CN101671381B

CN101671381B - 一种红霉素的制备方法

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Publication number: CN101671381B
Application number: CN200810042768A
Authority: CN
Inventors: 储炬; 邹祥; 李万钧; 段洪武; 庄英萍; 张嗣良
Original assignee: YIDU HEC BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: YIDU HEC BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2028-09-11
Also published as: CN101671381A

Abstract

本发明公开了一种红霉素的制备方法，所述的方法包括步骤：在培养红霉素产生菌的发酵系统中加入浓度为5—10w/v％的如式I所示的化合物1.8—3.6升使式I化合物的终浓度为0.2—0.8w/v％，得到红霉素；R1-CH₂-R2 I其中，R1选自氢、C1-C4的烷基、C1-C4的取代烷基、C1-C4的羧酸或盐、或C1-C4的取代烷基羧酸或盐；R2选自氢、或COOM，其中M选自氢和/或金属；所述的取代烷基和取代烷基羧酸具有1-3个选自下组的取代基：羟基、氨基、或卤素。本发明还公开了如式I化合物的用途。

Description

一种红霉素的制备方法

技术领域

本发明涉及抗生素发酵制备领域，尤其涉及一种红霉素的发酵制备方法。

背景技术

红霉素(Erythromycin)是大环内酯类抗生素重要的原料药和中间体，近几年，随着红霉素临床应用领域的扩大和以阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等为代表的新型半合成红霉素的出现，红霉素生产和销售日趋活跃。

红霉素发酵油(如豆油)作为辅助碳源有助于红霉素A和红霉内酯的合成(参见Mirjalili N，Zormpaidis V，Leadlay PF.The Effect of rapeseed oiluptake on the production of erythromycin and triketide lactone bySaccharopolyspora erythraea[J].Biotechnol Prog，1999，15(5)：911.)，且甲基丙二酰-CoA羧基转移酶活性高于淀粉和葡萄糖基质，有利于前体的合成(参见Choi DB，Park Y，Okabe M.Effects of rapeseed oil on activity ofmethylmalonyl-CoA carboxyltransferase in culture of Streptomycesfradiae[J].Biosci Biotechnol Biochem.1998，62：902.)，同时Hamedi等研究表明发酵用油中不饱和脂肪酸的含量有利于促进红霉素的生物合成(参见Hamedi J，Malekzadeh F，Niknam V.Improved production of erythromycinby Saccharopolyspora erythraea by various plant oi l s[J].BiotechnolLett，2002，24：697.和Hamedi J，Malekzadeh F，Saghafi-nia AE.Enhancingof erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea with commonand uncommon oils[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2004，31：447.)，原因可能对红霉素内酯环形成起到一定的修饰作用有关。但是，影响红霉素发酵成本中原材料成本占有重要比例，豆油作为红霉素发酵生产中重要的前体供应来源，随着豆油价格上涨迅速，以豆油为发酵碳源的抗生素发酵产品成本压力已越来越大。

因此，本领域迫切需要提供一种新的红霉素发酵制备方法，在不影响红霉素产量的同时降低油消耗，从而降低红霉素发酵成本。

发明内容

本发明旨在提供一种红霉素发酵制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种如式I的化合物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种红霉素的制备方法，所述的方法包括步骤：

在培养红霉素产生菌的发酵系统中加入浓度为5—10w/v％的如式I所示的化合物1.8—3.6升使式I化合物的终浓度为0.2—0.8w/v％，得到红霉素；

R1-CH₂-R2 I

其中，R1选自氢、C1-C4的烷基、C1-C4的取代烷基、C1-C4的羧酸或盐、或C1-C4的取代烷基羧酸或盐；

R2选自氢、或COOM，其中M选自氢和/或金属；

所述的取代烷基和取代烷基羧酸具有1-3个选自下组的取代基：羟基、氨基、或卤素。

在另一优选例中，培养红霉素产生菌3—14天后在发酵系统中加入如式I所示的化合物，得到红霉素；更优选5—10天。

在另一优选例中，分别在培养红霉素产生菌6至30小时、31至120小时、121小时至结束的时间段中，以每小时0.03—0.4克/升发酵液的速率在发酵系统中加入如式I所示的化合物，得到红霉素。

