CN109161533B

CN109161533B - 无血清培养组合物及其应用

Info

Publication number: CN109161533B
Application number: CN201810987732.2A
Authority: CN
Inventors: 翁源灿; 肖尚; 涂晶晶; 霍永庭
Original assignee: Fapon Biotech Inc
Current assignee: Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN109161533A

Abstract

本发明涉及一种无血清培养组合物及其应用。该无血清培养组合物包括无血清培养基及添加于无血清培养基中的营养组分，营养组分包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白及水解物，水解物选自酵母水解物及水解植物蛋白中的至少一种。采用上述无血清培养组合物能够简化杂交瘤细胞培养流程且有利于提高单克隆抗体表达量和表达稳定性。

Description

无血清培养组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种无血清培养组合物及其应用。

背景技术

杂交瘤细胞由B细胞和骨髓瘤细胞融合所得。杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。杂交瘤技术的出现极大地促进了诊断和生物药物产业的形成和发展。

在单克隆抗体的发现过程中，最常使用的技术便是杂交瘤发现。在发现的前期需要对几十株甚至几百株杂交瘤细胞进行驯化后再使用无血清培养基培养，以获得高品质的候选细胞，非常耗时费力。同时，采用现有的无血清培养基进行杂交瘤细胞的培养，单克隆抗体的表达量较低，且单克隆抗体的表达量波动较大。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够简化杂交瘤细胞培养流程且有利于提高单克隆抗体表达量和表达稳定性的无血清培养组合物及其应用。

一种无血清培养组合物，包括无血清培养基及添加于所述无血清培养基中的营养组分，所述营养组分包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白及水解物，所述水解物选自酵母水解物及水解植物蛋白中的至少一种。

本研究在培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方面进行了大量的探索，预料不到地发现，杂交瘤细胞无需经过驯化即可直接接种于上述无血清培养组合物中进行培养，无血清培养基与营养组分配合作用，使得杂交瘤细胞生长良好，能够达到较高活细胞密度，并且培养在该无血清培养组合物中的杂交瘤细胞的单克隆抗体的表达量较高且表达量较为稳定。经试验验证，采用上述无血清培养组合物培养得到的活细胞密度最大值为直接采用传统的无血清培养基培养得到的活细胞密度最大值的2倍～3倍，单克隆抗体的表达量是直接采用传统的无血清培养基进行培养的2倍～3倍，同时，将产CKMB抗体的杂交瘤细胞分为五组，采用同样的无血清培养组合物进行培养，得到活细胞的密度为(310±45) ×10^4cells/mL，单克隆抗体的表达量为(110±20)mg/L，杂交瘤细胞生长稳定且单克隆抗体的表达量稳定。

在其中一个实施例中，所述表皮细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L，所述白蛋白的添加量为 0.5g/L～3g/L，所述水解物的添加量为0.5g/L～3g/L。

在其中一个实施例中，所述表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L，所述水解物为酵母水解物，所述水解物的添加量为1g/L～3g/L。

在其中一个实施例中，所述无血清培养基为Hybridoma SFM培养基、CD Hybridoma培养基、NCTC-109培养基或PFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基。

在其中一个实施例中，所述水解植物蛋白选自水解大豆蛋白、水解小麦蛋白及玉米水解物中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，所述酵母水解物与所述水解植物蛋白的质量比为1:2～1:0.5。上述实施例任一项所述的无血清培养组合物在培养杂交瘤细胞中的应用。

上述实施例任一项所述的无血清培养组合物在单克隆抗体制备中的应用。

一种基于杂交瘤细胞的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

将杂交瘤细胞直接接种于上述实施例任一项所述的无血清培养组合物中培养，固液分离，得到上清液；及

将所述上清液纯化后得到单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述杂交瘤细胞的接种量为1×10^5cells/mL～5× 10^5cells/mL。

附图说明

图1为实施例1中A～D组的活细胞密度的对比图；

图2为实施例1中A、B、E和F组的活细胞密度的对比图；

图3为实施例1中A、B、G、H和I组的活细胞密度的对比图；

图4为实施例1中A、B、J和K组的活细胞密度的对比图；

图5为实施例1中A～K组的单克隆抗体的表达量对比图；

图6为实施例2中a～f组的活细胞密度的对比图；

图7为实施例2中a～f组的单克隆抗体的表达量对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的无血清培养组合物，其包括无血清培养基及添加于无血清培养基中的营养组分，营养组分包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白及水解物，水解物选自酵母水解物及水解植物蛋白中的至少一种。

