TWI593800B - Ｓｋｉｎ基因質體、包含該質體的轉型植物細胞以及增加植物產量的方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種SKIN基因質體，包含該質體的轉型植物細胞以及增加植物產量的方法。SKIN是水稻生長和產量的負向調控因子，且內源性SKIN表現的減少會增加水稻的產量。
植物生命週期伴隨著在生長和發育期間調節營養吸收和分配的供源-積儲轉換(source-sink transitions)。供源-積儲交流(source-sink communication)的調控決定了整個植物中的碳分配的模式，並且在決定作物生產力方面發揮關鍵的作用。大多數研究一直關注在調控基因表現的碳供給和需求的過程，這些基因涉及在供源組織(進行光合作用的葉子和儲存器官)中碳水化合物的產生和貯藏物的代謝、以及在積儲組織(生長中的營養和生殖組織)中的利用。然而，調節供源-積儲交流之訊息傳遞途徑的組成分大多還是未知的。對該調控機制的深入瞭解不僅對理解糖缺乏/需求如何調控植物生長和發育方面意義重大，對用於作物改良的供源-積儲營養分配的基因操控方面來說也很重要。
在穀物中，萌發和幼苗生長期間的供源-積儲轉換可以在營養供需模型中觀察到，這是一個可用來研究營養需求/缺乏之訊息傳遞以及供源-積儲交
流之基因調控的機制的理想系統。萌發和接下來的幼苗生長構成了植物新生命週期開始的兩個重要步驟，這些步驟的完成需要發育和生化過程相互配合，包括種子(供源組織)中儲藏物的代謝以及胚軸(積儲組織)的延長。在穀物的這些過程中，貯存在胚乳中的儲藏物會被一組水解酶降解並代謝為糖和其他養分，這些糖和養分會被子葉盤吸收並轉運至胚軸，以支持幼苗生長(Akazawa and Hara-Nishimura,1985；Beck and Ziegler,1989；Fincher,1989；Woodger et al.,2004)。占穀類乾重約75%的澱粉(Kennedy,1980)在萌發和幼苗生長期間提供了用以生成能量和代謝物的主要碳源。因此，在所有水解酶當中，α-澱粉酶類最為豐富，它在澱粉代謝方面、且因此在幼苗生長的速率方面發揮核心作用。α-澱粉酶的表現受到激素赤黴素(gibberellin，GA)和糖需求/缺乏的誘導(Yu,1999a；Yu,1999b；Lu et al.,2002；Sun and Gubler,2004；Woodger et al.,2004；Chen et al.,2006；Lu et al.,2007；Lee et al.,2009)，這已作為研究糖缺乏訊息傳遞以及與GA訊息傳遞途徑交流機制的模型。
我們之前在水稻上的研究顯示，糖缺乏(sugar starvation)係透過控制α-澱粉酶之轉錄速率和mRNA穩定性來調控其表現(Sheu et al.,1994；Sheu et al.,1996；Chan and Yu,1998)。轉錄調控是透過α-澱粉酶基因啟動子中的糖反應複合體(sugar response complex，SRC)來介導的，在這些啟動子中，TA盒(TA box)是關鍵的調控因子(Lu et al.,1998；Chen et al.,2002；Chen et al.,2006)。MYBS1是糖可抑制的R1 MYB轉錄因子，它會與前述TA盒相互作用，並在糖缺乏情形下，於水稻懸浮細胞和萌發的胚中誘導α-澱粉酶基因啟動子的活性(Lu et al.,2002；Lu et al.,2007)。GA也會透過GA反應複合體(GARC)來激活α-澱粉酶基因啟動子，其中相鄰的GA反應因子(GARE)和TA/Amy盒是關鍵因子，會協同作用(Rogers et al.,1994；Gubler
et al.,1999；Gomez-Cadenas et al.,2001)。MYBGA(也稱為GAMYB)是一種GA可誘導的R2R3 MYB，在穀物糊粉細胞中，它會回應GA，而與GARE結合，激活α-澱粉酶以及其他水解酶的啟動子(Gubler et al.,1995；Gubler et al.,1999；Hong et al.,2012)。我們近期的研究顯示，MYBS1的入核運輸受到糖的抑制，而GA會對抗糖抑制作用，其係透過提高MYBGA和MYBS1的共同核運輸以及形成穩定的二分MYB-DNA複合物(bipartite MYB-DNA complex)而激活α-澱粉酶基因啟動子(Hong et al.,2012)來達成。此外，除了糖缺乏訊息以外，氮和磷缺乏訊息也會有同樣的效果，而會與GA交流以促進MYBGA和MYBS1的共同核運輸，並促進上百種GA可誘導但功能互異的水解酶、轉運子和調控子的表現來補充全面營養物的代謝，以支持活躍的幼苗生長(Hong et al.,2012)。
