CN109923209A

CN109923209A - 修饰型酶及其利用

Info

Publication number: CN109923209A
Application number: CN201780067157.8A
Authority: CN
Inventors: 松井美里; 伊藤纪幸; 八十原良彦
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-06-21
Also published as: EP3536782A1; EP3536782A4; JPWO2018084165A1; US20190249165A1; WO2018084165A1

Abstract

本发明提供一种对野生型的谷胱甘肽合成酶进行修饰、使活性保持更稳定、热稳定性特别高的修饰型谷胱甘肽合成酶和/或生产该酶的转化体。本发明的多肽是(a)进行将甘氨酸与γ‑谷氨酰二肽结合的反应、且(b)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比、热稳定性和/或保存稳定性更高的多肽。

Description

修饰型酶及其利用

技术领域

本发明涉及修饰型谷胱甘肽合成酶、及编码该酶的基因、以及它们的利用。

背景技术

谷胱甘肽是由L-半胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸这3种氨基酸形成的肽，不仅存在于人体，还存在于其它的动物、植物、微生物等多种生物体内。另外，谷胱甘肽具有活性氧的消除作用、解毒作用、氨基酸代谢等功能，对于生物体是重要的化合物。

谷胱甘肽在生物体内以还原型谷胱甘肽(以下有时也称为“GSH”)或氧化型谷胱甘肽(以下有时也称为“GSSG”)的任一种形态存在，所述还原型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被还原的SH形态，所述氧化型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被氧化而在2分子谷胱甘肽之间形成了二硫键的形态。

作为谷胱甘肽的制造方法，已知在L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸及表面活性剂、有机溶剂的存在下，使用将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶重组而生产得到的大肠埃希氏菌、酿酒酵母的菌体作为酶源的酶法等(专利文献1及2)。另外，最近申请人公开了一种氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：由L-谷氨酸和L-胱氨酸制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，接着由氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸制造氧化型谷胱甘肽的工序(专利文献3)。

作为与谷胱甘肽合成相关的酶，已知有使L-谷氨酸与L-半胱氨酸结合而生成γ-谷氨酰半胱氨酸的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(以下，有时也称为“GSHI”)、和使γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸结合而生成还原型谷胱甘肽的谷胱甘肽合成酶(以下，有时也称为“GSHII”)。另外，已知GSHI及GSHII也可以分别以L-胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物进行利用，在该情况下，作为各酶反应的产物，分别合成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型谷胱甘肽(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭60-27396号公报(1985年2月12日公开)

专利文献2：日本特开昭60-27397号公报(1985年2月12日公开)

专利文献3：国际公开第2016/002884号公报(2016年1月7日公开)非专利文献

非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.,66,233(2004)

非专利文献2：Appl.Environ.Microbiol.,44,1444(1982)

发明内容

发明要解决的课题

然而，在以工业规模进行使用了谷胱甘肽合成酶的谷胱甘肽生产时，需要谷胱甘肽合成酶的保存稳定性、反应温度下的热稳定性。另外，在进行使用表达了谷胱甘肽合成酶的重组菌体的反应时，如果该酶的稳定性高，则可以通过对重组菌加热使来自宿主的除该酶以外的酶失活或活性降低，从而抑制来自宿主的酶引起的背景反应。

因此，本发明的课题在于提供一种与野生型谷胱甘肽合成酶相比其活性保持更稳定、热稳定性特别高的修饰型谷胱甘肽合成酶、和/或生产该酶的转化体。

解决课题的方法

本发明人等进行了深入研究，结果成功地从在野生型谷胱甘肽合成酶基因中导入突变而制备的突变型谷胱甘肽合成酶基因文库(以下，称为“突变酶基因文库”)中发现了热稳定性比野生型谷胱甘肽合成酶有所提高的修饰型谷胱甘肽合成酶，从而完成了本发明。

即，本发明的一个方式包含以下构成。

[1]一种多肽，其显示出以下(a)、(b)的性质：

(a)进行将甘氨酸与γ-谷氨酰二肽结合的反应，且

(b)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比，热稳定性和/或保存稳定性更高。

[2]一种多肽，其显示出以下(c)、(d)的性质：

(c)生成还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)，且

(d)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比，热稳定性和/或保存稳定性更高。

[3]根据[1]所述的多肽，其以γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSH及GSSG，或者以γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSH，或者以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSSG。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽，其是以下(A)～(C)中任一项所示的多肽：

(A)由序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自以下组的1个或多个氨基酸被取代了的氨基酸序列构成，所述组为：

第13、17、20、23、39、70、78、101、113、125、126、136、138、149、152、154、155、197、200、215、226、227、230、239、241、246、249、254、260、262、263、270、278、299、305、307及310位；

(B)在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自以下组的1个或多个氨基酸被取代了的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的1个或多个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失，所述组为：

(C)在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自以下组的1个或多个氨基酸被取代了的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上，所述组为：

第13、17、20、23、39、70、78、101、113、125、126、136、138、149、152、154、155、197、200、215、226、227、230、239、241、246、249、254、260、262、263、270、278、299、305、307及310位。

[5]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽，其是以下(D)～(F)中任一项所示的多肽：

(D)由序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组的1个或多个氨基酸取代的氨基酸序列构成，所述组为：

第13位被取代为丝氨酸、第17位被取代为谷氨酸、第20位被取代为苏氨酸、第23位被取代为亮氨酸、第39位被取代为苏氨酸、第70位被取代为丝氨酸、第78位被取代为亮氨酸、第101位被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、第113位被取代为组氨酸、第125位被取代为缬氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、第136位被取代为苏氨酸、第138位被取代为丙氨酸、第149位被取代为谷氨酰胺、第152位被取代为谷氨酰胺、第154位被取代为天冬酰胺、第155位被取代为亮氨酸、第197位被取代为谷氨酰胺、第200位被取代为丝氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、第226位被取代为精氨酸、第227位被取代为丝氨酸、第230位被取代为脯氨酸、第239位被取代为丝氨酸、第241位被取代为组氨酸、第246位被取代为精氨酸、第249位被取代为谷氨酸、第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、第262位被取代为半胱氨酸、第263位被取代为精氨酸、第270位被取代为异亮氨酸、第278位被取代为甘氨酸、丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、第307位被取代为缬氨酸、以及第310位被取代为苏氨酸；

(E)序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组的1个或多个氨基酸取代的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的1个或多个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失，所述组为：

(F)序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组的1个或多个氨基酸取代的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上，所述组为：

第13位被取代为丝氨酸、第17位被取代为谷氨酸、第20位被取代为苏氨酸、第23位被取代为亮氨酸、第39位被取代为苏氨酸、第70位被取代为丝氨酸、第78位被取代为亮氨酸、第101位被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、第113位被取代为组氨酸、第125位被取代为缬氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、第136位被取代为苏氨酸、第138位被取代为丙氨酸、第149位被取代为谷氨酰胺、第152位被取代为谷氨酰胺、第154位被取代为天冬酰胺、第155位被取代为亮氨酸、第197位被取代为谷氨酰胺、第200位被取代为丝氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、第226位被取代为精氨酸、第227位被取代为丝氨酸、第230位被取代为脯氨酸、第239位被取代为丝氨酸、第241位被取代为组氨酸、第246位被取代为精氨酸、第249位被取代为谷氨酸、第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、第262位被取代为半胱氨酸、第263位被取代为精氨酸、第270位被取代为异亮氨酸、第278位被取代为甘氨酸、丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、第307位被取代为缬氨酸、以及第310位被取代为苏氨酸。

[6]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽，其是以下(G)～(I)中任一项所示的多肽：

(G)由序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组(1)～(35)中的组的氨基酸取代的氨基酸序列构成，所述组(1)～(35)为：

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(2)第17位被取代为谷氨酸、第113位被取代为组氨酸、第230位被取代为脯氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(17)第138位被取代为丙氨酸、第149位被取代为谷氨酰胺、第241位被取代为组氨酸、第263位被取代为谷氨酰胺、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(26)第260位被取代为丙氨酸、第278位被取代为甘氨酸、第307位被取代为缬氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸；

(H)序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组(1)～(35)中的组的氨基酸取代的多肽中，除这些取代的氨基酸部位以外的1个或多个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失，所述组(1)～(35)为：

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸；

(I)序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组(1)～(35)中的组的氨基酸取代的多肽中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上，所述组(1)～(35)为：

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸。

[7]一种多核苷酸，其编码[1]～[6]中任一项所述的多肽。

[8]一种γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

使[1]～[6]中任一项所述的多肽、或者使[7]所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰二肽。

[9]一种GSSG的制造方法，该方法包括：

使[1]～[6]中任一项所述的多肽、或者使[7]所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

[10]一种GSH的制造方法，该方法包括：

使[1]～[6]中任一项所述的多肽、或者使[7]所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰半胱氨酸。

[11]根据[8]所述的γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

在ATP再生体系共存下进行反应。

[12]根据[11]所述的γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生体系。

[13]根据[9]所述的GSSG的制造方法，该方法包括：

在ATP再生体系共存下进行反应。

[14]根据[13]所述的GSSG的制造方法，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生体系。

[15]根据[10]所述的GSH的制造方法，该方法包括：

在ATP再生体系共存下进行反应。

[16]根据[15]所述的GSH的制造方法，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生体系。

发明的效果

根据本发明的一个方式，可以提供一种热稳定性比野生型谷胱甘肽合成酶有所提高的修饰型谷胱甘肽合成酶及编码该酶的基因、使该酶表达的转化体、和/或将其处理物作为催化剂使用的肽及谷胱甘肽的制造方法。