无血清培养基即为不含血清的培养基。一般地，无血清培养基为培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体、病毒抗原和重组蛋白等的培养基。

在其中一个实施例中，无血清培养基为Hybridoma SFM(Gibco)、CD Hybridoma培养基(Gibco)、NCTC-109培养基或PFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基。其中，NCTC-109培养基即为NCTC-109(1X)培养基。PFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基为PFHM-II Protein-FreeHybridoma Medium(liquid)。当然，需要说明的是，无血清培养基不限于上述指出的培养基，还可以为本领域中常见的无血清培养基。

表皮细胞生长因子，即EGF(Epidermal Growth Factor)，是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。EGF的主要功能是促进皮肤细胞的分裂，还可以用于诊断各种肿瘤和溃疡病。

在其中一个实施例中，表皮细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L。进一步地，表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L。采用此添加量的表皮细胞生长因子，更有利于提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量。在其中一些实施例中，表皮细胞生长因子的添加量为0.5μg/L、5μg/L、10μg/L、15μg/L、 20μg/L、25μg/L或30μg/L。

成纤维细胞生长因子(FGF，fibroblast growth factor)由内皮细胞、平滑肌细胞或巨噬细胞分泌。FGF能够促进内皮细胞的游走、平滑肌细胞的增殖和新血管形成，修复损害的内皮细胞。

在其中一个实施例中，成纤维细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L。进一步地，成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L。采用此添加量的成纤维细胞生长因子，更有利于提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量。在其中一些实施例中，成纤维细胞生长因子的添加量为0.5μg/L、5μg/L、10μg/L、 15μg/L、20μg/L、25μg/L或30μg/L。

白蛋白，又称清蛋白(albumin，Alb)，由肝实质细胞合成。白蛋白血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。白蛋白能够维持机体营养和渗透压，且白蛋白/球蛋白(A/G)在临床上具有重要的意义，例如血清白蛋白的下降及A/G的下降，对反映肝硬化时的肝功能程度具有重要的临床意义。

在其中一个实施例中，白蛋白的添加量为0.5g/L～3g/L。进一步地，白蛋白的添加量为1g/L～3g/L。采用此添加量的白蛋白，更有利于提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量。在其中一些实施例中，白蛋白的添加量为0.5g/L、 1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L。

酵母水解物为酵母细胞的水解产物，主要通过酵母自溶或通过外加酶水解酵母得到。酵母水解物中含有大量的氨基酸、小肽、丰富的B族维生素、谷胱甘肽及核苷酸类物质。

在其中一个实施例中，酵母水解物为毕赤酵母水解物。优选地，酵母水解物为购于Sigma-Aldrich公司的酵母水解物。

水解植物蛋白为植物性蛋白质在酸催化或酶催化作用下水解后的产物，其构成成分主要是氨基酸。

在其中一个实施例中，水解植物蛋白选自水解大豆蛋白、小麦水解物及玉米水解物中的至少一种。进一步地，水解植物蛋白包括水解大豆蛋白、小麦水解物及玉米水解物。

在其中一个实施例中，水解物的添加量为0.5g/L～3g/L。进一步地，水解物的添加量为1g/L～3g/L。采用此添加量的水解物，更有利于提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量。在其中一些实施例中，水解物的添加量为0.5g/L、 1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L。

在其中一些实施例中，酵母水解物的添加量为0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、 2.5g/L或3g/L。在其中一些实施例中，水解植物蛋白的添加量为0.5g/L、1g/L、 1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L。

在其中一个实施例中，水解物包括酵母水解物及水解植物蛋白，酵母水解物及水解植物蛋白的质量比为1:2～1:0.5。采用酵母水解物与水解植物蛋白协同作用，更有利于提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量。优选地，酵母水解物及水解植物蛋白的质量比为1:1。

在其中一个实施例中，表皮细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L，成纤维细胞生长因子的添加量为0.5μg/L～30μg/L，白蛋白的添加量为0.5g/L～3g/L，水解物的添加量为0.5L～3g/L。

