RU2712703C1 - Способ получения молочной кислоты - Google Patents

Способ получения молочной кислоты Download PDF

Info

Publication number
RU2712703C1
RU2712703C1 RU2019111498A RU2019111498A RU2712703C1 RU 2712703 C1 RU2712703 C1 RU 2712703C1 RU 2019111498 A RU2019111498 A RU 2019111498A RU 2019111498 A RU2019111498 A RU 2019111498A RU 2712703 C1 RU2712703 C1 RU 2712703C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lactic acid
cultivation
fermentation
medium
producing lactic
Prior art date
Application number
RU2019111498A
Other languages
English (en)
Inventor
Алиса Сергеевна Дерунец
Александр Евгеньевич Кузнецов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева)
Priority to RU2019111498A priority Critical patent/RU2712703C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2712703C1 publication Critical patent/RU2712703C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения молочной кислоты. Способ включает культивирование молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированных к агенту оксидативного стресса НО, с использованием источника дополнительного освещения при освещенности 300-3000 лк. Способ обеспечивает повышение выхода молочной кислоты. 2 табл., 3 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам культивирования молочнокислых бактерий и получения молочной кислоты, которая может быть использована в качестве предшественника для целого ряда продуктов, использующихся в промышленности для изготовления производственных и потребительских товаров, среди которых биоразлагаемые термопласты (полимолочная кислота), «зеленые растворители» (этил-, пропил-, бутилацетаты), окисленные химические вещества (пропиленгликоль) и многие другие.
Эффективность процесса биосинтеза молочной кислоты (МК) главным образом зависит от микроорганизма-продуцента МК и режимов культивирования. МК существует в двух диастереоизомерических формах: L(+) - и D(-). Микроорганизмы могут синтезировать оба стереоизомера как одновременно, так и по отдельности. Синтез зависит от наличия соответствующих лактатдегидрогеназ.
Известен способ получения МК путем сбраживания различных углеродсодержащих субстратов, в том числе отходов предприятий пищевой промышленности, с использованием различных микроорганизмов: бактерий, грибов, дрожжей, (Abdel-Rahman М. A., Tashiro Y. and Sonomoto К. Recent advances in lactic acid production by microbal fermentation processes // Biotechnol. Adv. - 2013. - Vol. 31. 877-902 pp.; Kleerebezem, R. Mixed culture biotechnology for bioenergy production / R. Kleerebezem, M.C.M. van Loosdrecht // Curr. Opin. Biotechnol. - 2007. Vol. 18. 207-212 pp.; Патент США №7300787), а также смешанных культур (Cui, F. Lactic acid production from corn stover using mixed cultures of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus brevis / F. Cui, Y. Li, C. Wan // Bioresour. Technol. - 2011. - Vol. 102. 831-1836 pp.; Nancib, A. Production of lactic acid from date juice extract with free cells of single and mixed cultures of Lactobacillus casei and Lactococcus lactis I A. Nancib, N. Nancib, J. Boudrant // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2009. -Vol. 25. 1423-1429 pp.).
Недостатками такого способа являются: образование в процессе ферментации нежелательных побочных продуктов, продуцирование смеси органических кислот либо образование молочной кислоты недостаточной степени оптической чистоты.
Известен способ получения молочной кислоты (Патент США №5786185), где в качестве питательного субстрата для молочнокислых бактерий используют сывороточный белок, кроме того добавляют также протеазы (ферменты класса гидролаз, которые расщепляют пептидную связь между аминокислотами в белках), необходимые для гидролиза белка с целью образования аминокислот в процессе ферментации. Жидкая питательная среда содержит также дрожжевой экстракт, K2HPO4, MgSO4*7H2O, MnSO4*2H2O, твин 80, лактозу для обеспечения оптимальной реакционной способности молочнокислых бактерий (Патент США №4749652; Патент США №5503750). В процессе ферментации контролируют рН водной суспензии для поддержания практически нейтральных или слабокислых значения для того, чтобы избежать накопления молочной кислоты в ферментативной среде, которая может ингибировать рост молочнокислых бактерий и их продуктивность. Таким образом, непрерывное добавление оснований, таких как гидроксид кальция, гидроксид натрия или аммиака преобразует молочную кислоту в лактат. Лактат в дальнейшем может быть переведен в молочную кислоту в результате реакции с кислотами.
