JPH03505817A - ガンマ及びデルタ ラクトンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガンマ及びデルタラクトンの調整方法 発明の背景 ラクトンは、有用な官能的性質を有することが知られており、そして風味材及び 芳香材として使用されて来た。たとえば、“Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 　ｉｎ　Ｆｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｆｔｉｏｎ”。

９月、１９７６．１〜５６ページに公開された包括的調査において、Ｍｅｇａは 、天然由来のラクトンの芳香及び風味性質を要約した。

Ｍｅｇａによれば、Ｔ−ヘキサラクトンは、クマリアン性カラメル味覚と共に草 木のような甘い臭気を有する。Ｔ−オクタラクトンは、甘いココナツツ臭気及び 味覚を有し、そしてＴ−及びδ−テカラクトンは、甘い桃の様な臭気及び味覚を 有する。

前記ラクトンの多くのうち草木又は果実起源は十分に確立されて来た。しかしな がら、抽出又は蒸留による植物材料からの分離は、しばしば、それらがひじよう に低い濃度で存在するので、実際的でなく又は不可能である。従って、合成反応 方法が、風味材及び芳香材として使用するためにラクトンを製造するのにしばし ば使用される。

ラクトンはまた、種々の微生物の代謝物からも同定されて来た。たとえば、Ｃｏ ｆｆ１ｎｓ及びＨａｌｉｍ（Ｊ、Ａ　ｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　ＣｈｅＩｌｌ、。

■兵、　２０．４３７）は、土壌菌類、トリコダーマ　ヒリド（Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）を含む培養物から生じる優先的な揮発性材料としてδ −ラクトン、６−ペンチル−２−ピロンを同定した。Ｄｒａｗｅｒｔ　星？、（ Ｃｈｅｍ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｌｅｂｅｎｓｕｍ、。

１９８３、８．９１）は、栄養ブイヨンにおける一徂」」（ｉスー」外ラノ、（ Ｐｏｌ　　ｏｒｕｓ　ｄｕｒｕｓ）の培養物から■量のＣｓＣ５Ｔ−ラクトンを 同定した。同様に、フサリウム　ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ凹）の培養された麦 芽ブイヨンからの一連のＴ−ラクトンの類似する収量が、５ｕｒｒｉｓ　ａｎｄ 　Ｌａｔｒａｓｓｅ（Ａ　ｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅＩｌｌ、。

１９８３、４９．３２２７）により報告された。アメリカ特許第４．５４２．０ ９７号は、低収量でのＴ−ラクトンの混合物の製造のためにビチロスボリウム（ Ｐｉ　ｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ）培養物の使用を開示する。Ｔａｈａｒａ＊ζ、、 　（Ａ　ｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　１９７２．３６．２５８５）は、微 生物スポロボロマイセス　オドラス（Ｓ　ｏｒｏｂｏｌｏｎ＋　ｃｅｓｏｄｏｒ ｕｓ）は、延長されたインキュベーション期間の後、１５１の発酵ブイヨンに■ 量のＴ−デカラクトンを生成したことを見出した。

いくつかのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）株によるリシノール酸の代謝が、０ｋｕ ｉ、　ｆｔｅ、、　（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　＋　１９６３＋　５Ｃ５３ ６）により研究され、そして彼は、γ−ヒドロキシデカン酸が酸化分解経路にお ける中間体であることを見出した。アメリカ特許第４，５６０，６５６号におい てＦａｒｂｏｏｄ及び−１１１ｉｓは、ヒマシ油におけるこのβ−酸化工程を詳 細に研究した。種々の微生物に関して、それらは発酵ブイヨン１２当たり５〜６ ｇのレベルでγ−ヒドロキシデカン酸及び続いてＴ−デカラクトンを生成するこ とができた。

ケトカルボン酸の微生物還元による一定の光学的に活性なラクトン及びその対応 するヒドロキシカルボン酸の調製方法もまた開示された。たとえばアメリカ特許 第３，０７６．７５０号は、５〜１８個の炭素原子を有する４−及び５−ケトカ ルボン酸の微生物還元方法を開示する。

ラクトンの微生物学的製造方法、たとえば上記方法は、微生物工程が合成方法に より必要とされる複数反応を単一段階に連合せしめるので、合成方法よりも利点 を有するように思える。さらに、微生物学的方法は、天然源から風味材及び芳香 材を得るための所望を満たすであろう、しかしながら、植物の抽出を利用する方 法のように、文献に記載される微生物学的方法は、ひじょうに低い収量を有し、 そして天然において一般的でない。それらは、特定のラクトンのみを生成し、そ して種々の分子量のラクトンの製造のために有用でない。