在其中一个实施例中，表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L，成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L～30μg/L，水解物的添加量为1g/L～3g/L，水解物为酵母水解物。通过添加此配方的营养组分于无血清培养基中，各组分协同作用，能够得到更高密度的杂交瘤细胞，使杂交瘤细胞表达更高添加量的抗体，抗体的表达量稳定。

在其中一个实施例中，表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L～20μg/L，成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L～20μg/L，白蛋白的添加量为1.5g/L～2.5g/L，水解物的添加量为1.5g/L～2.5g/L，水解物为酵母水解物。

本研究在培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方面进行了大量的探索，预料不到地发现，杂交瘤细胞无需经过驯化即可直接接种于上述无血清培养组合物中进行培养，无血清培养基与营养组分配合作用，使得杂交瘤细胞生长良好，能够达到较高活细胞密度，并且培养在该无血清培养组合物中的杂交瘤细胞的单克隆抗体的表达量较高且表达量较为稳定。由于上述无血清培养组合物具有能够直接培养杂交瘤细胞且得到较高表达量且表达量稳定的单克隆抗体的效果，可广泛推广应用，如可以应用于杂交瘤细胞的培养过程中，又如可以应用于制备单克隆抗体的过程中。经实验验证，采用上述无血清培养组合物培养得到的活细胞密度最大值为直接采用传统的无血清培养基培养得到的活细胞密度最大值的2倍～3倍，单克隆抗体的表达量是直接采用传统的无血清培养基进行培养的2倍～3倍，同时，将产CKMB抗体的杂交瘤细胞分为五组，采用同样的无血清培养组合物进行培养，得到活细胞的密度为(310±45)×10^4cells/mL，单克隆抗体的表达量为(110±20)mg/L，杂交瘤细胞生长稳定且单克隆抗体的表达量稳定。

一实施方式的基于杂交瘤细胞的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下操作S110～S120：

S110、将杂交瘤细胞直接接种于上述的无血清培养组合物中培养，固液分离，得到上清液。

在其中一个实施例中，杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞。需要说明的是，杂交瘤细胞不限于小鼠杂交瘤细胞，还可以为大鼠杂交瘤细胞。

进一步地，杂交瘤细胞为能产CA242抗体的杂交瘤细胞、能产CY211抗体的杂交瘤细胞或能产CKMB抗体的杂交瘤细胞。

其中，CA242抗体为能够特异性识别CA242的抗体。CA242是一种唾液酸化的糖类抗原，在临床上被用于消化道恶性肿瘤尤其是胰腺癌、结直肠癌的诊断。

CY211抗体为能够特异性识别CY211的抗体。CY211是一类分子质量为 40KD～70KD的上皮细胞支架蛋白，是构成细胞骨架的一类中间丝状物，有多种类型，已知的有20余种，命名为CYK1-20，在肿瘤细胞含量最丰富的是CUL19 和CYK19。在肺癌患者血清中它们会大量表达，这对肺癌的诊断、治疗和愈后有重要的临床意义。CY211-骨胶素是肺癌诊断的重要指标。

CKMB抗体能够特异性识别CKMB的抗体。CK为肌酸激酶。CKMB为肌酸激酶同工酶中的一种。肌酸激酶同工酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高。研究表明在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。其中 CKMB诊断的特异性最高。

在其中一个实施例中，将杂交瘤细胞接种于上述的无血清培养组合物中培养的操作中，培养条件为：培养温度35℃～39℃、二氧化碳的浓度为4％～10％，转速为110rpm～130rpm。

在其中一个实施例中，将杂交瘤细胞接种于上述的无血清培养组合物中培养的操作中，培养容器为方瓶、摇瓶或生物反应器。

在其中一个实施例中，杂交瘤细胞的接种量为1×10^5cells/mL～5×10^5cells/mL。

在其中一个实施例中，固液分离的方式为离心。具体地，离心转速为3000rpm～5000rpm，离心时间为10min～20min，离心的温度为4℃～10℃。

在其中一个实施例中，在S110之前，还包括如下步骤：将杂交瘤细胞固液分离，弃去上清，再加入无血清培养基重悬。具体地，将杂交瘤细胞于 1000rpm～1500rpm、20℃～30℃下离心6min～12min，弃去上清，再加入无血清培养基重悬至细胞添加量为1×10^5cells/mL～5×10^5cells/mL。

