CN107988315B - Ck、ckmb、ldh和ast联合检测试剂 - Google Patents

Ck、ckmb、ldh和ast联合检测试剂 Download PDF

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Abstract

一种CK、CKMB、LDH和AST联合检测试剂，包含稀释液1，稀释液2和4颗冻干小球。稀释液1：三羟甲基氨基甲烷、表面活性剂、去胆红素干扰剂、维生素C氧化酶、防腐剂；稀释液2：缓冲液、抑制CK‑M抗体；冻干小球1：缓冲液、α‑酮戊二酸、还原型辅酶Ⅰ、苹果酸脱氢酶、L‑门冬氨酸、冻干保护剂；冻干小球2；缓冲液、L‑乳酸锂、氧化型辅酶Ⅰ、冻干保护剂；冻干小球3、4：缓冲液、二磷酸腺苷、6‑磷酸葡萄糖脱氢酶、己糖激酶、D‑葡萄糖、磷酸肌酸、酶激活剂、冻干保护剂。适用于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，与临床上常用的大型生化分析仪上的液体试剂的检测结果具有良好的相关性，且具有操作简便，试剂保存运输便捷，检测成本低等优势。

Description

CK、CKMB、LDH和AST联合检测试剂
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及到一种CK（肌酸磷酸激酶或肌酸激酶）、CKMB（肌酸激酶同工酶或CH-MB或血清肌酸激酶同工酶）、LDH（乳酸脱氢酶）和AST（天门冬氨酸氨基转移酶）联合检测试剂。
背景技术
传统心肌酶谱中CK、CKMB在急性心肌梗塞（AMI）发作时出现早（3-8 h），达峰时间短（10-36 h），恢复时间快（72-80 h）左右。LDH、AST在AMI发作时出现较晚（8-18 h），达峰时间长（24-72 h），恢复时间长（6-10 d）。CK、CKMB能在发病早期，在心肌尚未受到大面积坏死时，可在病人血液中检测出来，第一时间为临床提供可靠资料。LDH、AST对就诊较晚和AMI的病程观察有可观的价值，若LDH恢复迟缓或病程中再次升高，可预示梗塞心肌范围扩大或再梗塞。所以这四项联合检测对AMI的临床诊断和病程监控上具有非常重要的意义。
国内的医院大多采用大型全自动生化分析仪，利用4种试剂分别检测CK、CKMB、LDH和AST项目，再将检测报告发给临床医生进行分析判定。而且现有的大型全自动生化分析仪上使用的试剂大多为液体型试剂，液体型试剂存在保存时间短，不便于运输等缺点。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种CK、CKMB、LDH和AST联合检测试剂，该试剂包含稀释液和反应试剂，其中稀释液以液体形式，反应试剂以冻干小球形式存在，稀释液和反应试剂置于离心式集成芯片中，该集成芯片适用于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，与临床上常用的大型生化分析仪上的液体试剂的检测结果具有良好的相关性，且具有操作简便，试剂保存运输便捷，检测成本低等优势。
为解决上述技术问题，本发明的具体技术方案为：一种CK、CKMB、LDH和AST联合检测试剂，该试剂包含稀释液和反应试剂。
本发明的稀释液能够将反应试剂充分组合并实现测试反应。
本发明所述的稀释液包含稀释液1和稀释液2。
本发明所述的反应试剂包含4颗冻干小球，分别为冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4。
本发明所述的稀释液1包含：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、表面活性剂、去胆红素干扰剂、维生素C氧化酶、防腐剂。
作为优选，稀释液1中各成份的具体含量为：Tris：0.01-1.0mol/L，PH6.5-7.5，
表面活性剂：0.1-10.0%，去胆红素干扰剂：1-10 mol/L或1-100 KU/L，维生素C氧化酶：1-100 KU/L，防腐剂：0.1-10.0%。
作为优选，稀释液1的组份中，表面活性剂为Triton X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚（Brij-35）、聚乙二醇（PEG）的一种或几种；去胆红素干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种；防腐剂为尼泊金酯类，如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯等中的一种或几种。
本发明所述的稀释液2包含：缓冲液、抑制CK-M抗体。
作为优选，稀释液2中各成份的具体含量为：缓冲液：0.01-1.0mol/L，pH6.0-8.0
抑制CK-M抗体（肌酸激酶M型抗体）：1-100 g/L。
作为优选，稀释液2组份中，缓冲液可以是三羟甲基氨基缓冲液（Tris）、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-羟基乙烷磺酸）缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-（N-吗啡啉）乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双（2-羟乙基）氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。
本发明所述的冻干小球1包含：缓冲液、α-酮戊二酸（α-KG）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、苹果酸脱氢酶（MDH）、L-门冬氨酸、冻干保护剂。
作为优选，冻干小球1各成份的具体含量为：缓冲液：0.01-1.0mol/L，PH6.5-8.5
α-KG：0.15-10 mol/L，NADH：1-100 mol/L，MDH：10-200 KU/L，L-门冬氨酸：5 -100mol/L，冻干保护剂：1-100 mol/L。
本发明所述的冻干小球2包含；缓冲液、L-乳酸锂、氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）、冻干保护剂。
