KR0136774B1 - 감마락톤과 델타락톤의 제조방법 - Google Patents

감마락톤과 델타락톤의 제조방법

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Abstract

내용없음

Description

감마락톤과 델타락톤의 제조방법
락톤은 유용한 감각 수용성(organoleptic property)을 지닌다고 공지되었으며 향미와 방향 물질로서 사용되어왔다. 예를들어, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1976년 9월, pp 1-56에 공개된 광범위한 조사에서 메가(Maga)는 천연적으로 생성된 락톤의 방향성과 향미성을 요약 설명하였다. 메가에 따르면, 감마-헥사락톤은 쿠마린과 함께 달콤한 풀냄새 및 카라멜 맛을 지닌다. 감마-옥타락톤은 과일, 코코넛 향과맛을 갖는 한편 감마-데카락톤과 델타-데카락톤은 복숭아 같은 과일향과 맛을 지닌다. 전기한 여러 락톤이 추출되는 풀 또는 과일이 잘 알려져 있다. 그러나, 추출이나 증류에 의해 식물로부터 락톤을 분리하는 것은 이것이 매우 작은 농도로 존재하므로 종종 실제적이지 않거나 불가능하다. 그러므로, 향미와 방향물질로서 사용하는 락톤을 제조하는데 합성반응 방법이 사용된다. 락톤은 또한 여러 미생물들의 대사산물 가운데서 확인되었다. 예를 들어, Collins와 Halim (J. Agric. Food Chem., 1972, 20, 437)은 토양 균류인 Trichoderma Viride를 함유한 배양물로부터 발생하는 휘발성 물질로서 델타-락톤, 6-펜틸-2-피론을 확인하였다.
Drawert와 그의 동료(Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensum., 1983, 8, 91)는 영양 브로쓰(broth)내Polyporus durus 의 배양물로부터 밀리그램 양의 C3-C8감마-락톤을 확인하였다. Fusarium poae의 배양된 맥아 브로쓰로부터 생성된 유사한 수율인 일련의 감마-락톤이 Sarris와 Latrasse (Agric. Biol. Chem., 1983, 49, 3227)에 의해 확인되었다. 적은 수율의 감마-락톤 혼합물을 생산하는데 Pityrosporum 배양물을 사용하는 것이 U.S. 특허 제 4.542.097호에 기재되어 있다. Tahara와 그의 동료(Agric. Biol. Chem., 1972, 36, 2585)는 Sporobolomyces odorus가 연장된 배양기간후에 15L 발효 브로쓰내에서 밀리그램양의 감마-데카락톤을 생산함을 발견하였다. 여러 Candida 균주에 의한 리시놀산의 대사를 Okui와 그의 동료 (J. Biochemistry, 1963, 54, 536)가 연구하여 감마-하이드록시데칸산이 산화적 분해 경로의 중간산물임을 알았다.
Farbood 와 Willis는 U.S. 특허 제 4.560.656호에서 피마자유로써 베타-산화 과정을 더 상세하게 연구하였다. 그들은 여러 가지 미생물로써 발효 브로쓰 1리터당 5-6그램의 수준으로 감마-하이드록시데칸산, 연속해서 감마-데카락톤을 생산할 수 있었다.
또한 케토카복실산의 미생물적인 환원에 의한 당해 하이드록시 카복실산 및 광학적 활성인 락톤의 제조법이 공지되었다. 예를 들어 미생물에 의해 C5-18를 갖는 4-카복실산과 5-카복실산을 환원시키는 방법이 U.S. 특허 제 3.076.750호에 기재되어 있다.
상기된 것들과 같은 락톤을 생산하는데 미생물적인 방법을 이용하는 것이 합성방법 보다 유리한데 왜냐하면 미생물적인 방법이 합성방법에 필요한 여러반응을 단일 단계로 행해지도록 하기 때문이다. 또한, 미생물적인 방법은 천연 소스(source)로부터 향미 물질과 방향물질을 얻고자하는 바를 만족시킨다. 그러나, 식물 추출물을 이용하는 방법과 같이, 상기 문헌에 기재된 미생물적인 방법은 수율이 매우 저조하므로 사실상 일반적이지 못하다. 이 방법은 단지 특정한 락톤만을 생성시키며 분자량이 다양한 락톤 생산에 유용하다고 공지되지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 탄소사슬 길이가 다양한 락톤을 생산하는 미생물적인 방법을 개발하는 것이다. 또한 감마 락톤이나 델타 락톤을 생산하는 것이 바람직하다. 또 다른 목적은 락톤 제조를 경제적이도록하는 수율과 함께 이러한 락톤을 미생물적으로 생산하는 것이다. 또 다른 목적은 당해 포화되거나 불포화된 카복실산 또는 이것의 유도체로부터 락톤을 생산하는 것이다.