具体实施方式

(1.多肽)

本发明的一个实施方式的多肽的特征在于，显示以下(a)～(b)、或者(c)～(d)的性质。

(a)进行将甘氨酸与γ-谷氨酰二肽结合的反应，且

(c)生成GSH和/或GSSG，且

在本说明书中，“γ-谷氨酰二肽”是指在谷氨酸的γ位的羧基结合了其它氨基酸的化合物。作为与谷氨酸的γ位结合的氨基酸，可以列举例如：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸等中性氨基酸；天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸；赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸；正缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、羟脯氨酸、α-氨基丁酸及β-氨基丁酸。

本发明的一个实施方式的多肽是进行将甘氨酸与γ-谷氨酰二肽结合的反应、且与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比显示出热稳定性和/或保存稳定性更高的性质的多肽，在以γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSH及GSSG，在以γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSH，在以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSSG。本发明的一个实施方式的多肽是生成GSH及GSSG、且与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比显示出热稳定性和/或保存稳定性更高的性质的多肽，在以γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSH及GSSG，在以γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSH，在以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸在底物时生成GSSG。本发明的一个实施方式的多肽是生成GSH、且与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比显示出热稳定性和/或保存稳定性更高的性质的多肽，在以γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时生成GSH。本发明的一个实施方式的多肽是生成GSSG、且与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比显示出热稳定性和/或保存稳定性更高的性质的多肽，在以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物时，生成GSSG。

[突变的记载方法]

需要说明的是，在本说明书中，氨基酸、肽、蛋白质使用如下所示的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(CBN)所采用的简称来表示。另外，只要没有特别说明，肽及蛋白质的氨基酸残基的序列以从左端至右端、从N末端至C末端的方式表示。另外，为了容易进行参照，应用通常使用的下述命名法。该命名法是表述为“原本的氨基酸；位置；取代的氨基酸”的方法，例如，将位置13的亮氨酸被取代为丝氨酸的情况表示为“L13S”。对于多重突变，利用符号“/”分开进行表示。例如，“S20T/E215D”表示位置20的丝氨酸被取代为苏氨酸、且位置215谷氨酸被取代为天冬氨酸。

[氨基酸的简称]

A＝Ala＝丙氨酸、C＝Cys＝半胱氨酸、

D＝Asp＝天冬氨酸、E＝Glu＝谷氨酸、

F＝Phe＝苯丙氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、

H＝His＝组氨酸、I＝Ile＝异亮氨酸、

K＝Lys＝赖氨酸、L＝Leu＝亮氨酸、

M＝Met＝甲硫氨酸、N＝Asn＝天冬酰胺、

P＝Pro＝脯氨酸、Q＝Gln＝谷氨酰胺、

R＝Arg＝精氨酸、S＝Ser＝丝氨酸、

T＝Thr＝苏氨酸、V＝Val＝缬氨酸、

W＝Trp＝色氨酸、Y＝Tyr＝酪氨酸。

[序列同一性]

多肽、多核苷酸的“序列同一性”是指，将待比对的2个多肽或多核苷酸最优排列，将氨基酸或核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)在两个序列中一致的位置的数量除以比较碱基的总数，然后用该结果乘以100而得到的数值表示。

序列同一性例如可以使用以下的序列分析用工具来计算；GCG WisconsinPackage(威斯康星大学)、the ExPASy World Wide Web分子生物学用服务器(瑞士生物信息学研究所)、BLAST(美国国家生物技术信息中心)、GENETYX(GENETYX公司)。

在本发明的一个实施方式中，导入突变前的野生型谷胱甘肽合成酶(在本说明书中，有时也称为“野生型酶”)是由以序列表的序列号1表示的314个氨基酸残基构成、且具有由以γ-Glu-X(例如，γ-谷氨酰丙氨酸)表示的γ-谷氨酰二肽和甘氨酸生成γ-Glu-X-Gly(例如，γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸)的能力、由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸生成GSH的能力、或由氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸生成GSSG的能力的多肽。

多肽的来源没有限定，优选为属于嗜氢菌科(Hydrogenophilales)的微生物，更优选为属于硫杆菌(Thiobacillus)属的微生物，进一步优选为来自于脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶。

在本发明的一个实施方式中，野生型谷胱甘肽合成酶只要是编码序列表的序列号1的氨基酸的酶即可，没有特别限定，例如，可以由序列表的序列号2所示的多核苷酸编码。该多核苷酸可以按照Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))等记载的通常的基因工程学方法由嗜氢菌科、优选为硫杆菌属、更优选为脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259株获得。另外，如序列表的序列号3所示，也可以通过化学合成而获得编码序列号1的氨基酸序列的多核苷酸，还可以通过化学合成而获得根据宿主进行了密码子最优化的多核苷酸。

即，通过以脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259株的基因组DNA为模板进行PCR，对编码序列号1所示的氨基酸序列的多核苷酸、或序列号2所示的多核苷酸进行扩增，可以制备野生型酶基因，例如，也可以如序列号3的多核苷酸那样对编码序列号1的氨基酸序列的多核苷酸进行化学合成。

本发明的一个实施方式的多肽可以是对序列号1所示的氨基酸序列进行修饰而得到的多肽。

作为对序列号1所示的氨基酸序列进行的修饰，可以列举：取代、添加、插入或缺失，可以仅包含1种修饰(例如，取代)，也可以包含2种以上的修饰(例如，取代和插入)。上述的“多个氨基酸”是指例如63个、优选为47个、更优选为31个、进一步优选为25个、16个、9个、7个、5个、4个、3个或2个氨基酸。

另外，进行修饰后的氨基酸序列与序列号1所示的氨基酸序列的序列同一性为80％以上，优选为85％以上，进一步优选为90％以上，更优选为92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上。

本发明的一个实施方式的多肽可以是如下所述的多肽，其不仅显示出上述(a)～(b)或(c)～(d)的性质、或者显示出以γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSH及GSSG、以γ-谷氨酰半胱氨酸在底物生成GSH、或以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSSG的性质，而且在如以下示例出的那样的序列表的序列号1所示的氨基酸序列中，氨基酸发生了取代、插入、缺失、添加，或者与这样的氨基酸序列具有特定的序列同一性。

对于本发明的一个实施方式的多肽而言，在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中，氨基酸发生取代、插入、缺失、添加的部位没有特别限制，优选为序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自第13、17、20、23、39、70、78、101、113、125、126、136、138、149、152、154、155、197、200、215、226、227、230、239、241、246、249、254、260、262、263、270、278、299、305、307及310位中的1个或多个氨基酸取代的氨基酸序列所构成的多肽。本发明的另一个实施方式的多肽可以是序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的1个或多个氨基酸发生了取代的氨基酸序列中，除上述取代的氨基酸部位以外的1个或多个、例如63个、优选为47个、更优选为31个、进一步优选为25个、16个、9个、7个、5个、4个、3个或2个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失的多肽。本发明的另一个实施方式的多肽可以是序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的1个或多个氨基酸发生了取代的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上、优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上的多肽。

更优选本发明的一个实施方式的多肽是序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了选自以下组的1个或多个氨基酸取代的多肽：第13位被取代为丝氨酸、第17位被取代为谷氨酸、第20位被取代为苏氨酸、第23位被取代为亮氨酸、第39位被取代为苏氨酸、第70位被取代为丝氨酸、第78位被取代为亮氨酸、第101位被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、第113位被取代为组氨酸、第125位被取代为缬氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、第136位被取代为苏氨酸、第138位被取代为丙氨酸、第149位被取代为谷氨酰胺、第152位被取代为谷氨酰胺、第154位被取代为天冬酰胺、第155位被取代为亮氨酸、第197位被取代为谷氨酰胺、第200位被取代为丝氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、第226位被取代为精氨酸、第227位被取代为丝氨酸、第230位被取代为脯氨酸、第239位被取代为丝氨酸、第241位被取代为组氨酸、第246位被取代为精氨酸、第249位被取代为谷氨酸、第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、第262位被取代为半胱氨酸、第263位被取代为精氨酸、第270位被取代为异亮氨酸、第278位被取代为甘氨酸、丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、第307位被取代为缬氨酸及第310位被取代为苏氨酸。本发明的另一个实施方式的多肽可以是在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的1个或多个氨基酸发生了取代的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的1个或多个、例如63个、优选为47个、更优选为31个、进一步优选为25个、16个、9个、7个、5个、4个、3个或2个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失的多肽。本发明的另一个实施方式的多肽可以是在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的1个或多个氨基酸发生了取代的氨基酸序列中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上、优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上的多肽。

进一步优选本发明的一个实施方式的多肽是序列表的序列号1所示的氨基酸序列中发生了以下组(1)～(35)中任意的氨基酸取代的多肽，所述组(1)～(35)为：

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸。本发明的另一个实施方式的多肽可以是在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的氨基酸发生了取代的多肽中，除这些取代的氨基酸部位以外的1个或多个、例如63个、优选为47个、更优选为31个、进一步优选为25个、16个、9个、7个、5个、4个、3个或2个氨基酸发生了取代、添加、插入或缺失的多肽。本发明的另一个实施方式的多肽可以是在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自上述所示位置的氨基酸发生了取代的多肽中，除这些取代的氨基酸部位以外的序列相对于序列表的序列号1所示的氨基酸序列的同一性为80％以上、优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上的多肽。

