本发明是关于作为药品用途的胞苷二磷酸胆碱(以下简称为“CDP-胆碱”)的酶制造方法。
CDP-胆碱是合成膦脂质的磷脂酰胆碱(卵磷脂)的中间体,可以用于治疗头部外伤、脑手术引起的意识障碍、帕金森氏病、脑中风半边麻痹等病。
作为CDP-胆碱的制造方法已经知道的有2种方法,即化学合成法(特公昭39-6541号公报、特公昭42-1384号公报特公昭63-6558号公报等)以及使用酵母等微生物菌体的酶法(特公昭48-2358号公报、特公昭48-40757号公报、特公昭48-40758号公报、特开昭53-109996号公报特开昭54-14593号公报、特开昭63-313594号公报等)。
这些制造方法中共同点是作为原料使用了胞苷-5′-单磷酸(以下简称“CMP”)、胞苷-5′-二磷酸(以下简称“CDP”胞苷-5′-三磷酸(以下简称“CTP”)、胞嘧啶等的胞嘧啶系核苷酸及其前体。
这些原料中,作为基本原料的CMP主要是通过RNA(核糖核酸)分解的方法来制造,但是由于这种方法可以同时得到4种核苷酸而不是选择性地得到CMP,所以不是一种效率高的方法。
本发明的目的在于提供作为用于药品的CDP-胆碱的高效制造方法。
按照本发明,可以提供一种不使用胞嘧啶系核苷酸及其前体,而从工业上易于得到的乳清酸经过一步酶处理,高效地制造CDP-胆碱的方法。
乳清酸是嘧啶系核苷酸的前体物质,可用于强肝剂。业已知道,通过使用棒状杆菌属的微生物进行发酵,能适用于工业上生产乳清酸的方法(特开平1-104189号公报)。本发明者着眼于此,对次乳清酸为原料的CDP-胆碱的生产进行了锐意的研究。
其结果,将含有编码磷酸胆碱转胞苷酰酶(以下简称“CCT”)胆碱激酶(以下简称“CKl”)及CTP连接酶(以下简称“pyrG”)的基因的DNA片段重组在载体DNA上而调制成携带重组体DNA的微生物和由乳清酸生成的UTP高活性微生物进行混合,以此作为酶源,通过与以乳清酸和胆碱及/或磷酸胆碱作为基质进行反应,可发现生成显著量的CDP-胆碱,因此完成了本发明。
以下详细说明本发明。
本发明提供了以微生物的培养液或其处理物为酶源,与乳清酸和胆碱及/或磷酸胆碱为基质进行反应,使反应液中生成和积蓄CDP-胆碱,并从该反应液中提取CDP-胆碱为特征的CDP-胆碱的制造方法。
若以乳清酸及磷酸胆碱为基质时,CDP-胆碱按下式,通过(11)~(6)的6个阶段酶反应而生成。另外,若以乳清酸及胆碱为基质时,进而还需要(7)的反应。
此外,式中的略语如下。
OMP:乳清酸核苷-5′-单磷酸
UMP:尿苷-5′-单磷酸
UDP:尿苷-5′-二磷酸
UTP:尿苷-5′-三磷酸
另外,催化(1)~(7)的反应的酶如下。
(1):乳清酸磷酸核糖转移酶(EC2、4、2、10)
(2):OMP脱酸酶(EC 4、1、1、23)
(3)核苷单磷酸酯激酶(EC 2、7、4、4)
(4):核苷二磷酸酯激酶(EC 2、7、4、6)
(5):CTP连接酶(EC 6、3、4、2)
(6):磷酸胆碱转胞苷酰酶(EC 2、7、7、15)
(7):胆碱激酶(EC 2、7、1、32)
这些7种反应中,(1)是消耗磷酸核糖焦磷酸(以下简称“PRPP”)生成焦磷酸的反应,(3)、(4)、(5)、(7是消耗腺苷-5′-三磷酸(以下简称“ATP”)生成腺苷-5′-二磷酸(以下简称“ADP”)的反应。
因此,本发明所使用的微生物,具有上式(1)~(7)的酶活性,进而希望有PRPP供给能力、ATP再生能力。只要能满足这些条件,使用多少数量的微生物都没有什么关系。
例如,如以下所述,这些酶活性可由2种微生物分担,将其混合后使用的方法也是可能的。即使用具有上式(5)和(6)及/或(7)酶活性的微生物(以下,称微生物A1)或者具有上式(5)和(6)酶活性的微生物(以下称微生物A2)以及上式(1)到(4)的活性很强的,可从乳清酸积蓄UTP的,最好同时PRPP供给能和ATP再生能很强的微生物(以下称微生物B)的方法。