従って、種々の炭素原子鎖の長さのラクトンの微生物学的製造方法を開発するこ とが本発明の目的である。Ｔ又はδラクトンを製造することもまた所望される。

さらにもう１つの目的は、経済的なラクトン製造を確立するであろう収量を伴ヮ て、そのようなラクトンの微生物学的製造である。さらにもう１つの目的は、そ の対応する飽和又は不飽和カルボン酸又はその誘導体からのラクトンの製造であ る。

主尻■！ｈ これらの及び他の目的は、γ又はδラクトンの微生物学的製造方法に向けられる 本発明により達成される０本発明によれば、ムコア（ｂμこ）属の菌類又はその 酵素抽出物の培養物を基質と共にインキュベートし、そしてこの基質は、γ又は δラクトンを発酵生成するための、少なくとも４個の炭素原子を有する有機カル ボン酸又はその誘導体、たとえば塩、アルキルエステル、モノ、ジ又はトリグリ セリド又は非置換性、モノアルキル又はジアルキルアミドである。

本発明の微生物学的方法のための基質として使用される有機カルボン酸又はその 誘導体は、基質のカルボニル基へのＴ又はδヒドロキシ基の形成又はＴ又はδラ クトン環の形成を妨害しないいづれかの基により置換され得る。生成されるＴ又 はδラクトンは、同じ置換パターンを有するであろう。

長さ４〜２０個の炭素原子の飽和又は不飽和カルボン酸又はその対応する誘導体 を基質として使用することが好ましい。

生成されるその対応するラクトンは、Ｃ１〜Ｃ２゜のγ又はδラクトンであろう 。

式Ｒ”ＣＯＺ　Ｃ式中、Ｒ２は長さ３〜１９個の炭素原子のアルキル又はアルケ ニル基であり；Ｚは−ＯＸ　、　　０ＣＨ２Ｃ）ＩＯＲ３（、ＨＯＲ’又は−Ｎ Ｒ’Ｒ６であり、ここでＸは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル、アルカリ又 はアルカリ土類金属カチオン又はイオン交換樹脂であり；Ｂ２及びＲ４は独立し て、水素、１〜６個の炭素原子のアルキル、又はＲ”ＣＯであり；そしてＲ５及 びＲｈは独立して、水素又は１〜６個の炭素原子のアルキルである〕で表わされ る基質を使用することはさらに好ましい。

アルキル又はアルケニル基は、枝分れ鎖でも又は直鎖でもあり得る。ＣＯＺ基に 隣接するアルキル又はアルケニル基の４個の炭素原子成分が枝分れ鎖でないこと もまた好ましい。生成されるその対応するラクトンは、下記式：〔式中、ｎはｌ 又は２であり、モしてＲ’　は水素又は長さ１〜１６個の炭素原子のアルキルで ある〕を有する。

本発明の方法に使用される栄養ブイヨンは、窒素、炭水化物、鉱物及び酸素の通 常の源を含む０本発明に使用されるインキュベーション発酵条件は、培養物の生 存性を維持するであろういづれかのｐＨ１温度、基質濃度及び基質の供給速度を 包含する。

本発明の方法は、バッチ操作又は連続態様で行なわれ得る。

バッチ発酵においては、栄養ブイヨン、培養物及び基質が組合され、そしてラク トン濃度が一定になるまで発酵される。

連続方法においては、栄養ブイヨン中の基質が、基質及び生成物がそれぞれ添加 され、そして再循環ブイヨンから除去される条件下で、発酵反応器を通して連続 的に再循環され得る。

光所企豊定坐星監 本発明の微生物学的方法は、少なくとも４個の炭素原子の有機カルボン酸又はそ の誘導体から光学的に活性なγ又はδラクトンを高収率で生成するために有用で ある。典型的には、有機カルボン酸は、Ｃ，〜Ｃ２゜のアルカノール又はアルカ ノール酸又はその誘導体であり、そして生成されるその対応するラクトンは、下 記式： を青し、ここで波状の線は、その対応するラクトンの（Ｒ）及び（Ｓ）鏡像異性 体を示す。

本明細書に記載される微生物の形質転換は、高い光学的純度を有するγ及びδラ クトン異性体を住せしめる。

そのようなラクトンは、風味及び芳香化合物である０本発明で生成されるＩ又は 複数のラクトンの存装置を含むことによって、飲料水、チューインガム、フルー ツジュース、タバコ製品、医薬製剤、香料、香料製品及び同様のものの官能的性 質を増大し又は増強することが可能である。これらのラクトンは特に、完全に天 然の成分が必要とされるある風味組成物において価値ある。

