CN101289646A - 嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脱氨酶、5’核苷酸酶的联合生产工艺 - Google Patents
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Abstract
血清腺苷脱氨酶和5’－核苷酸酶生化诊断试剂盒中所用的嘌呤核苷磷酸化酶对底物特异性有着特殊的要求。本发明旨在提供一种生产符合该要求的嘌呤核苷磷酸化酶，以及偶联生产腺苷脱氨酶和5’－核苷酸酶的发酵纯化工艺。采用这种生产工艺，从一步发酵中获得三种有用的酶制剂，工艺简单，周期短，最大的程度利用副产物，有很高的经济效益，嘌呤核苷磷酸化酶使用在腺苷脱氨酶以及5’－核苷酸酶测定试剂盒中，完全符合各项性能指标。
Description
技术领域
本发明属于诊断酶制剂领域。
本发明涉及一种来自于芽孢杆菌(Bacillus sp.，ACCC10741)的嘌呤核苷磷酸化酶(PurineNucleoside Phosphorylase，PNP，酶学分类号为EC 2.4.2.1)的生产工艺，该酶对肌苷有专一的底物特异性而对腺苷和次黄苷酸没有底物特异性，可用于测定血清腺苷脱氨酶(AdenosineDeaminase，以下简称为ADA)和5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，以下简称为5’-NT)的活性。本工艺可高效大量产生嘌呤核苷磷酸化酶，同时产生用于制备诊断试剂盒质控品的腺苷脱氨酶和5’-核苷酸酶，可通过纯化工艺逐一分离，经冷冻干燥后得到终产品。
技术背景
嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase，PNP，以下简称为PNP)，该酶根据底物特异性不同催化如下通用反应：
血清中的ADA为反映肝损伤的敏感指标，5’-NT的测定主要用于肝胆疾病的诊断及肝胆疾病与其他疾病的鉴别诊断，因而这两者是临床常做的生化检验项目。PNP在ADA和5’-NT的酶学检测中起到非常重要的作用。检测机理如下：
1)腺苷脱氨酶
2)5’-核苷酸酶
两者产生的次黄嘌呤都在XOD的作用下产生H2O2，最后偶联Trinder氏反应，比色测定：
此法灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好。近年来，国内外学者对该法进行了深入的研究并加以改良，使之广泛地应用于临床。目前ADA和5’-NT商品化试剂盒多采用该法。
在图1中可以看到微生物嘌呤代谢过程中，PNP(EC 2.4.2.1)可以作用于多种底物，例如腺苷(Adenosine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)、鸟嘌呤(Guanine)、肌苷(Inosine)等。但是从前面所述的试剂盒检测原理来看，如果PNP对腺苷(Adenosine)或者次黄苷酸(Inosine 5’-Monophosphate Disodium Salt，IMP)有底物特异性，则必然对检测产生很大的干扰，最终影响试剂盒的准确度。如图2所示，腺苷与肌苷在分子结构上的差别非常微小，唯一的区别是嘌呤环上的取代基不同：腺苷是-NH2取代，而肌苷是-OH取代，因此要求在ADA和5’-NT试剂盒中所使用的PNP有非常好的底物识别性。
现阶段所报道的PNP来源很多，不同来源的PNP底物特性性差异很大，表1中列举了不同来源的代表性PNP的底物特异性的不同：
表1不同来源的代表性PNP比较
| 参考文献或专利 | 菌种 | 底物特异性 |
| JP2222677 | FERM P-9666，Bacillus such asBacillus stearothermophilus JTS859——嗜热脂肪芽胞杆菌 | 作用于嘌呤核苷酶和碱基特别是腺嘌呤和腺苷 |
| JP2002017354 | Streptococcus thermophilus——嗜热的链球菌的转化菌株 | 利用肌苷，黄嘌呤核苷(Xanthosine)，鸟苷(Guanosine) |
| APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，May 1990：1435-1439：Purification andCharacterization of Purine NucleosidePhosphorylase from Proteus vulgaris | Proteus vulgaris——普通变形菌 | Km为3.9×10-5(肌苷)，2.9×10-5(鸟苷，Guanosine)，但是其不能催化腺苷 |
| 多篇文献 | E.coli——大肠杆菌 | 体内存在两种PNP，一种是由deoD基因编码的PNP，其由较广的底物特异性，但是不能作用于黄嘌呤核苷，另一种PNP由xapA基因编码，只作用于黄嘌呤核苷 |
