それと同等の活性を有するタンパク質をコードするものであれば、少なくとも１つの核酸塩基が置換、欠失、挿入又はそれらの組み合わせにより変異したものであってもよく、それらも本発明に含まれる。

本発明による前記結合体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核もしくは原核細胞において、前記ポリヌクレオチドを複製及び／又は発現することのできるベクターである。宿主細胞において前記ヌクレオチドが発現するように適切なプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。さらに、発現ベクターは、少なくとも１つの選別マーカーを含んでもよい。例えば、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態が挙げられる。

前記形質転換体は宿主細胞に発現ベクターを導入して提供することができる。本発明に使用される有用な宿主細胞の例としては、大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラティフィムリウムなどのバクテリア細胞と、酵母細胞と、ピキアパストリスなどの菌類細胞と、ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞と、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞，baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胎児性腎臓細胞，human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞と、植物細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施様態では、大腸菌細胞を宿主細胞として用いた（実施例２）。

本発明で使用される「導入」とは、前記結合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に組み込む方法を意味する。前記導入は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染法、ポリブレン−媒介形質感染法、電子衝撃法、微量注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン、原形質体融合法などの当該分野で公知の様々な方法で行うことができる。また、形質感染とは、感染（infection）を手段とし、ウイルス粒子を用いて目的物を細胞内に送達することを意味する。さらに、遺伝子ボンバードメントなどによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明における導入は、形質転換と混用される。

また、本発明のさらに他の実施様態は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体の製造方法を提供する。

前記製造方法は、（ａ）前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体をコードするポリヌクレオチドを送達するベクターを含む形質転換体を培養するステップと、（ｂ）前記培養した形質転換体又はその培養液から両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を回収するステップとを含むことが好ましい。

前記結合体を回収するステップは、前記培養物から得られた培養菌体又は培養上澄液に、菌体破砕、抽出、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、タンパク質沈殿、透析などの公知の精製方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。回収された目的タンパク質の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットなどの周知の方法を用いて行うことができる。

本発明の一実施様態においては、両親媒性ペプチドとリパーゼが連結された結合体である、パラシンＩ−ＴｌｉＡリパーゼ、ブフォリンＩＩｂ−ＴｌｉＡリパーゼ、Ｂ０−ＴｌｉＡリパーゼ、パラシンＩ−Ｍ３７リパーゼ、ブフォリンＩＩｂ−Ｍ３７リパーゼ、Ｂ０−Ｍ３７リパーゼ、ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼ及びＮＲＣ−Ｍ３７リパーゼの遺伝子をそれぞれ作成し、それを含む発現ベクター（ｐＥＴ−Ｐａｒ−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｂｕｆ−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｂ０−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｐａｒ−Ｍ３７、ｐＥＴ−Ｂｕｆ−Ｍ３７、ｐＥＴ−Ｂ０−Ｍ３７、ｐＥＴ−ＮＫＣ−Ｍ３７及びｐＥＴ−ＮＲＣ−Ｍ３７）をそれぞれ得た。前記得られた各発現ベクターを大腸菌に導入してそれぞれの形質転換体を作成し、次いで前記作成したそれぞれの形質転換体を培養し、それぞれの培養物からそれぞれの融合ポリペプチドを回収し、両親媒性ペプチドとリパーゼが連結された両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を製造した（実施例１及び２，図２及び３）。

さらに、本発明のさらに他の実施様態は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を用いた脂質の分解方法を提供する。この方法は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体と脂質を反応させるステップを含む。

前記両親媒性ペプチド、リパーゼ及び両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体については前述した通りである。前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体は、両親媒性ペプチドにより基質である脂質に対して向上した接近性及び反応性を示すので（図４〜８）、脂質の分解に効率的に用いることができる。また、両親媒性ペプチドが結合されているため別途の界面活性剤を用いる必要がなく、求められるリパーゼ使用量が少ないので、経済的にも脂質の分解に有用に用いることができる。

前記脂質は、本発明のリパーゼで分解される脂質であれば、その種類は特に限定されるものではない。

本発明の一実施様態においては、前記結合体のリパーゼ活性を両親媒性ペプチドが結合されていない野生型リパーゼのリパーゼ活性と比較した。ここで、基質としてはパラニトロフェニルパルミテート及びオリーブ油を用いた。その結果、パラニトロフェニルパルミテートを基質として用いた場合、リパーゼＴｌｉＡを含む結合体は、野生型リパーゼＴｌｉＡに比べてリパーゼ活性が約１０％増加した（図４）。リパーゼＭ３７を含む結合体は、野生型リパーゼＭ３７に比べてリパーゼ活性が約１．２〜４．２倍増加した（図６）。また、オリーブ油を基質として用いた場合、リパーゼＴｌｉＡを含む結合体は、リパーゼＴｌｉＡに比べてリパーゼ活性が約３５．５〜７８倍増加した（図５）。リパーゼＭ３７を含む融合タンパク質は、リパーゼＭ３７に比べてリパーゼ活性が約２．２〜１０．２倍増加した（図７）。これらの結果は、本発明の結合体が脂質の分解に効率的に用いることができることを裏付けるものである。