本発明によれば、種々の分子量のＴ又はδラクトンが調製され得る条件が発見さ れた。これらの条件は、所望する高収率のラクトンを得るために、適切な基質と 共に、ムコア属の菌類の発酵的インキュベーションに基づかれている。従って、 形質転換は、基質のカルボニルにｒ又はδ位置の炭素をヒドロキシル化すること ができるムコア菌類の存在下で行なわれ得ることが発見された。好ましい結果は 、二形性菌類のムユヱ属のメンバーにより及び好ましくは、次の種：Ｍ、サブチ リシマス（Ｍ、ｓｕｂｔｉｌｌｉｓｓｉｍｕｓ）、　　Ｍ、ムセド（Ｍ、ｍｕｃ ｅｄｏ）　＋Ｍ、ミニヘイ　（Ｍ、＋ｗｉｅｈｅｉ）、　　Ｍ、　　シルシネロ イデス（Ｍ、ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）＋　Ｍ　）Ｌｔｆ旦（Ｍ、Ｉｕｔ ｅｕｓ）＋　Ｍフ立亙ス（Ｍ、ｆｌａｖｕｓ）、　　Ｍ、　コルチコラス（Ｍ、 ｃｏｒｔｉｃｏｌｕｓ）及びＭ、アルボーアチル（Ｍ、ａｌｂｏ−ａｔｅｒ）の 株を利用して得られた。基質酸は直接添加され得又はそのナトリウム塩、カリウ ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩及び同様の塩の形で使用 され得る。他方、カルボン酸の代わりに、いづれかの既知のカルボン酸誘導体（ たとえばエステル、アミド、無水物及び同様のもの）が使用され得る。基質酸の エステルの場合、そのアルコール部分は好ましくは、１〜６個の炭素原子を有す るアルコールである。好ましいアルコールの例として、第一アルコール、たとえ ばメタノール、エタノール、ｎ−プロパツール及びｎ−ブタノール、２−メチル ブタノール、３−メチルブタノール及び第二アルコール、たとえばイソプロパツ ールを挙げることができる。基質酸のグリセロールエステルもまた使用され得る 。

本発明の１つの態様においては、使用される基質は、次の式： 〔式中、Ｒ１は水素又は１〜１７個の炭素原子を有するアルキル基であり、そし てＺは上記の通りである〕により定義され得る。

本発明の実施においては、菌類の培養及び発酵的インキュベージタンは、通常の 栄養物質の存在下で水性培地において達成される。適切な培地は、炭素源、窒素 、無機塩及び成長因子を含む培地である。適切な炭素源の中には、たとえばグル コース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、マ ンニトール、ソルビトール、グリセロール、トウモロコシシロップ及びトウモロ コシシロップ固体が包含される。適切な窒素源の例は、有機及び無機窒素含有物 質、たとえばペプトン、トウモロコシ浸漬リッカー、肉抽出物、酵母抽出物、カ ゼイン、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩、ニトレート及びそれらの混合物を包 含する。無機塩の例は、ホスフェート、スルフェート、マグネシウム、ナトリウ ム、カルシウム及びカリウムを包含する。これらの栄養物は、たとえば１又は複 数のビタミンＢグループ及び１　又は複数の微量鉱物、たとえば鉄、マンガン、 コバルト、銅ニより補充され得る。栄養ブイヨンに関しては、約２〜約２０重量 ％、より好ましくは約４〜約１５重量％及び最っとも好ましくは約８〜１２重量 ％の濃度でデキストロースを使用することが好ましい。別々の補充物として又は 酵母抽出物の形でビタミンＢを使用することもまた、好ましい。上記添加物の種 類及び量は、微生物の培養についての当業界の一般的な知識を通用することによ って決定され得る。

典型的な方法においては、ムコア菌類が、栄養ブイヨン中において成熟培養物を 生成するための接種量でまず培養される。培養物は発酵器の栄養ブイヨン中に接 種され、そしてそれ自体の確立を可能にされる。次に、基質が添加され、そして ラクトンの定常濃度が存在するまで、発酵が続けられる。

菌類の培養及び発酵的インキュベーションは、定常培養として又は含浸培養（た とえば振盪フラスコ、発酵器）として好ましくは好気性条件下で行なわれ得る。

培養及びインキュベーションは、約３〜約９のｐＨ範囲で、好ましくは約４〜約 ８のｐＨ範囲で及び最っとも好ましくは約６〜約７のｐＨ範囲で行なわれ得る。

そのｐｔ＋は、無機又は有機酸又は塩基、たとえば塩酸、酢酸、水酸化ナトリウ ム、炭酸カルシウム、アンモニア、イオン交換樹脂の添加により、又はリン酸塩 、フタレート又はＴｒｉｓ＠のような緩衝液の添加により調節され得る。

インキュベーション温度は、好ましくは約１８°Ｃ〜約３１°Ｃの間で維持され 、そして約り０℃〜約２８°Ｃの範囲が好ましく、そして約り４℃〜約２７“Ｃ の範囲が特に好ましい。

