CN105219746A - 一种受β-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种受β-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法提供了降低来源于Bacillus？circulans？STB01的β-CGT酶β-环糊精抑制作用的突变方案，获得突变体L600Y、L600E和L600R。相比于野生CGT酶，β-环糊精对突变体的β-环化活力抑制明显减弱，更适合环糊精的工业化生产。

Description

一种受β-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

技术领域

本发明涉及一种受β-环糊精抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精是淀粉及相关基质经酶解环合后得到的由六个以上葡萄糖经α-1,4-糖苷键连结而成的环状低聚化合物。根据环中葡萄糖的数量，由6、7和8个葡萄糖单元组成的环糊精分别称为α-、β-和γ-环糊精。环糊精的立体结构是中空圆筒形，具有外腔亲水、内腔疏水的特性。由于这种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基团嵌入圆筒内而形成包合物的特性，因此，在食品、医药、化工、农业、纺织等工业领域中有着广泛的应用。

目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase，简称CGT酶，EC2.4.1.19)催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精过程中，环糊精会与CGT酶发生结合，导致CGT酶的环化活力下降，出现由环糊精所引起的产物抑制现象，造成淀粉转化率相对偏低，环糊精生产成本居高不下，环糊精在工业中的应用受到极大的限制。

本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01的β-CGT酶，环糊精产物对其环化活力有明显的抑制作用，因此，减弱产物抑制作用，提高环糊精得率，将有利于环糊精的工业化生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种降低β-环糊对环糊精葡萄糖基转移酶抑制作用的突变体，即将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的野生CGT酶的第600位亮氨酸(Leu)突变为酪氨酸(Tyr)、谷氨酸(Glu)或精氨酸(Arg)，得到突变体L600Y、L600E或L600R。

编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01。

本发明的另一个目的是提供一种获得所述突变体L600Y、L600E、L600R的方法。根据B.circulansSTB01野生CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入L600Y、L600E、L600R密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码突变体L600Y、L600E、L600R的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600中进行表达。

所述方法包括以下步骤：

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体为模板进行定点突变。

引入Leu600Tyr突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCTATGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCATAGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

引入Leu600Glu突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCGAAGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCTTCGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

引入Leu600Arg突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCCGTGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCACGGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

PCR反应体系均为：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。

PCR反应扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。

将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilisWB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

(2)突变体的表达与纯化

挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisWB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水PhenylHP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体L600Y、L600E、L600W。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

本发明的有益效果：构建了3个有意义的突变体L600Y、L600E、L600R，均实现了降低β-环糊精对CGT酶的抑制作用，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。相比野生CGT酶，突变体L600Y、L600E、L600R与麦芽糊精反应24h后，环糊精得率分别提高了7.2％、7.4％以及4.8％。在应用玉米淀粉为底物进行环糊精生产时，L600Y、L600E和L600R能够有效提高β-环糊精得率。

具体实施方式

实施例1突变位点的确定

CGT酶在环化反应过程中的底物结合模型为：第一步直链淀粉结合到麦芽糖基结合位点1(MBS1)，然后通过麦芽糖基结合位点2(MBS2)，并在其帮助下直链淀粉链通过底物结合凹槽定位在亚位点上，淀粉链切断后，在亚位点附近氨基酸残基的帮助下完成环化，生成的环糊精与酶蛋白迅速分开。然而，在酶催化反应的过程中，环糊精可在MBS1、MBS2和活性中心处与酶以氢键或疏水相互作用相结合，从而造成产物抑制。

通过来源于B.circulansstrain251的环糊精葡萄糖基转移酶的PDB晶体结构(PDB编码1D3C)分析可知，具有线性混合型抑制的CGT酶，环糊精在麦芽糖基结合位点2处有多处氨基酸结合位点，其中，环糊精与酶在Leu600处以疏水相互作用相结合，并阻碍了底物通过凹槽传递到活性中心。该氨基酸位点可能与CGT酶的产物抑制有关。将其突变为不同类型的氨基酸可能会影响其产物抑制情况。

实施例2突变体L600Y、L600E和L600R的制备

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。

引入Leu600Tyr突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCTATGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCATAGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

引入Leu600Glu突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCGAAGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCTTCGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

引入Leu600Arg突变的引物：

正向引物：5’-CGACGACGGCCCGTGGGCAAAAT-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-ATTTTGCCCACGGGCCGTCGTCG-3’，下划线为突变碱基；

PCR反应体系均为：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。

PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。

将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilisWB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

(2)突变体的表达与纯化

挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisWB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水PhenylHP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体A599N、A599N/Y63A酶制品。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