발명의 요약
상기 목적과 기타 목적은 감마 락톤과 델타 락톤을 생산하는 미생물적인 방법에 관한 본 발명으로 성취된다. 이 방법에 따라서, 최소한 C4를 갖는 유기 카복실산인 기질이나 또는 염, 알킬 에스테르, 모노, 디 또는 트리글리세라이드 또는 치환되지않은 모노알킬 아미드나 디알킬 아미드를 포함하는 이것의 유도체와 함께 Mucor 속(genus)균류 배양물이나 이것의 효소 추출물을 배양하여 발효적으로 감마 락톤이나 델타 락톤을 생성시킨다. 본 발명의 미생물적인 방법에 대해 기질로서 사용된 유기 카복실산이나 이것의 유도체는 기질의 카보닐 그룹에 대해 감마 또는 델타 위치의 하이드록실 그룹 형성을 방해하지않거나 또는 감마 락톤 또는 델타 락톤 고리의 형성을 방해하지않는 어느 그룹으로 치환될 수 있다. 생성된 감마 락톤이나 델타 락톤은 상기와 동일한 치환 형태를 가질 것이다. 기질로서 C4-20길이인 포화되거나 불포화된 카복실산 또는 당해 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. 생성된 당해 락톤은 C4내지 C20인 감마 락톤 또는 델타 락톤일 것이다.
구조식 R2COZ인 기질을 사용하는 것이 더욱 바람직이며 식중에서 R2는 C4-19알킬 또는 알캐닐 그룹이고 Z는 -OX, -OCH2CHOR3CHOR4또는 -NR5R6이며 X는 수소, C1-6알킬, 알칼리 또는 알칼리 도금속 양이온 또는 이온교환 수지이고 R3및 R4는 독립적으로 수소. C1-6알킬 또는 R2CO이며 R5및 R6는 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이다. 알킬 또는 알케닐 그룹은 분지되거나 선형일 수 있다. COZ그룹에 인접한 알킬 또는 알케닐 그룹의 4개 탄소 부분이 분지되지않은 것이 바람직하다. 생성된 당해 락톤은 다음 구조식을 갖는다.
식중, n은 1 또는 2, R1은 수소 또는 C1-16알킬임.
본 발명의 방법에 따라 사용된 영양 브로쓰는 질소, 탄수화물, 무기물 및 산소로 된 통상적인 소스를 포함한다. 본 방법에 따라 사용한 발효 인큐베이션 조건으로는 배양물의 생존 능력을 유지시킬 수 있는 모든 기질 공급속도, 기질 농도, 온도 및 pH를 포함한다. 본 방법은 일괄적 또는 연속적으로 행해질 수 있다. 일괄적 발효에서, 영양브로쓰, 배양물 및 기질을 혼합하여 락톤농도가 일정해질때까지 발효시킨다. 연속적 방법에서, 영양 브로쓰내 기질은 발효 반응기를 통해 연속적으로 재순환될 수 있는데 단, 기질과 생성물은 각각 부가되고 재순환 브로쓰로부터 제거된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 미생물적인 방법은 최소한 C4로 된 유기 카복실산 또는 이것의 유도체로부터 광학적으로 활성인 감마 락톤 이나 델타 락톤을 고수율로 생산하는데 유용하다. 특징적으로, 유기 카복실산은 C4-20알칸산 또는 알켄산 또는 이것의 유도체일 것이며 생성된 당해 락톤은 다음 구조식을 가질 것이다.
식중 곡선은 당해 락톤의 (R) 및 (S) 에난티오머를 표시함.