さらに、本発明のさらに他の実施様態は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を用いたバイオディーゼルの生産方法を提供する。

前記バイオディーゼルの生産方法は、前記両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体と油脂及びアルコールを反応させるステップを含むことが好ましいが、これらに限定されるものではない。

また、前記バイオディーゼルの生産方法は、（ａ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換された形質転換体を得るステップと、（ｂ）前記得られた形質転換体を培養して培養物又は培養上澄液からリパーゼを回収するステップと、（ｃ）前記回収したリパーゼを用いて油脂とアルコールからバイオディーゼルを生産するステップとを含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明におけるバイオディーゼルの生産に用いるリパーゼは、これらに限定されるものではないが、自由な形態又は固定化した形態で用いることができる。また、前記リパーゼの固定化には、当業界で通常用いる様々な方法を用いることができるが、これらに限定されるものではなく、吸着法、包括法などの物理的な方法、及び共有結合法、架橋法などの化学的な方法を用いることができる。

前記油脂は、天然油脂、加工油脂及び廃油脂から選択されるものを用いることが好ましい。大豆油、菜種油、パーム油などを用いることがより好ましい。また、前記アルコールは、これらに限定されるものではないが、炭素数が２〜８のアルコールを用いることが好ましく、炭素数が２〜４のアルコールを用いることがより好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、１−プロパノール、イソ−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソ−ブタノール、テル−ブタノールなどを用いることができる。前記アルコールは、当業界で公知の様々な供給方法で供給することができる。例えば、段階的に供給することもでき、連続的に供給することもできる。

本発明の一実施様態においては、油脂としてオリーブ油又は油廃棄物を用い、アルコールとしてメタノールを用いた（実施例５）。また、高濃度のメタノール培地で不安定な一般のリパーゼとは異なり、本発明のリパーゼはＣａｌＢリパーゼに比べて３．３％、５％及び１０％でも高い活性を維持した（図９）。また、３段階のメタノール供給方法（１当量）を用いて、本発明の代表的な結合体であるＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼにおけるオリーブ油からバイオディーゼルへの生産効率を確認した結果、野生型Ｍ３７リパーゼに比べて２１時間も早く９５％の転換収率に達した（図１０ａ）。また、３段階のメタノール供給方法に比べてより経済的な２段階のメタノール供給方法を用いた場合、野生型Ｍ３７リパーゼに比べて２７時間早く最大転換収率に達した（図１０ｂ）。１段階のメタノール供給方法を用いた場合、野生型リパーゼに比べてはるかに早く最大転換収率に達した（図１０ｃ）。

また、原料ははるかに安価であるが、不純物、遊離脂肪酸、含水量などによりリパーゼの活性に影響を及ぼすことから、バイオディーゼルの生産には使用が難しいことが知られている油廃棄物を基質として用いた。その結果、油廃棄物に本発明の代表的な両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体であるＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いた場合、オリーブ油及びパーム油と同程度のバイオディーゼルが生産されたので、本発明の結合体がバイオディーゼル生産において経済的価値を有することが確認された（実施例５）。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらによって制限されるものではない。当業者にとって自明な構成要素の代替とその種々の比率は本発明の実施様態の範囲に含まれる。

実施例１：様々な両親媒性ペプチドとリパーゼが融合された融合リパーゼの開発
実施例１−１：ペプチド誘導体の作成
多くの抗菌ペプチドは、強力な抗菌活性を有すると共に、疎水基と親水基を有する両親媒性のα−ｈｅｌｉｘ構造をなしている。本発明者らは、その中でもとりわけ優れた両親媒性を示す、配列番号１のアミノ酸配列を有するブフォリンＩＩｂ（特許文献１）、前記ブフォリンＩＩｂを修飾した配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドＢ０、配列番号３のアミノ酸配列を有するパラシンＩ（特許文献２）、配列番号４のアミノ酸配列を有するＮＫＣ、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＮＲＣ（特許文献３）を作成し（表１）、これらを用いて脂質分解活性が増大した融合ポリペプチドを作成した。

前記５つの両親媒性ペプチドのαへリックス構造はＳｃｈｉｆｆｅｒ−Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎｗｈｅｅｌｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎにより視覚化することができ、これを図１に示した。図１に示したＷｈｅｅｌにおいて、連続するアミノ酸（consecutive amino acids）は１サイクル（cycle）当たり３．６アミノ酸を有するように、互いに約１００゜回転している。