Как правило, продуктивность простого периодического культивирования с поддержанием рН среды невелика. Наибольшая продуктивность отмечена у штаммов Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactis ssp. lactis (Abdel-Rahman M. A., Tashiro Y. and Sonomoto K. Recent advances in lactic acid production by microbal fermentation processes // Biotechnol. Adv. - 2013. - Vol. 31. 877-902 pp.). Для повышения продуктивности процесса применяют различные способы непрерывного культивирования, каскад реакторов, системы с иммобилизованными клетками микроорганизмов, мембранный реактор (Патент США №5503750; Патент США №5635368).
Недостатками вышеуказанных способов следует признать повышенное содержание побочных продуктов биосинтеза и неутилизированных минеральных компонентов.
Одним из способов улучшения технологии является управляемое культивирование, а именно - контролируемый оксидативный стресс (ОС), который представляет собой оптимальное целенаправленное воздействие, при котором развивающаяся устойчивость к стрессорному воздействию ведет к благоприятным изменениям в метаболизме. Контролируемое стрессовое воздействие используется для повышения эффективности процессов культивирования, поскольку при определенных условиях при воздействии стрессовых факторов возможно улучшить отдельные показатели биосинтеза (Davies J. М. S., Lowry С.V. and Davies K. J. A. Transient adaptation to oxidative stress in yeast // Archives of biochemistry and biophysics. - 1995. - Vol. 317, issue 1. 1-6 pp.; De Angelis M., Calasso M., Cavallo J. et al. Fermentation and proteome profiles of Lactobacillus plantarum strains during growth under food-like conditions // Proteomics. - 2016. - Vol. 16. 946-962 pp).
Известен способ (Патент РФ №2394098; Патент РФ №2268924) получения биомассы дрожжей, заключающийся в культивировании дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии пероксида водорода, причем предварительно проводят адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода. Затем осуществляют брожение при использовании подготовленного посевного материала и уровне освещения 40-90 мВт/л. Способ обеспечивает высокий выход биомассы дрожжей (прототип).
Также известно, что механизм фоторепарации присутствует у Lactobacillus casei (Srittmatter С.F. Flavin-linked oxidative enzymes of Lactobacillus casei // J. Biol. Chem. - 1959. - Vol. 234(10). 2794-2800 pp.) Таким образом, было интересно оценить возможность получения посевного материала культур МКБ с улучшенными физиолого-биохимическими характеристиками по аналогии с получением биомассы дрожжей (Патент РФ №2394098; Патент РФ №2268924), что может являться перспективным методом интенсификации биосинтеза молочной кислоты.
Технической задачей настоящего изобретения является получение L-молочной кислоты с высоким выходом (не менее 97%).
Сущность заявленного изобретения заключается в том, что разработан способ получения молочной кислоты, заключающийся в культивировании молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированных к агенту оксидативного стресса Н2О2, с использованием источника дополнительного освещения при освещенности 300-3000 лк.
Технический результат настоящего изобретения заключается в получении L-молочной кислоты с выходом 97-98%.
В настоящем изобретении для культивирования МКБ использовали колбы Эрленмейера и биореактор. Объектом экспериментов являлись МКБ Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированные к агенту оксидативного стресса Н2О2 по известной методике (A.S. Derunets. Using of oxidative stress for improvement of lactic acid biosynthesis // 18th interntional multidisciplinary scientific geoconference SGEM 2018. - Vol. 18. - 2018. - P. 315-321). При культивировании оптимальная температура составляла 37°С, рН от 6,5 до 7,0.
Состав среды для культивирования МКБ Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, г/л: глюкоза - 30 г/л, K2HPO4 - 2,0 г/л, MgSO4 - 0,1 г/л, MnSO4 - 0,05 г/л, источник азота и ростовых факторов (дрожжевой экстракт) - 7,5 г/л, вода - водопроводная. Компоненты питательной среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин.