在本发明的一个实施方式中，酶的热稳定性例如可以通过以下方法进行评价。

[酶的热稳定性的评价方法]

将含有酶的无细胞提取液在任意温度(例如40～90℃)下孵育任意时间(例如0.1分钟～48小时)。用0.01～1.0M的Tris-HCl缓冲液(pH6～9)稀释未进行热处理的无细胞提取液和热处理结束的样品，使用该稀释液按照下述的[谷胱甘肽合成酶活性的评价方法(1)]或[谷胱甘肽合成酶活性的评价方法(2)]中的任一者对酶的活性进行测定，从而利用下式计算出热处理后的残留活性。将该残留活性作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[热处理样品的酶活性]÷[非热处理样品的酶活性]×100。

[谷胱甘肽合成酶活性的评价方法(1)]

使在200mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中含有底物(例如，γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸)1～50mM、ATP二钠盐30mM、甘氨酸30mM、硫酸镁七水合物10mM及本发明的一个实施方式的多肽的反应液在30℃下进行反应，对得到的反应液进行HPLC分析，对产物(例如，GSH、GSSG、γ-谷氨酰半胱氨酰谷胱甘肽)进行定量，由此可以对谷胱甘肽合成酶活性进行评价。谷胱甘肽合成酶活性1U是1分钟催化1μmol的甘氨酸与底物结合的反应的酶量。

(HPLC条件)

色谱柱：Develosil ODS-HG-3(4.6mmφ×250mm、野村化学株式会社制造)；

洗脱液：用蒸馏水1.8L将磷酸二氢钾12.2g、1-庚烷磺酸钠7.2g溶解后，将该溶液调整为pH3.0，追加甲醇100ml进行溶解而得到的液体；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

测定波长：210nm。

[谷胱甘肽合成酶活性的评价方法(2)]

谷胱甘肽合成酶活性的测定也可以使用可以更低价获得的化合物(例如，γ-谷氨酰丙氨酸)作为γ-谷氨酰半胱氨酸或氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的代替底物来实施。更具体而言，使用代替底物来代替上述方法中的γ-谷氨酰半胱氨酸和/或氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。使用了代替底物的活性测定法如下所述。使在200mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中含有底物1～50mM、ATP二钠盐20mM、甘氨酸20mM、硫酸镁七水合物10mM及本发明的多肽的反应液在30℃下反应，对得到的反应液进行HPLC分析，对产物进行定量，由此可以对该酶的活性进行评价。酶活性1U是1分钟催化生产1μmol的产物的酶量。

(HPLC条件)

色谱柱：SUMICHIRAL OA-5000(4.6mmφ×250mm、住化分析中心制造)；

洗脱液：在蒸馏水∶异丙醇＝95∶5的溶液中溶解有2mM的硫酸铜的液体；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

测定波长：254nm。

在本说明书中，“提高了热稳定性”是指，进行了上述评价时的残留活性比序列表的序列号1中记载的谷胱甘肽合成酶高1％以上，优选高5％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。

具体是指，用后述的参考例3或4中记载的方法测定对在60℃或70℃下孵育后的γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸或γ-谷氨酰丙氨酸的残留活性时，在至少任一种方法中，残留活性比野生型酶高1％以上，优选高5％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。

由于酶会因热而变性，因此，通常热稳定性高的酶在缓慢的温度条件下的酶活性的稳定性高。热稳定性是包含氢键、疏水键、离子相互作用、金属键、和/或二硫键的稳定力的函数。这样的稳定效果有助于酶的长期稳定性(Pure&Appl.Chem.,63,10,1527-1540(1991))。即，对于酶而言，存在热稳定性越高、保存稳定性也越高的倾向(换言之，热稳定性与保存稳定性具有相关关系)。因此，本发明的一个实施方式的谷胱甘肽合成酶不仅热稳定性优异，而且保存稳定性也优异。

在本说明书中，“保存稳定性高”是指，例如，对于该酶、含有该酶的溶液、或生产该酶的重组体而言，在4～40℃下长期(例如1小时～2年)静置后进行上述的活性测定时，静置后的活性相对于静置前的活性的比例比野生型酶高1％以上，优选高5％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。

本发明的一个实施方式的谷胱甘肽合成酶可以通过下述的方法探索。

具体而言，可以使用易错(error-prone)PCR法(Leung et al.,Technique 1,11-15(1989))或基于相同原理的试剂盒得到在序列表的序列号3所示的碱基序列(化学合成的野生型酶基因)中导入了1个以上碱基序列的取代、插入、缺失、添加后的DNA片段。例如，通过以野生型酶基因为模板，使用引物1：5’-GGGTTTCATATGAAACTGCTGTTCGTCG-3’(序列表的序列号4)及引物2：5’-CCGGAATTCTTATCATTCCGGACGCG-3’(序列表的序列号5)、和DiversifyPCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司制造)，可以得到在编码野生型酶的基因的全长随机导入了突变、且在起始密码子中添加了NdeI识别位点、并在紧邻终止密码子之后添加了EcoRI识别位点的多种双链DNA(突变型酶基因)。用NdeI及EcoRI消化该扩增片段，并插入质粒pUCN18(利用PCR法将pUC18(Takara Bio公司制造)的第185位的T修饰为A来破坏NdeI位点、并进一步通过将第471-472位的GC修饰为TG而新导入了NdeI位点后得到的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，使用该质粒对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HB101株(以下称为E.coli HB101)进行转化。将转化后的大肠杆菌涂布于含有100μg/mL氨苄西林的LB平板培养基，得到单菌落的大肠杆菌。另外，也可以使用通过上述方法得到的突变型酶基因代替野生型基因，通过相同的操作制作进一步导入了突变的突变酶基因文库。

可以从上述文库中筛选本发明的一个实施方式的修饰型谷胱甘肽合成酶。作为筛选方法，没有特别限定，优选为以下所示的方法。需要说明的是，修饰型酶(或修饰型谷胱甘肽合成酶)是指导入了用于赋予目标性质的突变的突变型酶，在本说明书中是指，从突变酶基因文库中筛选出的比野生型酶的热稳定性和/或保存稳定性更高的谷胱甘肽合成酶。

[提高了热稳定性的酶的基于平板评价的筛选法]

将突变酶基因文库的各重组菌及生产野生型酶的重组菌(例如，参考例3所示的E.coli HB101(pTDGSH2))接种于适当的培养基(例如，含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0))，在37℃下进行24小时的振荡培养。对得到的各培养液进行离心分离，除去上清，用适当的缓冲液(例如，0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5))使其悬浮。对该悬浮液进行破碎处理后，通过离心分离除去沉淀，由此得到无细胞提取液。在适当的温度(优选为40～80℃)下加热包含各酶的无细胞提取液，进行孵育。在进行了0.1分钟～48小时左右的孵育后，分别注入96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，加入ATP二钠盐(优选为30mM)、硫酸镁七水合物(优选为10mM)、含有氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的溶液(优选为15mM)、含有甘氨酸(优选为30mM)的Tris-HCl缓冲液(pH5～9)，在10～50℃下进行3分钟～48小时的孵育。作为对在反应液中生成的谷胱甘肽进行定量的方法，可以举出例如以下的方法。将反应液分别注入新的96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，添加谷胱甘肽还原酶(优选为30U/L以上、Sigma Aldrich公司制造)、含有NADPH(优选为1.2mM)的Tris-HCl缓冲液(pH5～9)，在10～50℃下进行0.1～60分钟的孵育。其中，利用谷胱甘肽合成酶生成的氧化型谷胱甘肽被转化为还原型谷胱甘肽。向其中添加含有5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(以下记载为DTNB)(优选为0.2mg/mL)的Tris-HCl缓冲液(pH5～9)，经时地进行肉眼观察并检测405nm的光吸收。此时，如果反应液中存在还原型谷胱甘肽，则可以检测出405nm的光吸收。将使用热处理后的无细胞提取液进行谷胱甘肽合成反应的样品的吸光度、相对于使用未进行热处理的无细胞提取液进行谷胱甘肽合成反应的对照的吸光度的比率作为活性残留率，筛选了该活性残留率比野生型谷胱甘肽合成酶更高的酶作为提高了热稳定性的酶。从筛选后的酶的培养液中提取质粒，使用BigDye TerminatorCycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Japan公司制造)及Applied Biosystems3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems Japan公司制造)确定修饰型谷胱甘肽合成酶基因的碱基序列，可以确定突变部位。

通过部位特异性突变导入得到的多个修饰型谷胱甘肽合成酶的突变，并将一者的若干个、或两者进行组合，由此可以制备强化了热稳定性的修饰型谷胱甘肽合成酶。这样的修饰型谷胱甘肽合成酶也包含于本发明的一个实施方式的多肽中。

(2.多核苷酸)

在本发明的一个实施方式中，提供一种编码上述本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸。

本发明的一个实施方式的多核苷酸只要编码上述本发明的一个实施方式的多肽即可，没有特别限定。本发明的一个实施方式的多核苷酸可以列举例如：由序列表的序列号2及3所示的编码野生型酶的碱基序列构成的多核苷酸、或者对其进行修饰而得到的多核苷酸。