본원에 기술된 미생물적 변형으로 높은 광학 순도를 지닌 감마 및 델타 락톤 이성체가 생성된다. 이러한 락톤은 향미 및 방향 물질이다. 본 발명에 따라 생성된 하나 이상의 락톤을 효과적인 양으로 포함시키므로써, 음료, 츄잉검, 과일 주스, 담배, 제약학적 제제, 향수, 방향 제품등과 같은 소모품의 감각 수용성을 증대 또는 증가시키는 것이 가능하다. 이러한 락톤은 특히 완전한 천연 성분을 필요로하는 향미 조성물에 유용하다.
본 발명에 따라, 분자량이 다양한 감마 또는 델타 락톤을 제조할 수 있는 조건이 발견되었다. 이러한 조건은 높은 수율을 원하는 락톤을 얻기위해 적당한 기질과 함께 Mucor 속 균류의 발효 인큐베이션에 기초한다. 따라서, 기질의 카보닐에 대해 감마 또는 델타 위치에 있는 탄소를 하이드록실화할 수 있는 Mucor 균류의 존재에서 상기 변형이 행해질 수 있음이 발견되었다. 동종이형(dimorphic)의 Mucor 속 균류로써, 바람직하게 M. subtillissimus, M. mucedo, M. miehei, M. circinelloides, M. luteus, M. flavus, M. corticolus 및 M. albo-ater종의 균주를 이용해서 유리한 결과를 얻었다. 기질인 산은 직접 부가되거나 또는 그것의 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 암모늄 염 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 카복실산 대신에 공지된 카복실산 유도체(예를들어, 에스테르, 아미드, 무수물등)중 어느 것이 사용될 수 있다. 기질이 산 에스테르인 경우, 알콜 부분은 바람직하게 C1-6을 갖는 것이다. 바람직한 알콜의 예로는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 및 n-부탄올, 2-메틸 부탄올, 3-메틸 부탄을 같은 1차 알콜 및 이소프로판올 같은 2차 알콜이 있다. 상기 기질 산의 글리세롤 에스테르가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 이용된 기질은 다음 구조식으로 정의될 수 있다.
식중, R1은 수소 또는 C1-17알킬 그룹이고 Z는 상기 정의된 바와 같음.
본 발명을 실행함에 있어, 균류의 배양 및 발효 인큐베이션은 일반적인 영양물질이 존재하는 수성 배지내에서 이루어진다. 적당한 배지는 탄소원, 질소원, 무기염 및 성장인자들을 함유하고 있는 것이다. 적당한 탄소원으로는 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 크실로스, 수크로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 그리세롤, 옥수수시럽 및 고형옥수수 시럽이 있다. 적당한 질소원의 예로는 펩톤, 옥수수 증류주, 미트(meat)추출물, 효모 추출물, 카제인, 우레아, 아미노산, 암모늄 염, 질산염, 및 이들의 혼합물같은 유기 질소 및 무기질소 함유 물질이 있다. 무기염의 예로는 인산염, 황산염, 마그네슘, 나트륨 칼슘 및 칼륨이 있다. 이러한 영양물질은 예를 들어 하나 이상의 비타민 B군 및 필요하다면 철, 망산, 코발트, 구리같은 하나 이상의 미량 무기물로 보충될 수 있다. 영양 브로쓰에 대해, 약 2-20중량%, 더욱 바람직하게 약 4-15 중량% 가장 바람직하게 약 8-12 중량% 농도로 덱스트로스를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 비타민 B군을 별개의 보충물로서 또는 효모 추출물 형태로 사용하는것이 바람직하다. 상기 언급된 부가제들의 종류와 양은 미생물 배양 업계의 일반적인 지식을 이용하므로써 결정될 수 있다.
대표적인 방법에서 우선 Mucor 균류를 접종량으로 배양하여 영양 브로쓰내의 성숙한 배양물을 얻는다. 이 배양물을 발효조 영양브로쓰내에 접종한 후 정착시킨다. 다음에 기질을 부가하고 일정한 농도의 락톤이 존재할때까지 계속 발효시킨다. 상기 균류의 배양 및 발효 인큐베이션은 바람직하게 유산소 조건하에서 정치 배양(stationary culture) 또는 액내배양(submerged culture)(예를들어, 고반 플래스크, 발효조)으로 행해질 수 있다. 배양 및 인큐베이션은 적당하게 약 3-9, 바람직하게 약 4-8, 가장 바람직하게 약 6-7인 pH로 진행될 수 있다. pH는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산칼슘, 암모니아, 이온교환 수지같은 무기 또는 유기 산이나 염기를 부가함에 의해 또는 인산염, 프탈산염 또는 Trisⓡ같은 완충제를 부가함에 의해 조절될 수 있다. 인큐베이션 온도는 적당하게 약 18℃-31℃로 유지되며 약 20℃-28℃가 바람직하고 약 24℃-27℃가 특히 바람직하다.