作为优选，冻干小球2各成份的具体含量为：缓冲液：0.01-1.0mol/L，PH8.0-10.0，L-乳酸锂：1-100 mol/L，NAD+：1-100 mol/L，冻干保护剂：1-100 mol/L。
本发明所述的冻干小球3、4包含（均包含）；缓冲液、二磷酸腺苷（ADP）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）、己糖激酶（HK）、D-葡萄糖、磷酸肌酸、酶激活剂、冻干保护剂。
本发明冻干小球3、4各成份的具体含量为：缓冲液：0.01-1.0mol/L，PH6.0-8.0，ADP：1-100 mol/L，G-6-PDH：10-200 KU/L，HK10-200 KU/L，D-葡萄糖：1-100 mol/L，磷酸肌酸：1-100 mol/L，酶激活剂：1-100 mol/L，冻干保护剂：1-100 mol/L。
作为优选，冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4组份中，缓冲液可以是Tris、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-羟基乙烷磺酸）缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-（N-吗啡啉）乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双（2-羟乙基）氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。
作为优选，冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4组份中，冻干保护剂可以是海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、Triton X-100、Brij-35中的一种或者几种。
作为优选，冻干小球3、冻干小球4组份中，酶激活剂可以是硫酸镁、氯化镁、醋酸镁等常用酶激活剂中的一种或几种。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明采用特定组成的两种稀释液和4个冻干小球的试剂组合方式，稀释液1：主要作用有2点，第一，溶解冻干小球1、冻干小球2、冻干小球3；第二，稀释液1里面有一些去除干扰的物质（干扰物质例如胆红素），起到一定的去干扰作用；稀释液2：主要作用也有2点，第一，溶解冻干小球4，第二，稀释液2里面含有抑制CK-M抗体；这个是CKMB测试的原理，CKMB采用的是免疫抑制法，用抗人M血清，抑制M亚单位，然后测定剩余的B亚基，乘2即得CKMB活力；冻干小球3用于测试CK，冻干小球4用于测试CKMB，测试CKMB时，第一步需要用含有CK-M抗体处理样本，第二步再进行测试，而第二步的测试同CK测试。
2.本发明通过将4种试剂集成在一个芯片上，因此可以同时检测这4个项目。这4个项目同时检测具有临床意义。并且同类型的产品，不能同时检测CKMB，可以同时检测CK、LDH和AST，原因在于CKMB特殊的反应原理。同类型的产品，产品只有一种缓冲液。我们通过2种稀释液解决了这项难题；本发明的4种试剂集成在一个芯片上，并且试剂采用冻干小球形式，适用于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，无论在保存和运输方面相对与液体试剂都显得较有优势。并且只需要加一次样，做一个测试，即可得到4个项目的检测结果。
3.本发明的试剂并非简单的组合就能用于全光谱POCT生化分析仪上的，而是其稀释液的组成成份和4个冻干小球的组成成分决定着CK、CKMB、LDH和AST的检测可否组合在一起并可进行测试反应；本发明正是通过限定特定组成的稀释液种类和组分和4个冻干小球的组分和种类相互配合搭配，实现了将4个冻干小球组合在一起并可进行联合检测CK、CKMB、LDH和AST反应的技术效果。
附图说明
图1 日立7100上AST样本测定回归分析线性图。
图2日立7100上LDH样本测定回归分析线性图。
图3日立7100上CK样本测定回归分析线性图。
图4日立7100上CKMB样本测定回归分析线性图。
图5本发明实施例3制备的试剂样品对应AST于0、7、15、30、60、90、120、180天检测罗氏质控品，两个水平（B1和B2）的检测结果。
图6本发明实施例3制备的试剂样品对应LDH于0、7、15、30、60、90、120、180天检测罗氏质控品，两个水平（B1和B2）的检测结果。
图7本发明实施例3制备的试剂样品对应CK于0、7、15、30、60、90、120、180天检测罗氏质控品，两个水平（B1和B2）的检测结果。
图8本发明实施例3制备的试剂样品对应CKMB于0、7、15、30、60、90、120、180天检测罗氏质控品，两个水平（B1和B2）的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不限于下述实施例。
实施例1
稀释液1各成份的具体含量为：
Tris：0.5 mol/L，PH6.8
Triton X-100：1.0%
胆红素氧化酶：10 KU/L
维生素C氧化酶：20 KU/L
对羟基苯甲酸甲酯：2.0%
稀释液2各成份的具体含量为：
Tris：0.8mol/L，PH7.2
抑制CK-M抗体：5.0 g/L
冻干小球1各成份的具体含量为：
Tris：0.4mol/L，PH7.5
α-KG：2.0 mol/L
NADH：10 mol/L
MDH：20 KU/L
L-门冬氨酸：20 mol/L
牛血清白蛋白：10 mol/L
冻干小球2各成份的具体含量为：
Tris：0.5mol/L，PH8.5
L-乳酸锂：10 mol/L
NAD+：20 mol/L
牛血清白蛋白：20 mol/L
冻干小球3、4各成份的具体含量为：
Tris：0.4mol/L，PH7.8
ADP：10 mol/L
G-6-PDH：100 KU/L
HK：50 KU/L
D-葡萄糖：10 mol/L
磷酸肌酸：15 mol/L
硫酸镁：5 mol/L