作为微生物A1或微生物A2理想的菌株属于通过基因重组表达强化这些酶活性的埃希氏杆菌属的微生物,更具体的说,可举出携带含有来源于酿酒酵母(以下简称酵母”)的CCT及CKI基因、来源于大肠埃希氏杆菌(以下简称“大肠杆菌)的pyrG基因重组体DNA(pCKG55)的大肠杆菌MM294株(FERM BP-526、ATCC 33625)。
CCT基因由酵母染色体,以酵母CCT基因缺损变异互补为指标被克隆化,决定其全碱基顺序〔Eur·J·Biochem169卷,477-486页,1987年〕。作为CCT基因的给源可以举出在大肠杆菌载体pUC18〔Gene,33卷,103-119页,1985年〕的多克隆化位置的SmaI部位上插入含有来源于酵母的CCT基因1296碱基对(以下简称为“bp”)的DraI片段的质粒pCC41〔生化学,60,701(1988)〕等。
CKI基因也可同样由酵母染色体克隆化,决定全碱基顺序〔J Biol.chem.,264卷,2053-2059页,1989年〕。作为CKI基因的给源可以举出在酵母和大肠杆菌的往复性载体YEpM4〔Mol.Cell.Biol.,7卷,3629-3636页,1987年〕上插入含有来源于酵母的CKI基因2692bp的PstⅠ-HindⅢ片段的质粒pCKID等。
pyrG基因由大肠杆菌染色体克隆化,决定其全碱基顺序〔J.Biol.Chem.,261卷,5568-5574页,1986年〕。作为pyrG基因的给源可以举出pMW6等,它是在大肠杆菌载体pVC8〔Gene,19卷,259-268页,1982年〕的多克隆化位置的SmaⅠ-PStⅠ部位上插入了含有来源于大肠杆菌的pyrG基因的2426bp的NruⅠ-PstⅠ片段的质粒。
从带有这些质粒的大肠杆菌离析精制质粒DNA可按照公知的方法〔Nuc.Acids Res.,7卷,1513-1523页,1979年〕进行。此外,关于质粒DNA用限制性酶切断、切断的DNA片段的离析精制、DNA片断的酶结合、使用重组体DNA的宿主大肠杆菌的性状转变等、基因转变的种种操作可按公知的方法进行〔例如T.Maniatis等所著:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold spring Harbor Laboratory,(1982)〕。
作为载体,只要在宿主微生物内可以复制的即可,并无特殊的限制,但若以大肠杆菌作为宿主时,可以举出pUC8、pBR322等〔Gene,2卷,95-113页,1977年〕。
作为宿主微生物,只要能够表达重组体DNA、能够用于CDP-胆碱的生成反应的任何微生物,具体的可举出大肠杆菌MM294株(前述)。
另一方面,作为微生物B,理想的菌株是属于棒状杆菌属的微生物,再具体地可举出产氨棒状杆菌(旧名,产氨短杆菌ATCC 21170。
用于微生物A1、微生物A2及微生物B培养的培养基,只要恰当地含有碳源、氮源、无机物、氨基酸、维生素等的培养基,无论是天然培养基,还是人工培养基均可,在好的气氛条件下,边调节温度、PH值等,边用通常的方法培养即可。
作为碳源可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、山梨糖等的碳水化合物、糖醇、甘油、淀粉水解物、糖蜜等,进而还可使用丙酮酸、乳酸、柠檬酸等各种有机酸,谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等各种氨基酸。另外也可以使用白糠、木薯、甘蔗渣、玉米纤维液等天然有机营养源。
作为氮源可以使用氨或氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机及有机铵盐等,谷氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸等氨基酸、或胨、NE氨、玉米纤维液、肉汁、酵母汁、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物、蛹的水解物等的含氮有机物等种种物质。