水稻Snf1相關蛋白激酶1(Snf1-related protein kinase 1，SnRK1)家族中的SnRK1A及SnRK1B在結構和功能上分別相似於其酵母及和哺乳動物對應物：蔗糖非發酵1(sucrose non-fermenting 1，SNF1)及AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)(Lu et al.,2007)。SNF1、AMPK以及SnRK1是絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(Ser/Thr protein kinase)，並被認為是燃料量感應器，可監控細胞的碳水化合物的狀態及/或AMP/ATP量，以便維持糖產生和消耗的平衡，這對適當生長而言是必要的(Halford et al.,2003；Hardie and Sakamoto,2006；Rolland et al.,2006；Polge and Thomas,2007)。SNF1、AMPK以及SnRK1是異三聚體蛋白複合物，由一個催化激活亞單元(α或Snf1)和兩個調控亞單元(β及γ或Sip1/Sip2/Gal83和Snf4)構成(Polge and Thomas,2007)。這些蛋白激酶可分為N端激酶域(N-terminal kinase domain，KD)和C端調控域(C-terminal regulatory domain，RD)(Dyck et al.,1996；Jiang and Carlson,1996,1997；Crute et al.,1998；Lu et al.,2007)。
在葡萄糖充足的酵母細胞中，前述SNF1複合物以不活化且自動抑制的構型存在，在該構型中，Snf1 KD會結合至Snf1 RD(Jiang and Carlson,1996)。而在葡萄糖缺乏的酵母細胞中，Snf4會結合至Snf1 RD，Snf1 KD會被釋出，而形成有活性的開放構型Snf1(Jiang and Carlson,1996)。Sip1/Sip2/Gal83係作為支架蛋白，會與Snf1和Snf4雙方結合，而糖缺乏也會促進該種結合(Jiang and Carlson,1996,1997)。
現已在水稻的糖缺乏訊息傳遞途徑中證明了SnRK1蛋白激酶的保守性亞單元間和亞單元內的相互作用與功能，SnRK1A在上游作用，且在水稻激活MYBS1和α-澱粉酶表現的糖缺乏訊息傳遞途徑中扮演關鍵角色(Lu et al.,2007)。近來，我們發現CIPK15(即鈣調磷酸酶B類(CBL)相互作用蛋白激酶15[Calcineurin B-like(CBL)-interacting protein kinase 15])在SnRK1A上游作用，且在水稻的O2缺乏耐受性中扮演關鍵角色(Lee et al.,2009)。CIPK15會調控SnRK1A蛋白的累積，並與SnRK1A相互作用，且將O2缺乏訊息與SnRK1A依賴性糖缺乏傳感級聯聯繫起來，以調控糖和能量的生產，並安排水稻在洪水條件下的生長(Lee et al.,2009)。
已經有人提出SnRK1在植物中會協調和調節生長的生理和代謝需求，這些需求包括碳水化合物代謝的調控、澱粉的生物合成、生育力、器官發生、衰老、逆境反應以及與病原體的相互作用(Polge and Thomas,2007)。SnRK1會調控作物庫(如馬鈴薯塊莖(McKibbin et al.,2006)及豆科植物種子(Radehuk et al.,2010))的碳水化合物代謝和發育。SnRK1的過度表現會增加馬鈴薯塊莖中的澱粉累積(Purcell et al.,1998；Halford et al.,2003)，而SnRK1默化會在基因轉殖大麥中引起不正常的花粉發育和雄性不育(Zhang et al.,2001)。在阿拉伯芥中，SnRK1(KIN10/11)會激活那些涉及降解過程和光合作用的基因，並抑制那些涉及生物合成的基因(Baena-Gonzalez at