本発明のもう１つの典型的な方法によれば、その方法は便利には、培養の開始で 、培養培地に基質を好気性条件下で添加することによって行なわれる。他方、基 質は、単独で又は他の炭素源、たとえばグルコ−スと共に、発酵インキュベーシ ョンの間に、又は培養が完結した場合に添加され得る。発酵ブイヨン中の培養物 の増殖が始まった後、７〜２４時間の間、培養培地に基質を添加することが好ま しい。所望する結果は、基質が、７〜１２時間の初期菌類培養の後、全発酵にわ たって連続的に添加される場合に得られる。この連続的添加のための好ましい供 給速度は、０．０１〜Ｉｇ／ブイヨンＩＩｌ・時、より好ましくは、０．０１〜 １ｇ／２・時及び最っとも好ましくは０．６〜０．８　ｇ　／　ｌ・時である。

培地中の基質の濃度は、使用される条件に広く依存する。実際、培地中の基質の 濃度は便利には、それが培養物に添加される態様と一致して０．０１重量％〜約 １０重量％、好ましくは約０．１重量％〜約５重量％、より好ましくは０．５重 量％〜約２重量％である。

通常の条件下で、光学的に活性なγ及びδラクトンの混合物が一般的に生成され 、そしてγラクトンが実質的に好都合である。ｐＦＩ、酸素、栄養物及び基質の Ｚ基の調節がＴ：δラクトンの相対的割合の変化を引き起こすことができる場合 、その割合はしばしば、Ｔラクトンのために好ましいであろう。

しかしながら、ある条件下で及びあるムコア種によれば、δラクトンが好ましい 。例は、Ｔ：δラクトンの割合の変化についての詳細を教授する。ラクトン混合 物は、そのまま又は純粋なＴ及び／又はδラクトンを回収するためにさらに精製 して利用され得る。

反応期間は、特定のインキュベーションパラメーター、たとえば使用される微生 物の株、培養培地の組成及び存在する基質に従って変化する。一般的に、振盪フ ラスコ培養は、使用される微生物株及び基質に依存して、２〜約２４０時間、好 ましくは４８〜１９２時間、より好ましくは７２〜１４４時間を必要とする。し かしながら、発酵器が使用される場合、その発酵期間は９０時間又はそれ以下に 減じられ得る。

インキュベーションは好気性条件下で行なわれ、ここでインキュベーションブイ ヨン中の溶解酸素含有率は２０〜１００重量％、好ましくは３０〜８０重量％、 より好ましくは４０〜６０重量％である。また、好ましくは、基質は、水性相及 び微生物と連続的に接触して維持される。一般的に、激しい撹拌又は振盪が好ま しいが、しかし所望するには、界面活性剤、たとえばＴｗｅｅｎ８０が、基質の 分散を助けるために添加され得る。従来の消泡剤、たとえばシリコーン油、ポリ アルキレングリコール誘導体又はダイズ油が気泡を調節するために使用され得る 。

発酵のために使用される微生物の形は臨界ではない。発酵は、培養溶液から単離 された微生物の細胞又は既知の方法で前記細胞から単離された酵素抽出物を用い て行なわれ得る。

後者の場合、反応は便利には、水溶液中で、たとえば緩衝溶液中で、生理学的水 溶液中で、新鮮な栄養溶液中で又は水中で行なわれ得る。単離された細胞又はそ の酵素抽出物が固体支持体上に固定され、そして所望する形質転換が別々に行な われる。連続方法で酵素抽出物の固定形を使用することが便利であろう。基質の 発酵はまた、菌類の突然変異体によりもたらされ得る。

ラクトンの発酵的な製造の進行は、標準分析技法、たとえばクロマトグラフィー （ガス−液体、薄層又は高圧液体）及び分光分析器、たとえばＩＲ及びＮＭＲを 用いてラクトン濃度についてアッセイすることによってモニターされ得る。発酵 はまた、基質、グルコース、酸素の消費を測定することによって又はｐＨの変化 を測定することによっても推定され得る。

発酵は一般的に、すべての基質が消費され又はラクトン濃度の追加の上昇が観察 されない場合、停止される。

本発明の最終生成物の単離及び精製は、溶媒抽出、薄層、クロマトグラフィーに よる分離、高圧液体クロマトグラフィー及び同様の方法を包含する従来の技法に より達成され得る。

本発明は、従来の合成方法によりラクトンを生成するために必要とされる複雑な 段階を回避し、そして１１当たり数ミリグラムの程度でせいぜい生成物を生成す る従来の発酵方法に比べて、高収率でラクトンを生成する（たとえばブイヨン１ １当たり５〜１５ｇ）。