进而,根据需要可添加磷酸钾、磷酸二钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸铜、氯化锰、钼酸铵、硫酸锌等无机物。根据需要还可以添加维生素、氨基酸、核酸等其他物质,但是,如上述如果随着其他培养基的成分可供给培养基时,就没有必要特别加入。
培养是在振荡培养或者通气搅拌培养等的好的气氛条件下进行。培养温度较好是15~40℃,更好是20~35℃。培养中培养基的PH值最好维持在中性附近。培养的时间通常是5~72小时。
将具有从UTP和胆碱及/或磷酸胆碱生成CDP-胆碱能力的微生物A与具有从乳清酸生成UTP能力的微生物B混合时,可以分别单个培养,培养终了后混合。也可以在一个培养器中同时接种,混合培养。进而也可以在任何一个微生物的培养中或培养结束时,接种另一个微生物进行培养。
这样得到的微生物A及微生物B的培养液可以原封不动地,或经过各种处理后。进行CDP-胆碱的生成反应。CDP-胆碱的生成反应可以使微生物A及微生物B的培养液或其处理物的混合物与乳清酸和胆碱接触来进行,也可以使微生物B的培养液或其处理物与乳清酸接触,使之生成UTP后,再添加微生物A的培养液或其处理物和胆碱及/或磷酸胆碱来进行。
作为培养液的处理物可以举出培养液的浓缩物、或其干燥物、培养液离心分离后得到的菌体、菌体干燥物、表面活性剂及/或有机溶剂处理物、溶菌酶处理物、由固定化菌体或菌体萃取的酶样品等。
CDP-胆碱的生成反应,是在上述微生物和反应基质的混合物中,进而添加反应必要的成分,一边将PH调节为6~10、最好为7~8,一边在20~50℃,下保持2~48小时。作为反应必须的成分可举出ATP再生时必要的能量供给体、磷酸离子、镁离子、铵离子进而是表面活性剂及/或有机溶剂等。这些成分如果从上述微生物培养液带入所需的必要量时,就没有必要再添加。
作为反应基质的乳清酸可以使用纯品,含有微生物的乳清酸发酵液、或其粗精制物等的乳清酸的物质,如果是对反应没有妨碍哪种都可以使用。乳清酸的使用浓度为0.01~1.0mol/l,更好是0.01~0.3mol/l。此外,胆碱及/或磷酸胆碱可使用纯品,含有胆碱及/或磷酸胆碱的物质,如果其中的不纯物不妨碍反应也可以使用。胆碱及/或磷酸胆碱的使用浓度为0.01~3.0mol/l、更好是0.02~1.0mol/l。
作为能量供给体可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等碳水化合物,糖蜜、淀粉水解物等;丙酮酸、乳酸、醋酸、α-氧代戊二酸等有机酸,甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。其使用浓度为0.02~2.0mol/l。
作为磷酸离子,正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸、四聚偏磷酸等聚磷酸;聚偏磷酸、磷酸钾、磷酸二钾、磷酸-钠、磷酸二钠等无机磷酸盐等等都可以使用。其使用的浓度大约为0.01~0.5mol/l。
作为镁离子可以使用硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机镁盐,柠檬酸镁等有机镁盐等等。添加量通常为0.005~0.2mol/l
作为铵离子可以使用氨水,氨气,各种无机、有机铵盐,谷氨酰胺或含有酵母汁、酪蛋白氨基酸、玉米纤维液等的谷氨酰胺的天然物等等。添加量约为0.01~2.0mol/l。
作为表面活性剂,二辛基磺基琥珀酸钠(例如腊披索尔B-80日本油脂社制)、月桂酰。肌氨酸盐等阴离子表面活性剂,聚氧乙烯十六烷基醚(例如,非离子P-208,日本油脂社制)等非离子性表面活性剂,烷基二甲胺(例如,叔胺FB,日本油脂社制)等叔胺类等等,如果促进CDP-胆碱生成都可以使用的物质。其使用浓度通常为0.1~50g/l优选的是1~20g/l。
作为有机溶剂可举出二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、醋酸乙酯等其使用浓度通常为0.1~50ml/l、优选的是1~20ml/l。