al.,2007)。
然而，在植物生長和發育期間調控供源-積儲交流的機制目前還不是很明確。因此，有必要研究那些與在供源組織和積儲組織之間傳遞糖和營養需求訊息的有關基因。
本發明供了一種新型的非生物逆境誘導(abiotic stress-inducible)的植物特異性基因家族，包括SKIN1和SKIN2，其會與SnRK1A相互作用並抑制SnRK1A的功能。我們發現來自積儲積儲組織(萌發的胚)的糖需求訊息係透過SnRK1A來傳遞，以在供源組織(澱粉胚乳)中誘導產生糖和其他養分所必須的一整套酶的表現。透過使用值物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)作為逆境訊息傳導誘導劑，我們進一步發現這些SKIN基因會透過抑制SnRK1A和MYBS1共同入核運輸的方式來阻遏SnRK1A依賴性糖/營養缺乏的訊息傳導，並因此抑制了SnRK1A和MYBS1在非生物逆境條件下誘導促進營養代謝的酶表現方面的功能。
本發明提供了一種SKIN基因默化質體，其包含：啟動子；兩個DNA片段，其係取自源於SKIN1或SKIN2之cDNA的一個DNA片段，並以正義和反義的方向排列；以及第三個DNA片段，其係插在前述兩個DNA片段之間。較佳者，前述第三個DNA片段係源於GFP之cDNA。更佳者，前述源於SKIN1之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：58(307bp)，前述源於SKIN2之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：59(245bp)，且前述第三個DNA片段為SEQ ID NO：60(750bp)。
在前述SKIN基因默化質體之一較佳具體實施例中，前述啟動子係選自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7
或泛素(ubiquitin)啟動子。
本發明還提供了一種轉型植物細胞，其包含上述SKIN基因默化質體。具體而言，前述SKIN基因默化質體包含：啟動子；兩個DNA片段，其係取自源於SKIN1或SKIN2之cDNA的一個DNA片段，並以正義和反義的方向排列；以及第三個DNA片段，其係插在前述兩個DNA片段之間。較佳者，前述第三個DNA片段源於GFP之cDNA。更佳者，前述源於SKIN1之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：58(307bp)，前述源於SKIN2之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：59(245bp)，且前述第三個DNA片段為SEQ ID NO：60(750bp)。
在前述轉型植物細胞之一較佳具體實施例中，前述啟動子係選自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7或泛素啟動子。
在前述轉型植物細胞之一較佳具體實施例中，前述植物是選自玉米(maize)、小麥(wheat)、大麥(barley)、小米(millet)、甘蔗(sugarcane)、芒草(Miscanthus)、柳枝稷(switchgrass)或高粱(sorghum)的單子葉植物。
在前述轉型植物細胞之一較佳具體實施例中，前述植物是選自阿拉伯芥(Arabidopsis)、番茄(tomato)、馬鈴薯(potato)、蕓苔(brassica)、大豆(soybean)、芥花(canola)或甜菜(sugarbeet)的雙子葉植物。
本發明還提供了一種基因轉殖植物，其包含上述SKIN基因默化質體。具體而言，前述SKIN基因默化質體包含：啟動子；兩個DNA片段，其係取自源於SKIN1或SKIN2之cDNA的一個DNA片段，並以正義和反義的方向排列；以及第三個DNA片段，其係插在前述兩個DNA片段之間。較佳者，前述第三個DNA片段源於GFP之cDNA。更佳者，前述源於SKIN1
之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：58(307bp)，前述源於SKIN2之cDNA的一個DNA片段是SEQ ID NO：59(245bp)，且前述第三個DNA片段為SEQ ID NO：60(750bp)。