| 本专利 | Bacillus——芽孢杆菌 | 该酶对肌苷有专一的底物特异性而对腺苷和次黄苷酸没有底物特异性 |
在过去的研究过程中，也发现了来自于芽孢杆菌(Bacillus)的腺苷脱氨酶(Powell，JoanF.；Hunter，JR.Adenosine deaminase and ribosidase in spores of Bacillus cereus.Biochem J.1956Mar；62(3)：381-387.[PubMed])、5’-核苷酸酶(Gerald B.Jacobsen and Victor W.Rodwell.ABacillus Ribonucleic Acid Phosphodiesterase with Associated 5′-Nucleotidase Activity.J.Biol.Chem.1972.247：5811-5817)，以及嘌呤核苷磷酸化酶(HL Engelbrecht，HL Sadoff.Properties ofPurine Nucleoside Phosphorylases from Spores and Vegetative Cells of Bacillus cereus and TheirModification by Orthophosphate Journal of Biological Chemistry，1969.244(22)：6228-6232)，但对其是否适于在诊断试剂盒中使用没有报道，也没有三种酶偶联生产工艺的相关报道。
发明内容
本发明在于提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，以及腺苷脱氨酶(ADA)和5’-核苷酸酶(5’NT)的生产工艺。
为了确定芽孢杆菌(Bacillus sp.)所产的PNP，ADA和5’-NT的酶活大小，采取以下的酶活测定方式：
1)PNP
①原理：
在293nm测定尿酸的生成
酶活定义：1U为在特定条件下每min产生1μmol尿酸所用的酶量
②测定试剂：
A.K-phosphate buffer pH7.7，50mM
B.Inosine溶液：32mM(将85.8mg的肌苷(MW＝268.23)加热溶解在10ml水中，可以在4度稳定存在2周)
C.XOD：60ku/l(溶解在A缓冲液中，必须新鲜配制)
D.酶液：用A溶解
③具体操作过程：
1取下列反应液放在37度反应：K-phosphate buffer pH7.7 2.7ml
Inosine溶液： 0.2ml
XOD： 0.1ml
2.加入0.05ml的酶液
3.记录293nm下，37度反应3-4min的反应速率
线性范围：0.2-1ku
④酶活计算公式：
酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C
Vt：总体积(3.05ml)
Vs：酶液样品体积(0.05ml)
12.5：在测定条件下尿酸的摩尔吸光系数(cm2/μmol)
1.0：光径长度(cm)
df：稀释倍数
C：溶液中酶浓度
2)ADA和5’-NT的测定：分别采用北京利德曼生化技术有限公司的腺苷脱氨酶测定试剂盒-ADA、5’-核苷酸酶测定试剂盒-5’-NT测定酶活。
本发明所生产的PNP符合诊断试剂盒中所采用的工具酶的特殊要求：
1)专一的底物特异性：对肌苷有专一的底物特异性，而不催化腺苷(Adenosine)或者次黄苷酸(Inosine 5’-Monophosphate Disodium Salt)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)反应，对鸟苷(Guanosine)有部分催化作用，本专利的PNP底物特异性见表2：
表2.来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)PNP底物特异性
| 底物(0.2mM) | 相对活性 |
| 肌苷(Inosine) | 100 |
| 腺苷(Adenosine) | 0 |
| 次黄苷酸(Inosine 5’-Monophosphate Disodium Salt) | 0 |
| 次黄嘌呤(Hypoxanthine) | 0 |
| 黄嘌呤(Xanthine) | 0 |
2)在较宽pH值范围内有良好的适应性：由于不同使用者pH值需要不同，有可能使用在偏酸性的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸，缓冲范围pH5.4～6.8]缓冲液中，也有可能使用在偏碱性的硼酸缓冲液(borate，缓冲范围pH8.5～10.0)中，因此要求所使用的工具酶必须能在较宽的pH范围内稳定性比较好。图3为本发明中PNP在不同pH缓冲液中，30度水浴放置16小时后测定的相对酶活，图4为将同一份样品在不同pH测活体系中的相对酶活曲线，从中可以看出该酶的pH稳定性(pH Stability)范围为：pH 6.0-9.0(30℃，16hr)，最适pH(OptimumpH)为：7.5-8.0。