Сущность изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами:
Пример 1. Подготовка посевного материала (инокулята).
Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,3 г/л (типичная сублетальная концентрация) на конец экспоненциальной фазы роста, концентрация биомассы МКБ в ферментационной среде (среде культивирования) на момент внесения пероксида водорода составляет 2,36-2,54 г/л, при культивировании колбы освещаются источником дополнительного освещения (светодиодный источник белого света), освещенность при этом составляет от 300 лк до 3000 лк. Время культивирования составляет 20-24 часа (см. табл. 1, 2).
Пример 2. Подготовка посевного материала (инокулята).
Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,3 г/л на конец экспоненциальной фазы роста, концентрация биомассы МКБ в ферментационной среде (среде культивирования) на момент внесения пероксида водорода составляет 2,36-2,54 г/л, при культивировании колбы не освещаются источником дополнительного освещения. Содержимое колб экранируют и от видимого света светонепроницаемым материалом. Время культивирования составляет 20-24 часа (см. табл. 1, 2).
Пассивирование проводят до тех пор, пока не произойдет адаптация МКБ Lactobacillus paracasei к пероксиду водорода, т.е. пока доля мертвых клеток для пассивированной линии не станет равна доле мертвых клеток для контрольной линии (см. табл. 2). Источник дополнительного освещения используется для активации ферментов фоторепарации, что обеспечивает более быструю адаптацию к агенту стрессового воздействия. Кроме того, контролируют выход молочной кислоты, который увеличивается по мере пассивирования.
Контрольные варианты (Контроль) велись для каждого пассажа, результаты идентичны, поэтому в табл.2 контрольный вариант представлен одной строкой.
Видно, что при отсутствии дополнительного освещения, молочнокислые бактерии плохо адаптируются к стрессовому агенту (пероксид водорода),
выход молочной кислоты меньше по сравнению с контролем, в то время как при использовании источника дополнительного освещения молочнокислые бактерии адаптировались к пероксиду водорода, выход молочной кислоты больше, чем у контрольного варианта. Все это может свидетельствовать об активации механизма фоторепарации.
Посевной материал примера 1 после адаптации к пероксиду водорода (после 20-21 пассажа) используют в качестве инокулята для проведения стадии молочнокислого брожения в биореакторе, культивирование проводят в анаэробном режиме.
Пример 3. Проведение стадии молочнокислого брожения в биореакторе.
Стадию брожения проводят с использованием биореактора Minifors (INFORS НТ, Швейцария), общий объем которого составляет 5 л. Данный аппарат снабжен устройствами для измерения и регулирования температуры и рН среды, оборудован датчиком для измерения концентрации растворенного кислорода, сигнализатором уровня пены и приспособлением для пеногашения, а также резервуарами для хранения компонентов питательной среды и насосами для их непрерывной подачи в ферментер. Рабочий объем среды составляет 3 л. Скорость вращения мешалки - 150,0-200,0 об/мин. В ходе процесса осуществляют автоматическую подтитровку 25% раствором аммиака до значений кислотности среды 6,8. Используют питательную среду того же состава, что и в примерах 1,2 за исключением содержания глюкозы. При культивировании с использованием биореактора концентрация глюкозы составляет 110 г/л. В качестве источника дополнительного освещения используют светодиодный источник белого света, освещенность при этом составляет от 300 лк до 3000 лк.
Культивирование проводят в анаэробном режиме с использованием в качестве инокулята посевного материала примера 1 после адаптации к
пероксиду водорода (после 20-21 пассажа). Выход молочной кислоты при этом составляет 97-98%.
Таким образом, показана возможность существенного улучшения показателей роста МКБ и процесса молочнокислого брожения при сочетании воздействия на МКБ доз агента окислительного стресса (пероксида водорода) и антистресс-фактора - дополнительного освещения, что позволяет предложить новый способ получения молочной кислоты с высоким выходом.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003