在前述基因轉殖植物之一較佳具體實施例中，前述啟動子係選自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7或泛素啟動子。
在前述基因轉殖植物之一較佳具體實施例中，前述植物是選自玉米、小麥、大麥、小米、甘蔗、芒草、柳枝稷或高粱的單子葉植物。
在前述基因轉殖植物之一較佳具體實施例中，前述植物是選自阿拉伯芥、番茄、馬鈴薯、蕓苔、大豆、芥花或甜菜的雙子葉植物。
第一圖係顯示一包含GKSKSF域(KSD)之調控蛋白的新家族。(A)植物中包含KSD之蛋白的序列比對。相同的胺基酸用黑色背景上的白色字母顯示，相似的胺基酸用灰色背景上的黑色字母表示。以方框顯示GKSKSF域(KSD)、推定的核定位訊息(NLS)以及蛋白激酶A誘導域(KID)。星號表示單子葉植物中的保守域。(B)植物中包含KSD之蛋白的親緣分析。刻度值0.1表示每個位點有0.1個胺基酸取代。彩色區域表示單子葉植物特異性基因簇。
第二圖係顯示SKIN的N端與SnRK1A的激酶域相互作用。為了進行GAL4-UAS雙雜交分析，用效應子(effector)和報告質體共轉染水稻胚，在-S培養基中培育24小時，然後進行螢光素酶活性測定。將經過效應子Ubi：GAD、Ubi：GBD以及報告子(reporter)5XUAS-35S mp：Luc轟擊之水稻胚的螢光素酶活性設定為1X，其他數值則相對於此數值來進行計算。誤差
棒係顯示三次重複試驗的標準差(SE)。顯著性水準：*p<0.1，**p<0.05。Y軸表示不同構築體的相對螢光素酶活性。(A)質體構築。(B)用效應子Ubi：GAD-SnRK1A和Ubi：GBD-SKIN(野生型或截短型)以及報告子5XUAS-35S mp：Luc共轉染的水稻胚。(C)用效應子Ubi：GAD-SnRK1A(野生型、激酶域(KD)或調節域(RD))，Ubi：GBD-SKIN以及報告子5XUAS-35S mp：Luc共轉染的水稻胚。(D)用效應子Ubi：GAD-SnRK1A、Ubi：GBD-SKIN以及報告子5XUAS-35S mp：Luc共轉染後在含有1μM ABA之-S培養基中培育的水稻胚。
第三圖係顯示高度保守的GKSKSF域(KSD)對於這些SKIN基因拮抗SnRK1A的功能而言是至關重要的。將轉染有質體的水稻胚在具有100mM葡萄糖的(+S)培養基或不含葡萄糖的(-S)培養基中培育24小時，然後進行螢光素酶活性測定。將僅經過SRC-35S mp-Luc構築體轟擊並培養在+S培養基中之水稻胚的螢光素酶活性設定為1X，其他數值則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的標準差(SE)。(A)質體構築。(B)單獨使用效應子Ubi：SnRK1A、Ubi：SKIN1或Ubi：SKIN(Ri)和報告子SRC--35S mp：Luc共轉染的水稻胚，或使用效應子Ubi：SnRK1A和Ubi：SKIN或Ubi：SKIN(Ri)和報告子SRC-35S mp：Luc共轉染的水稻胚。(C)從透過粒子轟擊(particle bombardment)轉染了Ubi：SnRK1A、Ubi：SKIN或Ubi：SnRK1A和Ubi：SKIN的水稻胚中萃取中總細胞蛋白，使用針對SnRK1A、以及與這些SKIN的N端融合之HA標籤的抗體進行西方墨點分析。蛋白填載量對照組係透過麗春紅S染色而顯示於第十五圖A。(D)用效應子Ubi：SnRK1A和Ubi：SKIN1(野生型或截短型)以及報告子SRC-35Smp：Luc共轉染的水稻胚。(E)用效應子Ubi：SnRK1A和Ubi：SKIN(野生型、刪除KSD後，或以6個Ala取代KSD後)以及報告子SRC-35Smp：Luc共轉染的水稻胚。