S120、将上清液纯化后得到单克隆抗体。

在其中一个实施例中，上清液纯化的方式为Protein G亲和纯化。需要说明的是，若上清液的单克隆抗体的纯度能够达到实际需求时，S120可以省略。

在其中一个实施例中，单克隆抗体为CA242抗体、CY211抗体或CKMB 抗体。

上述制备方法中，无需对杂交瘤细胞进行长时间驯化，即可使杂交瘤细胞大量增殖以达到较高的细胞密度，还能够使杂交瘤细胞表达较高产量的单克隆抗体，且单克隆抗体的表达量较为稳定，工艺简单和稳定，对单克隆抗体的发现和生产具有重要的指导意义。经实验验证，采用上述无血清培养组合物培养得到的活细胞密度最大值为直接采用传统无血清培养基培养得到的活细胞密度最大值的2倍～3倍，单克隆抗体的表达量是直接采用传统无血清培养基进行培养的2倍～3倍，同时，将产CKMB抗体的杂交瘤细胞分为五组，采用同样的无血清培养组合物进行培养，得到活细胞的密度为(310±45)×10^4cells/mL，单克隆抗体的表达量为(110±20)mg/L，杂交瘤细胞生长稳定且单克隆抗体的表达量稳定。

以下为具体实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

以下实施例中，如无特别说明，无血清培养基为Hybridoma SFM(Gibco)，购于Thermo Fisher公司。酵母水解物购于Sigma-Aldrich公司。水解大豆蛋白、水解小麦蛋白及玉米水解物均购于Sigma-Aldrich公司。

实施例1

实验共有11个组，编号分别为A～K，细胞株均为细胞株1，分泌CA242 抗体。每组细胞株的培养过程具体如下：

(1)按照说明书配制无血清培养基，并向无血清培养基中加入EGF、FGF、白蛋白和水解物，得到无血清培养组合物；EGF、FGF、白蛋白和水解物的添加量如表1所示，其中，A～K组所用的水解物为酵母水解物。

(2)将无血清培养组合无菌过滤后加入摇瓶中，将未经驯化的细胞株1按照3×10^5cells/mL的密度接种到无血清培养组合物中，置于摇床中培养；培养条件为：8％的CO₂，转速为120rpm，振幅为50mm，温度为37℃。每隔24h取样检测活细胞的密度和单克隆抗体的表达量。共培养6天。

表1实施例1中各组所用的无血清培养组合物的组分

(3)检测：

(a)样品处理：

在培养过程中，每天取样0.1mL于EP管中。

(b)活细胞密度：

采用台盼蓝染色对收集的沉淀进行染色，再通过上海睿钰厂家IC 1000型号的活细胞计数仪进行自动检测。测定结果详见图1～5。其中，图1为A～D组的活细胞密度的对比图；图2为A、B、E和F组的活细胞密度的对比图；图3为A、B、G、H和I组的活细胞密度的对比图；图4为A、B、J和K组的活细胞密度的对比图。

从图1可以看出，B～D组的活细胞密度的最大值分别为1.7×10^6cells/mL、 2.23×10^6cells/mL和2.41×10^6cells/mL，均高于A组的活细胞密度的最大值 (即为1.13×10^6cells/mL)，说明细胞株1能够直接利用B～D组的无血清培养组合物，细胞株1生长良好，活细胞的密度较高。

从图2可以看出，E～F组的活细胞密度的最大值分别为1.52×10^6cells/mL 和1.96×10^6cells/mL，均高于A组的活细胞密度的最大值，说明细胞株1能够直接利用E～F组的无血清培养组合物，细胞株1生长良好，活细胞的密度较高。

从图3可以看出，G～I组的活细胞密度的最大值分别为2.15×10^6cells/mL、2.46×10^6cells/mL和2.3×10^6cells/mL，均高于A组的活细胞密度的最大值，说明细胞株1能够直接利用G～I组的无血清培养组合物，细胞株1生长良好，活细胞的密度较高。

从图4可以看出，J～K组的活细胞密度的最大值分别为2.58×10^6cells/mL 和2.52×10^6cells/mL，均高于A组的活细胞密度的最大值，说明细胞株1能够直接利用J～K组的无血清培养组合物，细胞株1生长良好，活细胞的密度较高。