反应液中生成的CDP-胆碱的提取,可使用活性碳和离子交换树脂等的常规方法进行。
下面给出本发明的实施例
实施例1
同时表达CCT、CKI、pyrG的重组质粒的形成:
关于同时表达CCT、CKI、pyrG重组质粒pCKG55的形成方法如以下所述。此外,形成工程归纳表示在图1中。
1)CCT/CKI融合蛋白的表达
将携带有来源酵母染色体的CCT基因质粒pCC41的大肠杆菌MM294/pCC41株(以下质粒携带株以“宿主株名/质粒名。”的形式表示)接种在含有细菌胰化胨(ディフコ社制)(10g/l)、酵母汁(ディフコ社制)(5g/l),NaCl(5g/l)、NaCl(5g/l)的、PH值调节在7.2的400ml培养基中,在30℃培养18小时。从得到的培养菌体,用公知的方法(前述)离析精制出质粒pCC41。具有来源于酵母染色体的CKI基因的质粒pCKID也可用同样的方法从其携带株的大肠杆菌MM294/pCKID株离析精制出来。
将调制的pCC41质粒DNA5μg溶解在50μl含有10mmol tris-盐酸(pH7.5)、50mmolNaCl、7mmol MgCl2及6mmol 2-巯基乙醇的缓冲液中(以下,用限制性酶进行消化反应的缓冲液,根据NaCl的浓度值以“Y-50缓冲液”形式命名),加入20单位的HindⅢ(宝酒造社制,以下限制性酶类均使用宝酒造社制品)和20单位的HpaⅠ,在37℃进行2小时消化反应。将此消化物用琼脂糖凝胶进行电泳后,对凝胶萃取可离析出很大的DNA片断(3808bp)。另一方面,pCKID质粒DNA5μg也可用同样的方法,用HindⅢ和Hpal消化后,精制离析出2297bp的DNA片断。
将这样得到的约0.2μg的来源于pCC41的DNA片断和约0.05μg的来源于pCKID的DNA片断在40μl含有20mmol tris-盐酸(pH7.6)、10mmolMgCl2、10mmol二硫代苏糖醇及0.5mmolATP的缓冲液(以下称“T4连接酶缓冲液”)中,加入2个单位的T4连接酶(宝酒造社),在4℃进行18小时的结合反应。用这样得到的重组体DNA使大肠杆菌MM294株进行性状转变,得到抗氨必西林性的性状转变株。
从此性状转换株离析精制出质粒DNA,该DNA通过用HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ等限制性酶消化,进行质粒结构解析,其结果,已确认排列着具有目的结构6.1千碱基(以下略称“kb”)的质粒。该质粒命名为pCKI(参照图1)。
由pCKI编码的CCT/CKⅠ融合蛋白的结构表示在图2中pCC41具有在大肠菌载体pUCⅠ的多克隆化位置的SmaⅠ部位上,插入了来源于酵母染色体的1296bp DraⅠ片断的结构。DraⅠ消化时,除去了原来CCT基因的N来端24个氨基酸,而取代的是形成连接来源于载体JacZ基因的11个氨基酸形成(参照图3)。另外,由于HpaⅠ切断和结合的结果,成为除去了CCT基因的C末端14氨基酸及CKl基因的N末端31氨基酸而结合的形式,成为总计由948个氨基酸组成的融合蛋白。
对于MM294/pCKI株,在后述的CCT活性测定系统中进行反应时,生成了以CTP和磷酸胆碱为基质的CDP-胆碱,进而,在该系统中,将5mmol磷酸胆碱置换成5mmol氯化胆碱即使添加5mmol ATP同样也可生成CDP-胆碱。于是,已确认pCKI携带株同时具有CCT、CKI两种活性。
2)CCT/CKI融合蛋白的N末端部分缺失体的制取:
为了达到增大CCT/CKI融合蛋白表达量的目的,按以所述的方法,进行CCT/CKI融合蛋白的N末端部分缺失体的制取取。
将2μg pCKI质粒DNA溶解在30μl Y-50缓冲液中,加入15单位的KpnⅠ,在37℃进行2小时消化反应。向此消化物中加入20μl 5倍浓度的Ba131缓冲液〔100mmoltris-盐酸(pH8.0)、60mmol、MgCl2、60mmol CaCl3,3Mol NaCl〕、46μl蒸馏水和0.1单位的Ba131核酸酶(宝酒造社),在30℃进行3分钟消化反应。