次の例は、本発明の態様をより十分に例示するために示されているが、本発明の 範囲を限定するものではない。

拠−上 Ｍ、サブチリシマスの ムコア　サブチリシマス（ＦＤＯ単離物５．６）の２４時間ブイヨン培養物１０ ｄの培養物を、ペプトン２ｇ、酵母抽出物１ｇ及びデキストロース２０ｇを含む 滅菌ブイヨン（この後、ＰＹＥブイヨンとして言及する）２００ｄに接種した。

この培養物を２７°Ｃでインキュベートし、そして２５叶卯で２１時間撹拌した 。この時点で、培養物のｐＨを７．０に調整し、そしてエチルヘキサノエート１ ．５　ｇを添加した。追加の４８時間の発酵の後（この間、ｐＨは２４時間ごと に７．０に調整された）、培養ブイヨンを塩化メチレンにより抽出し、そしてそ の抽出物をガスクロマトグラフィーにより分析した。蒸留の後、回収された抽出 物は０．７５ｇの重量であり、そして５．２％のδ−ヘキサラクトン及び０．９ ％のＴ−ヘキサラクトンを含んだ。異なった増殖培地及び基質を用いての追加の 結果は、第１表に示されている。すべての場合、抽出物は、添加された基質の４ ０〜５０重量％について計数した。

例２ Ｍ　シルシネロイ−スの ムロア　シルシネロイデス（ＦＤＯ単離物９．１７）の２４時間ブイヨン培養物 １０ｍを、ＰＹＥブイヨン２００ｄに接種した。

上記条件下での２４時間のインキュベーションの後、ｐＦｌを７．０に調整し、 そして１．５ｇのエチルオククノエートを添加した。

追加の４８時間の発酵の後、ブイヨンを有機溶媒により抽出した。回収された抽 出物は０．８ｇの重量であり、そして４９．４％のγ−オクタラクトン及び微量 のδ−オクタラクトンを含んだ。異なった増殖培地及び基質を用いての追加の結 果は、第■表に示される。

ムコア　シルシネロイデスのＦＤＯ株は、主要培養物収集所での寄託に基づく株 に形態学的に類似するけれども、それは高収率でラクトンを生成するように思え る。従って、ＦＤＯ培養物は、分類されるためにＡＴＣＣに提出されている。

例３ い　つかのムコア　　びエステルを　いての次のムコア種のそれぞれを、１％（ Ｖ／Ｖ）のエチルオクタノエートの添加の前、２４〜４８時間、前記のようにし てＰＹＥブイヨンに培養した。その培養物を、発酵の追加の３〜５日後、抽出し 、そしてその抽出物をガスクロマトグラフィーにより分析した。それぞれの抽出 物は、添加された基質の４０〜６０重量％について計算した。結果は、下記の第 ■表に示される。

例４ い　つかのムコア　　びアミドを　いての次のムコア種のそれぞれを、０．５％ （Ｗ／Ｖ）のオクタンアミド及び１．５％（ｖ／ｖ）の丁−ｅｅｎ　−８０の添 加の前、２４時間、前記のようにしてＰＹＥブイヨンに培養した。その培養物を 、追加の３日間の発酵の後、抽出し、そしてその抽出物をガスクロマトグラフィ ーにより分析した。それぞれの抽出物は、添加された基質の５０〜６０重量％に ついて計数した。結果は下記筒■表に示される。

ネロイテス（ＦＤｏ、ｌ１Ｉｉｌｉｉ物９．１７）　（７）２０時間培養物８０ ０ｄニヨり接種した。温度を２７℃で維持し、ｐＨを７，１（±０．２）で維持 し、酸素濃度を、自動コントローラーにより５０％飽和（±１５％）で維持した 。７時間のインキュベーションの後、エチルオクタノエートを、４０時間の合計 発酵時間の間、０．７ｄ／ｌブイヨン／時の速度でブイヨン中に添加した。この ブイヨンＩＩ２を酸性化し、そして塩化メチレンにより抽出した。抽出物は２５ ｇの重量であり、そして２０ｇを蒸留の後、回収した。

その蒸留物は、５６％のγ−オクタラクトンを含み、これは発酵ブイヨン１２当 たりに回収される１１．２ｇのラクトンに等しい。

例６ Ｍ、サブチリシマス　びエステルの　　　な　酵２０１の発酵器中におけるＰＹ Ｅブイヨン１５！を、ムコアサグ天ユ之ヱス（ＦＤＯ単離物５．６）の２０時間 ＰＹＥブイヨン培養物４００−により接種した。温度を２７°Ｃに維持し、ｐＨ を６．５で維持し、溶解された酸素濃度を自動コントローラーにより５０％飽和 で維持した。発酵容器における５時間のインキュベーションの後、エチルカプロ エートを、次の２４時間、０．４ｄ／時／ｌ培養ブイヨンの速度で培養物中に添 加した。