実施例１−２：ペプチド−リパーゼ結合体をコードする遺伝子の作成
酵素の活性が強く、バイオディーゼル生産時の転換効率に優れるシュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来のリパーゼＴｌｉＡと、メタノール耐性の強いフォトバクテリウムリポリチカム（Photobacterium lipolyticum）由来のリパーゼＭ３７の遺伝子を含むプラスミドｐＨＯＰＥ（非特許文献１）とｐＥＭＬ３７（非特許文献２）を鋳型とし、組換えＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により前記リパーゼ遺伝子と選別したペプチド遺伝子を融合した。ＰＣＲで用いたプライマーの情報を表２に示す。

実施例１−２−１：パラシンＩとリパーゼＴｌｉＡ結合体をコードする遺伝子の作成
パラシンＩとリパーゼの融合タンパク質(paracin1/TliA)をコードする遺伝子を作成するために、まずｐＥＴ１６ｂベクター（Merck biosciences）のＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片をｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｐａｒ）プライマー対を用いて、ＰＣＲで増幅した。

また、ｐＨＯＰＥプラスミドを鋳型とし、プライマーＴｌｉＡ−ｒｅｖ（Ｐａｒ）とＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、パラシン遺伝子の一部とリパーゼ遺伝子が融合したＤＮＡ断片を合成した。

前記増幅した２つのＤＮＡ断片を基質として用い、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−パラシンＩペプチド−リパーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。

実施例１−２−２：ブフォリンＩＩｂとリパーゼＴｌｉＡ結合体をコードする遺伝子の作成
ブフォリンＩＩｂとリパーゼＴｌｉＡの融合タンパクt質(buforinIIb/TliA)をコードする遺伝子を作成するために、まずｐＥＴ１６ｂベクターのＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された断片を、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｂｕｆ）プライマー対を用いてＰＣＲで増幅した。

また、ｐＨＯＰＥプラスミドを鋳型とし、プライマーＴｌｉＡ−ｒｅｖ（Ｂｕｆ）とＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、ブフォリン遺伝子の一部とリパーゼ遺伝子が融合したＤＮＡ断片を合成した。

前記増幅した２つのＤＮＡ断片を基質として用い、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−ブフォリンＩＩｂペプチド−リパーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。

実施例１−２−３：Ｂ０とリパーゼＴｌｉＡ結合体をコードする遺伝子の作成
Ｂ０とリパーゼの融合タンパク質（BO/TliA）をコードする遺伝子を作成するために、まずｐＥＴ１６ｂベクターのＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｂ０）プライマー対を用いてＰＣＲで増幅した。

また、ｐＨＯＰＥプラスミドを鋳型とし、プライマーＴｌｉＡ−ｒｅｖ（Ｂ０）とＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、ブフォリン遺伝子の一部とリパーゼ遺伝子が融合したＤＮＡ断片を合成した。

前記増幅した２つのＤＮＡ断片を基質として用い、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−Ｂ０ペプチド−リパーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。

実施例１−２−４：リパーゼＴｌｉＡを含む対照遺伝子の作成
両親媒性ペプチドが結合していない対照群（Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−リパーゼＴｌｉＡ）ＤＮＡを増幅するために、ｐＥＴ１６ｂベクターを鋳型とし、ＤＮＡプライマーｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（ｃｏｎ）を用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグが連結された遺伝子断片を増幅した。

また、ｐＨＯＰＥプラスミドを基質とし、ＰＣＲを行い、プライマーＴｌｉＡ−ｒｅｖ（ｃｏｎ）とＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてリパーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を合成した。

前記増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−ＴｌｉＡ−ｆｏｒを用いてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−リパーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。

実施例１−２−５：ブフォリンＩＩｂとリパーゼＭ３７結合体をコードする遺伝子の作成
ブフォリンＩＩｂとＭ３７リパーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を作成した。この遺伝子を作成するために、まず、プライマーｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｂｕｆ）プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｐＥＴ１６ｂにおいてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を増幅した。それとは別に、リパーゼ遺伝子と両親媒性ペプチドの遺伝子の一部が融合されたＤＮＡ断片を合成するために、ｐＥＭＬ３７プラスミドを鋳型とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（Ｂｕｆ）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−ブフォリンＩＩｂ−リパーゼ遺伝子を増幅した。

実施例１−２−６：パラシンＩとリパーゼＭ３７結合体をコードする遺伝子の作成
パラシンＩとＭ３７リパーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を作成した。この遺伝子を作成するために、まず、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｐａｒ）プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｐＥＴ１６ｂにおいてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を増幅した。それとは別に、リパーゼ遺伝子と両親媒性ペプチドの遺伝子の一部が融合されたＤＮＡ断片を合成するために、ｐＥＭＬ３７プラスミドを鋳型とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（Ｐａｒ）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−パラシンＩ−リパーゼ遺伝子を増幅した。