Claims (1)

  1. Способ получения молочной кислоты, заключающийся в культивировании молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированных к агенту оксидативного стресса Н2О2, с использованием источника дополнительного освещения при освещенности 300-3000 лк.
RU2019111498A 2019-04-17 2019-04-17 Способ получения молочной кислоты RU2712703C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019111498A RU2712703C1 (ru) 2019-04-17 2019-04-17 Способ получения молочной кислоты

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019111498A RU2712703C1 (ru) 2019-04-17 2019-04-17 Способ получения молочной кислоты

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2712703C1 true RU2712703C1 (ru) 2020-01-30

Family

ID=69624822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019111498A RU2712703C1 (ru) 2019-04-17 2019-04-17 Способ получения молочной кислоты

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2712703C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2012116235A (ru) * 2012-04-24 2013-10-27 Дмитрий Михайлович Манаков Способ получения молочной кислоты
JP2014121281A (ja) * 2012-12-20 2014-07-03 Snow Brand Milk Products Co Ltd 酸化ストレス耐性が向上した微生物およびその製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2012116235A (ru) * 2012-04-24 2013-10-27 Дмитрий Михайлович Манаков Способ получения молочной кислоты
JP2014121281A (ja) * 2012-12-20 2014-07-03 Snow Brand Milk Products Co Ltd 酸化ストレス耐性が向上した微生物およびその製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КАЛЕНОВ С.В. "Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса" // Автореферат дисс. к.т.н., 2007, с.3, 4,8, 9, 19. *
ШЕВЧЕНКО И.А. и др. "Источники азота в составе комплексных сред для микробиологического крупнотоннажного синтеза молочной кислоты" // Успехи в химии и химической технологии, 2016, том ХХХ, N 9, с.30-32. *
ШЕВЧЕНКО И.А. и др. "Источники азота в составе комплексных сред для микробиологического крупнотоннажного синтеза молочной кислоты" // Успехи в химии и химической технологии, 2016, том ХХХ, N 9, с.30-32. КАЛЕНОВ С.В. "Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса" // Автореферат дисс. к.т.н., 2007, с.3, 4,8, 9, 19. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU754069B2 (en) Low PH lactic acid fermentation
US8592198B2 (en) Method for culturing microorganisms on a growth substrate comprising biomass obtained from methanotrophic bacteria
CN101912051A (zh) 海参配合饲料的发酵工艺
Miura et al. Hydrogen production by a green alga, Chlamydomonas reinhardtii, in an alternating light/dark cycle
Bai et al. Ammonium lactate production by Lactobacillus lactis BME5-18M in pH-controlled fed-batch fermentations
CN105543297B (zh) 产氢菌与真养产碱杆菌联合转化生物质和co2制备聚羟基脂肪酸酯的方法
CN111187794B (zh) 一种利用大肠杆菌发酵制备l-苯丙氨酸的方法
RU2712703C1 (ru) Способ получения молочной кислоты
KR100463738B1 (ko) 아카르보스제조를위한삼투조절된발효방법
AU2021102566A4 (en) Co-production process of pyruvic acid and Levodopa and use thereof
KR101414734B1 (ko) 미세조류를 질소원으로 이용한 숙신산의 생산 방법
CN109337821B (zh) 一种产甾醇酯酶的枝孢菌及产酶方法
US9096874B2 (en) Method for producing lactic acid under pressure that exceeds normal atmospheric pressure
CN102399845A (zh) 基于尾气中co2浓度的维生素b12发酵生产控制工艺
Jame et al. Carbon source utilization and hydrogen production by isolated anaerobic bacteria
CN110885774A (zh) 一种优化谷氨酸发酵的方法
NL2028307B1 (en) Co-production process of pyruvic acid and levodopa and use thereof
JP2002085083A (ja) 微生物を用いた代謝生産物の製造方法
JP2011092045A (ja) 発酵法による安価な乳酸の製法
US20230097164A1 (en) Use of microbial cell lines to maximize organic acid production
CA1209073A (en) Process for the biotechnical production of l-malic acid
JPH01108988A (ja) 焦性ぶどう酸の製法
JP2006521801A (ja) 低濃度の炭素含有養分及び窒素含有養分を用いる発酵方法
CN104611401A (zh) 一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法
CN116479066A (zh) 一种提高l-丙氨酸发酵生产效率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20210418