实施例3酶活测定分析

(1)酶活力的测定

β-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.0)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL30mMNaOH和0.5mL由5mMNa₂CO₃溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。

(2)酶产物抑制比较

在一定反应温度、pH条件下，添加定量的酶液，以麦芽糊精(DE＝5)溶液作为反应底物，选择反应底物浓度范围为1.25-20mg/mL，测定β-环化活力，作米氏方程双倒数图，计算得K_m和k_cat的值；其他条件不变，在酶反应体系中添加0、1或2mg/mL的β-环糊精，测定不同底物浓度下反应10min后的β-环化活力，作米氏方程双倒数图，计算其竞争性抑制常数和非竞争性抑制常数。

实验结果列于表1，结果发现，β-环糊精对野生CGT酶及其突变体的三种环化活力抑制类型为线性混合型抑制，方程式如下：

$v=\frac{V_{max}\[S\]}{K_m(1+\frac{\[I\]}{K_i})+\[S\](1+\frac{\[I\]}{{K_i}^{\′}})}$

其中K_i为竞争性抑制常数，K_i’为非竞争性抑制常数，v为酶反应速率，V_max为酶最大反应速率，K_m为米氏常数，[S]为底物浓度，[I]为抑制剂浓度。

从表1中可以看出，突变体L600Y、L600E和L600R的K_i和K_i’均大于野生型CGT酶，这说明相比野生β-CGT酶，β-环糊精对CGT酶突变体的β-环化活力的抑制作用明显减弱，这可能是由于单突变改变了麦芽糖基结合位点2区域的空间结构，使环糊精与麦芽糖基结合位点2的结合作用减弱。

表1

实施例4利用HPLC分析不同环糊精生产得率

以配制5％(干基，含水量8％，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，5g麦芽糊精(DE＝5)溶解在90mL磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生CGT酶、突变体A599N、A599N/Y633A使反应体系中总环化活力为0.1U/mL，置于45℃下反应24h，隔时间取样600μL，煮沸灭酶10min，12000rpm离心10min，取上清500μL，加5μL糖化酶(70U/mL)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μL上HPLC分析。

HPLC测定条件为：Waters600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱LichrosorbNH₂(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。

实验结果如表2所示，相比野生CGT酶，突变体L600Y、L600E、L600R与麦芽糊精反应24h后，环糊精得率分别提高了7.2％、7.4％以及4.8％。

综合以上数据可以看出，相比于野生β-CGT酶，突变体L600Y、L600E、L600R更适用于环糊精生产，有助于提高环糊精产率。野生β-CGT酶β-环糊精的产量为68.4％，3种突变体的β-环糊精产量略有降低，但均在66.8％以上，即其产物特异性未发生明显变化，说明突变对β-CGT酶产物特异性的影响不大。

表2

实施例5突变体模拟β-环糊精工业生产

将500mL四口烧瓶固定于超级恒温水槽中，并在四口烧瓶上连上搅拌器，搅拌器转速设为250r/min。在四口烧瓶中加入350mL20％(干基)的玉米淀粉乳，按β-环化活力4U/g(干基淀粉含量)的加酶量加入重组CGT酶，在60℃下保温60min进行液化，升温至80℃，保温30min进行糊化，降温至45℃，按β-环化活力2U/g(干基淀粉含量)的加酶量加入突变CGT酶，同时加入1.5％(v/v)的环己烷，环化反应12h。转速10000r/min下离心15min后，倒掉上层清液，用适量去离子水溶解沉淀，蒸馏去除环己烷，再将样品定容至5L，取样分析，测定其β-环糊精含量，计算β-环糊精产率。

表3

由表3可知，以20％(干基，w/v)玉米淀粉为底物时，相比野生型β-CGT酶，突变体L600Y与玉米淀粉反应能够将β-环糊精得率提升11.3％，淀粉转化率提升明显。突变体L600E和L600R应用于生产转化率较野生型CGT酶分别提升3.7％和3.5％，淀粉转化率略有提升。

综上所述，在应用玉米淀粉为底物进行环糊精生产时，L600Y、L600E和L600R能够有效提高β-环糊精得率，均是非常具有潜在工业应用价值的突变β-CGT酶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第600位的亮氨酸突变为酪氨酸、谷氨酸或精氨酸，得到突变体L600Y、L600E或L600R。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，根据SEQIDNO.1所示的基因序列，设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体L600Y、L600E和L600R的基因，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600为表达宿主。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.SubtilisWB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵24～48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体酶制品。

7.一种减弱CGT酶产物抑制的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的CGT酶的第600位的亮氨酸突变为酪氨酸、谷氨酸或精氨酸。

8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。

9.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在β-环糊精生产中的应用。