본 발명의 다른 대표적인 방법에 따라, 상기 방법은 유산소 조건하에서 배양의 시작시에 기질을 배양 배지에 부가함에 의해 편리하게 행해진다. 또한, 기질은 발효 인큐베이션 동안이나 배양이 완결되었을 때 글루코스같은 또 다른 탄소원과 함께 또는 단독으로 부가될 수있다.
발효 브로쓰내 배양물 증식이 개시된후, 7-24시간의 기간동안에 기질을 배양 배지에 부가하는 것이 바람직하다.
7-12시간인 초기 균 배양기간이 지난후에 기질을 전체 발효에 대해 연속적으로 부가할때 바람직한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 연속부가에 대해 바람직한 공급율은 브로쓰 리터당 시간당 0.001-2g이며 더욱 바람직하기로는 브로쓰 리터당 시간당 0.01-1g이고 가장 바람직하기로는 브로쓰 리터당 시간당 0.6-0.8g이다. 배지내 기질 농도는 사용된 조건에 따라 변할 수 있다. 실제로, 배지내 기질 농도는 이것이 배양물에 부가되는 방법에 따라서 0.01-10 중량%, 바람직하게 약 0.1-5중량%, 더욱 바람직하게 0.5-2중량%로 변할 수 있다.
통상적인 조건하에서, 광학적으로 활성인 감마 및 델타락톤의 혼합물이 일반적으로 생성되며 감마 락톤이 실질적으로 바람직하다. 기질의 Z그룹, pH, 산소 및 영양물질의 조절로 감마 락톤 대 델타 락톤의 상대비율이 변할 수 있지만, 흔히 감마 락톤이 우세하다. 그러나, 어떤 조건하 어떤 Mucor 종으로는 델타 락톤이 우세하다. 실시예는 감마 락톤 대 델타 락톤의 비율 변화에 대한 상세한 사항을 설명한다. 락톤 혼합물이 사용되거나 또는 더 정제되어 순수한 감마 및/또는 델타 락톤을 회수할 수 있다.
반응 시간은 사용된 미생물 균주, 배양 배지의 조성물 및 존재하는 기질과 같은 특정한 인큐베이션 한정요소에 따라 변한다. 일반적으로, 고반 플래스크 배양은 사용된 기질과 미생물 균주에 따라 2-240시간, 바람직하게 48-192시간, 더욱 바람직하게 72-144시간을 필요로 한다. 그러나 발효조가 사용될 때, 발효 기간은 90시간 이하로 단축될 수 있다.
인큐베이션은 유산소 조건하에서 행해지며 인큐베이션 브로쓰내 용해된 산소 함량은 20-100%, 바람직하게 30-80%, 더욱 바람직하게 40-60%의 포화도이다. 또한, 바람직하게 기질은 수성상 및 미생물과 연속적으로 접촉하여 유지된다. 일반적으로 강력한 고반이나 세이킹(shaking)이면 충분하지만 필요하다면 Tween 80같은 계면활성제를 부가하여 기질의 분산을 도울 수 있다. 실리콘 오일, 폴리알킬렌 글리콜 유도체 또는 콩기름 같은 통상적인 기포방지제(antifoam agents)가 기포형성을 조절하는데 사용될 수 있다.
미생물을 발효에 사용하는 형태가 중요하지는 않다. 이러한 발효는 배양 용액으로부터 분리된 미생물을 이용하거나 또는 공지된 방법으로 상기 미생물로부터 분리된 효소 추출물을 이용해 행해질 수 있다. 후자의 경우, 반응은 수성 용액, 예를들어 완충 용액, 생리적 식염수, 신선한 영양 용액, 또는 물내에서 편리하게 행해질 수 있다. 분리된 미생물이나 이것의 효소 추출물은 고체 지지체상에 고정화될 수 있으며 필요한 변형이 각각 행해진다.