向反应液中加入100μl的苯酚氯仿(容量比1∶1)混合液充分搅拌,使反应停止后,离心分离,提取上层液(以上把此操作称为“苯酚∶氯仿萃取”)。向提取的水层中加入2倍容量的冰冷乙醇在-80℃下静置30分钟。离心分离乙醇混合物后,弃去上清液,在减压下干燥沉淀(以下将此操作称为“乙醇沉淀)。向得到的沉淀物中加入50μlT4连接酶缓冲液,溶解后,加入1个单位的T4连接酶,在4℃进行18小时的结合反应。
用得到的重组体DNA使大肠杆菌MM294株性状转变,选择抗氨比西林性的性状转变株。培养得到的抗氨比西林性株,在后述的CCT活性测定系统中测定CCT活性,选择活性最高的株离,离析精制质粒DNA,通过用HindⅢ、HpaⅠ、PvuⅡ等限制性酶切断该DNA,已确认具有目的要求的结构。将该质粒命名为pCK55。(参照图1)。
pCK55上的CCT/CKI融合基因的N末端部分的碱基顺序,可按照F·Sanger等的双脱氧法〔J.Mol.Biol.,143卷,161-178页,1980年〕决定,具有如图3表示的碱基顺序。即通过Ba131核酸酶消化,从KpnⅠ部位在上流及下流方向合计失去36bp,可以看出,因此,缺失了来源于大肠杆菌载体pUCI8的9个氨基酸和来源于CCT基因的3个氨基酸的合计12个氨基酸,作为由结合的936个氨基酸组成的融合蛋白表达。
3)CCT、CKI、pyrG同时表达质粒的形成:
从携带具有来源于大肠杆菌染色体的pyrG基因质粒pMW6的大肠杆菌MM294/pMW6株离析精制出质粒DNA。将5μg调制的pMW6质粒DNA溶在50μl Y-150缓冲液中加入20单位的MluI,在37℃进行2小时消化反应。接着用苯酚:氯仿萃取和乙醇沉淀后,将DNA片段溶解在总量为50μl的DNA多聚酶缓冲液〔50mmol tris-盐酸(pH8.8)、7mmol MgCl2、6mmol2-巯基乙醇、7μmol EDTA、0.25mmol dATP、0.25mmol dCTP、0.25mmol dGTP、0.25mmol dTTP〕中、加入5单位的T4DNA多聚酶(宝酒造社),在37℃进行2小时反应,通过MluⅠ消化,使生成的5′-突出末端成为平滑末端。反应液用苯酚∶氯仿萃取、乙醇沉淀后,将得到的DNA片断溶解在50μl Y-50缓冲液、加入15单位的HindⅢ,在37℃进行2小时消化反应。将此消化物用琼脂糖凝胶进行电泳后,从凝胶中萃取、离析出大的DNA片段。
另一方面,质粒pCK55也从那个携带株(MM294/pCK55)离析精制出。将5μg调制的pCK55质粒DNA溶解在50μl Y-50缓冲液中,加入20单位的HindⅢ和20单位的PvuⅡ,在37℃进行2小时消化反应。将此消化物进行琼脂糖凝胶电泳后,离析精制出含有CCT/CKI基因的大的DNA片段(3610bp)。
将这样得到的约0.05μg的来源于pMW6的DNA片段和约0.2μg的来源于pCK55的DNA片段在50μl的T4连接酶缓冲液中,用2单位的T4连接酶,在4℃进行18小时结合反应。用得到的重组体DNA使大肠杆菌MM294株进行性状转变,得到抗氨比西林性的性状转变株。
从这个性状转变株离析精制质粒DNA,通过用HindⅢ,HpaⅠ、KpnⅠ等限制性酶消化该DNA,进行质粒结构分析的结果已确认构筑成要求的8、3Kb的质粒(参照图1)。
4)携带重组体DNA株的CCT、pyrG活性:
携带重组体DNA株的CCT、pyrG活性的测定可按以下的方法进行。
将供给活性测定实验的大肠杆菌接种到装有10ml含有氨西比林(50μg/ml)的L培养基的大型试管中,在25℃振荡培养18小时。将100μl这种培养液接种在装有10μl含有氨西比林(50μl/ml)的L培养基的大型试管中,在33℃振荡培养10小时。将得到的500μl培养液离心分离后,弃去上清液将菌体悬浮在500μl 20mmol磷酸钾缓冲液(pH7.0中、向其中加入5μl二甲苯后搅拌,在30℃处理10分钟。这样得到的二甲苯处理物作为粗酶液使用,按照下述方法测定酶活性。