牛血清白蛋白：10 mol/L。
将上述试剂制成冻干小球（冻干小球的形成为行业常规技术），并加入离心式集成芯片的反应孔中。测试时，将离心式试剂盘置于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪上，稀释液1孔位加入80μL稀释液1，稀释液2孔位加入80μL稀释液2，样品孔中加入60μL血清或全血，启动一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，约15min后即可得到检测结果。同时在日立7100生化分析仪上用大生化CK、CKMB、LDH和AST试剂对样本进行测试。
分别用本发明试剂和大生化CK、CKMB、LDH和AST试剂检测临床血清样本40份。检测结果显示血清CK、CKMB、LDH和AST值分布范围内，以本发明试剂测得的值（X）对大生化试剂测得的值（Y）做回归分析，结果如下：CK、CKMB、LDH和AST的相关性分别是 Y=1.010X+3.916，R2=0.999；Y=0.983X+28.48，R2=0.998；Y=1.013X+0.890，R2=0.999；Y=0.990X+2.349，R2=0.999（具体见附图1-4所示）。
实施例2
稀释液1各成份的具体含量为：
Tris：1.0 mol/L，PH7.5
Brij-35：5.0%
亚铁氰化钾：10 mol/L
维生素C氧化酶：50 KU/L
对羟基苯甲酸异丁酯：5.0%
稀释液2各成份的具体含量为：
甘氨酸-NaOH缓冲液：1.0mol/L，PH7.8
抑制CK-M抗体：10.0 g/L
冻干小球1各成份的具体含量为：
N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液：1.0mol/L，PH7.5
α-KG：5.0 mol/L
NADH：20 mol/L
MDH：50 KU/L
L-门冬氨酸：40 mol/L
海藻糖：20 mol/L
冻干小球2各成份的具体含量为：
N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液：1.0mol/L，PH9.0
L-乳酸锂：20 mol/L
NAD+：40 mol/L
海藻糖：40 mol/L
冻干小球3、4各成份的具体含量为：
3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液：1.0mol/L，PH6.5
ADP：20 mol/L
G-6-PDH：200 KU/L
HK：100 KU/L
D-葡萄糖：20 mol/L
磷酸肌酸：30 mol/L
氯化镁：15 mol/L
海藻糖：20 mol/L
将上述试剂制成冻干小球，并加入离心式集成芯片的反应孔中。测试时，将离心式试剂盘置于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪上，稀释液1孔位加入80μL稀释液1，稀释液2孔位加入80μL稀释液2，样品孔中加入60μL血清或全血，启动一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，约15min后即可得到检测结果。同时在日立7100生化分析仪上用大生化CK、CKMB、LDH和AST试剂对样本进行测试。
用本发明试剂检测高、中、低血清样本3份，重复测定20次，计算检测精密度。结果显示如下表1-4所列:
表1 高、中、低血清样本中CK精密度
Figure 414654DEST_PATH_IMAGE001
表2高、中、低血清样本中CKMB精密度
Figure 394111DEST_PATH_IMAGE002
表3高、中、低血清样本中LDH精密度
Figure 737630DEST_PATH_IMAGE003
表4 高、中、低血清样本中AST 精密度
Figure 991894DEST_PATH_IMAGE004
从上述检测结果可以得出，本发明的试剂对CK、CKMB、LDH和AST检测精密度稿，完全能够达到临床检测的要求。
实施例3
稀释液1各成份的具体含量为：
Tris：2.5 mol/L，PH7.5
PEG：5.0%
高铁氰化钾：5 mol/L
维生素C氧化酶：100 KU/L
对羟基苯甲酸异丙酯：10.0%
稀释液2各成份的具体含量为：
3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液：0.5mol/L，PH8.0
抑制CK-M抗体：15.0 g/L
冻干小球1各成份的具体含量为：
3-（环已胺）-1-丙磺酸缓冲液：0.8mol/L，PH8.5
α-KG：10 mol/L
NADH：100 mol/L
MDH：100 KU/L
L-门冬氨酸：100 mol/L
吐温80：100 mol/L
冻干小球2各成份的具体含量为：
N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液：1.0mol/L，PH10.0
L-乳酸锂：50 mol/L
NAD+：100 mol/L
吐温80：100 mol/L
冻干小球3、4各成份的具体含量为：
3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液：0.8mol/L，PH8.0
ADP：50 mol/L
G-6-PDH：150 KU/L
HK：100 KU/L
D-葡萄糖：100 mol/L
磷酸肌酸：50 mol/L
醋酸镁：50 mol/L
吐温80：50 mol/L
将上述试剂制成冻干小球，并加入离心式集成芯片的反应孔中。测试时，将离心式试剂盘置于一种多功能的全光谱POCT生化分析仪上，稀释液1孔位加入80μL稀释液1，稀释液2孔位加入80μL稀释液2，样品孔中加入60μL血清或全血，启动一种多功能的全光谱POCT生化分析仪，约15min后即可得到检测结果。同时在日立7100生化分析仪上用大生化CK、CKMB、LDH和AST试剂对样本进行测试。
用本发明试剂于0、7、15、30、60、90、120、180天检测罗氏质控品，两个水平（B1和B2）。如附图5-8检测结果显示本发明试剂在6个月内质控偏差在可允许范围内。