在另一优选例中，所述的速率为每小时0.05—0.3克/升发酵液。

在另一优选例中，加入浓度为6—8w/v％的如式I所示的化合物1.8—3.6升使式I化合物的终浓度为0.3—0.6w/v％。

在另一优选例中，所述的R1选自氢、C1-C4的烷基、C1-C4的羟基取代烷基、C1-C4的羧酸或盐、或C1-C4的羟基取代烷基羧酸或盐。

在另一优选例中，所述的R1选自H，CH₃，-CH₂-COOM，或MOOC-C(OH)-CH₂-COOM；其中M选自H，Na，和/或NH₄。

在另一优选例中，所述的红霉素产生菌选自红霉糖多孢菌No.8；所述的发酵在200—250r/分钟、30—37℃的条件下进行。

在本发明的第二方面，提供了一种如式I所示的化合物的用途，在发酵制备红霉素的工艺中作为豆油的替代物；

R1-CH₂-R2 I

R2选自氢、或COOM，其中M选自氢和/或金属；

在另一优选例中，所述的所述的R1选自氢、C1-C4的烷基、C1-C4的羟基取代烷基、C1-C4的羧酸或盐、或C1-C4的羟基取代烷基羧酸或盐；更优选R1选自H，-CH₃，-CH₂-COOM，或MOOC-C(OH)-CH₂-COOM；M选自H，Na，和/或NH₄。

在另一优选例中，所述的发酵制备红霉素工艺不添加豆油。

据此，本发明提供了一种新的红霉素发酵制备方法，在不影响红霉素产量的同时降低油消耗，从而降低红霉素发酵成本。

附图说明

图1显示了部分如式I的化合物在摇瓶培养制备红霉素中的作用。

图2显示了在50L发酵罐中制备红霉素时随发酵时间添加豆油的情况；其中：A表示红霉素效价变化情况，B表示菌体浓度(PMV)变化情况，C表示过程补糖情况，D表示总糖利用情况；■连成的曲线表示添加豆油的情况，◆连成的曲线表示没有添加豆油的情况。

图3显示了在50L发酵罐中制备红霉素时随发酵时间添加乙酸钠的情况；其中■连成的曲线表示红霉素效价变化情况，▲连成的曲线表示PMV变化情况，

连成的曲线表示过程补糖情况，●连成的曲线表示表示总糖利用情况。

具体实施方式

基于对红霉素生物合成的深入研究，发明人发现如果在红霉素发酵制备过程中添加豆油代谢途径中的中间代谢物，可以减少豆油的添加量，并且保持红霉素的产量(效价)同直接添加豆油无异。

具体地，本发明在红霉素发酵制备过程中所添加的是如式I所示的化合物，添加方式可以在菌种培养一段时间后一次性加入；也可以采取流加发酵的形式，在不同的时间段以不同或相同的速率加入，直至放罐结束。

R1-CH₂-R2 I

R2选自氢、或COOM，其中M选自氢和/或金属；

如本文所用，“红霉素产生菌”是指可以通过微生物发酵产生红霉素的微生物，它可以是本领域技术人员所熟知的微生物，例如但不限于红色链丝菌(Streptomyces erythrus)、红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)优选红霉糖多孢菌。

如本文所用，“培养红霉素产生菌”是指通过微生物发酵产生红霉素的过程，是本领域技术人员所熟知的技术，可以是摇瓶培养，也可以通过发酵罐培养。

如本文所用，“红霉素的生物合成”是指通过红霉素产生菌发酵获得红霉素的过程。

如本文所用，“发酵系统”是指放置在特定容器中的，通过微生物发酵产生红霉素所需要的物质，包括红霉素产生菌、基础培养基等。

所述的基础培养基是本领域技术人员所熟知的，它含有放线菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数放线菌生长。本领域技术人员可以自制获得，例如但不限于在牛肉浸液中加入适量的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节pH7.2—7.6，经灭菌处理后，即成；或再加入0.3％—0.5％的琼脂，则为基础半固体培养基；或加入2％—3％的琼脂，则为基础固体培养基。本领域技术人员也可以通过商业渠道购买。

如本文所用，“流加发酵”和“补料分批发酵”可以互换使用，都是指在微生物发酵产生红霉素的过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的方法。