実施例１−２−７：Ｂ０とリパーゼＭ３７結合体をコードする遺伝子の作成
Ｂ０とＭ３７リパーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子を作成した。この遺伝子を作成するために、まず、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（Ｂ０）プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｐＥＴ１６ｂにおいてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を増幅した。それとは別に、リパーゼ遺伝子と両親媒性ペプチドの遺伝子の一部が融合したＤＮＡ断片を合成するために、ｐＥＭＬ３７プラスミドを鋳型とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（Ｂ０）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−Ｂ０−リパーゼ遺伝子を増幅した。

実施例１−２−８：ペプチドＮＫＣとリパーゼＭ３７結合体をコードする遺伝子の作成
ＮＫＣとＭ３７リパーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を作成した。この遺伝子を作成するために、まず、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（ＮＫＣ）プライマー対を用いてｐＥＴ１６ｂにおいてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を増幅した。それとは別に、リパーゼ遺伝子と両親媒性ペプチドの遺伝子の一部が融合されたＤＮＡ断片を合成するために、ｐＥＭＬ３７プラスミドを鋳型とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（ＮＫＣ）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−ＮＫＣ−リパーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。

実施例１−２−９：ＮＲＣとリパーゼＭ３７結合体をコードする遺伝子の作成
ＮＲＣとＭ３７リパーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を作成した。この遺伝子を作成するために、まず、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（ＮＲＣ）プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｐＥＴ１６ｂにおいてＴ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグに連結された遺伝子断片を増幅した。それとは別に、リパーゼ遺伝子と両親媒性ペプチドの遺伝子の一部が融合されたＤＮＡ断片を合成するために、ｐＥＭＬ３７プラスミドを鋳型とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（ＮＲＣ）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−ＮＲＣ−リパーゼ遺伝子を増幅した。

実施例１−２−１０：リパーゼＭ３７を含む対照遺伝子の作成
両親媒性ペプチドが結合していない対照ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−リパーゼＭ３７）を増幅した。Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ遺伝子断片を合成するために、ｐＥＴ１６ｂベクターを鋳型とし、ｐＥＴ１６−ＬとｐＥＴ−Ｒ（ＮＲＣ）プライマー対を用いてＰＣＲを行った。それとは別に、ｐＥＭＬ３７プラスミドを基質とし、プライマーＭ３７−ｒｅｖ（ｃｏｎ）とＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてリパーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲを行った。その後、増幅した２つのＤＮＡ断片を基質とし、プライマーｐＥＴ１６−ＬとＮｄｅ−Ｍ３７−ｆｏｒを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−Ｍ３７リパーゼ遺伝子を増幅した。

実施例１−３：両親媒性ペプチドとリパーゼ融合タンパク質遺伝子とを含む発現ベクターの作成
実施例１−２で作成された各Ｔ７プロモーター−リボソーム結合部位−Ｈｉｓタグ−ペプチド−リパーゼ結合ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｄｅＩを用いて切断し、ＢｇｌＩＩとＮｄｅＩを用いて切断したｐＥＴ１６ｂベクターにクローニングした（図２）。図２は活性が増大したリパーゼを発現するためのベクターの遺伝子構造図である。ベクターにおいて、リパーゼ遺伝子のＮ末端の条件付きプロモーター（conditional promoter）の下流に両親媒性ペプチド遺伝子を融合した。発現したタンパク質の純粋分離のためにペプチドの前方にヒスチジンタグを融合し、発現及び純粋分離後にヒスチジンタグを除去するためにヒスチジンタグとペプチド遺伝子の間にタンパク質分解酵素ＦａｃｔｏｒＸａの認識部位を挿入した。発現後にヒスチジンタグ−ペプチド−リパーゼ結合体をニッケルカラム（Ni-column）で分離し、目的とする両親媒性ペプチド−リパーゼ構造を分離するために酵素ＦａｃｔｏｒＸａで処理した。前述したように、これらの遺伝子を条件付きプロモーターの下流に配置し、所望の条件で両親媒性ペプチドと融合されて活性が増大したリパーゼが発現するようにした。

前記クローニングされたプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（invitrogen社製）に導入して形質転換させ、抗生剤アンピシリンを含むＬＢ平板培地で選別した。正確なプラスミド作成を確認するために、平板培地上で成長するコロニーからプラスミドを分離し、その後制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｄｅＩを用いて分解した。ＤＮＡ分解物はアガロースゲルを用いてＤＮＡ断片の大きさを確認し、ＤＮＡ塩基配列分析により正確に検証した。