作为野生型酶基因的修饰方法，可以使用Current Protocols in MolecularBiology(Frederick M.Ausubel,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))等中记载的公知的方法。即，可以通过使野生型酶基因的1个或多个碱基(例如40个、优选为20个、更优选为10个、进一步优选为5个、4个、3个或2个碱基)发生取代、添加、插入或缺失，从而制备修饰了野生型酶的氨基酸序列的多核苷酸。可以列举例如：使用了易错PCR法(Leung et al.,Technique 1,11-15(1989))等PCR的突变导入法、或者利用市售的试剂盒Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司制造)、Transformer Mutagenesis Kit(Clontech公司制造)、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit(Stratagene公司制造)、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)等。

在利用部位特异性突变导入法制备多核苷酸的情况下，作为部位特异性突变导入法，可以列举例如：Olfert Landt等(Gene,96,125-128(1990))、Smith等(GeneticEngineering,3,1,Setlow,J.Plenum Press)、Vlasuk等(Experimental Manipulation ofGene Expression,Inouye,M.Academic Press)、Hos.N.Hunt等(Gene,77,51(1989))的方法、利用QuikChange II Kit(Stratagene公司制造)市售试剂盒等。需要说明的是，在2个部位导入突变时，可以通过将基于上述方法的方法重复2次而得到作为目标的本发明的一个实施方式的多核苷酸。需要说明的是，在多个其它位置被其它氨基酸取代的情况下，也可以通过该方法得到作为目标的本发明的一个实施方式的多核苷酸。

作为编码本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸，例如，优选为具有分别由γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸或γ-谷氨酰丙氨酸与甘氨酸生成还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽或γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸的活性、编码与由序列表的序列号1所示的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶相比热稳定性更高的多肽、且在严格条件下与包含和由序列表的序列号2及3所示的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的多核苷酸。

其中，“在严格条件下与由和序列表的序列号2所示的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸进行杂交的多核苷酸”是指，以由与序列表的序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸作为探针，在严格条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA杂交(Southern hybridization)法等而得到的多核苷酸。

杂交例如可以按照Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))等记载的方法来进行。其中，“在严格条件下进行杂交的多核苷酸”是指，可以举出例如，使用将来自菌落或噬菌斑的多核苷酸固定化而得到的过滤器，在0.7～1.0M氯化钠存在下、于65℃下进行了杂交，然后，可以通过使用0.3倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65℃的条件下对过滤器进行清洗而得到的DNA。更优选为可以通过在65℃下用0.13倍浓度的SSC溶液进行清洗、进一步优选为在65℃下用0.09倍浓度的SSC溶液进行清洗、特别优选为在65℃下用0.07倍、0.06倍、0.04倍、0.03倍、0.02倍浓度的SSC溶液进行清洗而得到的多核苷酸。

如上所示记载了杂交条件，但并不特别限定于这些条件。作为影响到杂交的严格性的要素，认为是温度、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就可以通过适当选择这些要素来实现最优的严格性。

作为可在上述条件下进行杂交的多核苷酸，可以列举与序列号2所示的多核苷酸的序列同一性优选为78％以上、更优选为84％以上、进一步优选为87％以上、特别优选为89％、90％、93％、95％、97％以上的DNA，所编码的多肽只要具有本发明的一个实施方式的多肽的性质，就包含在上述本发明的一个实施方式的多核苷酸中。

关于“严格条件下与由和序列表的序列号3所示的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸进行杂交的多核苷酸”，与上述相同，可以举出在0.7～1.0M的氯化钠存在下，于65℃下进行了杂交之后，使用0.6倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，可以通过在65℃的条件下清洗过滤器而得到的DNA。更优选为可以通过在65℃下用0.25倍浓度的SSC溶液进行清洗、进一步优选为在65℃下用0.15倍浓度的SSC溶液进行清洗、特别优选为在65℃下用0.12倍、0.10倍、0.07倍、0.05倍、0.04倍浓度的SSC溶液进行清洗而得到的多核苷酸。

作为可在上述条件下进行杂交的多核苷酸，可以列举与序列号2所示的多核苷酸的序列同一性优选为78％以上、更优选为84％以上、进一步优选为87％以上、特别优选为89％、90％、93％、95％、97％以上的DNA，所编码的多肽只要具有本发明的一个实施方式的多肽的性质，就包含在上述一个实施方式的多核苷酸中。

(3.转化体)

在本发明的一个实施方式中，提供上述本发明的一个实施方式的多肽，或者使上述本发明的一个实施方式的多核苷酸表达的转化体。

通过将编码本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸插入表达载体，可以制备多肽表达载体。

在本说明书中，“表达载体”是指，包含启动子等序列、以在转化后的细胞内表达基因的方式构建的载体。作为上述所用的表达载体，只要是在适当的宿主生物内能够表达上述本发明的一个实施方式的多核苷酸所编码的多肽即可，没有特别限定。

在本说明书中，“载体”是指，引入基因并使重组DNA扩增、保持、导入的核酸分子。作为这样的载体，可列举例如质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等，另外，也可以使用可与其它宿主株之间进行基因交换的穿梭载体。

本发明的一个实施方式的载体可以包含与本发明的一个实施方式的多核苷酸可操作地连结的控制因子。在本说明书中，“控制因子”是指具有功能性启动子及任意的关联转录要素(例如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)的碱基序列。另外，在本说明书中，“可操作地连结”是指：调节基因表达的启动子、增强子等各种调节元素(包括上述控制因子)和基因以在宿主细胞中可操作的状态被连结。控制因子的类型及种类可以根据本发明的一个实施方式的载体被导入的宿主生物而变化，这是本领域技术人员众所周知的事项。

在本发明的一个实施方式中，例如，在宿主生物为大肠杆菌的情况下，本发明的一个实施方式的载体通常包含lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等控制因子，可以作为包含与本发明的一个实施方式的多核苷酸可操作地连结的表达单元的表达载体而优选使用。作为这样的载体，可以列举例如：pUCN18(参照参考例1)、pSTV28(Takara Bio公司制造)、pUCNT(国际公开第94/03613号公报)等。

关于可以在各种宿主生物中利用的载体、启动子等，详细地记述于微生物学基础讲座(8、安藤忠彦、共立出版、(1987))等。

本发明的一个实施方式的载体可以进一步包含编码具有ATP再生能力的多肽的多核苷酸。作为具有ATP再生能力的多肽，可以列举例如：聚磷酸激酶(以下，有时也称为“PPK”)、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、乙酸激酶、磷酸肌酸激酶。

通过利用本发明的一个实施方式的载体对宿主细胞进行转化，可以得到本发明的一个实施方式的转化体。作为本发明的一个实施方式的转化体，也包括将编码本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸导入染色体中而得到的转化体。

作为通过导入本发明的一个实施方式的载体而转化的宿主细胞，只要是利用包含编码本发明的一个实施方式的各多肽的多核苷酸的多肽表达载体进行转化、且可以表达导入的多核苷酸所编码的多肽的细胞即可，没有特别限制。作为可作为宿主细胞利用的微生物，可列举例如：埃希杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属及乳酸杆菌(Lactobacillus)属等开发了宿主载体系统的细菌；红球菌(Rhodococcus)属及链霉菌(Streptomyces)属等开发了宿主载体系统的放线菌；酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、子囊菌酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属及念珠菌(Candida)属等开发了宿主载体系统的酵母；链孢霉菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、及木霉(Trichoderma)属等开发了宿主载体系统的霉菌等。另外，除微生物以外，在植物、动物中开发了各种各样的宿主载体系统，特别开发了在使用了蚕的昆虫(Nature，315，592-594(1985))或菜籽、玉米、马铃薯等植物中使异种蛋白质大量表达的体系，可以优选利用。其中，从导入及表达效率的观点考虑，优选为细菌，特别优选为大肠杆菌。

本发明的一个实施方式的载体可以通过公知的方法导入宿主细胞。例如，在使用在上述的表达载体pUCN18中导入了编码修饰型谷胱甘肽合成酶的多核苷酸而得到的本发明的一个实施方式的质粒(实施例1～2、7～8、12～18所示的pNKPm01～35)作为多肽表达载体、且使用大肠杆菌作为宿主微生物的情况下，可以通过使用市售的E.coli HB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)等按照其实验方案进行操作，得到将该载体导入宿主细胞而成的转化体(例如实施例18所示的E.coli HB101(pTDGSH2m35))。

另外，也可以制备使本发明的一个实施方式的多肽及上述的具有ATP再生能力的多肽这两种多肽在同一菌体内表达的转化体。即，可以通过将编码本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸及编码具有ATP再生能力的多肽的多核苷酸引入同一载体、并将其导入宿主细胞而得到。另外，也可以通过将这2种DNA分别引入不亲和性组不同的2种载体、并将它们导入同一宿主细胞而得到。

作为如此得到的转化体，可以列举例如：将编码本发明的一个实施方式的修饰型谷胱甘肽合成酶的核苷酸导入上述的表达载体pUCN18而得到的重组载体(例如，实施例2所示的pTDGSH2m15)、和包含编码作为具有ATP再生能力的多肽、即聚磷酸激酶的多核苷酸的载体导入E.coli HB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)而成的转化体等，但不限定于此。

(4.制造方法)

在本发明的一个实施方式中，提供一种γ-Glu-X-Gly(X表示氨基酸)的制造方法，该方法包括：使上述本发明的一个实施方式的多肽、或上述表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰二肽。

通过使本发明的一个实施方式的多肽、或表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰二肽、更优选作用于γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸或γ-谷氨酰丙氨酸，可以分别制造进一步添加了1分子氨基酸的γ-Glu-X-Gly(X表示氨基酸)、更优选为进一步添加了1分子氨基酸的还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽或γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸。