3)热稳定性好：商品化的诊断试剂盒，虽然要求保存在4度环境中，但是往往因为运输，检验使用过程以及周围环境的温度变化，试剂盒中的成分至少应该能够承受45度的高温而不丧失活性，因此要求诊断工具酶有较好的热稳定性。图4为本发明中PNP酶液(15ku/l，K-phosphate，pH7.7)在不同的温度下放置30min后测定其相对活性曲线，从图4可以看出：该酶温度稳定性(Thermal Stability)良好，在45度以下半个小时可保持95％以上的活性。
4)温度依赖性符合试剂盒需要
由于血清ADA和5’NT的测定实验是在人体的生理温度下进行的，因此要求商品化诊断试剂盒中的成分在37度又较高的生理活性。图5为该酶的温度依赖性测定结果。从图5可以看到该酶的最适温度(Optimum Temperature)范围为55-60℃，但在37度时的活性为最高活性的60％以上，完全符合诊断试剂盒的要求。
本发明工艺可同时生产PNP、ADA和5’NT。具体的生产工艺如下：
1)本专利中适合于芽孢杆菌(Bacillus sp.)生长的培养基包括：LB培养基(包括蛋白胨、酵母粉、NaCl)、营养肉汤培养基(包括牛肉膏，蛋白胨，NaCl)、硝酸盐肉汤培养基(包括牛肉浸出物，蛋白胨，示蛋白胨，硝酸钾)，其中诱导培养基中加入0.1-2％的肌苷作为诱导物，必要时加入微量元素提供菌体生长的需要。该菌种的生长温度为25～37℃，最佳培养温度为30-32℃。培养基的pH一般为6～8.5，最适pH在7.2左右。本专利中的芽孢杆菌为比较好氧的菌种，发酵罐空气流速为10～20l/min，搅拌速度150～350rpm/min，培养18～40小时后，离心所得到的培养基，收集菌体。
2)将菌体悬浮于磷酸钾缓冲液中。加入溶菌酶，37℃，1h，使用细胞破碎仪破碎细菌，离心得到上清。加入2～10％硫酸链霉素或者pH7.5的饱和硫酸精蛋白溶液直至没有沉淀产生，离心得到上清。加入30-50％硫酸铵(一级硫酸铵沉淀)去除大部分杂蛋白，在获得的上清中继续加入硫酸铵至终浓度为75-85％(二级硫酸铵沉淀)，离心得到沉淀，复溶。
3)采取离子交换或者疏水层析使ADA从复溶液中分离得到ADA组分，使用凝胶过滤收集第一峰得到5’-NT组分，收集第二峰得到PNP组分。采用疏水层析纯化时，每个步骤纯化收率见表3，PNP最终收率在50％左右。
表3来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)的PNP纯化
4)通过冷冻干燥得到终产品，产品呈白色粉末状，在此过程中需要加入冻干保护剂。在-20℃保存可以稳定12个月
将进口商品酶与自制PNP冻干品同时配制ADA和5’NT测定试剂盒，按照商品化试剂盒检验的方法进行实验。按照商品化试剂盒产品说明书在自动生化仪上，测定以下几个指标：试剂的空白速率(PNP中如果混有ADA、5’NT，则空白速率会增加)、测定准确度(在质控的靶值范围内：ADA质控靶值30±5u/l，5’NT质控靶值40.0±7.2u/l)，42度加速三天稳定性(质控血清的数值变化在±20％范围之内)。结果表明(表4)：自制的PNP在性能上完全可以与进口产品相当，各项指标完全符合试剂盒要求。
表4.对照与自制酶制剂配入试剂盒的性能对比
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：PNP发酵工艺
发酵培养基：
LB培养基：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、NaCl 10g/l(固体培养基加入琼脂1％)pH7.0
诱导培养基：葡萄糖2g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、尿素1g/l、NaNO3 0.5g/l，NaCl 5g/l、MgSO40.5g/l、K2HPO42g/l、肌苷5g/l
1)菌种制备(一级种子)：将保藏的芽孢杆菌接在LB固体培养基上，pH值为7.0，30℃培养15～24小时长出单菌落。
2)摇瓶培养(二级种子)：将一级种子单菌落接种于含200ml LB培养基的1L三角瓶中，在30℃，和不断搅拌通氧条件下培养8-15小时，取样在紫外分光光度计上测定菌体密度600nm的吸光度值，OD600达到0.8-1.2之间进行下一步骤。
3)30L发酵罐培养(三级种子)：取二级种子按照1％接种量接入含有15L LB培养基的发酵罐中，搅拌速度180r/min，通气量2.0m3/h，30度培养8h。