Claims (2)

1.一种肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶联合检测试剂，其特征在于：该试剂包含稀释液和反应试剂，所述的稀释液包含稀释液1和稀释液2；
所述的反应试剂包含4颗冻干小球，分别为冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4；
所述的稀释液1具体为：0.01-1.0mol/L的pH为6.5-7.5的三羟甲基氨基甲烷，0.1-10.0%的表面活性剂，去胆红素干扰剂选自1-10 mol/L的高铁氰化钾或1-100 KU/L的胆红素氧化酶中的一种，1-100 KU/L的维生素C氧化酶，0.1-10.0%的尼泊金酯类防腐剂；
所述的稀释液2具体为：0.01-1.0mol/L的pH为6.0-8.0的缓冲液，1-100 g/L的肌酸激酶M型抗体；所述的冻干小球1包含：缓冲液、α-酮戊二酸、还原型辅酶Ⅰ、苹果酸脱氢酶、L-门冬氨酸、冻干保护剂；冻干小球1各成份的具体含量为：0.01-1.0mol/L的pH为6.5-8.5的缓冲液，0.15-10 mol/L 的α-酮戊二酸，1-100 mol/L的还原型辅酶Ⅰ，10-200 KU/L 的MDH，5-100 mol/L 的L-门冬氨酸，1-100 mol/L的冻干保护剂；
所述的冻干小球2包含；缓冲液、L-乳酸锂、氧化型辅酶Ⅰ、冻干保护剂；冻干小球2各成份的具体含量为：0.01-1.0mol/L的pH为8.0-10.0缓冲液，1-100 mol/L 的L-乳酸锂，1-100mol/L的氧化型辅酶Ⅰ，1-100 mol/L的冻干保护剂；
所述的冻干小球3、4包含；缓冲液、二磷酸腺苷、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、己糖激酶、D-葡萄糖、磷酸肌酸、酶激活剂、冻干保护剂；冻干小球3、4各成份的具体含量为：0.01-1.0mol/L的pH为6.0-8.0的缓冲液，1-100 mol/L的二磷酸腺苷，10-200 KU/L 的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，10-200 KU/L的己糖激酶，1-100 mol/L D-葡萄糖，1-100 mol/L的磷酸肌酸，1-100mol/L的酶激活剂，1-100 mol/L的冻干保护剂；
所述的稀释液1用于溶解冻干小球1、冻干小球2和冻干小球3，所述的稀释液2用于溶解冻干小球4，其中冻干小球1用于检测天门冬氨酸氨基转移酶、冻干小球2用于检测乳酸脱氢酶、冻干小球3用于检测肌酸激酶、冻干小球4用于检测肌酸激酶同工酶；
稀释液2组份中，缓冲液选自三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-羟基乙烷磺酸）缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-（N-吗啡啉）乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双（2-羟乙基）氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种；
冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4组份中的缓冲液选自三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-羟基乙烷磺酸）缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-（N-吗啡啉）乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双（2-羟乙基）氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-（环已胺）-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种；
冻干小球1，冻干小球2，冻干小球3，冻干小球4组份中的冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、Triton X-100、Brij-35中的一种；冻干小球3、冻干小球4组份中的酶激活剂选自硫酸镁、氯化镁、醋酸镁中的一种。
2.根据权利要求1所述的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶联合检测试剂，其特征在于：稀释液1的组份中，表面活性剂选自Triton X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙二醇中的一种。
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