作为本发明的一个实施方式的多肽、或表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物的底物的肽没有特别限制，在对γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸添加甘氨酸的反应的情况下，其产物为有用的谷胱甘肽，因此是非常有益的反应。

在使用本发明的一个实施方式的多肽、或表达本发明的一个实施方式的多肽的转化体和/或其处理物、以上述肽为底物进行肽伸长反应时，可以如下所述实施。但并不限定于以下的方法。

具体而言，加入适当的溶剂(例如，50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)等)、作为底物的肽(例如，γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸、γ-谷氨酰丙氨酸)，添加硫酸镁、ATP等辅酶、及本发明的一个实施方式的转化体的培养物和/或其处理物等，调整pH进行搅拌，使其反应。此时，可以添加与表达本发明的一个实施方式的多肽的转化体不同的、表达上述具有ATP再生能力的多肽的转化体及其培养物、和/或其处理物等。

在本说明书中，“转化体的处理物”是指，例如，无细胞提取液、粗提取液、培养菌体、冷冻干燥生物体、丙酮干燥生物体、菌体破碎物、或者它们的混合物或固定化物等，其残留有本发明的一个实施方式的多肽的酶催化活性。本发明的一个实施方式的多肽本身、表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体的固定化物等也包含于上述“转化体的处理物”的范围。

本发明的一个实施方式的多肽、或表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物与底物的反应在5～80℃、优选在10～70℃、更优选在20～70℃的温度下进行。反应中的反应液的pH保持为3～10、优选保持为4～10、更优选保持为5～9。反应可以以分批方式或连续方式进行。在分批方式的情况下，反应底物可以以0.01～100％(w/v)、优选为0.1～70％、更优选为0.5～50％的加料浓度添加。另外，也可以在反应过程中追加新的底物。

另外，本发明的一个实施方式的多肽、或表达本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物与底物的反应中可以使用水性溶剂，也可以混合使用水性溶剂和有机系溶剂。作为有机系溶剂，可以列举例如：二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-丙醇、乙酸乙酯、甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、己烷、乙腈、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、二甲氧基丙烷、甲基叔丁基醚、二乙基醚、二异丙基醚、二烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、二甘醇二甲醚、乙二醇、二甲氧基乙烷、四氯化碳、二氯甲烷、乙基溶纤剂、乙酸溶纤剂、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、六甲基磷酸三酰胺等。

另外，在进行本发明的一个实施方式的多肽、或编码本发明的一个实施方式的多核苷酸的转化体和/或其处理物与底物的反应时，如果使用生产本发明的一个实施方式的多肽及具有ATP再生能力的多肽这两者的转化体、或者另行添加生产具有ATP再生能力的多肽的转化体使用，则可以大幅减少辅酶ATP的用量。对于具有ATP再生能力的多肽，在以下详细说明。

在使用具有本发明的一个实施方式的多肽的生产能力的转化体进行γ-Glu-X-Gly、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽合成反应的情况下，需要ATP作为辅酶。如上所述，也可以通过在反应体系中添加必要量的ATP来实施。但是，通过将具有将脱磷酸化的该辅酶(ADP、AMP)转变为ATP的能力(以下，称为“ATP再生能力”)的酶与其底物一起使用，即将ATP再生体系与本发明的一个实施方式的多肽组合进行上述反应，可以大幅减少昂贵的ATP的用量。作为具有ATP再生能力的酶，可以使用聚磷酸激酶、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、乙酸激酶、磷酸肌酸激酶等，这些酶可以单独使用，也可以将它们中的多种组合。优选使用聚磷酸激酶、腺苷酸激酶。

使用ATP再生体系的上述反应可以通过将ATP再生体系添加至γ-Glu-X-Gly、还原型谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽合成反应体系内来进行。但是，在使用由编码本发明的一个实施方式的多肽的多核苷酸及编码具有ATP再生能力的多肽的多核苷酸这两者转化得到的转化体作为催化剂的情况下，即使不另行制备具有ATP再生能力的酶并添加于反应体系内，也能够高效地进行反应。这样的转化体可以通过上述的方法得到。

从合成反应后的反应液收集产物的方法没有特别限定，通过从反应液中直接纯化，或者从反应液中分离菌体等后用甲醇等溶剂提取、脱水后利用蒸馏、重结晶、硅胶柱色谱、合成吸附剂的柱色谱等进行纯化，可以容易地得到产物。

实施例

以下，通过实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不受这些例子的限定。需要说明的是，以下的实施例中使用的重组DNA技术相关的详细操作方法等记载于以下的文献：

Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))、Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.Ausubel,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))。

(参考例1)重组载体pTDGSH2的构建

通过Eurofin Genomics公司化学合成了在基因序列(序列号2)的5’端添加NdeI位点、在3’端添加EcoRI位点的序列，所述基因序列(序列号2)是将编码来自于ThiobacillusdenifitricansATCC25259的谷胱甘肽合成酶(NCBI Reference Sequence：WP＿011312921)的基因进行了与大肠杆菌宿主对应的密码子最优化而成的。用NdeI及EcoRI消化该基因，并插入质粒pUCN18(利用PCR法将pUC18(Takara Bio公司制造)的第185位的T修饰为A来破坏NdeI位点、并进一步通过将第471-472位的GC修饰为TG而新导入NdeI位点所得到的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pTDGSH2。

(参考例2)表达多肽的重组生物的制备

使用参考例1中构建的重组载体pTDGSH2对E.coli HB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pTDGSH2)。另外，使用pUCN18对E.coliHB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pUCN18)。

(参考例3)重组生物中的DNA的表达

将参考例2中得到的2种重组生物(E.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pTDGSH2))接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml，在37℃下振荡培养24小时。对于上述培养中得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于1ml的200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。测定了这些无细胞提取液的谷胱甘肽合成酶活性。对于谷胱甘肽合成酶活性而言，在200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中添加氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸15mM、甘氨酸30mM、ATP30mM、硫酸镁10mM及无细胞提取液，在30℃下进行10分钟的反应，利用HPLC分析对生成的氧化型谷胱甘肽进行了定量。在该反应条件下，将1分钟生成1μmol氧化型谷胱甘肽的酶活性定义为2U。以下示出各重组生物的谷胱甘肽合成酶活性。

对于E.coliHB101(pUCN18)，谷胱甘肽合成酶活性为0.1mU/mg以下。另一方面，表达TDGSH2的E.coli HB101(pTDGSH2)的谷胱甘肽合成活性为700mU/mg。如上所述，参考例2中得到的重组生物具有谷胱甘肽合成活性，可以确认到TDGSH2的生产。

(参考例4)使用了代替底物的酶活性测定

将参考例2中得到的2种重组生物(E.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pTDGSH2))接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml，在37℃下振荡培养24小时。对于上述培养中得到的各培养液，利用离心分离收集菌体，悬浮于1ml的200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，利用离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。对这些无细胞提取液的γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成酶活性进行测定。对于γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成酶活性而言，在200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中添加γ-谷氨酰丙氨酸20mM、甘氨酸20mM、ATP 20mM、硫酸镁10mM及用200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)进行了20倍稀释的无细胞提取液，在30℃下进行10分钟的反应，通过HPLC分析对生成的γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸进行了定量。在该反应条件下，将1分钟生成1μmol的γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸的酶活性定义为1U。以下示出各重组生物的γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成酶活性。

对于E.coli HB101(pUCN18)，γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成酶活性为0.1U/mg以下。另一方面，表达TDGSH2的E.coli HB101(pTDGSH2)的γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性为6U/mg。如上所述，可以确认野生型的谷胱甘肽合成酶也具有γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性。

(参考例5)野生型酶的热稳定性

通过与参考例3相同的方法得到了野生型酶的无细胞提取液。将该无细胞提取液在60℃下孵育10分钟或30分钟、在70℃下孵育10分钟或15分钟。在孵育后，对各无细胞提取液进行了稀释。未加热的无细胞提取液也同样地进行了稀释。用与参考例3相同的方法测定了这些无细胞提取液的谷胱甘肽合成活性。通过下式计算出加热后的残留活性，将该值作为热稳定性的指标。将结果示于表1。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

[表1]

野生型酶在这些条件下加热时，发生失活，无法检测出活性。

(实施例1)突变酶基因文库的制作1

将参考例1中制备的包含来自于T.denitrificans的谷胱甘肽合成酶基因的质粒pTDGSH2作为模板，使用引物1：5’-GGGTTTCATATGAAACTGCTGTTCGTCG-3’(序列表的序列号4)及引物2：5’-CCGGAATTCTTATCATTCCGGACGCG-3’(序列表的序列号5)，通过易错PCR法(Leunget al.Technique1,11-15(1989))得到了在RKP基因全长导入了随机突变的DNA扩增片段。用限制酶NdeI及EcoRI消化了该扩增片段后，引入用该酶处理过的高表达载体pUCN18，制作了多个突变酶表达质粒。使用该质粒对E.coli HB101进行转化，涂布于含有100μg/mL氨苄西林的LB平板培养基。生长的菌落为具有突变导入的谷胱甘肽合成酶基因的重组大肠杆菌，将该重组菌群作为突变酶基因文库1。

