CN113151329A - 中性蛋白酶突变体及其构造方法和应用 - Google Patents

中性蛋白酶突变体及其构造方法和应用 Download PDF

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韩楠玉
胡懋
魏婷柳
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    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Abstract

一种复合位点突变体NPI‑D632G/A633V；其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种热稳定性提高的中性蛋白酶NPI的复合位点突变体NPI‑D632G/A633V‑LANT326‑329VSSS；其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

Description

中性蛋白酶突变体及其构造方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程、酶工程的蛋白分子改造领域，特别涉及定向改造热稳定性提高的中性蛋白酶突变体及其构造方法。
背景技术
中性蛋白酶是指在对蛋白质在中性条件下具有较好水解效果的蛋白酶，因其无工业污染、催化反应速度快和催化反应条件适应性宽等特点，使其在洗涤剂、毛皮软化、化妆品、丝纺、食品、制药等行业都具有广泛应用。
温度对酶促反应的作用效率具有关键作用，热稳定性的优良决定了酶对底物的催化效果的可持续性，但大多中性蛋白酶的耐热性较差，生产与使用条件复杂，这极大的限制了其的工业化应用，所以通过一定的手段策略提高中性蛋白酶的热稳定性，是目前中性蛋白酶产业化应用中亟待解决的问题。定点突变是一种有效的蛋白分子改造，被广泛应用于酶性质的改良和酶活性的提高等方面。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供定向改造热稳定性提高的中性蛋白酶突变体及其构造方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种复合位点突变体NPI-D632G/A633V；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种热稳定性提高的中性蛋白酶NPI的复合位点突变体NPI-D632G/A633V-LANT326-329VSSS；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，他们的最适pH为7，最适温度为55℃。
所述突变体的突变方法，其步骤如下：
(1)中性蛋白酶基因NPI的序列优化及克隆：利用DNAwork对NPI进行毕赤酵母表达的序列优化后直接合成目的序列，以此序列为模板进行PCR扩增，将产物连接到pPIC9K载体上，得到重组载体pPIC9K-NPI；
(2)定点突变：以载体pPIC9K-NPI为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增、消化；将消化产物以热激法转入DMT感受态细胞，经菌液PCR验证后送测序，确定正确的突变子提取质粒后经SalI限制性内切酶，以电转法转入毕赤酵母GS115进行表达。
进一步的，所述突变方法的突变引物为：
NPI-D632G/A633V-F
5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'
NPI-D632G/A633V-R
5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-F
5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-R
5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'
进一步的，所述突变体在中性蛋白酶NPI热稳定性提高方面的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本实验利用毕赤酵母对来源于米曲霉的中性蛋白酶NPI进行异源表达，为毕赤酵母可工业化生产中性蛋白酶提供了理论依据。其上清粗酶液在中性条件下对酪蛋白具有良好水解效果，证明其在皮革、饲料、食品方面具有较好的应用潜力。本实验通过对NPI基因序列的normalized b-factor计算和结构生物学分析，发现A链中326-329,630-634的B-factor超过std的两倍，631-634的B-factor超过std的三倍。经双突变D632G/A633V,60℃耐受30min,突变体D632G/A633V较NPI野生型相对剩余酶活高20％；60℃耐受30min后，突变体D632G/A633V-LANT326-329VSSS的相对剩余酶活较NPI野生型提高32％，其余突变体均无明显变化。综上知，针对中性蛋白酶NPI进行的热稳定性的改造有较明显的效果。
附图说明
图1中性蛋白酶NPI多序列比对图
图2中性蛋白酶NPI晶体结构模拟图
图3中性蛋白酶NPI成熟蛋白(ChainA)晶体结构
图4中性蛋白酶NPI及其突变体最适pH
图5中性蛋白酶NPI及其突变体pH稳定性
图6中性蛋白酶NPI及其突变体最适温度
图7中性蛋白酶NPI及其突变体热稳定性
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1-7所示，
本发明通过normalized b-factor计算和结构生物学分析对其进行定点突变提高了NPI的温度稳定性，为中性蛋白酶NPI热稳定性的改造提供了新的策略，奠定了其在工业化应用上的基础。
本发明提供一种热稳定性提高的中性蛋白酶NPI的双位点突变体NPI-D632G/A633V；
本发明提供一种热稳定性提高的中性蛋白酶NPI的复合位点突变体NPI-D632G/A633V-LANT326-329VSSS；
本发明提供一个经密码子优化的热稳定性提高的NPI双位点突变体编码基因NPI-D632G/A633V，对应的核苷中序列如图SEQ ID NO.2所示。