4)300L发酵罐培养：取三级种子，接入含有200L有诱导培养基的发酵罐中，搅拌速度200rpm/min，通气量200m3/h，培养时间24～30小时，600nm的吸光度值在15-18之间结束发酵。
其中：菌体密度OD600测定：发酵液经合适倍数的稀释后，用紫外分光光度计在600nm处测其光吸收值和稀释倍数的乘积即发酵液的菌体密度(OD600)。
实施例2：PNP，ADA和5’-NT的纯化工艺
1)发酵后的发酵液200L利用连续流离心机离心得到菌体，使用10L浓度为50mM，pH7.7磷酸钾缓冲液重悬菌，加入200g溶菌酶搅拌混匀，37℃温育1-2h。
2)使用高压匀浆机(压力800mbar)，循环两次，破碎细菌，高速冷冻离心机8000rpm，离心15min去除菌体，得到胞内粗酶液9.8L。
3)在粗酶液中加入pH7.5的饱和硫酸精蛋白溶液直至没有沉淀产生，4度8000rpm离心15分钟去除沉淀得到9.8L上清，边搅拌边加入3077g硫酸铵(50％，314g/l)——该操作在4度冷室中进行，离心同上步骤获得上清9.7L。在获得的上清中继续加入2625g硫酸铵至终浓度为85％(250g/l)，离心得到沉淀。用10L磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.7)复溶沉淀，离心，上清液过0.22μm的膜作为下一步纯化的样品。
4)疏水层析分离ADA
层析填料：Octyl sephsrose 4 fast flow；
层析柱：BPG 100/500(其中装柱体积为1CV——柱体积)
A.平衡缓冲液：PBS+1M(NH4)2SO4
B.洗脱缓冲液：①PBS+0.6M(NH4)2SO4；②PBS
其中：PBS缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 4.3mM，KH2PO4 1.4mM用A平衡层析柱，10L样品上样，用A平衡2×CV，缓冲液B-①洗脱2CV，收集离子强度大于60mAU的洗脱峰1，然后用缓冲液B-②洗脱1CV，收集大于30mAU的洗脱峰2。洗脱峰1中存在大部分的PNP和5’-NT，洗脱峰2中得到ADA。
5)凝胶过滤分离5’-NT
层析填料：Sephacryl S-200HR；
层析柱：COLUMN XK 50/100(其中装柱体积为1CV)
平衡、洗脱缓冲液：PBS
用PBS平衡柱，5％CV上样，继续用PBS洗脱，收集大于30mAU第一个洗脱峰1，收集大于60mAU的洗脱峰2。在洗脱峰1得到5’-NT，洗脱峰2中得到PNP。
实施例3.PNP，ADA和5’-NT的冻干
将上例中纯化所得的ADA和5’-NT酶液，加入2％甘露醇和10％NaCl进行冻干，PNP酶液中加入2％甘露醇冻干，冻干收率为85％。冻干酶制剂在-20℃保存可以稳定12个月。
实施例4.PNP在诊断试剂盒中的适用性检验
ADA以及5’-NT测定试剂盒配方如表5，表6。
表5.腺苷脱氨酶试剂盒配方
| 组成 | 溶液的浓度 |
| R1：TRIS缓冲液 | 150mM pH＝7.4 |
| 4-AA | 4mM |
| PNP | 0.1u/l |
| XOD | 700u/l |
| POD | 2Ku/l |
| R2：缓冲液 | 50mM pH7.0 |
| 腺苷 | 10mM |
| N，N二甲基间甲苯胺 | 2mM |
表6.5’-核苷酸酶试剂盒配方
| 组成 | 溶液的浓度 |
| R1：HEPES缓冲液 | 100mM pH＝7.2 |
| 4-AA | 4mM |
| PNP | 0.1u/l |
| XOD | 700u/l |
| POD | 2Ku/l |
| R2：HEPES缓冲液 | 100mM pH7.2 |
| 次黄嘌呤核苷酸 | 10mM |
| 2，4，6三碘酚羟基苯甲酸 | 2mM |
将配制好的对照试剂和自配酶试剂，在日立7060自动生化仪上定标得到试剂的空白速率(S1)，检测ADA以及5’-NT质控各三次，求其均值。新配制的试剂在7060上定标并测定质控的数值，记录S1。放入42℃温箱，3天后用试剂检测质控数值，检测前不需重新定标。
附图说明：
图1是微生物体内的嘌呤代谢途径图
图2是腺苷和肌苷的分子结构图
图3是PNP的pH稳定性图(15ku/l溶解在不同pH的缓冲液中，在30度放置16h，测定酶活)(30℃，16hr-treatment with 50mM buffer solution：pH4.0-6.0，acetate：pH6.0-9.0，K-phosphate；pH9.0-10.0，borate)
图4是PNP的pH活性图(37℃，5min-reaction in 50mM buffer solution：pH4.0-7.0，acetate；pH6.5-8.5-K-phosphate；pH8.0-9.0，Tris-HCl；pH8.5-10.5.borate.)
