CN105463042A - 一种生物酶催化制备胞二磷胆碱的方法 - Google Patents

Abstract

一种生物酶催化制备胞二磷胆碱的方法，其特征在于用单一经人工改造的基因工程菌株培养物作为酶源，氯化铵催化、乳清酸和磷酸胆碱等化学物质进行反应，生成胞二磷胆碱，进而从该反应液中提取胞二磷胆碱。该发明与现有技术相比，采用单一菌株进行发酵，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，能广泛应用于胞磷胆碱钠的产业化生产的酶催化合成胞磷胆碱钠的方法。

Description

一种生物酶催化制备胞二磷胆碱的方法

技术领域

本发明涉及生物技术及制药领域，包括基因工程和酶工程，本发明公开了用这个菌株制备胞二磷胆碱的方法。

背景技术

胞二磷胆碱，又名胞苷二磷酸胆碱，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，英文名：Citichaline，它的化学名称：胆碱胞嘧啶核苷-5’-二磷酸酯。它是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。

上世纪50年代由kennedy博士等人发现并确定分子结构，稍后Rossiter等阐明其功能。70年代初，日本武田制药株式会社研发并用于治疗脑外伤，脑手术伴随的意识障碍的临床获得成功，其商品名：Nichdin，中译名：尼柯灵。我国自70年代中期，华东师范大学生化教研室和天厨味精厂等单位协作，首先采用啤酒酵母作酶促生物发酵，稍后又进行了化学合成的探索，并在上海华山医院、上海市第一人民医院、新华医院等脑外科和神经内科进行约二年期的临床应用。目前，胞二磷胆碱已作为脑外科、神经内科以及不同类型的老年痴呆症用药。因此，对它的需求量很大，目前国内市场已达60吨上下，且出口量也与日俱增。

现行的胞二磷胆碱生产方法多由多种微生物参与或者所使用底物价格昂贵，成本高，且较难以控制，本发明采用单一菌株进行发酵，目的在于提供作为用于药品胞二磷胆碱的更为高效经济的制造方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在大肠杆菌中高效表达酵母磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)及大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和CTP连接酶(pyrG)，利用氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱基质进行反应，生成胞苷二磷酸胆碱的方法。

以下详细说明本发明：

本发明所使用的工程菌为单一菌株，同时具有酵母磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)及大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和CTP连接酶(pyrG)活性。

把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养48～72小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5％～10％；期间补充适量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体。

取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入铵盐进行盐析，获得饱和度为10％～50％盐析液，再将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1∶4～1∶10。

培养本发明微生物的培养基，所述培养基体系中含有蛋白胨20～30g/L，酵母提取物10～20g/L，葡萄糖5～8g/L，无机盐8～15g/L，余量为纯化水，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80％，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80％。

无机盐，优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20～30g/L，三磷酸胞苷二钠为40～60mmol/L；磷酸胆碱120～240mmol/L；乙酸镁20～30mmol/L；反应温度30～40℃；pH值为6.5～8.0。

培养最适温度为25～37℃，培养中培养基的pH值最好维持在中性6.5～8，培养时间是6～24小时。

附图说明

附图1为质粒构建流程图；

附图2为胞磷胆碱钠标准品的IR图谱；

附图3为制得的胞磷胆碱钠的IR图谱；

附图4为制得的胞磷胆碱钠的UV图谱；

附图5为制得的胞磷胆碱钠的1H-NMR图谱；

附图6为制得的胞磷胆碱钠的13C-NMR图谱；

附图7为制得的胞磷胆碱钠的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

cct和pyrG基因表达载体构建

根据已知大肠杆菌K12MG1655pyrG基因核酸序列和酿酒酵母cct基因核酸序列，分别以大肠杆菌和酿酒酵母染色体作为模板，扩增出全长cct基因和pyrG基因。

采用常规细菌和酵母菌DNA提取方法分别提取了购自德国的原始大肠杆菌菌株DH5α和酿酒酵母菌株ATCC26786/26787(DSM4266/4267)的基因组DNA。