本发明提供一个经密码子优化的热稳定性提高的NPI复合位点突变体编码基因NPI-D632G/A633V-LANT326-329VSSS；对应的核苷中序列如图SEQ ID NO.3所示。
所述的热稳定性提高的中性蛋白酶NPI突变体的最适pH为7，最适温度为55℃。
本发明通过对NPI及其突变体酶学性质的测定，比较分析了野生型和本发明所述突变体的热稳定性的差异，突变后的蛋白酶热稳定性较野生型有了明显提高；
本发明所述热稳定性提高的中性蛋白酶NPI的突变体的突变方法，其步骤如下：
(1)中性蛋白酶基因NPI的序列优化及克隆：利用DNAwork对NPI进行毕赤酵母表达的序列优化后直接合成目的序列，以此序列为模板进行PCR扩增，将产物连接到pPIC9K载体上，得到重组载体pPIC9K-NPI。
(2)定点突变：以载体pPIC9K-NPI为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增、消化。将消化产物以热激法转入DMT感受态细胞，经菌液PCR验证后送测序，确定正确的突变子提取质粒后经SalI限制性内切酶，以电转法转入毕赤酵母GS115进行表达。
所述的提高中性蛋白酶NPI的定点突变的突变方法，其特征在于，突变引物为：
NPI-D632G/A633V-F
5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'
NPI-D632G/A633V-R
5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-F
5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-R
5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'
试验例：
1、菌株与载体
大肠杆菌DH5α感受态细胞(全式金生物公司)、大肠杆菌DMT感受态细胞(全式金生物公司)、pPIC9K表达质粒(本实验室提供)
2、培养基
固体培养基
YEPD固体培养基：酵母粉(1％)，蛋白胨(2％)，葡萄糖(2％),琼脂(2.5％)；
YEPD-Sorbitol固体培养基：酵母粉(1％)，蛋白胨(2％)，山梨醇(1mol/L),琼脂(2.5％)；
YEPD+G418固体培养基：酵母粉(1％)，蛋白胨(2％)，葡萄糖(2％),琼脂(2.5％)，G418(0.8g/L)；
液体培养基；
FA培养基：酵母粉(1％)，蛋白胨(2％)，甘油(2％)，磷中储备液，YNB溶液均为10％，生物素(0.04g/L)
FB培养基：酵母粉(1％)，蛋白胨(2％)，甲醇(0.5％)，磷中储备液，YNB溶液均为10％，生物素(0.04g/L)
实施例1中性蛋白酶突变体NPI-D632G/A633V、NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS的构建
将NPI基因序列利用DNAwork在线软件进行毕赤酵母表达的序列优化后直接合成，以限制性酶切位点EcorI、NotI设计嵌套引物进行带接头的目的基因的扩增，经胶回收纯化后与相应限制性内切酶酶切后的pPIC9K载体进行连接，获得重组载体pPIC9K-NPI。将重组载体pPIC9K-NPI转入DH5α感受态细胞，提质粒。根据Fast Mutagenesis System试剂盒说明书，以重组载体pPIC9K-NPI为模板，重叠突变引物进行PCR。加1ulDMT酶消化1h,将产物利用热激法转入DMT感受态细胞，涂板。次日，挑取单菌落进行阳性验证，提取突变体的质粒，利用电转法转入GS115毕赤酵母。
嵌套引物：
pPIC9K-NPI-F:5'-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGCATCCAACTCATCA-3'
pPIC9K-NPI-R:5'-ATTCGCGGCCGCACAAACACCAGATGGAACCTT-3'
重叠突变引物:
NPI-D632G/A633V-F
5'-CCATCTGGTGTTTGTGCGGCCGCGAAT-3'
NPI-D632G/A633V-R
5'-AACACCAGATGGAACCTTGTCAGAAC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-F
5'-TACCCATACTCAGTTTCTTCTTCTCCCCCAGAAAG-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-R
5'-AGAAGAAGAAACTGAGTATGGGTATTGAAACTTC-3'
目的基因扩增体系：双蒸水:38.75ul，Buffer:5ul,dNTPMix:2.5ul,上、下游嵌套引物各1.25ul,模板:2.5ul,rTaq:0.625ul。
目的基因PCR扩增条件：
94℃:5min,94℃:30s,62℃:30s,72℃:1min,72℃:10min,4℃:30min pPIC9K载体酶切体系及条件：EcorI:2ul,NotI:2ul,pPIC9K质粒：20ul,10×BufferH:6ul，BSA:6ul,双蒸水：24ul。30℃酶切3.5h,胶回收后-20℃保存备用。
NPI与pPIC9K连接体系及条件：目的片段NPI:2ul,pPIC9K酶切后质粒：2ul，重组酶1ul,CE Buffer:2ul,双蒸水：3ul。37℃温育30min，热激转入DH5α感受态细胞，阳性验证后提质粒-20℃保存备用。
突变体扩增体系：
增体系：2×Transstart FastPfu Fly PCR SuperMix：25ul，双蒸水：22ul,pPIC9K-NPI质粒：1ul，重叠突变上下游引物各1ul。
突变体扩增PCR程序：
94℃:5min,94℃:30s,62℃:20s,72℃:6min,72℃:10min。
扩增后，加入1ulDMT酶，混匀，37℃孵育1h消化,热激转入DMT感受态细胞，涂板，阳性验证后送测序。将测序后突变正确的菌样提质粒，以salI限制性内切酶酶切，酶切体系：质粒：100ul,salI内切酶：6ul，BufferH:10ul。37℃水浴3.5h,加40ul醋中钠，300ul无水乙醇过夜冷冻，电转入酵母。
实施例2中性蛋白酶的诱导表达