图5是PNP的温度稳定性图(30min-treatment with 50mM K-phosphate buffer，pH7.7.enzymeconcentration：15U/ml)
图6是PNP的温度依赖性图(5min-reatcion in 50mM K-phosphate buffer，pH7.7)。
Claims (4)
1.通过实验室间交流，本实验室获得一株芽孢杆菌(Bacillus sp.，ACCC10741)，在特定的培养生产工艺下，得到一种应用在血清腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase，ADA)和5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，5’-NT)商品化检测试剂盒中所使用的工具酶——嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase，PNP)。该酶特异性的作用于肌苷(Inosine)，而对腺苷(Adenosine)和次黄苷酸(Inosine 5′-Monophosphate Disodium Salt，IMP)没有底物特异性，因此可在血清ADA和5’-NT测定试剂盒中使用。
2.权利1中的芽孢杆菌在发酵过程中不但可以产生嘌呤核苷磷酸化酶，同时还可以得到腺苷脱氨酶和5’-核苷酸酶，根据这三个酶分子量、等电点等蛋白性质的不同，利用凝胶过滤、离子交换、疏水层析等蛋白质分离纯化手段，将其逐一分离，这就在得到主产物——嘌呤核苷磷酸化酶的同时，获得了腺苷脱氨酶以及5’-核苷酸酶。该过程工艺简单，周期短，最大的程度利用副产物，有很高的经济效益。
3.按权利1所述的嘌呤核苷磷酸化酶发酵生产工艺，其特征如下：
1)将权利要求1所述的芽孢杆菌接在LB固体培养基上，LB固体培养基的成分有蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂、pH值为7.0-7.2、在高压灭菌锅(120℃，0.15MPa)中灭菌20分钟，30℃培养15-24小时长出单菌落。
2)将单菌落转接到种子罐扩大培养，罐中培养基成分有一定的碳、氮配比的蛋白胨与酵母粉、NaCl、MgSO4、KH2PO4，K2HPO4，pH值为7.0-7.2，在高压灭菌锅(120℃，0.15MPa)中灭菌20分钟。在30℃，和不断搅拌通氧条件下培养，取样在紫外分光光度计上测定600nm的吸光度值，OD600达到0.8～1.2之间进行下一步骤。
3)按照1～5％的接种量转接到发酵罐中，培养基成分包括一定量的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaNO3，NaCl、MgSO4、KH2PO4，K2HPO4以及诱导物肌苷，培养条件同步骤2，培养时间18-26个小时，600nm的吸光度值在15～18之间结束发酵(设发酵液体积为V)。
4.按权利2所述的嘌呤核苷磷酸化酶纯化生产工艺，其特征如下：
1)权利3中发酵后的发酵液按照常规方法得到菌体，使用浓度为磷酸钾缓冲液(0.1V体积)重悬菌体，加入溶菌酶，37℃温育1-2h。其中磷酸钾缓冲液的浓度为20-50mM，pH值为6.8-7.8，溶菌酶的终浓度为10～150mg/ml发酵液。
2)使用高压细胞破碎仪破碎细菌，4度下10000rpm离心20min去除菌体，得到胞内粗酶液。
3)在粗酶液中加入硫酸链霉素或者硫酸鱼精蛋白等去除核酸杂质，离心步骤同步骤2)，使用硫酸铵沉淀进行初步分离，离心得到沉淀，复溶。
4)采取离子交换或者疏水层析使腺苷脱氨酶从复溶液中分离，得到腺苷脱氨酶，使用凝胶过滤收集第一峰得到5’核苷酸酶，收集第二峰得到嘌呤核苷磷酸化酶。
5)通过冷冻干燥最终得到终产品，产品成白色粉末状，在此过程中需要加入冻干保护剂。
在-20℃保存可以稳定12个月。嘌呤核苷磷酸化酶成品在腺苷脱氨酶以及5’-核苷酸酶测定试剂盒中使用完全符合各项性能指标。
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2007
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