(c)单克隆抗体浓度检测：

采用高效液相色谱对培养6天收集的样品分离得到的上清液进行单克隆抗体浓度的测定。测定结果详见图5。其中，图5为A～K组的单克隆抗体的表达量对比图。

具体地，将25μL的上清液加入1mL的缓冲液中均匀，即得到检测样。每针的进样量为10μL，流速为1mL/min，保留时间为7.9min，采用100％的流动相等度洗脱，检测波长为280nm。其中，色谱柱为TSKgel G3000SWXL，7.8×300 mm，5μm。缓冲液为pH为7.4的PBS。流动相包括50mM的磷酸盐及300mM 的氯化钠，pH为7.0。

从图5可以看出，B～K组的单克隆抗体的表达量至少为21mg/L，明显优于 A组的单克隆抗体的表达量(即为12mg/L)，说明细胞株1能够直接利用B～K 组的无血清培养组合物，获得较高表达量的单克隆抗体。其中，K组的单克隆抗体的表达量最高，为43mg/L。

实施例2

实验共有6个组，编号分别为a～g，细胞株均为细胞株2，分泌CY211抗体。每组细胞的培养过程具体如下：

(1)按照说明书配制无血清培养基，并向无血清培养基中加入EGF、FGF、白蛋白和水解物，得到无血清培养组合物；EGF、FGF、白蛋白和水解物的添加量如表2所示。其中，a～d组所用的水解物为酵母水解物。e组所用的水解物为水解大豆蛋白。f组所用的水解物为酵母水解物与水解大豆蛋白的混合物，且酵母水解物与水解大豆蛋白的质量比为1：1。g组所用的水解物为酵母水解物与水解植物蛋白的混合物，且酵母水解物与水解植物蛋白的质量比为1：1，水解植物蛋白包括水解大豆蛋白、水解小麦蛋白及玉米水解物，且水解大豆蛋白、水解小麦蛋白及玉米水解物的质量比为1:1:1。

(2)将无血清培养组合无菌过滤后加入摇瓶中，将未经驯化的细胞株2按照30万/mL的密度接种到无血清培养组合物中，置于摇床中培养；培养条件为： 8％的CO₂，转速为120rpm，振幅为50mm，温度为37℃。每隔24h取样检测活细胞的密度和单克隆抗体的表达量。共培养6天。

表2实施例2中各组所用的无血清培养组合物的组分

(3)测试：

按照实施例1中步骤(3)的方法测定a～g组的活细胞密度和单克隆抗体的表达量。其中，a～f组的测定结果详见图6～7。图6为a～f组的活细胞密度的对比图。图7为a～f组的单克隆抗体的表达量对比图。

从图6可以看出，b～d组的活细胞密度的最大值分别为2.22×10^6cells/mL、2.45×10^6cells/mL和2.38×10^6cells/mL，均高于a组的活细胞密度的最大值 (即为1.43×10^6cells/mL)，说明细胞株2能够直接利用b～d组的无血清培养组合物，细胞株2生长良好，活细胞的密度较高。同时，e组的活细胞密度的最大值为2.2×10^6cells/mL，说明将酵母水解物替换成水解植物蛋白也能够使细胞株2生长良好，积累较高密度的活细胞。f组的活细胞密度的最大值为2.63×10^6 cells/mL，优于e组，说明将酵母水解物与水解植物蛋白协同作用更优于促进细胞株2的增殖，积累较高密度的活细胞。经检测，g组的活细胞密度的最大值为 2.85×10^6cells/mL，优于f组，说明将水解大豆蛋白、水解小麦蛋白、玉米水解物与酵母水解物协同作用更优于促进细胞株2的增殖，积累较高密度的活细胞。

从图7可以看出，b～d组的单克隆抗体的表达量至少为57mg/L，明显优于 a组的单克隆抗体的表达量(即为32mg/L)，说明细胞株2能够直接利用b～d组的无血清培养组合物，获得较高表达量的单克隆抗体。其中，c组的单克隆抗体的表达量最高，为68mg/L。同时，e组的单克隆抗体的表达量为63mg/L，说明将酵母水解物替换成水解植物蛋白也能够使细胞株2表达较高产量的单克隆抗体。f组的单克隆抗体的表达量为75mg/L，优于e组，说明将酵母水解物与水解植物蛋白协同作用更有利于促进细胞株2表达单克隆抗体，以提高单克隆抗体的表达量。经检测，g组的单克隆抗体的表达量为82mg/L，优于f组，说明将水解大豆蛋白、水解小麦蛋白、玉米水解物与酵母水解物协同作用更有利于促进细胞株2表达单克隆抗体，以提高单克隆抗体的表达量。