突变质粒转入GS115酵母后,涂于加山梨醇的YEPD平板，两日后，加2mlYEPD液体培养基后混匀刮取下菌体，梯度稀释，取10-3,10-4稀释菌液涂于加G418抗生素的YEPD固体培养基。单菌落长出后，接入YEPD液体培养基过夜，次日转入FA液体培养基富集菌体，二日后转入0.5％(v/v)的FB培养基诱导表达，甲醇每24h补充一次，30℃恒温培养120h。
实例3中性蛋白酶NPI及其突变体pH、温度相关性质
参照国标法测定中性蛋白酶NPI及其突变体pH、温度相关性质。
1、中性蛋白酶NPI及其突变体最适pH及pH稳定性；
如图4和图5中性蛋白酶NPI及其突变体的最适均pH为7.0，pH稳定性突变前后无明显变化。
2、中性蛋白酶NPI及其突变体最适温度及热稳定性；
由图6和图7知：野生型与突变体的最适温度均为55℃，野生型经双位点D632G/A633V突变后，60℃耐受30min,突变体D632G/A633V较NPI野生型相对剩余酶活高20％；经D632G/A633V-LNAT326-329VSSS组合突变后，60℃耐受30min后，突变体D632G/A633V-LANT326-329VSSS的相对剩余酶活较NPI野生型提高32％。综上知，针对中性蛋白酶NPI进行的热稳定性的改造有较明显的效果。
其中，野生型中性蛋白酶优化后序列NPI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
中性蛋白酶NPI氨基中序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 中性蛋白酶突变体及其构造方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1851
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 1
atgcatccaa ctcatcatgc tcatggtttg cagagaagga ctgttgattt gaactctttt 60
agattgcatc aagctgctaa gtacattaac gctactgaat cttctagtga tgtttcttca 120
tctttttctc catttactga acaatcttac gttgaaactg ctactcaatt ggttaagaac 180
attttgccag atgctacttt tagagttgtt aaggatcatt acattggttc taacggtgtt 240
gctcatgtta actttagaca aacggctcat ggtttggata ttgataacgc tgattttaac 300
gtcaatgttg gcaagaacgg taagattttt tcttacggtc attcttttta cactggtaaa 360
attcccgatg ctaacccatt gactaagaga gattacactg acccagttgc tgctttgaga 420
ggtactaacg aggctttgca attgtctatt actttggatc aagtttctac tgaggctact 480
gaagataagg aatcttttaa ctttaagggt gtttctggta ctgttagtga cccaaaagct 540
caattggttt acttggttaa ggaagatggt tctttggctt tgacttggaa ggttgaaact 600
gacatcgact ctaactggct attgacctac attgacgcta acactggtaa ggatgttcat 660
ggtgttgttg attacgttgc tgaagctgat taccaagttt acgcttgggg tattaacgac 720
ccaactgaag gtccaagaac tgttatttct gatccatggg acagttctgc tagtgccttc 780
acgtggattt ccgacggaga gaacaattac actaccacta gaggtaacaa cggtatcgct 840
caatctaacc caactggtgg ttcccagtac ttaaagaact accgtcccga ttcaccagat 900
ttgaagtttc aatacccata ctcattgaac gcaactcccc cagaaagtta cattgatgct 960
tctatcactc agttgtttta cactgccaac acttaccacg atttgttgta cactcttggt 1020
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<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
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attttgccag atgctacttt tagagttgtt aaggatcatt acattggttc taacggtgtt 240
gctcatgtta actttagaca aacggctcat ggtttggata ttgataacgc tgattttaac 300
gtcaatgttg gcaagaacgg taagattttt tcttacggtc attcttttta cactggtaaa 360
attcccgatg ctaacccatt gactaagaga gattacactg acccagttgc tgctttgaga 420
ggtactaacg aggctttgca attgtctatt actttggatc aagtttctac tgaggctact 480
gaagataagg aatcttttaa ctttaagggt gtttctggta ctgttagtga cccaaaagct 540
caattggttt acttggttaa ggaagatggt tctttggctt tgacttggaa ggttgaaact 600
gacatcgact ctaactggct attgacctac attgacgcta acactggtaa ggatgttcat 660
ggtgttgttg attacgttgc tgaagctgat taccaagttt acgcttgggg tattaacgac 720