よって、それぞれのＴｌｉＡリパーゼ（対照群）、パラシンＩ−ＴｌｉＡリパーゼ、ブフォリンＩＩｂ−ＴｌｉＡリパーゼ、Ｂ０−ＴｌｉＡリパーゼ、Ｍ３７リパーゼ（対照群）、パラシンＩ−Ｍ３７リパーゼ、ブフォリンＩＩｂ−Ｍ３７リパーゼ、Ｂ０−Ｍ３７リパーゼ、ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼ、ＮＲＣ−Ｍ３７リパーゼを発現するために、完成したプラスミドをそれぞれｐＥＴ−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｐａｒ−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｂｕｆ−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｂ０−ＴｌｉＡ、ｐＥＴ−Ｍ３７、ｐＥＴ−Ｐａｒ−Ｍ３７、ｐＥＴ−Ｂｕｆ−Ｍ３７、ｐＥＴ−Ｂ０−Ｍ３７、ｐＥＴ−ＮＫＣ−Ｍ３７及びｐＥＴ−ＮＲＣ−Ｍ３７と命名した。

実施例２：ペプチド−リパーゼ結合体の分離及び酵素活性の分析
実施例２−１：ペプチド−リパーゼ融合タンパク質の発現
ペプチド−リパーゼ融合タンパク質を発現した。そのために、まず、製造したプラスミドを電気穿孔法（electroporation）によりＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（Merck biosciences）に導入し、塗抹した。単一コロニーを選別し、ＬＢ液体培地に接種した。３７℃で６００ｎｍの波長にて吸光度が０．４になるまで成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド）を添加してペプチドが結合されたリパーゼの発現を誘導した。４時間後に大腸菌を回収した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでペプチド−リパーゼ結合体が発現するか否かを確認した。次に、ブラッドフォード分析法を用いてタンパク質の濃度を測定した。

その結果、ペプチド−リパーゼ融合タンパク質は大腸菌において封入体（inclusion body）の形態で発現することが観察された（図３）。図３は本発明で発現したペプチド−リパーゼＴｌｉＡ融合タンパク質の発現様相を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であり、レーンＭはタンパク質サイズマーカー（size marker）を示し、レーン１〜４はそれぞれＩＰＴＧで誘導されていない細胞の破砕液、ＩＰＴＧで誘導された細胞の破砕液、ＩＰＴＧで誘導された細胞の溶解上清液部分、及びＩＰＴＧで誘導された細胞の封入体部分を示す図である。ここで、ＰａｒはパラシンＩを示すものであり、ＢｕｆはブフォリンＩＩｂを示すものである。

実施例２−２：ペプチド−リパーゼ融合タンパク質の分離
組換えタンパク質を分離するために、培養した大腸菌を溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４，３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に懸濁して超音波で粉砕した（５２０秒，０．５サイクル，５０％ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）。超音波で粉砕した破砕液を４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、溶解上清液（soluble supernatant）と封入体（inclusion body）を含む非溶解部分に分けた。非溶解部分に存在するペプチド−リパーゼ融合タンパク質を洗浄緩衝液（１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４，１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，８Ｍのｕｒｅａ，ｐＨ６．３）に溶解し、遠心分離して細胞残渣を除去した。遠心分離後、ＮＴＡ（Ni²⁺nitriloacetic acid）アガロースカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて上清液中のペプチド−リパーゼ融合タンパク質を分離し、膜透析（dialysis）により余分な要素を除去した。融合タンパク質の分離に用いられたＨｉｓタグを除去するためにＦａｃｔｏｒＸａ酵素（New England Biolab, USA）を用い、純粋分離したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認してＮ末端のアミノ酸塩基配列を分析して確認した。

実施例２−３：ペプチド−リパーゼ融合タンパク質のリパーゼ活性の測定
実施例２−３−１：パラニトロフェニルパルミテートを用いたリパーゼ活性の測定
リパーゼの活性は、まず、パラニトロフェニルパルミテート（p-nitrophenyl palmitate）の発色反応を用いて測定した。１０ｍＭの濃度でアセトニトリル（acetonitrile）に溶解したパラニトロフェニルパルミテート溶液、エタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）を１：４：９５の割合で混合して用いた。パラニトロフェニルパルミテートを含む溶液０．８ｍｌに０．２ｍｌの融合タンパク質溶液を混合し、その後４５℃で１０分間反応させて４０５ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図４及び６にそれぞれ示した。図４は、リパーゼ反応により発色するパラニトロフェニルパルミテートを用いて、本発明の両親媒性ペプチドを融合したＴｌｉＡリパーゼの脂質分解活性を測定した結果を示すグラフである。図６は、リパーゼ反応により発色するパラニトロフェニルパルミテートを用いて、本発明の両親媒性ペプチドを融合したＭ３７リパーゼの脂質分解活性を測定した結果を示すグラフである。