实施例3

取十组相同的未经驯化的细胞株3，分泌CKMB抗体。其中五组均为实验组，另外五组均为对照组。实验组的五组细胞株均以实施例2中c组的无血清培养组合物进行培养，对照组的五组细胞株均以实施例2中a组的无血清培养基进行培养。接种量为3×10^5cells/mL；培养条件为：8％的CO₂，转速为120rpm，振幅为50mm，温度为37℃。共培养6天，每隔24h取样检测活细胞的密度和单克隆抗体的表达量。

其中，按照实施例1中步骤(3)的方法测定样品的活细胞密度和单克隆抗体的表达量。确定各组样品的活细胞密度的最大值及单克隆抗体的最大表达量，并计算实验组的活细胞密度最大值的平均值与方差、单克隆抗体最大表达量的平均值与方差，且并计算对照组的活细胞密度最大值的平均值与方差、单克隆抗体最大表达量的平均值与方差。测定结果详见表3，其中结果表示为平均值±方差。

表3实验组与对照组的结果对比

从表3可以看出，对照组中活细胞密度最大值的平均值为153×10^4 cells/mL，方差为54×10^4cells/mL，说明对照组的活细胞密度差异较大；同时，对照组的单克隆抗体表达量的平均值为35mg/L，方差为15mg/L，说明对照组的单克隆抗体表达量的差异也较大，进而说明对照组的培养基的工艺稳定性较差，不能得到较为稳定的活细胞密度和单克隆抗体的表达量。

实验组中活细胞密度最大值的平均值为310×10^4cells/mL，方差为45×10^4cells/mL，说明实验组的活细胞密度差异较小；同时，实验组的单克隆抗体表达量的平均值为110mg/L，方差为20mg/L，说明实验组的单克隆抗体表达量的差异也较小，进而说明采用上述无血清培养组合物使得单克隆抗体的制备工艺更加稳定，能够较为稳定的活细胞密度和单克隆抗体的表达量。

综上所述，采用上述实施方式的无血清培养组合物培养得到的活细胞密度最大值为仅采用无血清培养基培养得到的活细胞密度最大值的2倍～3倍。采用上述实施方式的无血清培养组合物培养得到的单克隆抗体的表达量为仅采用无血清培养基培养得到的单克隆抗体的表达量的2倍～3倍。杂交瘤细胞无需经过驯化即可直接培养于上述实施方式的无血清培养组合物中，得到较高细胞密度的杂交瘤细胞、表达量较高且表达量较为稳定的单克隆抗体。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种无血清培养组合物在培养杂交瘤细胞或在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，所述无血清培养组合物由无血清培养基及添加于所述无血清培养基中的营养组分组成，所述营养组分由表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白及水解物组成，所述水解物由酵母水解物和水解植物蛋白组成，所述酵母水解物与所述水解植物蛋白的质量比为1：1，所述表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L~30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L~30μg/L，所述白蛋白的添加量为1g/L~3g/L，所述水解物的添加量为1g/L~3g/L。

2.根据权利要求1所述的无血清培养组合物在培养杂交瘤细胞或在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，所述表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L、15μg/L、20μg/L、25μg/L或30μg/L；所述成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L、15μg/L、20μg/L、25μg/L或30μg/L；所述白蛋白的添加量为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L。

3.根据权利要求2所述的无血清培养组合物在培养杂交瘤细胞或在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，所述表皮细胞生长因子的添加量为20μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为20μg/L，所述白蛋白的添加量为1g/L，所述水解物的添加量为2g/L。

4.根据权利要求1所述的无血清培养组合物在培养杂交瘤细胞或在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，所述无血清培养基为Hybridoma SFM培养基、CD Hybridoma培养基、NCTC-109培养基或PFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基。

5.一种基于杂交瘤细胞的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将杂交瘤细胞直接接种于权利要求1~4任一项所述应用中的无血清培养组合物中培养，固液分离，得到上清液；及

将所述上清液纯化后得到单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞的接种量为1×10⁵个/mL~5×10⁵个/mL。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述将杂交瘤细胞直接接种于所述无血清组合物中培养的步骤中，培养条件为：培养温度35℃~39℃、二氧化碳的浓度为4%~10%，转速为110rpm~130rpm。