CN102477462A - 酶法检测5’核苷酸酶试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶法检测5’核苷酸酶试剂盒。本发明试剂盒由试剂1和试剂2组成。本发明的试剂盒通过加入酶的复合促进剂，对反应的灵敏度提高，加速了5’核苷酸酶的反应；选用复合抑制剂，确保了反应的特异性；还添加酶保护剂，对试剂中的酶有很强的保护作用，提高了试剂的稳定性，本发明的试剂盒对酶的保护作用更明显，经过12个月后与没加保护剂的试剂相比，残存酶活率升高57％。本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。

Description

酶法检测5’核苷酸酶试剂盒

技术领域：

本发明涉及生物试剂，具体涉及一种酶法检测5’核苷酸酶试剂盒。

背景技术：

5’-核苷酸酶(5’Nueleotidme，5’一NT是一种糖蛋白，由两个分子量为7000的亚基组成。5’一NT的主要功能是参与核酸的分解代谢，并广泛存在于肝脏和各种组织中。当血清中此酶升高时，常见于肝脏系统疾病，如原发性和转移性肝癌，慢性肝炎，肝硬化，病毒性肝炎，梗阻性黄疸胆结石.胆囊炎等。5-NT的增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正比例关系。因此，5’一NT是诊断肝肿瘤及消化道肿瘤及消化道恶性肿瘤非常灵敏的酶学指标。在病变早期，当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时，该酶活性已明显增高。对于AFP(甲胎蛋白)阴性病例，其与AFP互补诊断肝癌的阳性率可达94％。另外，5’一NT特异性高，ALP在肝胆系统疾病和骨骼系统疾病时均可增高。5’一NT除肝胆系统疾病增高外，骨骼系统疾病一般均不升高。还可用于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸，后者5’一NT明显高于前者，以及发生胆汁淤积的高于未发生胆汁淤积的患者。

5’-NT用于其它方面的检测如：

有助于检测肺癌疾病。5’-NT活性变化与肺癌肿瘤细胞生长、发展和转归密切相关，是肺癌核苷酸代谢中重要的转化相关酶，监测其改变既可作为肿瘤恶变和衡量分化程度的指标，又是肿瘤生长的分子基础。因此可根据其增高不同程度来鉴别肺部良性与恶性疾患，由于当肿瘤并发肝、胆系统疾患时，5’-NT也可明显升高，故需结合病史进行分析和区别。但如与肺癌的血清肿瘤标志物联检以互补诊断，对发现肺癌有一定的辅助诊断作用，且方法简便、快速、准确。

有助于检测冠状动脉病变疾病。血清5’-核苷酸酶升高可能在冠心病发生发展中起到一定的保护作用，对此进行干预，如使用ATP制剂、腺苷、α1受体激动剂等有可能提高5’-核苷酸酶的含量及活性，可能对心血管事件的发生起到预防作用。

由于血清5′-NT测定对肝胆及多种疾病的诊断有较好的特异性和灵敏度，5’-NT已作为肝功能常规项目检查进入临床，将能使临床医生更全面地了解患者肝脏情况，提高其临床应用价值。在近20年中，测定方法得到不断开发和改进，先后发展了检测方法和相应的检测试剂，如：测磷比色法，其原理为5’-NT将次黄苷-5′-单磷酸盐(5′-IMP)脱氨产生次黄苷(Inosine)和磷酸(Pi)，后者与钼酸铵作用生成磷钼酸，再被还原剂还原成钼蓝，颜色深浅与释放的磷酸成正比。但测磷比色法试剂种类多，操作繁琐、费时，不适宜自动化分析，而且血清中ALP也能水解5’-磷酸腺苷生成相同的产物，反应过程中需加入Ni2+离子抑制ALP的非特异性反应，否则会影响测定结果的准确性。另一种方法为5’-NT催化5′-IMP水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot色反应(1859)测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清5’-NT活性单位，所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高。5’-NT偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)法因血清含氨干扰，以及测试系统中过高NADH造成非特异性氧化而无法计算。又如5’-NT测试法：Kalckar氏应用5’-NT偶联，嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleosidephosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)过氧化物酶(PEROXIDASE，PEO)；反应连续监测法：通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算5’-NT活性，但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。酶法测定5’-NT简便快捷、结果可靠，对肝胆疾患的诊断具有较高应用价值。酶法原理：