扩增使用的是保真性较好的pfu酶，加A尾后连接于pUC19-Tvector，挑取阳性克隆送交测序公司。

①质粒pUCG的构建

将连接于pUC19-Tvector上的pyrG基因从载体上酶切下来，使用的限制性内切酶为SmaI和BamHI，同时载体pUC18使用限制性内切酶NruI和BamHI进行酶切，将载体酶切产物回收后，与回收的pyrG基因片段进行酶连反应，通过SmaI和BamHI等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成功。最终获得质粒pUCG，pyrG基因此时是由lacZ启动子诱导表达的。

②质粒pUC-CCT的构建

将连接于pUC19-Tvector上的cct基因从载体上酶切下来，使用的平末端限制性内切酶为DraI，同样，pUC18使用的为平末端酶SmaI，将载体酶切回收后，与cct基因进行酶连反应，先PCR扩增验证，再通过SmaI等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成功。

③质粒pUCG-CCT的构建

通过PCR扩增，先将带有启动子的cct基因连接于pUC19-Tvector上，测序确认序列，用NdeI酶切下目的片段，进行琼脂糖电泳，按照回收试剂盒操作说明回收DNA，溶解在20μLTE中，于离心管内-20℃保存。与脱磷载体pUCG/NdeI的连接，取一个0.2mLPCR管，加入7.5μL外源DNA片段，1μLpUCG脱磷酸化载体，1μL10×T4LigationBuffer，0.5μLT4连接酶，混匀后放置于16℃水浴过夜。将酶联产物转化至大肠杆菌菌株DH5α中，在含有100mg/L的Amp的平板上挑取阳性克隆。酶切并PCR扩增以验证阳性克隆的正确性。

大肠杆菌染色体上pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元的构建

从大肠杆菌K12MG1655染色体上分别扩增出pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因，测序后，通过EcoRI、SacI酶切位点将pyrE片段连接于质粒pUC18上，得到质粒pUCpyrE；再通过SacI、SmaI位点将pyrF片段连接到质粒pUCpyrE上，得到质粒pUC-pyrEF；接着将pyrH片段经由SmaI和XbaI位点连接到pUC-pyrEF上，得到质粒pUCpyrEFH；最后通过XbaI和HindIII位点将ndk片段连接到pUCpyrEFH上，获得在lac启动子后可诱导表达pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因的操纵元的质粒pUCpyrEFHk，构建流程参照图1。

带有KRT-Km-FRT元件的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元质粒的构建

ndk基因引物上设计有XhoI位点，将pUCpyrEFHk用XhoI和ScaI酶切，与同样带有XhoI和ScaI酶切位点的以质粒pKD13为模板扩增出的带有FRT位点的Kan基因片段相连，构建成质粒pUCpyrEFHkKmFRT(图1)。

Red同源重组方法重组pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因

①线性双链DNA打靶分子的制备与处理

用于基因敲除的外源DNA的PCR扩增引物，它们分别由5’端38bps的阿拉伯糖操纵元同源区和3′端20bps的模板质粒pKD13的卡那霉素抗性基因同源区或质粒pUCpyrEFHkKmFRT上20bp同源区组成。

建立如下的扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

使用高保真DNA聚合酶(PfuDNA聚合酶)，经PCR合成了线性双链DNA打靶分子(5’同源臂+筛选标记+3’同源臂，同源部分已用下划线标出)。PCR产物中存在的质粒模板会造成重组子的假阳性化，用DpnI酶作用于PCR产物，可以将甲基化的模板质粒分解，对于没有甲基化的PCR产物则没有作用。将DpnI作用后的PCR产物用乙醇沉淀法进行回收后即可用于Red同源重组，采取直接切胶回收的方法也可以达到同样的效果。

DpnI处理：建立如下体系：

37℃水浴酶切2-3h。

回收步骤参照试剂盒进行操作。

②重组酶基因的诱导表达和感受态细胞的制备

将编码Red重组系统的质粒pKD46用CaCl2法转化至大肠杆菌中，将宿主菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中30℃过夜振荡培养，接种1mL菌液于50mL的含有Amp的LB液体培养基中，30℃振荡培养3-4h，至OD600≈0.6。在培养终止前1h加入L-阿拉伯糖，使之终浓度为0.1％，使质粒pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达。冰上预冷10min，离心收集菌体，用10％甘油或超纯水洗3-4次，最后将菌体重悬于500μL冷的无菌10％甘油中，取50μL用于电击转化，其余可存放于-80℃冰箱中备用。以上操作步骤都要在冰上进行。