次に、そのブイヨンを酸性化し、そして有機溶媒により抽出した。蒸留の後、サ ンプル２５ｇを回収し、そしてこのサンプルはＴ−ヘキサラクトン２．６ｇ、δ −ヘキサラクトン７．３ｇ及びカプロン酸１３．５ｇを含んだ。

例７ Ｍ、ヒエマリス　びエステルの ２０ｆｌの発酵器中におけるＰＹＥブイヨン１５ｆｆを、ムコアヒエマリス）Ａ ＴＣＣＮα２００２８の２４時間ＰＹＥブイヨン培養物１００ｍにより接種した 。温度を２７°Ｃで維持し、ｐＨを６．５で維持し、そして溶解された酸素を２ ０％で維持した。発酵容器における１８時間のインキュベーションの後、エチル カプエートを、次の５２時間、０．６ｄ／時／！ブイヨンの速度で培養物中に添 加した。次に、その培養物を酸性化し、そして有機溶媒により抽出した。抽出物 を蒸留した後、合計１３３ｇを回収し、そしてこのサンプルはＴ−デカラクトン ３ｇを含み、そして残りはヒドロキシエステル及び酸の混合物であった。

例８　 アプリコツト風味の飲物 水性垢原液を、１１の水にスクロース２０ｇ及び塩０，１ｇと溶解することによ って調製することができる。次に、この水性原液２２に、次のラクトン：Ｔヘキ サラクトン（１０％）、Ｔ及びδオクタラクトン（４０％）、Ｔ及びδデカラク トン（４０％）及びＴドデカラクトン（１０％）の混合物的０．２ｇを添加し、 ここで％は合計混合物の重量によってである。約１〜２ｇのアルギネートガムを その混合物に添加し、そして乳化剤としてレシチン０．５〜１ｇを使用した。そ の混合物を、それを均質化するために高速度ブレンダーに配置し、そして次に、 ビン詰めし、そして冷蔵庫に入れた。得られた生成物は、アプリコツト様味覚を 有する甘い飲料である。

補正された請求の範囲 １、　Ｃ４〜Ｃ２゜のδ又はＴラクトンの微生物学的製造方法であって、ムコア 属の菌類の培養物又はその酵素抽出物を、栄養ブイヨン中において、長さ４〜２ ０個の炭素原子の飽和又は不飽和カルボン酸、その塩、そのアルキルエステル、 そのモノ、ジ又はトリグリセリド又はその非置換性モノアルキル又はジアルキル アミドを含んで成る基質と共にインキュベートし、それによってラクトンを生成 することを含んで成る方法。

λ　前記ラクトンが、下記式： 〔式中、ｎは１又は２であり、そしてＲ１は水素又は長さ１〜１５個の炭素原子 のアルキルである〕を有する請求の範囲第１項記載の方法。

３、前記基質が、下記式： 〔式中、Ｒ２は長さ３〜１９個の炭素原子のアルキル又はアルケニル基であり； Ｚは−ＯＸ　、　　０ＣＨｚＣＨＯＲ３ＣＨＯＲ’又は−ＮＲ’Ｒ６であり、こ こでＸは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル、アルカリ又はアルカリ土類金属 カチオン又はイオン交換樹脂であり、Ｒ３及びＲ４は独立して、水素、１〜６個 の炭素原子のアルキル、又はＲ”ＣＯであり；そしてＲ５及びＲ６は独立して、 水素又は１〜６個の炭素原子のアルキルである〕を有する請求の範囲第２項記載 の方法。

４、ＣＯ２基に隣接するアルキル又はアルケニル基の少なくとも４個の炭素原子 成分が枝分れされていない請求の範囲第３項記載の方法。

５、　前記インキュベーションを約３〜約９のｐＨ及び約１８°Ｃ〜３１°Ｃの 温度で行ない、そして前記栄養ブイヨンが窒素及び炭水化物の栄養源を有し、そ して約１８〜約１００％の酸素を含む雰囲気下で接触して存在する請求の範囲第 １項記載の方法。

６、前記栄養ブイヨン中の基質濃度が栄養ブイヨンの合計重量に対して約０．０ １重量％〜約１０重量％であり、前記基質が栄養ブイヨン１！・時当たり約１■ 〜約２ｇの供給速度で連続的に添加され、そして前記インキュベージジン期間が 約１〜１０日である請求の範囲第１項記載の方法。

７、　前記栄養ブイヨン中の基質濃度が栄養ブイヨンの合計重量に対して約０． ０１重量％〜約１０重量％であり、前記窒素源がブイヨンの合計重量に対して約 ０．０１〜約３重量％の濃度でのペプトン及び約０．１〜２重量％の濃度での酵 母抽出物であり、前記炭水化物がブイヨンの重量に対して約２〜約２０重景％の 濃度でのデキストロースであり、前記基質が栄養ブイヨン１１・時当たり約１■ 〜約２ｇの供給速度で連続的に添加され、そして前記インキュベーション期間が 約１〜１０日である請求の範囲第５項記載の方法。