5’-IMP+H₂O5-NT＞次黄苷+NH₄ ⁺

次黄苷+Pi PNP＞次黄嘌呤+核糖-1-磷酸

次黄嘌呤XOD＞尿酸+H₂O₂

H₂O₂+4-AAP+EHSPT POD＞红色醌衍生物+H₂O

但是目前这种试剂的检测方法并不完善，一是PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)试剂价格昂贵，使用价格高，二是PNP试剂不稳定。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种加速5’核苷酸酶反应，提高试剂稳定性的酶法检测5’核苷酸酶的试剂。

本发明提供了一种酶法检测5’核苷酸酶试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2组成的：

试剂1：(3L)

缓冲液                     10-200mmol/L

toos(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)1-100mmol/L

Triton x-405(曲拉通405)    0.01-20ml/L

苯甲酸钠                   20-100mmol/L

FeCl2                      1-100mmol/L

PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)      10-20u/L

Xot(黄嘌呤氧化酶)          30-40u/L

Peo(过氧化物酶)            200-300u/L

甘油醛                     10-100g/L

砷酸钠                     10-100g/L

试剂2：(1L)

磷酸氢二钠                 10-200mmol/L

KCl                        10-500mmol/L

甘露醇                     10-200mmol/L

proclin300(生物防腐剂)     0.01-0.5ml/L

次黄苷-5’-单磷酸盐        10-200mmol/L

4-氨基替比林                1-5mmol/L

所述试剂1缓冲液选自TRIS(三羟甲基氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane)、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)或HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)。

本发明酶法检测5’核苷酸酶试剂盒在使用时，试剂1加检测样本后再加入试剂2，即可进行检测。

本发明的另一目的是提供了酶法检测5’核苷酸酶试剂盒的制备方法：包括下列步骤：

(一)制备试剂1：(3L)

(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；

(2)依次加入缓冲液、toos、Triton x-405(曲拉通405)苯甲酸钠、FeCl2、甘油醛、砷酸钠；

(3)最后加入酶：PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、Xot(黄嘌呤氧化酶)、Peo(过氧化物酶)；

(4)加入剩余的去离子水混合均匀；

(二)制备试剂2：(1L)

向容器内依次加入磷酸氢二钠、KCl、甘露醇、proclin300、次黄苷-5’-单磷酸盐、4-氨基替比林混合均匀。

本发明基于下列原理：

(1)选用促进剂加速5’核苷酸酶的反应，其中酶的复合促进剂为FeCl2、苯甲酸钠、TrionX-405(表面活性剂)；

(2)选用复合抑制剂，确保反应的特异性，抑制碱性磷酸酶的干扰，复合抑制剂为：甘油醛等；

(3)添加了特殊的酶保护剂如甘露醇，确保试剂的稳定性。

本发明的试剂盒检测效果好：

(1)0.1M FeCl₂、苯甲酸钠、Triton x-405作为复合激活剂对反应的灵敏度提高，时间缩短。

(2)本发明的试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂与没加保护剂的试剂相比，残存酶活率升高57％。

具体实施方式：

实施例1制备酶法检测5’核苷酸酶试剂盒

组成：

试剂1：(3L)

TRIS缓冲液                            50mmol/L

toos                                  2mmol/L

Triton x-405                          2ml/L

苯甲酸钠                              20mmol/L

FeCl2                                 3mmol/L

PNP                                   10u/L

Xot                                   30u/L

Peo                                   220u/L

甘油醛                                20g/L

砷酸钠                                80g/L

试剂2：(1L)

磷酸氢二钠                            50mmol/L

KCl                                   10mmol/L

甘露醇                                20mmol/L

proclin300                            0.5ml/L

次黄苷-5’-单磷酸盐                   15mmol/L

4-氨基替比林                    3mmol/L

制备：

(一)制备试剂1：(3L)

(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；

(2)依次加入TRIS缓冲液、toos  、Triton x-405(曲拉通405)苯甲酸钠、FeCl2、甘油醛、砷酸钠；

(3)最后加入酶：PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、Xot(黄嘌呤氧化酶)、Peo(过氧化物酶)；

(4)加入剩余的水混合均匀；

(二)制备试剂2：(1L)