ccaactgaag gtccaagaac tgttatttct gatccatggg acagttctgc tagtgccttc 780
acgtggattt ccgacggaga gaacaattac actaccacta gaggtaacaa cggtatcgct 840
caatctaacc caactggtgg ttcccagtac ttaaagaact accgtcccga ttcaccagat 900
ttgaagtttc aatacccata ctcagtttct tcttctcccc cagaaagtta cattgatgct 960
tctatcactc agttgtttta cactgccaac acttaccacg atttgttgta cactcttggt 1020
tttaacgagg aagctggtaa cttccaatac gataacaacg gtaagggtgg tgcaggtaac 1080
gattacgtta ttttgaatgc tcaagacggt tctggtacta acaacgctaa ctttgctact 1140
ccaccagatg gtcaaccagg tagaatgagg atgtatattt ggactgaatc tcagccatac 1200
agggatggtt cttttgaagc cggaattgta attcacgaat acactcatgg tttgtcaaac 1260
agattgactg gtggcccagc taacagtaga tgtttgaacg ctcttgaatc tggtggtatg 1320
ggtgaaggtt ggggtgattt tatggctact gctattagat tgaaggctgg tgacactcat 1380
tctactgatt acactatggg agaatgggct gctaacaaga agggcggtat tagagcttac 1440
ccattttcta cttctttgga aactaaccca ttgacttaca cttctttgaa cgaattggat 1500
gaggttcatg ctattggtgc tgtttgggct aacgttttgt atgaattgtt gtggaacttg 1560
attgataagc atggtaaaaa cgatggtcca aagccagaat ttaaggatgg tgttccaact 1620
gatggtaagt atttggctat gaagttggtt attgatggta tggctttgca accatgtaat 1680
ccaaactgtg ttcaagctag agatgctatt ttggatgctg ataaggcttt gactgatggc 1740
gctaacaagt gtgaaatttg gaaggcattc gctaagagag gtttgggtga aggtgctgaa 1800
taccatgctt ctaggagagt tggttctgac aaggttccat ctggtgtttg t 1851
<210> 4
<211> 617
<212> PRT
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 4
Met His Pro Thr His His Ala His Gly Leu Gln Arg Arg Thr Val Asp
1 5 10 15
Leu Asn Ser Phe Arg Leu His Gln Ala Ala Lys Tyr Ile Asn Ala Thr
20 25 30
Glu Ser Ser Ser Asp Val Ser Ser Ser Phe Ser Pro Phe Thr Glu Gln
35 40 45
Ser Tyr Val Glu Thr Ala Thr Gln Leu Val Lys Asn Ile Leu Pro Asp
50 55 60
Ala Thr Phe Arg Val Val Lys Asp His Tyr Ile Gly Ser Asn Gly Val
65 70 75 80
Ala His Val Asn Phe Arg Gln Thr Ala His Gly Leu Asp Ile Asp Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Asn Val Asn Val Gly Lys Asn Gly Lys Ile Phe Ser Tyr
100 105 110
Gly His Ser Phe Tyr Thr Gly Lys Ile Pro Asp Ala Asn Pro Leu Thr
115 120 125
Lys Arg Asp Tyr Thr Asp Pro Val Ala Ala Leu Arg Gly Thr Asn Glu
130 135 140
Ala Leu Gln Leu Ser Ile Thr Leu Asp Gln Val Ser Thr Glu Ala Thr
145 150 155 160
Glu Asp Lys Glu Ser Phe Asn Phe Lys Gly Val Ser Gly Thr Val Ser
165 170 175
Asp Pro Lys Ala Gln Leu Val Tyr Leu Val Lys Glu Asp Gly Ser Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Trp Lys Val Glu Thr Asp Ile Asp Ser Asn Trp Leu Leu
195 200 205
Thr Tyr Ile Asp Ala Asn Thr Gly Lys Asp Val His Gly Val Val Asp
210 215 220
Tyr Val Ala Glu Ala Asp Tyr Gln Val Tyr Ala Trp Gly Ile Asn Asp
225 230 235 240
Pro Thr Glu Gly Pro Arg Thr Val Ile Ser Asp Pro Trp Asp Ser Ser
245 250 255
Ala Ser Ala Phe Thr Trp Ile Ser Asp Gly Glu Asn Asn Tyr Thr Thr
260 265 270