その結果、パラシンＩが融合されたパラシン−ＴｌｉＡ融合リパーゼ（Ｐａｒ−ｌｉｐ）は、常温でも反応最適温度である４５℃の場合と類似した活性を示すことが確認された（図４）。パラシンＩとＢ０がそれぞれ融合されたＴｌｉＡの場合、対照群に比べて、４５℃で活性が約１０％増加したことが確認された。また、図６に示すように、Ｂ０が融合されたＭ３７リパーゼ（Ｂ０−Ｍ３７）、ブフォリンＩＩｂが融合されたＭ３７リパーゼ（Ｂｕｆ−Ｍ３７）、ＮＫＣが融合されたＭ３７リパーゼ（ＮＫＣ−Ｍ３７）、ＮＲＣが融合されたＭ３７リパーゼ（ＮＲＣ−Ｍ３７）、及びパラシンＩが融合されたＭ３７リパーゼ（Ｐａｒ−Ｍ３７）のそれぞれは、対照群に比べて４．２倍、２．７倍、６．３倍、１．３倍、及び１．２倍増加した。これらの結果は、両親媒性ペプチドを融合した本発明のリパーゼが両親媒性ペプチドを融合していないリパーゼに比べて優れたリパーゼ活性を示すことを裏付けるものである。

実施例２−３−２：オリーブ油の加水分解を用いたリパーゼ活性の測定
リパーゼの活性をより定量的に測定するために、リパーゼによるオリーブ油の加水分解後に遊離する脂肪酸の量を測定した。オリーブ油のエマルジョンは、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５％（ｗ／ｖ）アラビアゴム（gum arabic）溶液４５０ｍｌに５ｍｌのオリーブ油を添加してワーリングブレンダー（Waring blender）にて最高速度で２分間乳濁させて準備した。１０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いて前記基質エマルジョンのｐＨが８．０となるように調整し、これにリパーゼを添加した。遊離する脂肪酸の量をｐＨ滴定器（718 Stat Titrino, Metrohm）にて５０℃で５分間測定した。その結果をそれぞれ図５及び７に示す。図５は本発明により製造されたＴｌｉＡリパーゼの脂質分解活性の増大をｐＨ−ＳＴＡＴで測定した結果を示すグラフである。図７は本発明により製造されたＭ３７リパーゼの脂質分解活性の増大をｐＨ−ＳＴＡＴで測定した結果を示すグラフである。

その結果、図５に示すように、Ｂ０−ＴｌｉＡ、Ｐａｒ−ＴｌｉＡ、Ｂｕｆ−ＴｌｉＡ融合タンパク質の場合、ＴｌｉＡに比べてその活性がそれぞれ７８±１１．３倍、６８．５±２．１倍、３５．５±１９．１倍増加することが分かった。また、図７に示すように、Ｂ０−Ｍ３７、Ｂｕｆ−Ｍ３７、ＮＫＣ−Ｍ３７、ＮＲＣ−Ｍ３７、Ｐａｒ−Ｍ３７融合タンパク質の場合、Ｍ３７に比べてその活性がそれぞれ２．８倍、４．２倍、１０．２倍、４．１倍、２．２倍増加することが分かった。

これらの結果は、両親媒性ペプチドを融合した本発明のリパーゼが両親媒性ペプチドを融合していないリパーゼに比べて優れた脂質分解活性を示すことを裏付けるものである。

実施例３：ＮＫＣが融合されたＭ３７リパーゼ（ＮＫＣ−Ｍ３７）の基質である質（lipid substrates）に対する接近性増大の確認
Ｍ３７リパーゼの活性部位はリッドヘリックス（Lid helix, α3）で遮られている。Ｍ３７リパーゼのリッド部位の周辺に位置するほとんどの疎水性残基（Ile97, Trp100, Leu101, and Phe102）は隠れており、活性部位の周辺に位置するが、これらの事実は、基質がリパーゼに結合すると前記疎水性残基が露出して広い疎水性表面（wide hydrophobic surface）を形成することを示唆するものである。よって、疎水性基質がＭ３７リパーゼの活性部位に接近するためには、ある程度の構造変化（conformational change）が必要である。本発明においては、両親媒性ペプチドであるＮＫＣをＭ３７リパーゼに接合させるので、疎水性基質が前記リパーゼの活性部位に接近しやすい状態となり、前記酵素と基質間の親和性も増大する。これらを立証するために、野生型Ｍ３７リパーゼとＮＫＣが融合された各Ｍ３７リパーゼ（ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼ）にＧＦＰを融合したＧＦＰハイブリッド（GFP hybrid）を作成し、前記リパーゼの脂質粒子内の位置を確認した（図８）。蛍光顕微鏡で観察した結果、ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼの場合、野生型Ｍ３７リパーゼに比べて脂質粒子内に位置する割合がはるかに高い。これらの結果は、ＮＫＣなどの両親媒性ペプチドがリパーゼの機能的な形態を形成する上で必須のものであることを示すものである。