８、　前記ｐＨが約４〜約８であり、前記温度が約２０°Ｃ〜約２８゛Ｃであり 、前記酵母抽出物濃度が約０．１〜約２％であり、前記ペプトン濃度が約０．１ 〜２％であり、前記デキストロース濃度が約４％〜約１５％であり、前記雰囲気 が約３０％〜約８０％の酸素を含み、前記基質濃度が約０．１％〜約５％であり 、前記供給速度が約０．０１　ｇ〜Ｉｇ／時・！であり、そして前記インキュベ ーション期間が約２〜８日である請求の範囲第７項記載の方法。

９、　前記ｐＨが約６〜約７であり、前記温度が約２４°Ｃ〜約２７°Ｃであり 、前記酵母抽出物濃度が約０．５〜約１％であり、前記ペプトン濃度が約０．１ 〜２％であり、前記デキストロース濃度が約８％〜約１２％であり、前記雰囲気 が約４０％〜約６０％の酸素を含み、前記基質濃度が約０．５％〜約２％であり 、前記供給速度が約０．６　ｇ〜０．８ｇ／時・Ｅであり、そして前記インキュ ベーション期間が約３〜６日である請求の範囲第７項記載の方法。

１０、前記インキュベーションの開始でのデキストロース濃度が約１０％であり 、ビタミンＢが補足物として添加され、前記基質供給速度が約０．６ｇ／時・Ｐ であり、そして前記雰囲気が約４０％〜６０％の溶解された酸素である請求の範 囲第７項記載の方法。

１１、前記栄養ブイヨン中のラクトン濃度をモニターし、そしてラクトンの濃度 がほぼ一定して存続する場合、そのインキュベーションを停止することを含んで 成る請求の範囲第１項記載の方法。

１２、前記基質がアルキルエステルである請求の範囲第１項記載の方法。

１３、前記アルキル基が長さ１〜３個の炭素原子である請求の範囲第１２項記載 の方法。

１４、前記基質が置換されていないアミドである請求の範囲第１項記載の方法。

１５、前記Ｔ及びδラクトンの混合物を生成する請求の範囲第ｆ項記載の方法。

１６、前記混合物がδラクトンを実質的に含んで成る、請求の範囲第１５項記載 の方法。

１７、前記混合物がγラクトンを実質的に含んで成る請求の範囲第１５項記載の 方法。

１８、前記Ｔ及びδラクトンを分離する請求の範囲第１５項記載の方法。

１９、前記γ又はδラクトンが光学的に活性である請求の範囲第１項記載の方法 。

２０、前記Ｔ又はδラクトンが光学的同位体の混合物である請求の範囲第１項記 載の方法。

２１、前記γラクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。

２２、前記δラクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。

中− ２３、Ｔ−オタフクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。

２４、前記基質がエチルオクタノエートである請求の範囲第１項記載の方法。

２５、前記菌類の酵母抽出物を、培養物として使用する請求の範囲第１項記載の 方法。

２６、前記生存菌類を、培養物として使用する請求の範囲第１項記載の方法。

２７、前記ビタミンＢが酵母抽出物の形で添加される請求の範囲第１Ｏ項記載の 方法。

２８、　　Ｃ，、のＴ又はδラクトンの微生物学的製造方法であって、ムコア属 の菌類の培養物又はその酵母抽出物を、栄養ブイヨン中において、２１個の炭素 原子を含む飽和又は不飽和カルボン酸、その塩、アルキルエステル、モノ−、ジ ー、又はトリグリセリド又はその非置換性モノアルキル又はジアルキルアミドを 含んで成る基質と共にインキュベートし、それによってラクトンを生成すること を含んで成る方法。