第四圖係顯示SKIN會抑制SnRK1A依賴性糖和營養缺乏訊息傳導途徑。(A)來自野生型以及基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)、SKIN2-Ri(R1)兩天齡的幼苗在+S或-S以14h光照/10h黑暗迴圈條件下生長18h。從細胞中純化出總RNA，使用所示基因之特異性引子進行定量RT-PCR分析，並將mRNA量以相對於Act1 mRNA量的方式進行標準化。將野生型的最低mRNA量設定為1X，其他樣品則相對於此數值來進行計算。將最高的mRNA量設定為100%。誤差棒係顯示三次重複試驗的SE。(B)從SKIN-Ox基因轉殖系兩天齡的幼苗中萃取總細胞蛋白，使用針對SnRK1A和與這些SKIN的N端融合之HA標籤的抗體進行西方墨點分析。蛋白填載量對照組係透過麗春紅S染色而顯示於第十五圖B。
第五圖係顯示這些SKIN會透過抑制胚乳中的營養代謝來阻遏幼苗生長。以下試驗中使用了基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)。(A)種子係在水中於28℃以14h光照/10h黑暗迴圈或連續黑暗的條件下在無蔗糖(圖面1)或有3%(90mM)蔗糖(圖面2)的情形萌發並生長6天。(B)測量(A)中幼苗芽和根的長度。圖面1和圖面2分別表示無蔗糖及有蔗糖。(C)將幼苗以14h光照/10h黑暗迴圈或連續黑暗的條件下生長3天。萃取總RNA並用αAmy3(圖面1)和EP3A(圖面2)之特異性引子進行定量(即時)RT-PCR分析。誤差棒係表示顯著水準的SE(n=12)：(B)和(C)中*p<0.1，**p<0.05。
第六圖係顯示這些SKIN會在低氧條件下抑制幼苗生長所必要的糖生成。水稻種子在空氣或有或無90mM蔗糖的水中於28℃以14h光照/10h黑暗迴圈的條件下萌發不同的時間長度。每天測量幼苗芽的長度。誤差棒係表示芽長度的S.E.(n=10)。圖面1：過度表現SKIN1的基因轉殖系SKIN1-O4；圖面2：過度表現SKIN2的基因轉殖系SKIN2-O4。對於更多
SKIN-Ox和SKIN-Ri系的數據，可在線上參見第十六圖。
第七圖係顯示SKIN和SnRK1A主要在細胞質中相互作用。將質體構築體轉染至大麥糊粉層，並在-S培養基中培育24小時。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm的光學切片，但此處只顯示了5個規則間隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。對於各細胞的更多切片圖像，也可在線上參見第十七圖。
第八圖係顯示這些SKIN基因在細胞質和細胞核中均可拮抗SnRK1A的功能。(A)質體構築。(B)經過Ubi：SKIN-GFP或Ubi：SKIN△NLS-GFP轟擊之大麥糊粉層細胞。細胞在+S培養基或-S培養基中培育24小時。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm的光學切片，但此處只顯示了5個規則間隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。對於各細胞的更多切片圖像，也可在線上參見第十八圖。(C)使用SnRK1A和Ubi：SKIN-GFP或Ubi：SKIN△NLS-GFP共轉染水稻胚，並在+S培養基或-S培養基中培育24小時，然後進行螢光素酶活性測定。將僅經過SRC-35S mp-Luc構築體轟擊並培養在+S培養基中之水稻胚的螢光素酶活性設定為1X，其他數值則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的標準差(SE)。
第九圖係顯示SKIN的表現會受多種非生物逆境以及ABA的誘導，並且這些SKIN會提高ABA的敏感性。(A)從2天齡水稻幼苗的葉片中純化總RNA，這些幼苗係經乾旱、使用200mM的鹽處理、在4℃培育、或用1μM的ABA處理，或來自在水中生長(低氧)之幼苗的胚，以上處理均以多個
時間長度來進行。使用SKIN1和SKIN2的特異性引子對這些RNA進行定量RT-PCR分析。將最高的mRNA量設定為100%。將最低的mRNA量定為數值1X，其他樣品的mRNA量則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的標準差(SE)。(B)基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)的種子在28℃以14h光照/10h黑暗迴圈條件下於含有不同濃度ABA的水中萌發並生長6天。測量芽的長度。誤差棒係表示在顯著水準的SE(n=8)：*p<0.1，**p<0.05。也可以在線上參看第二十圖中經處理之幼苗的照片。