実施例４：メタノールに対するＭ３７リパーゼの安定性に及ぼす両親媒性ペプチドの効果の確認
メタノールは、バイオディーゼル生産過程において酵素基質であるだけでなく、溶媒としても機能する。しかし、一般的なリパーゼは高濃度のメタノール培地において不安定であるので、バイオディーゼルの生産量は相対的に制限される。トリグリセリド１当量（1 molar equivalent）をそれに該当するメチルエステルに完全に転化するためには、少なくとも３当量のメタノールを必要とする。しかし、一般的なリパーゼは、オイルに対して１当量以上のメタノール（３．３％ｖ／ｖ）を含む培地においては不活性化される。よって、バイオディーゼル生産過程は、リパーゼの不活性化を防止するために、メタノールを複数段階で追加して行う。

Ｍ３７リパーゼは高濃度のメタノールにおいても高い安定性を示すことが報告されている。１段階のメタノール供給方法（1-stepwise methanol feeding method, 3 molar equivalents）を用いた場合、Ｍ３７リパーゼは７０％の転換収率であったのに対して、カンジダアンタークティカリパーゼＢであるＣａｌＢリパーゼは極少量のオイルのみバイオディーゼルに転換させた。

このように、高濃度のメタノールにおいても高い安定性を示すＭ３７リパーゼに両親媒性ペプチドを結合した場合にその収率が向上するか否かを確認するために、下記の通り実験を行った。

両親媒性ペプチドの１つであるＮＫＣペプチドを融合したＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いて、高濃度のメタノールにおいても安定性を示すか否かを確認した。前記安定性の確認は、メタノール処理後に残っている活性を測定することにより行った。ＣａｌＢリパーゼ、野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼの安定性を、４℃及び４０℃で０％、３．３％、５％及び１０％メタノール溶液にて１２時間反応させた後に測定した。

その結果、野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼは、４℃の温度で３．３％、５％及び１０％メタノール溶液においてもその活性を維持した。エステル交換反応における実際の温度である４０℃でメタノールに対するリパーゼの安定性を測定する際、ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼは野生型Ｍ３７リパーゼに比べて１０％のメタノール溶液で安定性が若干減少したが、ＣａｌＢリパーゼは早く不活性化された（図９）。これらの結果は、本発明のＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼが野生型Ｍ３７リパーゼのようにメタノールにおいて非常に安定していることを示すものであり、本発明の両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体がバイオディーゼルの生産に効率的に用いられることを示唆するものである。

実施例５：ＮＫＣが融合されたＭ３７リパーゼを用いたバイオディーゼル生産
図７に示すように、ＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼは野生型Ｍ３７リパーゼに比べて１０倍高い触媒活性（catalytic activity）を示し、この事実は、ＮＫＣなどの両親媒性ペプチドがリパーゼと基質である脂質の接近性を向上させることにより、Ｍ３７リパーゼの触媒活性増大に非常に効果的であることを示唆するものである。そこで、触媒活性が増大したＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いて、バイオディーゼル生産過程及びオリーブ油のエステル交換過程を行った。

バイオディーゼル生産のために、反応フラスコにてオイル／メタノールを化学量論的モル比で反応させ、攪拌して反応温度を上昇させた。通常、リパーゼは、オイルに対して１当量以上のメタノールを含む混合物においては不活性化される。よって、前述したように、バイオディーゼル過程はメタノールを数回追加して反応させることにより行った。ただし、実施例４に示す結果のように、野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼはメタノール３当量の存在下でも安定していた。

まず、３段階のメタノール供給方法（１当量）を用いてバイオディーゼル生産を確認した。生産されたバイオディーゼルの量は、ガスクロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィー方法を用いて分析した（図１０ａ）。

薄層クロマトグラフィーで分析した結果、オリーブ油のほとんどはバイオディーゼルに転換されていた。図１０は野生型Ｍ３７リパーゼ及びＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼにおいて９５％転換されるまでの時間を示す。ガスクロマトグラフィー分析の結果、野生型Ｍ３７リパーゼを用いたバイオディーゼル生産においては、３６時間で９５％の転換収率を示した。しかし、本発明のＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼは、わずか１５時間で９５％の転換収率を示した（図１０ａ）。これらの結果は、本発明の両親媒性ペプチドを融合したリパーゼがバイオディーゼルの経済的かつ効果的な生産に用いられることを示唆するものである。