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ４〜Ｃ２０のδ又はγラクトンの微生物学的製造方法であって、ムコア属 の菌類の培養物又はその酵素抽出物を、栄養ブイヨン中において、長さ４〜２１ 個の炭素原子の飽和又は不飽和カルボン酸、その塩、そのアルキルエステル、そ のモノ、ジ又はトリグリセリド又はその非置換性モノアルキル又はジアルキルア ミドを含んで成る基質と共にインキュベートし、それによってラクトンを生成す ることを含んで成る方法。
2. ２．前記ラクトンが、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは１又は２であり、そしてＲ１は水素又は長さ１〜１５個の炭素原子 のアルキルである〕を有する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記基質が、下記式： Ｒ２ＣＯＺ 〔式中、Ｒ２は長さ３〜１９個の炭素原子のアルキル又はアルケニル基であり； Ｚは−ＯＸ，−ＯＣＨ２ＣＨＯＲ３ＣＨＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６であり、ここで Ｘは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル、アルカリ又はアルカリ土類金属カチ オン又はイオン交換樹脂であり；Ｒ３及びＲ４は独立して、水素、１〜６個の炭 素原子のアルキル、又はＲ２ＣＯＺであり；そしてＲ５及びＲ６は独立して、水 素又は１〜６個の炭素原子のアルキルである〕を有する請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．ＣＯＺ基に隣接するアルキル又はアルケニル基の少なくとも４個の炭素原子 成分が枝分れされていない請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記インキュベーションを約３〜約９のｐＨ及び約１８℃〜３１℃の温度で 行ない、そして前記栄養ブイヨンが窒素及び炭水化物の栄養源を有し、そして約 １８〜約１００％溶解された酸素を含む雰囲気下で接触して存在する請求の範囲 第１項記載の方法。
6. ６．前記栄養ブイヨン中の基質濃度が栄養ブイヨンの合計重量に対して約０．０ １重量％〜約１０重量％であり、前記基質が栄養ブイヨン１ｌ・時当たり約１ｍ ｇ〜約２ｇの供給速度で連続的に添加され、そして前記インキュベーション期間 が約１〜１０日である請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記栄養ブイヨン中の基質濃度が栄養ブイヨンの合計重量に対して約０．０ １重量％〜約１０重量％であり、前記窒素源がブイヨンの合計重量に対して約０ ．０１〜約３重量％の濃度でのべブトン及び約０．１〜２重量％の濃度での酵母 抽出物であり、前記炭水化物がブイヨンの重量に対して約２〜約２０重量％の濃 度でのデキストロースであり、前記基質が栄養ブイヨン１ｌ・時当たり約１ｍｇ 〜約２ｇの供給速度で連続的に添加され、そして前記インキュベーション期間が 約１〜１０日である請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．前記ｐＨが約４〜約８であり、前記温度が約２０℃〜約２８℃であり、前記 酵母抽出物濃度が約０．１〜約２％であり、前記ペプトン濃度が約０．１〜２％ であり、前記デキストロース濃度が約４％〜約１５％であり、前記雰囲気が約３ ０％〜約８０％の酸素を含み、前記基質濃度が約０．１％〜約５％であり、前記 供給速度が約０．０１ｇ〜１ｇ／時・ｌであり、そして前記インキュベーション 期間が約２〜８日である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記ｐＨが約６〜約７であり、前記温度が約２４℃〜約２７℃であり、前記 酵母抽出物濃度が約０．５〜約１％であり、前記ペプトン濃度が約０．１〜２％ であり、前記デキストロース濃度が約８％〜約１２％であり、前記雰囲気が約４ ０％〜約６０％の溶解された酸素を含み、前記基質濃度が約０．５％〜約２％で あり、前記供給速度が約０．６ｇ〜０．８ｇ／時・ｌであり、そして前記インキ ュベーション期間が約３〜６日である請求の範囲第７項記載の方法。
10. １０．前記インキュベーションの開始でのデキストロース濃度が約１０％であり 、ビタミンＢが補足物又は酵母抽出物として添加され、前記基質供給速度が約０ ．６ｇ／時・ｌであり、そして前記雰囲気が約４０％〜６０％の溶解された酸素 である請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．前記栄養ブイヨン中のラクトン濃度をモニターし、そしてラクトンの濃度 がほぼ一定して存続する場合、そのインキュベーションを停止することを含んで 成る請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．前記基質がアルキルエステルである請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．前記アルキル基が長さ１〜３個の炭素原子である請求の範囲第１２項記載 の方法。
14. １４．前記基質が置換されていないアミドである請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．前記γ及びδラクトンの混合物を生成する請求の範囲第１項記載の方法。
16. １６．前記混合物がδラクトンを実質的に含んで成る、請求の範囲第１５項記載 の方法。
17. １７．前記混合物がγラクトンを実質的に含んで成る請求の範囲第１５項記載の 方法。
18. １８．前記γ及びδラクトンを分離する請求の範囲第１５項記載の方法。
19. １９．前記γ又はδラクトンが光学的に活性である請求の範囲第１項記載の方法 。
20. ２０．前記γ又はδラクトンが光学的同位体の混合物である請求の範囲第１項記 載の方法。
21. ２１．前記γラクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．前記δラクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。
23. ２３．γ−オクタラクトンが生成される請求の範囲第１項記載の方法。
24. ２４．前記基質がエチルオクタノエートである請求の範囲第１項記載の方法。
25. ２５．前記菌類の酵母抽出物を、培養物として使用する請求の範囲第１項記載の 方法。
26. ２６．前記生存菌類を、培養物として使用する請求の範囲第１項記載の方法。