“CCT活性测定法”
将由150mmol磷酸钾缓冲液(pH7.5)、25mmol氯化镁、5mmol CTP、5mmol磷酸胆碱及粗酶液组成的500μl反应液在30℃进行2小时反应。定时地每次提取50μl反应液,添加50μl 0.2mmol醋酸后,通过在100℃加热处理2分钟中止反应。该处理物经离心分离后,用适宜的蒸馏水稀释上清液,用高速液体色谱法定量生成的CDP-胆碱。将每分钟生成1μmol的CDP-胆碱的酶量作为1单位(U)计算出酶活性。
“pyrG活性测定法”
将由40mmol tris-盐酸(pH7.1)、10mmol氯化镁、1mmol ATP、1mmol UTP、0.2mmol GTP、2mmol谷氨酰胺、8mmol磷酸环己醇丙酮酸及粗酶液组成的2ml反应液在38℃进行60分钟反应。定时地每次提取200μl反应液,通过与1.8ml3.5%高氯酸混合而中止反应。
这种酸处理液离心分离后,用比色计测定上清液的291nm的吸光度。在3.5%高氯酸中,在291nm处对作为基质的UTP几乎没有吸收,而对是生成物的CTP有吸收。因此,通过测定291nm的吸收可以知道CTP的生成量。以每分钟生成1μmol CTP的酶量作为1单位(U)计算出酶活性。
按本发明制成的质粒携带株CCT及pyrG活性的测定结果如表1所示。活性的值以每1ml培养液的酶活性(U)表示。
此外,携带pCKG55大肠杆菌菌株(Escherichia coli MM294/pCKG55)在平成4年(1992)1月27日,按照布达佩斯的条约的条件,以寄存号为FERM Bp-3137寄存在工业技术院微生物工业技术研究所。
实施例2
将实施例1得到的大肠杆菌MM294/pCKG55株在装有10ml含氨比匹林(50μg/ml)的培养基的大型试管中接种、在25℃以300rpm进行24小时振荡培养。将20ml该培养液在装有400ml氨比西林(50μg/ml)的培养基的带有隔板的2l三角烧瓶中接种,在25℃以190rpm进行16小时旋转振荡培养。
将125ml此培养液在装有2.5l由葡萄糖(5g/l(另外灭菌)、胨(极东制药工业社制)(5g/l)、Na2HPO4(6g/l)、KH2PO4(3g/l)、NaCl(5g/l)、NH4Cl(1g/l)、MgSO4·7H2O(250mg/l)(另外灭菌)及维生素B1(4mg/l(另外灭菌)组成的液体培养基(pH不调整)的5l容积的培养槽中接种,在25℃下、11小时,而后32℃下、13小时以600rpm搅拌,通气量为2.5l/分的培养条件下,用14%氨水一边调节pH为7.0一边进行培养。培养中,从开始培养后第11小时到第24小时之间,将由葡萄糖(167g/l)、胨(167g/l)组成的进料液通过蠕动移液泵,以30ml/小时的速度流动添加。
另一方面,将产氨棒状杆菌ATCC21170株在装有10ml由葡萄糖(50g/l)、多胨(大五荣食化学社)(10g/l)、酵母汁(大五荣食化学社制)(10g/l)、尿素(5g/l)、(NH4)2SO4(5g/l)、KH2PO4(1g/l)K2HPO4(3g/l)、MgSO4·7H2O(1g/l)、CaCl2·2H2O(0.1g/l)、FeSO4·7H2O(10mg/l)、ZnSO4·7H2O(10mg/l)、MnSO4·4~6H2O(20mg/l)、L-磺基丙氨酸(20mg/l)、D-泛酸钙(10mg/l)、维生素B1(5mg/l)、尼古丁酸(5mg/l)及生物素(30μg/l)(用苛性钠调节pH值为7.2)组成的液体培养基的大型试管中进行接种,在28℃以300rpm进行24小时的往复振荡培养。
将20ml此培养液在装有与上述同一组成的230ml液体培养基的21带有隔板三角烧瓶中进行接种,在28℃以190rpm进行24小时旋转振荡培养。