向容器内依次加入磷酸氢二钠、KCl、甘露醇、proclin300、次黄苷-5’-单磷酸盐、4-氨基替比林混合均匀。

实施例2

本发明实施例1的试剂盒检测效果试验：

(1)0.1M FeCl₂、苯甲酸钠、Triton x-405作为复合激活对反应的影响：

试剂1中加入0.1M FeCl₂、苯甲酸钠、Triton x-405，与没有加入这些物质的试剂进行比对。

测定方法：

步骤一：输入参数于自动生化分析仪：温度37℃，主波长550nm，次波长800nm，

R1 225ul.R2 75ul.样本6ul

读数点：0-270-10

步骤二：测定前将R1与R2平衡至室温.，然后放入试剂仓内

步骤三输入定标因子：998

复合激活剂对反应的影响

(2)保护剂甘露醇对试剂盒中的酶活性的影响：加入0.1M的甘露醇对酶的保护作用

上述检测结果表明本发明的试剂盒加入0.1M的甘露醇对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂与没加保护剂的试剂相比，残存酶活率升高57％。

实施例3与梅里埃5’核苷酸酶试剂盒的临床相关性比较试验

本实施例1试剂盒与梅里埃5’核苷酸酶试剂盒作了临床相关性比较：

取30例不同浓度的临床样本与市售得到的梅里埃5’核苷酸酶试剂盒(试剂1：2*80ml试剂2：16*10ml)生产商(法国梅里埃公司)平行进行检测

使用仪器：奥林巴斯400

测定方法

步骤一：输入参数于自动生化分析仪：温度37℃，主波长550nm，次波长800nm，

R1 225ul.R2 75ul.样本6ul

读数点：0-270-10

步骤二：测定前将R1与R2平衡至室温.，然后放入试剂仓内

步骤三输入定标因子：998

在奥林巴斯400上输入以上参数，就可以进行检测.

试验结果：

根据上面的临床比对数据，本试剂与梅里埃试剂的临床相关性良好，没有差异。可以用于临床，替代进口产品，降低医疗费用。

实施例4

试剂1：

MOPS缓冲液                        50mmol/L

toos                              2mmol/L

Triton x-405                      4ml/L

苯甲酸钠                          24mmol/L

FeCl2                             5mmol/L

PNP                               18u/L

Xot                               30u/L

Peo                               200u/L

甘油醛                            30g/L

砷酸钠                            18g/L

试剂2：

磷酸氢二钠                        40mmol/L

KCl                               15mmol/L

甘露醇                            25mmol/L

proclin300                        0.5ml/L

次黄苷-5’-单磷酸盐                16mmol/L

4-氨基替比林                       2mmol/L

制备方法同实施例1。

实施例5

试剂1：

HEPES缓冲液                        100mmol/L

toos                               2mmol/L

Triton x-405                       2ml/L

苯甲酸钠                           3mmol/L

FeCl2                              2mmol/L

PNP                                10u/L

Xot                                20u/L

Peo                                30u/L

甘油醛                             20/L

砷酸钠                             20g/L

试剂2：

磷酸氢二钠                         50mmol/L

KCl                                2mmol/L

甘露醇                             20mmol/L

proclin300                         0.3ml/L

次黄苷-5’-单磷酸盐                15mmol/L

4-氨基替比林                       2mmol/L

制备方法同实施例1。

Claims (3)

1.一种酶法检测5’核苷酸酶试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由下列试剂1和试剂2组成：

试剂1：3L

缓冲液                                    10-200mmol/L

toos                                      1-100mmol/L

Triton x-405                              0.01-20ml/L

苯甲酸钠                                  20-100mmol/L

FeCl2                                     1-100mmol/L

PNP                                       10-20u/L

Xot                                       30-40u/L

Peo                                       200-300u/L

甘油醛                                    10-100g/L

砷酸钠                                    10-100g/L；

试剂2：1L

磷酸氢二钠                                10-200mmol/L

KCl                                       10-500mmol/L

甘露醇                                    10-200mmol/L

procl in300                               0.01-0.5ml/L

次黄苷-5’-单磷酸盐                       10-200mmol/L

4-氨基替比林                              1-5mmol/L

2.根据权利要求1所述酶法检测5’核苷酸酶试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂1缓冲液选自TRIS、MOPS或HEPES。

3.一种如权利要求1所述酶法检测5’核苷酸酶试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(一)制备试剂1：3L

(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；

(2)依次加入缓冲液、toos、Triton x-405、苯甲酸钠、FeCl2、甘油醛、砷酸钠；

(3)最后加入酶，PNP、Xot、Peo；

(4)加入剩余的水混合均匀；

(二)制备试剂2：1L

向容器内依次加入磷酸氢二钠、KCl、甘露醇、proclin300、次黄苷-5’-单磷酸盐、4-氨基替比林混合均匀。