(实施例2)修饰型谷胱甘肽合成酶的筛选1

利用突变酶基因文库1筛选了热稳定性比野生型谷胱甘肽合成酶有所提高的修饰型谷胱甘肽合成酶。用与参考例3相同的方法分别对实施例1中制备的突变酶基因文库1的各重组菌及参考例2中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行培养。将得到的各培养液离心分离，去除上清，例如用0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5))悬浮。对该悬浮液进行破碎处理后，通过利用离心分离去除沉淀，得到了无细胞提取液。将各含有酶的无细胞提取液在60℃下加热。在30分钟加热后分别注入96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，加入含有ATP二钠盐30mM、硫酸镁七水合物10mM、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸15mM、甘氨酸30mM的0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5)，在30℃下进行了3小时的孵育。将反应液分别注入新的96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，添加含有谷胱甘肽还原酶(30单位/L、Sigma Aldrich公司制造)、NADPH1.2mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在室温下进行了2分钟孵育。其中，通过谷胱甘肽合成酶生成的氧化型谷胱甘肽被转变为还原型谷胱甘肽。向其中添加含有DTNB0.2mg/mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，经时地检测405nm的吸光度。在对无细胞提取液进行热处理后进行了谷胱甘肽合成反应的样品的吸光度、相对于未对无细胞提取液进行热处理而进行了谷胱甘肽合成反应的对照的吸光度的比率作为活性残留率，筛选该活性残留率比野生型谷胱甘肽合成酶的活性残留率更高的酶作为提高了热稳定性的酶。从筛选后的酶的培养液中提取质粒，使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems Japan公司制造)及Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer(AppliedBiosystems Japan公司制造)确定修饰型谷胱甘肽合成酶基因的碱基序列，确定了突变部位。将得到的提高了热稳定性的修饰型谷胱甘肽合成酶的突变部位示于表2。

[表2]

得到了表2所示的17种提高了热稳定性的酶。

(实施例3)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价1

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例2中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例2中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行了培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。对于这些无细胞提取液，通过与参考例3及4相同的方法确认了具有谷胱甘肽合成活性及γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性这两者。在将野生型酶的谷胱甘肽合成活性设为100时，将修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表3。

[表3]

(实施例4)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价2

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例2中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行了培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在60℃下将无细胞提取液加热了10分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过60℃、10分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表4。

[表4]

表4所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。

(实施例5)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价3

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例2中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行了培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在60℃下将无细胞提取液加热了30分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过60℃、30分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表5。

[表5]

表5所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。

(实施例6)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价4

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例2中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行了培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在70℃下将无细胞提取液加热了15分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过70℃、15分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表6。

[表6]

表6所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。

(实施例7)突变酶基因文库的制作2

将实施例2中得到的质粒pTDGSH2m15(参照表2)作为模板，使用引物1：5’-GGGTTTCATATGAAACTGCTGTTCGTCG-3’(序列表的序列号4)及引物2：5’-CCGGAATTCTTATCATTCCGGACGCG-3’(序列表的序列号5)，利用易错PCR法(Leung etal.Technique 1,11-15(1989))得到了在谷胱甘肽合成酶基因全长导入了随机突变的DNA扩增片段。用限制酶NdeI及EcoRI消化该扩增片段，然后引入用该酶处理过的高表达载体pUCN18，制备了多个突变酶表达质粒。使用该质粒对E.coli HB101进行转化，涂布于含有100μg/mL氨苄西林的LB平板培养基。生长的菌落是具有突变导入的谷胱甘肽合成酶基因的重组大肠杆菌，将该重组菌群作为突变酶基因文库2。

(实施例8)修饰型谷胱甘肽合成酶的筛选2

从突变酶基因文库2中筛选了热稳定性比野生型谷胱甘肽合成酶有所提高的修饰型谷胱甘肽合成酶。分别用与参考例3相同的方法对实施例7中制备的突变酶基因文库2的各重组菌及参考例2中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)、实施例2中得到的E.coliHB101(pTDGSH2m15)进行培养。对得到的各培养液进行离心分离，去除上清，例如用0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5))使其悬浮。对该悬浮液进行破碎处理后，通过离心分离去除沉淀，从而得到了无细胞提取液。在60℃下对包含各酶的无细胞提取液进行加热。在加热40分钟后，分别注入96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，加入含有ATP二钠盐30mM、硫酸镁七水合物10mM、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸15mM、甘氨酸30mM的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，在30℃下进行3小时的孵育。将反应液分别注入新的96孔板(AGC TECHNO GLASS公司制造)，添加含有谷胱甘肽还原酶(30单位/L、Sigma Aldrich公司制造)、NADPH1.2mM)的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，在室温下进行了2分钟的孵育。其中，通过谷胱甘肽合成酶生成的氧化型谷胱甘肽被转变为还原型谷胱甘肽。向其中添加含有DTNB 0.2mg/mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，经时地检测405nm的吸光度。将在对无细胞提取液进行热处理后进行了谷胱甘肽合成反应的样品的吸光度、相对于未对无细胞提取液进行热处理而进行了谷胱甘肽合成反应的对照吸光度的比率作为活性残留率，将该活性残留率比野生型谷胱甘肽合成酶及通过E.coli HB101(pTDGSH2m15)生产的修饰型酶的活性残留率更高的酶筛选为提高了热稳定性的酶。从筛选后的酶的培养液中提取质粒，使用Big Dye Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems Japan公司制造)及Applied Biosystems 3130xlGenetic Analyzer(Applied Biosystems Japan公司制造)确定修饰型谷胱甘肽合成酶基因的碱基序列，确定了突变部位。将得到的提高了热稳定性的修饰型谷胱甘肽合成酶中的突变部位示于表7。

[表7]

得到了表7所示的11种热稳定性提高的酶。

(实施例9)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价5

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例8中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例2中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。对于这些无细胞提取液，通过与参考例3及4相同的方法确认了具有谷胱甘肽合成活性及γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性这两者。在将野生型酶的谷胱甘肽合成活性设为100时，将修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表8。

[表8]

(实施例10)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价6

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例8中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在60℃下将无细胞提取液加热10分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过60℃、10分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表9。

[表9]

表9所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。

(实施例11)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价7

分别用与参考例3及4相同的方法对实施例8中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)、实施例2中得到的E.coliHB101(pTDGSH2m15)进行培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在70℃下将无细胞提取液加热10分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过70℃、10分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的残留活性示于表10。

[表10]

表10所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。另外也显示，通过对V260A突变施加其它突变，热稳定性进一步提高。

(实施例12)在260位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备1

将参考例3中制备的质粒pTDGSH2作为模板，示于引物3：5’-ACGATTGCCCCTTGGTGTCGCAGCCAGGGCATT-3’(序列表的序列号6)、引物4：5’-AATGCCCTGGCTGCGACACCAAGGGGCAATCGT-3’(序列表的序列号7)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有V260C的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化得到的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶V260C的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m29)。

(实施例13)在260位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备2

将参考例3中制备的质粒pTDGSH2作为模板，使用引物5：5’-ACGATTGCCCCTTGGGGTCGCAGCCAGGGCATT-3’(序列表的序列号8)、引物6：5’-AATGCCCTGGCTGCGACCCCAAGGGGCAATCGT-3’(序列表的序列号9)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有V260G的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化后的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶V260G的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m30)。

(实施例14)在260位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备3

以参考例3中制备的质粒pTDGSH2为模板，使用引物7：5’-ACGATTGCCCCTTGGCAGCGCAGCCAGGGCATT-3’(序列表的序列号10)、引物8：5’-AATGCCCTGGCTGCGCTGCCAAGGGGCAATCGT-3’(序列表的序列号11)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有V260Q的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶V260Q的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m31)。

(实施例15)在260位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备4

以参考例3中制备的质粒pTDGSH2为模板，使用引物9：5’-ACGATTGCCCCTTGGACACGCAGCCAGGGCATT-3’(序列表的序列号12)、引物10：5’-AATGCCCTGGCTGCGTGTCCAAGGGGCAATCGT-3’(序列表的序列号13)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有V260T的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化得到的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了成产修饰型谷胱甘肽合成酶V260T的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m32)。

(实施例16)在101位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备1

以参考例3中制备的质粒pTDGSH2为模板，使用引物11：5’-GCGACGCACCTGTTAAACGTAGCCGAAACCAAC-3’(序列表的序列号14)、引物12：5’-GTTGGTTTCGGCTACCTTTAACAGGTGCGTCGC-3’(序列表的序列号15)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有G101N的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶G101N的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m33)。

(实施例17)在101位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备2

以参考例3中制备的质粒pTDGSH2为模板，使用引物13：5’-GCGACGCACCTGTTACAGGTAGCCGAAACCAAC-3’(序列表的序列号16)、引物14：5’-GTTGGTTTCGGCTACCTGTAACAGGTGCGTCGC-3’(序列表的序列号17)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有G101Q的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶G101Q的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m34)。

(实施例18)在101位进行了取代的修饰型谷胱甘肽合成酶的制备3

以参考例3中制备的质粒pTDGSH2为模板，使用引物15：5’-GCGACGCACCTGTTAACCGTAGCCGAAACCAAC-3’(序列表的序列号18)、引物16：5’-GTTGGTTTCGGCTACGGTTAACAGGTGCGTCGC-3’(序列表的序列号19)进行PCR，对序列号1所示的氨基酸序列中具有G101T的氨基酸取代的质粒全长进行扩增。使用将该PCR反应液100μL用DpnI消化的产物对E.coli(HB101)感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了生产修饰型谷胱甘肽合成酶G101T的重组生物E.coli HB101(pTDGSH2m35)。