고정화된 형태의 효소 추출물을 연속 방법에 사용하는 것이 편리할 것이다. 기질의 발효는 또한 균류의 돌연변이체로 행해질 수 있다. 락톤의 발효적 생산정도는 크로마토그래피(기체-액체, 박층 또는 고압 액체) 및 스펙트로스코피(IR 및 NMR)같은 표준 분석기술을 이용해 락톤 농도를 분석함에 의해 검사될 수 있다. 발효는 또한 기질, 글루코스, 산소의 소모를 측정하거나 pH변화를 측정하여 검사될 수 있다. 발효는 일반적으로 모든 기질이 소모되었을때나 또는 락톤 농도가 더 이상 증가하지 않을 때 종결된다. 본 발명의 최종 생성물 분리 및 정제는 용매 추출, 증류, 크로마토그래피적 분리, 고압 액체 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방법으로 행해질 수 있다.
본 발명은 통상적인 합성방법으로 락톤을 생산하는데 필요한 복잡한 단계들을 피할 수 있으며 리터당 최고 몇 밀리그램의 생성물을 얻는 통상적인 발효방법과 비교하여 고수율의 락톤(예를 들어 브로쓰 리터당 5-15그램)을 생산한다. 다음 실시예는 본 발명의 구체예를 더욱 완전히 설명하기 위해 주어지지만 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
M. subtillissimus 발효
24시간 배양한 Mucor subtillissimus(FDO 분리 5.6)의 브로쓰 배양물 10㎖을 2g 펩톤, 1g 효모 추출물 및 20g 덱스트로스를 함유하는 200㎖의 무균 브로쓰(이후로 PYE 브로쓰로서 언급됨)에 접종하였다. 이 배양물을 27℃에서 인큐베이트하고 250rpm에서 21시간동안 교반하였다. 이때에 배양물의 pH를 7.0으로 조절하고 1.5g의 에틸 헥사노에이트를 부가하였다. 48시간의 부가적인 발효기간후에, pH를 24시간마다 7.0으로 조절하는 동안, 배양 브로쓰를 염화 메틸렌으로 추출하고 추출물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 증류후에, 회수된 추출물은 0.75g이며 5.2%의 델타-헥사락톤과 0.9%의 감마-헥사락톤을 함유하였다. 다른 증식 배지와 기질을 이용한 또 다른 결과를 표 1에 기록하였다. 모든 경우에 추출물은 부가된 기질의 40-50중량%가 되었다.
[표 1]
1. Difco Laboratories.
2. PYE 브로쓰는 1% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 10% 덱스트로스로 구성됨
실시예 2
M. circinelloides 발효
24시간 배양한 Mucor circinelloides의 브로쓰 배양물(FDO 분리 9.17) 10㎖을 200㎖의 PYE 브로쓰에 접종하였다. 상기 조건하에서 24시간 인큐베이션한후, pH를 7.0으로 조절하고 1.5g의 에틸옥타노에이트를 부가하였다. 48시간의 부가적인 발효후에, 브로쓰를 유기 용매로 추출하였다. 회수된 추출물은 0.8g이고 49.4%의 감마-옥타락톤과 미량의 델타-옥타락톤을 함유하였다. 다른 증식 배지와 기질을 이용한 또 다른 결과를 표 2에 기록하였다. Mucor circinelloides의 FDO 균주가 현재 주요 배양물 기탁기관에 기탁되어있는 균주와 형태적으로 유사하지만, 더 높은 수율의 락톤을 생산한다. 그러므로, FDO 배양물을 ATCC에 기탁하여 분류하였다.
[표 2]
3. 이 배양물은 이것의 부작용을 제한하기위해 유리산(free acid)을 결합시키는데 사용된 음이온 수지인 Dowex 203을 20g 함유함.
NM=측정되지 않았음.
실시예 3
여러 Mucor 종과 에스테르를 이용한 발효
다음 Mucor 종들 각각을 24-48시간 동안 전술된 바와같은 PYE 브로쓰내에서 배양한 다음 1%(v/v)의 에틸 옥타노에이트를 부가하였다. 3-5일의 부가적인 발효후에 배양물을 추출하고 추출물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 각 추출물은 다르게 표시한 경우를 제외하고 부가된 기질의 40-60 중량%가 되었다. 결과를 다음 표 3에 기록하였다.
[표 3]
a. 표시가 되어있는 경우를 제외하고 ATCC 균주번호임.