③电击转化

取2μL(20-100ng)PCR产物与50μl刚制备的感受态混合，采用BioRad公司Micro-Pulser电穿孔仪进行，0.2cm电转化杯，转化参数为2.5kV，5.8ms。迅速加入LB培养基1ml，置于37℃摇床中培养1-2h，复苏，用含筛选标记的LB平板筛选发生了同源重组的阳性克隆，获得菌株重组菌K1。

④验证引物设计及扩增条件

对重组菌K1进行鉴定时，引物设计的一般原则是：一条引物设计在打靶区外围，另外一条则位于线性打靶序列内部。

建立如下的扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

通过测序确认了重组事件发生的位置，获得的菌株即可用于下一步抗性去除。

⑤卡那霉素抗性基因的去除

质粒pCP20表达FLP重组酶，作用在重组体染色体上两个FRT靶位点上，使卡那霉素抗性基因丢失。将具有氨苄青霉素抗性的质粒pCP20利用CaCl2方法转化进入具有Kan抗性的阳性菌株中，于30℃培养条件下在含有Amp和Kan的平板上获得阳性转化子。然后转接到没有抗生素的LB培养基中，42℃培养5h，37℃平板划线培养。对所得到的单菌落进行Amp和Kan敏感检测，最后的Amp和Kan敏感的表型菌株就是去除掉Kan基因的重组子。同时使用Kan这对引物对抗性消除进行验证，条件同上。得到去除抗性的重组子K1-E。

实施例3

将实例2获得的重组子K1-E制备为感受态细胞，再将实例1中构建的质粒pUCG-CCT导入其中，可得到具有催化乳清酸、磷酸胆碱和氯化铵合成胞苷二磷胆碱能力的工程菌K1-E/pUCG-CCT。

将固体培养基上的工程菌K1-E/pUCG-CCT菌株接入5-150ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的种子培养液中，25-37℃以150-280rpm振荡培养8-16小时。按0.1-10％的接种量将该培养液转接至10-500ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的种子LB培养基液的1L三角烧瓶中，在25-37℃以150-280rpm振荡培养2-8小时，然后加入终浓度为0.1-1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4-12小时，培养温度适当下调。

用冷冻离心机将发酵液于4-20℃下以1000-5000rpm的速度离心5-30min，弃上清，用25-150ml0.05M，pH8.0的Tris-HCl重悬菌体细胞。

将这样得到的重悬4g大肠杆菌细胞加入三角瓶中，并向其中添加10g葡萄糖、0.6g乳清酸、0.8g氯化铵、1g磷酸氢二钾、1g磷酸二氢钾、1.5g磷酸胆碱、1mg硫酸亚铁、0.8mg硫酸锰、40mg硫酸镁和0.4mL二甲苯，再加入蒸馏水定容至100mL。将此混合液装入2L容量的三角瓶中，在30℃、100rpm的条件下进行反应。反应中，在适宜的进程中添加KOH以便保持反应体系pH值为7.2。反应24小时后，用HPLC方法测定胞苷二磷酸胆碱的生成量为6.9g/L。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种生物酶催化制备胞二磷胆碱的方法，其特征在于用单一经人工改造的基因工程菌株培养物作为酶源，催化氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱等化学物质进行反应，生成胞二磷胆碱，进而从该反应液中提取胞二磷胆碱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该基因工程菌株具有可诱导表达的酵母磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)及大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和CTP连接酶(pyrG)的活性，其中编码CCT和pyrE酶的基因位于质粒载体上。

3.根据权利要求2所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。

4.根据权利要求2所述酶编码基因的宿主细胞，其特征在于染色体上插入可诱导表达的乳清苷酸焦磷酸化酶基因(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶基因(pyrF)、尿甘酸激酶基因(pyrH)和核苷二磷酸激酶基因(ndk)。

5.根据权利要求4所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。