红霉素的生物合成主要由1个丙酰辅酶A，依次接上6个2-甲基丙二酰辅酶A环化形成(参见Mironov VA，Nastasyak IN，Danilenko VN.Biogenesisand regulation of biosynthesis of erythromycins in Saccharopolysporaerythraea[J].Appl Biochem Microbiol，2004，40(6)：531)，豆油分解代谢后通过三羧酸循环(TCA循环)代谢产生琥珀酰辅酶A，经异构化后生成2-甲基丙二酰辅酶A。根据油代谢途径，补加中间代谢物结构类似的如式I化合物，则在不影响红霉素产量的条件下降低油消耗。

本发明提供的红霉素制备方法，是在在培养红霉素产生菌的发酵系统中加入如式I所示的化合物，得到红霉素；

R1-CH₂-R2 I

R2选自氢、或COOM，其中M选自氢和/或金属；

在本发明的一个优选例中，所述的R1选自氢、C1-C4的烷基、C1-C4的羟基取代烷基、C1-C4的羧酸或盐、或C1-C4的羟基取代烷基羧酸或盐。

更佳地，R1选自H，CH₃，-CH₂-COOM，或MOOC-C(OH)-CH₂-COOM；M选自H，Na，和/或NH₄。

在本发明的一个实施例中，摇瓶培养红霉素产生菌的3—14天后在基础培养基中加入终浓度为0.2—0.8w/v％(较佳地0.3—0.6w/v％)的如式I所示的化合物，得到红霉素；优选在5—10天后加入。

在本发明的另一实施例中，发明人通过发酵罐进行红霉素的生物合成，在这个过程中，按发酵6至30小时速率0.03—0.4克/升·小时，31至120小时速率0.03—0.4克/升·小时，121小时至放罐结束后速率0.03—0.4克/升·小时，进行如式I的化合物的流加发酵，发酵系统中共计加入0.2—0.8w/v％(较佳地0.3—0.6w/v％)的如式I所示的化合物，得到红霉素。优选速率为0.05—0.3克/升·小时。按不同速率加入的式I化合物的浓度是按发酵系统计，所述发酵系统也可称为发酵液。所述发酵液的主要成分红霉素A(发酵液中红霉素组分含有红霉素A、B、C三种物质，其中红霉素A为主要成分。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、首次应用在红霉素生物合成过程中补加豆油代谢途径中的中间代谢物的结构类似物以降低油耗、并保持红霉素产量高的概念。

2、在红霉素生物合成过程中补加如式I的化合物，所述的如式I化合物都是价格低廉的物质。

3、有效降低了红霉素生物合成的成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明实施例中的各种测定方法如下：

1、菌体浓度(PMV)测定

准确量取10ml发酵液于10ml离心管中，3000r/min离心10分钟，测得沉淀物的体积占10ml发酵液体积的百分含量即得PMV。

2、红霉素效价测定：

(1)化学效价法发酵液经乙酸丁酯萃取后，经硫酸水解后成黄色，498nm处测定吸收值。

(2)生物效价采用管碟法。

3、红霉素组分HPLC分析

用JASCO PU2080高效液相系统，色谱柱为硅胶BDS-C18柱(4mm×250mm，5μm)，流动相为0.025mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液:乙腈＝60:40，流速0.9ml/min，柱温35℃，检测波长215nm。

实施例1

红霉素生物合成I

1材料与方法

1.1材料如表1所示：

表1

材料	来源
		红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraeaNo.8)	宜都东阳光生化制药有限公司
乙酸钠
		丙酸钠
乙酸铵
		丁二酸钠
柠檬酸钠
		丙酸
豆油

1.2培养方法

摇瓶培养8个500mL摇瓶装液量50mL，转速220r/min，温度32℃，摇瓶培养7天，摇瓶基础培养基中各自补加0.4％表1中的低碳链化合物，等量豆油为对照组。

2结果

低碳链化合物替代豆油的摇瓶筛选试验，即选择一系列与中间代谢物分子结构类似的低碳链化合物，摇瓶基础培养基中代替豆油进行筛选(如图1)。

结果表明，与豆油对照组相比，补加二碳化合物乙酸钠，作为乙酰CoA供体，红霉素效价达到3358U/ml，接近豆油添加组3862U/ml，与豆油的接近，但成本大大降低。