* = CBS ↑ = NRRL ** = DSM.
b. 기질과 함께 5일 발효한 후 이들 샘플의 회수 중량%가 10중량% 이하였음.
실시예 4
여러 Mucor 종과 아미드를 이용한 발효
다음 Mucor 종 각각을 24시간 동안 전술된 바와같은 PYE 브로쓰내에서 배양한 다음 0.5%(v/v)의 옥탄아미드 및 1.5%(v/v) Tween 80을 부가하였다. 3일간의 부가적인 발효후에 배양물을 추출하고 추출물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 각 추출물은 부가된 기질의 50-60 중량%가 되었다. 결과를 다음 표 4에 기록하였다.
[표 4]
실시예 5
M. circinelloides 와 에스테르의 대규모 발효
4L의 PYE 브로쓰가 들어있는 5L 들이 발효 용기에다 20시간 배양한 M. circinelloides(FDO분리 9.17)의 배양물 800㎖을 접종하였다. 온도를 27℃로 유지시키고 pH를 7.1(±0.2)로 유지시키며 산소 농도를 자동 조절에 의해 50%(±15%) 포화도로 유지시켰다.
7시간 인큐베이션한 후에 에틸 옥타노에이트를 총 40시간의 발효기간동안 0.7㎖/브로쓰/시간의 비율로 브로쓰내에 펌프시켰다. 상기 브로쓰 1리터를 산성화시키고 염화메틸렌으로 추출하였다. 증류후에 25g 및 20g 인 추출물을 회수하였다. 증류물은 발효 브로쓰 리터당 회수된 11.2g의 락톤에 상당하는 56% 감마-옥타락톤을 함유하였다.
실시예 6
M. subtillissimus 와 에스테르의 대규모 발효
20시간 배양한 Mucor subtillissimus(FDO분리 5.6)의 PYE 브로쓰 배양물 400㎖을 20L 발효조내에서 15리터의 PYE 브로쓰에 접종하였다. 온도를 27℃로 유지하고 pH를 6.5로 유지시키며 용해된 산소 농도를 자동 조절에 의해 50% 포화도로 유지시켰다.
발효조내에서 5시간 인큐베이션한 후에 에틸 카프로에이트를 0.4㎖/시간/배양브로쓰 리터 비율로 24시간동안 배양물내로 펌프시켰다. 다음에 브로쓰를 산성화시키고 유기용매로 추출하였다. 증류한 후, 25g의 샘플을 회수하였으며 이 샘플은 2.6g 감마-헥사락톤, 7.3g델타-헥사락톤 및 13.5g 카프론산을 함유하였다.
실시예 7
M. hiemalis 와 에스테르의 대규모 발효
24시간 배양한 Mucor hiemalis(ATCC 번호 20028)의 PYE 브로쓰 배양물 100㎖을 20L 발효조내에서 15리터의 PYE 브로쓰에 접종하였다. 온도를 27℃로 유지하고 pH를 6.5로 유지시키며 용해된 산소를 20% 로 유지시켰다. 발효조내에서 18시간 인큐베이션한 후에 에틸 데카노에이트를 0.6㎖/시간/브로쓰 리터 비율로 52시간동안 배양물내로 펌프시켰다. 다음에 배양물을 산성화하고 유기용매로 추출하였다. 추출물을 증류시킨후에 총 133g을 회수하였으며 이 샘플은 3g 감마-데카락톤을 함유하였고 나머지는 하이드록시 에스테르와 산과의 혼합물이었다.
실시예 8
살구맛 음료
20g 수크로스와 0.1g 식염을 1L 물에 용해시켜 수성의 당 스톡(stock)을 제조할 수 있다.
2L의 이러한 수성 수톡에다 감마 헥사락톤(10%), 감마 및 델타 옥타락톤(40%), 감마 및 델타 데카락톤(40%) 및 감마도데카락톤(10%)의 혼합물 약 0.2g을 부가할 수 있으며 퍼센트는 총 혼합물의 중량에 기준한다.
1-2g의 검 알기네이트를 혼합물에 부가하여 농후하게 만들 수 있으며 유화제로서 0.5-1g레시틴을 부가할 수 있다. 혼합물을 고속 혼합기에 넣어 균질화한 다음 병에 넣어 냉장시킬 수 있다. 결과의 생성물은 살구맛을 지닌 달콤한 음료이다.