将250ml此培养液在装有2.5l由葡萄糖(100g/l)、肉汁(10g/l)、多胨(10g/l)、KH2PO4(1g/l)、K2HPO4(1g/l)、MgSO4·7H2O(1g/l)、CaCl2·2H2O(0.1g/l)、FeSO4·7H2O(20mg/l)、ZnSO4·7H2O(10mg/l)、MnSO4、4~6H2O(20mg/l)、β-丙氨酸(15mg/l)、L-磺基丙氨酸(20mg/l)、生物素(100μg/l)、尿素(2g/l)(另灭菌)及维生素B1(5mg/l)(另灭菌)(用苛性钠调节pH为7.2)组成的液体培养基的5l容积培养槽中进行接种,在32℃搅拌速度为600rpm通气量为2.5l/分的培养条件下、边用浓氨水调节pH值在6.8边进行物种培养。
当上述物种培养液的上清液中的葡萄糖消耗掉时,无菌地提取350ml培养液,并在装有2.5l由葡萄糖(180g/l)、KH2PO4(10g/l)、K2HPO4(10g/l)、MgSO4·7H2O(10g/l)、CaCl2、2H2O(0.1g/l)FeSO4、7H2O(20mg/l)、ZnSO4、7H2O(10mg/l)、MnSO4·4~6H2O(20mg/l)(另外灭菌)、β-丙氨酸(15mg/lL-磺基丙氨酸(20mg/l)、谷氨酸钠(1g/l)、生物素(100μg/l)、尿素(2g/l)(另外灭菌)及维生素B1(5mg/l)(另外灭菌)(用苛性钠调节pH值为7.2)组成的液体培养基的5l容积的培养槽中接种,在32℃、搅拌速度为600rpm、通气量为2.5l/分的培养条件下,边用浓氨水调节pH值为6.8边进行培养。在培养液的上清液中的葡萄糖消耗时,终止培养。
将这样得到的360ml大肠杆菌MM294/pCKG55株培养液和360ml产氨棒状杆菌ATCC21170株培养液加入2l容积的培养槽中,并向其中添加葡萄糖(100g/l)、乳清酸(10g/l,47mmol、氯化胆碱(8.4g/l,60mmol)、MgSO4·7H2O(5g/l)、二甲苯(20ml/l),再加入蒸馏水或全量为800ml。将此混合液,在32℃、800rpm搅拌速度、通气量0.81/分的条件下,边用10N的NaOH调节pH值为7.2边进行反应。反应中,在适宜的进程中添加KH2PO4,以便保持反应上清液中磷酸浓度为1~5g/l。进行23小时反应后,生成CDP-胆碱(11.0g/l,21.5mmol)。此外,不添加大肠杆菌MM294/pCKG55株培养液,而取代之加入360ml蒸馏水进行反应时,完全不能生成CDP-胆碱。另外,加入360ml蒸馏水代替产氨棒状杆菌ATCC21170株培养液进行反应时,CDP-胆碱的生成量为0.7g/l(1.4mmol)。
实施例3
作为反应基质,除了使用磷酸胆碱(16.5g/l,50mmol)代替氯化胆碱之外,进行与实施例2相同的反应,反应23小时,生成CDP-胆碱(9.5g/l,18.6mmol)
本发明提供了从乳清酸和胆碱及/或磷酸胆碱在工业上制造CDP-胆碱的方法。
顺序表
顺序:1
顺序长度:54碱基对
顺序类型:核酸
拓扑:线性
顺序种类:其他核酸
片段型:中间型片段
起源
生物名:酿酒酵母(Saccha-romyces Cerevisiae)
株名:×2180-1
顺序
A T G A C C A T G A T T A C G A A T T C G A G C T C G G T
A C C C A A A A A A A A T A A A A A T A A A A G A 54
顺序:2
顺序长度:18碱基对
顺序类型:核酸
拓朴:线性
顺序种类:其他核酸
片段型:中间型片段
起源
生物名:酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae)
株名:×2180-1
顺序
A T G A C C A A A A A T A A A A G A 18
图1表示质粒pCKIG55的形成工程
图2表示由质粒pCKI编码的CCT/CKI融合蛋白的结构。
图3表示由质粒pCKI及pCK55编码的CCT/CKI融合蛋白基因的N末端部分的碱基顺序。