实施例2

红霉素生物合成II

1材料与方法

1.1材料如表1所示：

1.2培养方法

50L发酵罐培养采用三级发酵方式，挑取新鲜斜面孢子，接到装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，温度33℃，转速220r/min，培养44小时后，转二级15L种子罐培养，接种量为5％，相同条件培养29小时后再转50L发酵罐培养，接种量为15％。采用上海国强生化工程装备公司的FUS-50(A)发酵罐进行发酵试验，该发酵罐能够在线全程监控发酵过程(包括pH、DO、OUR、CER等参数)。

1.350L发酵罐流加工艺

豆油流加策略按发酵6—30小时速率0.1g/l.h，31—120h0.16g/l.h，121h至放罐结束后0.12g/l.h进行。

表1中的低碳链化合物流加

流加策略1按发酵6—30小时速率0.1g/l.h，31—120h0.2g/l.h，121h至放罐0.15g/l.h进行；

流加策略2按发酵6—30小时速率0.07g/l.h，31—120h0.13g/l.h，121h至放罐0.09g/l.h进行。

2结果

2.1流加豆油对红霉素发酵的影响

以往研究虽已证实，豆油有利于提高红霉素发酵产量，但在发酵过程起到多大作用缺乏深入分析，图2为流加豆油对红霉素发酵代谢的影响，与发酵过程不补油相比，虽然起步效价相当，由于补油的前体供应充足，红霉素合成速率明显加快(图2A)，184小时，红霉素效价达到8219U/ml，不补油效价仅为6022U/ml，提高了36.4％；同时48小时后补豆油菌体生长速率明显高于不补豆油组(图2B)，补豆油后菌体继续生长，70小时菌体高达54％；不补油菌体生长缓慢，64小时菌体浓度最高仅为35％；与过程补糖(图2C)和总糖利用情况(图2D)结合来看，发酵过程不补加豆油，造成豆油分解产生的短链脂肪酸等前体供应不足，为维持菌体生长和产素的需要，整个过程耗糖速率明显高于补加豆油组。

结果表明，豆油在发酵过程中除补充前体外，同时氧化产生大量能量供应菌体生长和维持。

2.2流加乙酸钠的影响

豆油代谢主要以乙酰辅酶A进入TCA循环，乙酸钠作为二碳链化合物，可能作为乙酰CoA的供体起到替代豆油的作用，因此发酵过程按0.1g/L.h的速度匀速流加乙酸钠替代豆油，试验结果如图3。

结果表明，流加乙酸钠后，和过程不补油相比(见图2)，过程糖耗速率明显加快，前期菌体生长较快，65小时，菌浓达到42％，表明乙酸分子能够被红霉糖多孢菌利用，加快TCA循环，促进菌体生长；最终整体发酵成本有所降低。

3.讨论

油为碳源由于不易发生降解物的阻遏效应，有利于次级代谢产物合成，被广泛应用于众多抗生素发酵生产。红霉素作为大环内酯抗生素，油分解产生的短链脂肪酸是红霉素合成前体的重要来源，发明人从红霉素发酵过程油脂代谢利用途径出发，筛选代谢途径中间产物类似化合物进行替代豆油，获得低碳链化合物能有效替代豆油，发酵综合成本降低，本研究结果无疑为红霉素发酵及其他抗生素产品在发酵原料大豆油价格急剧上涨的市场环境下，降低发酵成本开辟新的途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种红霉素的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

在培养红霉素产生菌的发酵系统中加入浓度为5-10w/v％的乙酸钠1.8-3.6升使乙酸钠的终浓度为0.2-0.8w/v％，得到红霉素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养红霉素产生菌3-14天后在发酵系统中加入乙酸钠，得到红霉素。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，培养红霉素产生菌5-10天后在发酵系统中加入乙酸钠。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分别在培养红霉素产生菌6至30小时、31至120小时、121小时至结束的时间段中，以每小时0.03-0.4克/升发酵液的速率在发酵系统中加入乙酸钠，得到红霉素。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的速率为每小时0.05-0.3克/升发酵液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加入浓度为6-8w/v％的乙酸钠1.8-3.6升使乙酸钠的终浓度为0.3-0.6w/v％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的红霉素产生菌选自红霉糖多孢菌No.8；所述的发酵在200-250r/分钟、30-37℃的条件下进行。

8.一种乙酸钠的用途，其特征在于，在发酵制备红霉素的工艺中作为豆油的替代物。