Claims (26)

  1. C4-21의 길이인 포화되거나 불포화된 카복실산, 이것의 염, 이것의 알킬에스테르, 이것의 모노, 디 또는 트리글리세라이드 또는 치환되지 않은 이것의 모노알킬 또는 디알킬 아미드를 포함하는 기질과 함께 Mucor 속의 균류 배양물 또는 이것의 효소 추출물을 영양 브로쓰내에서 인큐베이션하여 락톤을 얻는 단계를 포함하는, C4-20델타 락톤이나 감마 락톤을 제조하는 미생물학적 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 락톤이 다음 구조식을 갖는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 기질이 다음 구조식을 갖는 방법.
    R2COZ
  4. 제 3항에 있어서, COZ 그룹에 인접한 알킬 그룹이나 알케닐 그룹의 최소 4개 탄소 부분이 분지되지 않은 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 인큐베이션이 3-9인 pH, 18-31℃인 온도에서 행해지고 영양브로쓰가 질소와 탄수화물의 영양원을 함유하면서 18-100%로 용해된 산소를 함유하는 분위기와 접촉하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 영양 브로쓰 내 기질 농도가 영양 브로쓰의 총중량에 대해 0.01-10 중량%이고 기질이 영양 브로쓰 리터당 시간당 1㎎-2g의 공급율로 연속해서 부가되며 인큐베이션 기간이 1-10일인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 영양 브로쓰 내 기질 농도가 영양 브로쓰의 총중량에 대해 0.01-10 중량%이고 질소원이 영양 브로쓰 총중량에 대해 0.01-3 중량% 농도인 펩톤이고 효모 추출물은 0.1-2 중량% 농도이며 탄수화물이 영양 브로쓰 총중량에 대해 2-20 중량% 농도인 덱스트로스이고 기질이 영양 브로쓰 리터당 시간당 1㎎-2g의 공급율로 연속해서 부가되며 인큐베이션 기간이 1-10일인 방법.
  8. 제7항에 있어서, pH가 4∼8이고 온도가 20 -28℃이며 효소 추출물 농도가 0.1-2 중량%이고, 펩톤 농도가 4-15 중량%이고 덱스트로스 농도가 4-15 중량%이고 분위기가 30-80 중량% 용해된 산소를 함유하며 기질 농도가 0.1∼5 중량%이고 공급율이 리터당 시간당 0.01∼1g이며 인큐베이션 기간이 2∼8일인 방법.
  9. 제7항에 있어서, pH가 6 - 7이고 온도가 24 - 27℃이며 효소 추출물 농도가 0.5 - 1 중량%이고, 펩톤 농도가 0.1 - 2 중량%이고 덱스트로스 농도가 8-12 중량%이고 분위기가 40 - 60 중량% 용해된 산소를 함유하며 기질 농도가 0.5 - 2 중량%이고 공급율이 리터당 시간당 0.6 - 0.8g이며 인큐베이션 기간이 3 - 6일인 방법.
  10. 제7항에 있어서, pH가 6 - 7이고 인큐베이션 초기의 덱스트로스 농도가 10중량%이며, 비타민 B 군이 보충물로서 또는 효모추출물로서 부가되고 기질 공급율이 리터당 시간당 0.6g이며 분위기가 40 - 60% 용해된 산소인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 영양 브로쓰내 락톤 농도를 검사하는 단계 및 락톤 농도가 일정해졌을 때 인큐베이션을 종결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 기질이 알킬 에스테르인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 알킬 그룹이 C1-3길이인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 기질이 치환되지 않은 아미드인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 감마 락톤과 델타 락톤의 혼합물이 생성되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 혼합물이 델타 락톤을 상당량 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 혼합물이 감마 락톤을 상당량 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 감마 락톤과 델타 락톤을 분리되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 감마 락톤이나 델타 락톤이 광학적으로 활성인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 감마 락톤이나 델타 락톤이 광학 이성체의 혼합물인 방법
  21. 제1항에 있어서, 감마 락톤이 생성되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 델타 락톤이 생성되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 감마-옥타 락톤이 생성되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 기질이 에틸 옥타노에이트인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 균류의 효소 추출물이 사용되는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 살아있는 균류의 배양물이 사용되는 방법.
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