前述したように、酵素的バイオディーゼル生産過程（Enzymatic biodiesel production process）は、メタノールに対するリパーゼの低い許容度（low tolerance）から、主に３段階のメタノール供給方法が用いられる。しかし、経済的なバイオディーゼル生産のためには２段階のメタノール供給方法のほうが有利なので、２段階のメタノール供給方法を用いてバイオディーゼル生産を確認した。２段階のメタノール（２当量）供給方法を用いた場合、本発明の向上した触媒活性を示すＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼは２１時間で９０％以上の高い転換収率を示したのに対して、野生型Ｍ３７リパーゼは４８時間で同じ収率に達した（図１０ｂ）。これらの結果は、本発明の両親媒性ペプチドが融合されたリパーゼが野生型リパーゼに比べて非常に効果的な触媒剤（catalyst）であることを示すものである。また、より経済的な１段階のメタノール供給方法を用いてバイオディーゼル生産を確認した結果、野生型Ｍ３７リパーゼより本発明の代表的な結合体であるＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼのほうが最大転換収率にはるかに早く達した（図１０ｃ）。

また、バイオディーゼルにかかる経費は概ね原料（feedstock）価格に依存する。原料価格はバイオディーゼル生産費の７０％以上を占めることが知られている。生産費が高くなると、商用性は非常に低くなる。バイオディーゼルが石油ディーゼルに比べて価格競争力を有するように、廃調理油、牛脂（beef tallow）、豚ラード（pork lard）、黄色油脂（yellow grease）などの安価な原料を用いる研究が進められている。しかし、油廃棄物などを用いる場合、油廃棄物内に含まれる不純物、遊離脂肪酸及び含水量の影響でバイオディーゼル生産量が急激に減少する。Ｍ３７リパーゼは油廃棄物内に存在する遊離脂肪酸及び含水量に影響されない新たなリパーゼとして報告されているので、本発明は両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体もこのような効果を有するか確認した。その結果、油廃棄物を基質としてＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼを用いた場合、オリーブ油及びパーム油と同程度のバイオディーゼルが生産された。これらの結果は、本発明のＮＫＣ−Ｍ３７リパーゼがバイオディーゼル生産において多大な効果を有するリパーゼとして用いられることを示唆するものである。

本発明は、前述の好ましく代案的実施様態を参照して示し説明されているが、本明細書に記述された本発明の実施様態についての様々な変更が、添付の特許範囲に定義されているような本発明の精神及び範囲を逸脱するものでなく、本発明を実施するにあたって用いられるものとして、当業者らは理解するであろう。以下の特許請求の範囲は本発明を定義し、またその請求項の範囲内での方法及び装置並びにその均等物が含まれ得るものである。本発明のこのような説明は、本明細書に記述された構成要素の全ての新規で非自明的な結合を含むものと理解されなければならないし、また、請求項はその構成要素の新規で自明な組合せによって本出願又は、後続の出願において示すことができる。

Claims

両親媒性ペプチド（amphipathic peptide）とリパーゼが連結した両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体。
前記両親媒性ペプチドが、ブフォリンＩＩｂ、Ｂ０、パラシンＩ、ＮＫＣ及びＮＲＣからなる群から選択される請求項１に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記両親媒性ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むブフォリンＩＩｂ、配列番号２のアミノ酸配列を含むＢ０、配列番号３のアミノ酸配列を含むパラシンＩ、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＫＣ、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＮＲＣからなる群から選択される請求項２に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記リパーゼが、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来のリパーゼＴｌｉＡ（thermostable lipase）、又はフォトバクテリウムリポリチカム（Photobacterium lipolyticum）由来のリパーゼＭ３７である請求項１に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記ＴｌｉＡが配列番号６のアミノ酸配列を有するリパーゼであり、Ｍ３７は配列番号７のアミノ酸配列を有するリパーゼである請求項４に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記両親媒性ペプチドがリパーゼのＮ末端又はＣ末端に位置するか、２つの両親媒性ペプチドがリパーゼのＮ末端及びＣ末端の両方に位置する請求項１に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記両親媒性ペプチドとリパーゼがリンカーにより連結した請求項１に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記リンカーが非ペプチド性リンカー又はペプチド性リンカーである請求項７に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記非ペプチド性リンカーが、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項８に記載の両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体。
前記結合体が、配列番号８〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む両親媒性ペプチド-リパーゼ請求項１に記載の結合体。
請求項１〜１０のいずれかの両親媒性ペプチド-リパーゼ結合体をコードするポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
請求項１１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項１３の発現ベクターが導入された形質転換体。
（ａ）請求項１４の形質転換体を培養するステップと、
（ｂ）前記培養した形質転換体又はその培養液から両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体を回収するステップとを含む、両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体の製造方法。
前記結合体は、配列番号８〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の製造方法。
請求項１〜１０のいずれかの両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体と脂質を反応させるステップを含む、基質である脂質の分解方法。
請求項１〜１０のいずれかの両親媒性ペプチド−リパーゼ結合体と油脂及びアルコールを反応させるステップを含む、バイオディーゼルの生産方法。