(实施例19)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价8

分别通过与参考例3及4相同的方法对实施例12～18中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例2中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。对于这些无细胞提取液，通过与参考例3及4相同的方法确认了具有谷胱甘肽合成活性及γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性这两者。将野生型酶的谷胱甘肽合成活性设为100时，将修饰型谷胱甘肽合成酶的相对活性示于表11。

[表11]

(实施例20)修饰型谷胱甘肽合成酶的评价9

分别通过与参考例3及4相同的方法对实施例12～18中得到的修饰型谷胱甘肽合成酶的各重组菌及参考例3中制备的E.coli HB101(pTDGSH2)(对照)进行培养。对于得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于与培养液等量的0.2MTris-HCl缓冲液(pH8.5)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。在60℃下将无细胞提取液加热10分钟。对加热后的无细胞提取液及非加热的无细胞提取液进行稀释，按照参考例4所示的方法对γ-谷氨酰丙氨酰甘氨酸合成活性进行了测定。通过下式计算出加热后的残留活性，以该值作为热稳定性的指标。

残留活性(％)＝[加热后的酶活性]÷[加热前的酶活性]×100

将通过60℃、10分钟的加热进行了评价的野生型酶及修饰型谷胱甘肽合成酶的残留活性示于表12。

[表12]

表12所示的修饰型谷胱甘肽合成酶与野生型酶的热稳定性相比有所提高。

(参考例6)修饰型谷胱甘肽合成酶的制备

将实施例2中得到的E.coli HB101(pTDGSH2m15)接种于含有200μg/ml氨苄西林的2YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％)、NaCl0.5％、pH7.0)50ml，在37℃下振荡培养24小时。对酶活性进行测定时，按照(参考例4)中记载的方法为4U/ml。另外，按照国际公开第2016/002884号公报中记载的方法对来自于作为宿主细胞使用的E.coli HB101的腺苷酸激酶(ADK)活性进行测定时，为90U/ml。接着，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于2.5ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，进行超声波破碎，制成酶液。

(实施例21)利用修饰型谷胱甘肽合成酶进行的谷胱甘肽的制造1

按照国际公开第2016/002884号公报的＜实施例1＞中记载的方法合成了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。在该反应中，在22小时后的反应液中添加甘氨酸0.19g(2.53mmol)、参考例6中制备的修饰型谷胱甘肽合成酶(V260A)2g、通过与国际公开第2016/002884号公报的实验4相同的方法制备的PAP酶液2g，开始进行反应。此时，用15质量％的氢氧化钠水溶液0.7g将pH调整为7.5。在反应1小时后对反应液进行了分析，结果可以确认到氧化型谷胱甘肽的生成。收率以相对于初始L-胱氨酸计，在2.5小时反应后为6mol％，在14小时反应后为43mol％。

(参考例7)聚磷酸激酶用表达载体的构建

基于国际公开第2006/080313号公报中记载的信息，通过Eurofin Genomics公司化学合成了将来自于Pseudomonas aeruginosa的聚磷酸激酶(NCBI Reference Sequence：WP＿023109529)的N末端侧82氨基酸切断、且对将编码使第83位的天冬酰胺取代为作为起始密码子的甲硫氨酸的多肽的基因进行了与大肠杆菌宿主对应的密码子最优化而成的基因序列(序列号20)在5’端添加了NdeI位点、在3’端添加了EcoRI位点的序列。用NdeI及EcoRI消化该基因，并插入于质粒pUCN18(通过利用PCR法将pUC18(Takara Bio公司制造)的第185位的T修饰为A来破坏NdeI位点、并进一步通过将第471-472位的GC修饰为TG而新导入了NdeI位点的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pPPK。

(参考例8)表达聚磷酸激酶的重组生物的制备

使用参考例7中构建的重组载体pPPK对E.coli HB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pPPK)。另外，使用pUCN18对E.coliHB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pUCN18)。

(参考例9)重组生物中的聚磷酸激酶基因的表达

将参考例8中得到的2种重组生物(E.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pPPK))接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml，在37℃下振荡培养24小时。对于上述培养中得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于1ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。测定了这些无细胞提取液的聚磷酸激酶活性。对于聚磷酸激酶活性而言，在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加偏磷酸钠(和光纯药株式会社制造)5mM、ADP二钠盐(Oriental Yeast公司)10mM、硫酸镁(和光纯药株式会社制造)70mM及无细胞提取液，在30℃下进行5分钟的反应，通过HPLC分析对生成的ATP进行了定量。在该反应条件下，将1分钟生成1μmol的ATP的酶活性定义为1U。以下示出各重组生物的无细胞提取液的ATP生成活性。对于E.coli HB101(pUCN18)，ATP生成活性为0.1mU/mg以下。另一方面，表达聚磷酸激酶的E.coli HB101(pPPK)的ATP生成活性为160U/mg。如上所述，可以确认参考例8中得到的重组生物具有ATP生成活性，生产聚磷酸激酶。

(参考例10)聚磷酸激酶的制备

将参考例8中得到的E.coli HB101(pPPK)接种于含有200μg/ml氨苄西林的2YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％)、NaCl0.5％、pH7.0)50ml，在37℃下振荡培养24小时。对酶活性进行测定时，按照(参考例9)中记载的方法为110U/mL。接着，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于2.5ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，进行超声波破碎，制成酶液。

(实施例22)利用修饰型谷胱甘肽合成酶进行的谷胱甘肽的制造2

按照国际公开第2016/002884号公报的＜实施例1＞中记载的方法合成了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。在该反应中，在22小时后的反应液中添加甘氨酸0.19g(2.53mmol)、参考例6中制备的修饰型谷胱甘肽合成酶(V260A)2g、参考例9中制备的聚磷酸激酶酶液2g，开始进行反应。此时，用15质量％的氢氧化钠水溶液1.1g将pH调整为7.5。在反应1小时后对反应液进行了分析，结果可以确认到氧化型谷胱甘肽的生成。收率以相对于初始L-胱氨酸计，在2小时反应后为33mol％，在8小时反应后为64mol％。

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 修饰型酶及其利用

<130> B160880

<150> JP 2016-214073

<151> 2016-11-01

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)

<400> 1

Met Lys Leu Leu Phe Val Val Asp Pro Leu Ala Ser Leu Lys Pro Tyr

1 5 10 15

Lys Asp Ser Ser Val Ala Met Met Arg Ala Ala Cys Ala Arg Gly His

20 25 30

Ala Val Phe Ala Ala Glu Ala Arg Ala Leu Leu Val Arg Asp Gly Val

35 40 45

Ala Arg Ser Arg Ala Asp Ala Val Glu Thr Arg Gly Asp Asp Asp Trp

50 55 60

Tyr Arg Val Thr Glu Thr Arg Glu Phe Ala Leu Thr Asp Phe Asp Ala

65 70 75 80

Val Val Met Arg Ala Asp Pro Pro Val Asp Val Asp Tyr Leu Leu Ala

85 90 95

Thr His Leu Leu Gly Val Ala Glu Thr Asn Gly Ala Arg Val Leu Asn

100 105 110

Arg Pro Arg Ala Leu Arg Asp Phe Asn Glu Lys Leu Ala Ile Leu Glu

115 120 125

Phe Pro Gln Phe Val Ala Pro Thr Leu Val Ser Ala Asp Ala Thr Glu

130 135 140

Ile Ala His Phe Leu Ala Ala His Ala Asp Ile Ile Val Lys Pro Leu

145 150 155 160

Thr Glu Met Gly Gly Ser Gly Val Phe Arg Leu Gly Val Ser Asp Pro

165 170 175

Asn Arg Asn Ala Ile Leu Glu Thr Leu Thr Arg Arg Gly Ser Arg Pro

180 185 190

Ile Met Ala Gln Arg Tyr Leu Pro Ala Ile Ser Glu Gly Asp Lys Arg

195 200 205

Ile Leu Leu Ile Asp Gly Glu Val Val Pro Trp Ala Leu Ala Arg Ile

210 215 220

Pro Leu Thr Gly Glu Thr Arg Gly Asn Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala

225 230 235 240

Arg Ala Gln Pro Leu Ser Glu Arg Asp Arg Glu Ile Ala Glu Thr Ile

245 250 255

Ala Pro Trp Val Arg Ser Gln Gly Ile Phe Leu Ala Gly Leu Asp Val

260 265 270

Ile Gly Asp Cys Leu Thr Glu Ile Asn Val Thr Ser Pro Thr Gly Phe

275 280 285

Gln Glu Ile Thr Ala Gln Ser Gly His Asp Val Ala Asp Gln Phe Ile

290 295 300

Ala Ala Ile Glu Arg Ala Thr Arg Pro Glu

305 310

<210> 2

<211> 945

<212> DNA

<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)