Thr Arg Gly Asn Asn Gly Ile Ala Gln Ser Asn Pro Thr Gly Gly Ser
275 280 285
Gln Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg Pro Asp Ser Pro Asp Leu Lys Phe Gln
290 295 300
Tyr Pro Tyr Ser Leu Asn Ala Thr Pro Pro Glu Ser Tyr Ile Asp Ala
305 310 315 320
Ser Ile Thr Gln Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Thr Tyr His Asp Leu Leu
325 330 335
Tyr Thr Leu Gly Phe Asn Glu Glu Ala Gly Asn Phe Gln Tyr Asp Asn
340 345 350
Asn Gly Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Val Ile Leu Asn Ala Gln
355 360 365
Asp Gly Ser Gly Thr Asn Asn Ala Asn Phe Ala Thr Pro Pro Asp Gly
370 375 380
Gln Pro Gly Arg Met Arg Met Tyr Ile Trp Thr Glu Ser Gln Pro Tyr
385 390 395 400
Arg Asp Gly Ser Phe Glu Ala Gly Ile Val Ile His Glu Tyr Thr His
405 410 415
Gly Leu Ser Asn Arg Leu Thr Gly Gly Pro Ala Asn Ser Arg Cys Leu
420 425 430
Asn Ala Leu Glu Ser Gly Gly Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe Met
435 440 445
Ala Thr Ala Ile Arg Leu Lys Ala Gly Asp Thr His Ser Thr Asp Tyr
450 455 460
Thr Met Gly Glu Trp Ala Ala Asn Lys Lys Gly Gly Ile Arg Ala Tyr
465 470 475 480
Pro Phe Ser Thr Ser Leu Glu Thr Asn Pro Leu Thr Tyr Thr Ser Leu
485 490 495
Asn Glu Leu Asp Glu Val His Ala Ile Gly Ala Val Trp Ala Asn Val
500 505 510
Leu Tyr Glu Leu Leu Trp Asn Leu Ile Asp Lys His Gly Lys Asn Asp
515 520 525
Gly Pro Lys Pro Glu Phe Lys Asp Gly Val Pro Thr Asp Gly Lys Tyr
530 535 540
Leu Ala Met Lys Leu Val Ile Asp Gly Met Ala Leu Gln Pro Cys Asn
545 550 555 560
Pro Asn Cys Val Gln Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Asp Lys Ala
565 570 575
Leu Thr Asp Gly Ala Asn Lys Cys Glu Ile Trp Lys Ala Phe Ala Lys
580 585 590
Arg Gly Leu Gly Glu Gly Ala Glu Tyr His Ala Ser Arg Arg Val Gly
595 600 605
Ser Asp Lys Val Pro Ser Asp Ala Cys
610 615

Claims (6)

1.一种中性蛋白酶突变体，其特征在于，该突变体为复合位点突变体NPI-D632G/A633V；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种中性蛋白酶突变体，其特征在于，该突变体为复合位点突变体NPI-D632G/A633V-LANT326-329VSSS；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1或2所述的突变体的特征在于，他们的最适pH为7，最适温度为55℃。
4.权利要求1或2所述突变体的突变方法，其步骤如下：
(1)中性蛋白酶基因NPI的序列优化及克隆：利用DNAwork对NPI进行毕赤酵母表达的序列优化后直接合成目的序列，以此序列为模板进行PCR扩增，将产物连接到pPIC9K载体上，得到重组载体pPIC9K-NPI；
(2)定点突变：以载体pPIC9K-NPI为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增、消化；将消化产物以热激法转入DMT感受态细胞，经菌液PCR验证后送测序，确定正确的突变子提取质粒后经SalI限制性内切酶，以电转法转入毕赤酵母GS115进行表达。
5.权利要求4所述的突变方法，其特征在于，突变引物为：
NPI-D632G/A633V-F
5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'
NPI-D632G/A633V-R
5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-F
5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'
NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-R
5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'
6.权利要求1或2所述突变体在中性蛋白酶NPI热稳定性提高方面的应用。
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