<400> 2

atgaagctgc tgttcgtcgt cgatccgctg gcgagcctca agccgtacaa ggacagttcg 60

gtcgcgatga tgcgcgcggc ctgtgcgcgc ggccacgccg tgttcgcggc cgaagcacgc 120

gcgctgctgg tgcgcgacgg agtcgcgcgg tcgcgcgccg acgccgtcga gacgcgcggc 180

gacgacgatt ggtatcgcgt gaccgaaacg cgcgaattcg cgctcacgga tttcgatgcc 240

gttgtgatgc gcgccgaccc gccggtcgac gtcgactacc tgctcgcgac ccacctgctc 300

ggcgtcgccg agaccaacgg cgcgcgcgtg ctgaaccggc cgcgcgcgct gcgcgacttc 360

aacgaaaaac tcgccatcct cgagtttccg caatttgtcg ccccgacgct ggtttcggcc 420

gacgcgacag aaatcgccca cttcctcgcc gcccacgccg acatcatcgt caagccgctc 480

accgagatgg gcggcagcgg cgtcttccgc ctcggcgttt ccgacccgaa ccgcaacgcc 540

atcctcgaaa cgctcacccg acgcggcagc cggccgatca tggcgcagcg ttatctgccg 600

gcgatcagcg aaggcgacaa gcgcatcctg ctgatcgacg gcgaggtggt gccgtgggcc 660

ctcgcgcgga ttccgctgac gggcgagacg cgcggcaatc tcgccgcggg cggcacggcg 720

cgtgcccagc cgctttcgga acgcgaccgc gagatcgccg agacgatcgc gccctgggtg 780

cgctcgcaag gcatcttcct cgccggcctc gacgtgatcg gcgactgcct caccgaaatc 840

aacgtcacga gcccgaccgg ctttcaggaa atcacggcgc agagcggcca cgacgtcgcg 900

gaccagttca tcgccgcgat cgagcgtgcc acgcgtccgg aataa 945

<210> 3

<211> 948

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)的谷胱甘肽合成酶的优化序列

<400> 3

atgaaactgc tgttcgtcgt tgatcccctg gccagcttga aaccgtacaa ggatagctcc 60

gttgccatga tgcgcgcagc gtgtgctcgt ggtcatgccg tgttcgcagc agaagcgcgc 120

gcactgctgg ttcgtgatgg ggtggctcgt tctcgtgcag atgctgtcga aacgcgtggc 180

gacgatgact ggtatcgcgt taccgaaacg cgtgaatttg ccttaaccga ctttgatgca 240

gtggtgatgc gcgcagatcc gcccgttgac gtggattacc ttctcgcgac gcacctgtta 300

ggcgtagccg aaaccaacgg tgcacgtgtc ctgaatcgcc cgcgtgcctt gcgcgatttc 360

aacgagaaac tggccattct ggaatttccg cagtttgtcg cacctaccct ggtaagtgcg 420

gacgcaaccg aaattgccca ctttctggct gctcatgcgg atatcatcgt caaaccgctg 480

actgagatgg gtggctccgg tgtgtttcgc ctgggagtta gcgatccgaa tcggaacgcg 540

attctggaga cattaacccg tcgtggctct cgcccaatca tggctcagcg gtatttgcca 600

gcgatctcag agggcgacaa acgcatcctg ctgatcgacg gcgaagtagt gccatgggcc 660

ttggcgcgca ttccgctgac cggtgaaact cgcgggaatc ttgcggctgg tggtacagcg 720

cgcgcgcaac cgctcagtga acgggatcgc gaaatcgccg aaacgattgc cccttgggta 780

cgcagccagg gcattttcct tgcgggctta gacgtgattg gggattgcct caccgagatt 840

aacgtgacat cgcctactgg atttcaggag attaccgccc aatcgggcca tgatgttgcg 900

gaccagttca ttgcggcgat cgaacgcgcg acgcgtccgg aatgataa 948

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 易错(error-prone)PCR的引物

<400> 4

gggtttcata tgaaactgct gttcgtcg 28

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 易错(error-prone)PCR的引物

<400> 5

ccggaattct tatcattccg gacgcg 26

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 6

acgattgccc cttggtgtcg cagccagggc att 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 7

aatgccctgg ctgcgacacc aaggggcaat cgt 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 8

acgattgccc cttggggtcg cagccagggc att 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 9

aatgccctgg ctgcgacccc aaggggcaat cgt 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 10

acgattgccc cttggcagcg cagccagggc att 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 11

aatgccctgg ctgcgctgcc aaggggcaat cgt 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 12

acgattgccc cttggacacg cagccagggc att 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 13

aatgccctgg ctgcgtgtcc aaggggcaat cgt 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 14

gcgacgcacc tgttaaacgt agccgaaacc aac 33

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 15

gttggtttcg gctaccttta acaggtgcgt cgc 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 16

gcgacgcacc tgttacaggt agccgaaacc aac 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 17

gttggtttcg gctacctgta acaggtgcgt cgc 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 18

gcgacgcacc tgttaaccgt agccgaaacc aac 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增突变基因的PCR的引物

<400> 19

gttggtttcg gctacggtta acaggtgcgt cgc 33

<210> 20

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变聚磷酸激酶的优化序列

<400> 20

atgaactatc cgtaccatac gcgtatgcgt cgcaatgaat atgaaaaagc caaacacgac 60

ctgcaaattg aactgctgaa agttcagagc tgggtcaaag aaaccggcca gcgcgtggtt 120

gtcctgtttg aaggccgtga tgcggccggt aaaggcggta cgattaaacg cttcatggaa 180

catctgaacc cgcgtggcgc ccgtattgtt gcactggaaa aaccgagttc ccaggaacaa 240

ggccagtggt attttcaacg ttacatccag cacctgccga ccgcgggcga aatggtgttt 300

ttcgatcgtt cttggtataa ccgcgccggc gtggaacgtg ttatgggttt ttgcagtccg 360

ctgcaatacc tggaatttat gcgccaggcg ccggaactgg aacgtatgct gaccaacagc 420

ggtattctgc tgtttaaata ttggttctct gttagtcgcg aagaacagct gcgtcgcttt 480

atcagccgtc gcgatgaccc gctgaaacat tggaaactgt ccccgattga tatcaaatca 540

ctggacaaat gggatgacta caccgcagct aaacaggcaa tgtttttcca caccgatacg 600

gcagacgctc cgtggacggt gattaaatcc gatgacaaaa aacgtgcgcg cctgaattgt 660

atccgccatt tcctgcactc actggattac ccggataaag accgtcgcat tgctcatgaa 720

ccggatccgc tgctggttgg cccggcaagc cgtgttatcg aagaagatga aaaagtttac 780

gcagaagcag cagcagcacc gggtcacgcc aacctggaca ttccggcatg ataa 834

Claims

1.一种多肽，其显示出以下(a)、(b)的性质：

(a)进行将甘氨酸与γ-谷氨酰二肽结合的反应，且

2.一种多肽，其显示出以下(c)、(d)的性质：

(c)生成还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)，且

3.根据权利要求1所述的多肽，其以γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSH及GSSG，或者以γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSH，或者以氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物生成GSSG。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其是以下(A)～(C)中任一项所示的多肽：

5.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其是以下(D)～(F)中任一项所示的多肽：

6.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其是以下(G)～(I)中任一项所示的多肽：

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸；

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸；

(1)第13位被取代为丝氨酸、

(3)第20位被取代为苏氨酸、第215位被取代为天冬氨酸、

(4)第20位被取代为苏氨酸、第241位被取代为组氨酸、

(5)第23位被取代为亮氨酸、第126位被取代为天冬酰胺、

(6)第39位被取代为苏氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(7)第70位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(8)第78位被取代为亮氨酸、第278位被取代为丙氨酸、

(9)第101位被取代为天冬酰胺、

(10)第101位被取代为谷氨酰胺、

(11)第101位被取代为丝氨酸、

(12)第101位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(13)第101位被取代为苏氨酸、

(14)第125位被取代为缬氨酸、第249位被取代为谷氨酸、

(15)第125位被取代为缬氨酸、第152位被取代为谷氨酰胺、

(16)第136位被取代为苏氨酸、

(18)第154位被取代为天冬酰胺、第246位被取代为精氨酸、

(19)第155位被取代为亮氨酸、第239位被取代为丝氨酸、

(20)第197位被取代为谷氨酰胺、

(21)第200位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(22)第226位被取代为精氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(23)第227位被取代为丝氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(24)第254位被取代为天冬氨酸、第260位被取代为丙氨酸、

(25)第260位被取代为丙氨酸、

(27)第260位被取代为丙氨酸、第299位被取代为丙氨酸、

(28)第260位被取代为丙氨酸、第305位被取代为甘氨酸、

(29)第260位被取代为丙氨酸、第310位被取代为苏氨酸、

(30)第260位被取代为半胱氨酸、

(31)第260位被取代为甘氨酸、

(32)第260位被取代为谷氨酰胺、

(33)第260位被取代为苏氨酸、

(34)第262位被取代为半胱氨酸、

(35)第270位被取代为异亮氨酸。

7.一种多核苷酸，其编码权利要求1～6中任一项所述的多肽。

8.一种γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

使权利要求1～6中任一项所述的多肽、或者使权利要求7所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰二肽。

9.一种GSSG的制造方法，该方法包括：

使权利要求1～6中任一项所述的多肽、或者使权利要求7所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

10.一种GSH的制造方法，该方法包括：

使权利要求1～6中任一项所述的多肽、或者使权利要求7所述的多核苷酸表达而得到的转化体和/或其处理物作用于γ-谷氨酰半胱氨酸。

11.根据权利要求8所述的γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

在ATP再生物体系共存下进行反应。

12.根据权利要求11所述的γ-Glu-X-Gly的制造方法，X表示氨基酸，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生物体系。

13.根据权利要求9所述的GSSG的制造方法，该方法包括：

在ATP再生物体系共存下进行反应。

14.根据权利要求13所述的GSSG的制造方法，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生物体系。

15.根据权利要求10所述的GSH的制造方法，该方法包括：

在ATP再生物体系共存下进行反应。

16.根据权利要求15所述的GSH的制造方法，该方法包括：

使用聚磷酸激酶作为ATP再生物体系。