第十圖係顯示在糖缺乏條件下，ABA會在細胞質中限制這些SKIN、SnRK1A和MYBS1。用所示的質體構築體共轉染大麥糊粉層，並在具有ABA(+ABA)或沒有ABA(-ABA)的+S培養基或-S培養基中培育48小時。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm的光學切片，但此處只顯示了5個規則間隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。對於各細胞的更多切片圖像，也可在線上參見第二十二圖。(A)單獨用Ubi：SKIN1-GFP、Ubi：SKIN2-GFP、Ubi：SnRK1A-GFP或Ubi：MYBS1-GFP轉染的大麥糊粉層。(B)單獨用Ubi：MYBS1-GFP轉染(圖面1)、或用Ubi：MYBS1-GFP和Ubi：SnRK1A共轉染(圖面2)、或用Ubi：MYBS1-GFP和Ubi：SnRK1A(Ri)共轉染(圖面3)的大麥糊粉層。(C)用Ubi：SnRK1A-GFP和Ubi：SKIN(Ri)共轉染的大麥糊粉層。(D)野生型水稻(WT)或過度表現Ubi：SKIN(Ri)之基因轉殖水稻用Ubi：SnRK1A-GFP(圖面1-3)或Ubi：MYBS1-GFP(圖面4-6)轉染後的情形。
第十一圖係顯示SnRK1A在調控穀物幼苗中的營養代謝的供源-積儲交流上發揮核心作用，且關鍵因子的差異性細胞定位會在非生物逆境下調控
前述過程。來自有營養需求之積儲組織(萌發的胚和幼苗)的糖缺乏訊息會觸發SnRK1A和MYBS1的共核定位，而引起多種水解酶的誘導作用，這些水解酶對供源組織(胚乳)中的養分代謝是必要的。逆境和ABA會促進SKIN的胞質定位，而SKIN會與SnRK1A結合並阻止SnRK1A和MYBS1進入細胞核。說明書中將更詳細地討論這點。
第十二圖係顯示SKIN1和SKIN2與SnRK1A會在酵母中相互作用。在酵母雙雜交測定中，係使用質體構築體ADH1：GAD-SnRK1A和ADH1：GBD-SKIN作為效應子，並使用Mel1：LacZ、Mel1：Mel1和Gal1：HIS3作為報告子。將單獨含有GADSnRK1A或GAD(─)的酵母菌株AH109與單獨含有GBD-SKIN或GBD(─)的酵母菌株Y187進行配對。使用p53與大T抗原(T-Ag)間的相互作用作為陽性對照組。
第十三圖係顯示SKIN1和SKIN2的胺基酸序列比對。相同的胺基酸用黑色背景上的白色字母顯示，而相似的胺基酸用灰色背景上的黑色字母表示。功能域的縮寫：NLS，核定位訊息；KSD，GKSKSF域；KID，蛋白激酶A誘導域。
第十四圖係顯示SKIN1之N端的1-83位胺基酸與SnRK1A的激酶域和自動抑制(autoinhibitory)域在酵母中的相互作用。(A)使用質體構築ADH1：GAD-SnRK1A和ADH1：GBD-SKIN1(野生型，或N或C端缺失的)作為效應子，而Mel1：LacZ、Mel1：Mel1和Gal1：HIS3作為報告子。(B)在酵母雙雜交測定中，SKIN1的N端會與SnRK1A相互作用。(C)SnRK1A的激酶域(KD)和自動抑制域(AID)會與SKIN1以及SKIN2相互作用。單獨含有GAD-SnRK1A或GAD(─)的酵母菌株AH109與單獨含有各種GBD-SKIN1構築體或GBD(─)的酵母菌株Y187進行配對。使用p53與
大T抗原(T-Ag)間的相互作用作為陽性對照組。
第十五圖係顯示硝酸纖維素膜用麗春紅S染色的結果，以顯示西方墨點分析中的蛋白填載量。(A)透過粒子轟擊將Ubi.SnRK1A、Ubi.SKIN或Ubi.SnRK1A和Ubi.SKIN轉染至水稻胚。萃取總蛋白並將其印至硝酸纖維素膜，用於西方墨點分析，如第三圖C所示。接著，用麗春紅S對同一張硝酸纖維素膜進行染色。泳道1至8中的蛋白是在同一塊膠中進行電泳，泳道9至12中的蛋白則在另一塊膠中進行電泳。NT：沒有進行轉染的胚。(B)從二天齡的SKIN-Ox基因轉殖系幼苗中萃取總蛋白並將其印至硝酸纖維素膜，用於西方墨點分析，如第四圖B所示。接著，用麗春紅S對同一張硝酸纖維素膜進行染色。泳道1至4中的蛋白是在同一塊膠中進行電泳，泳道5至8中的蛋白則在另一塊膠中進行電泳。WT：野生型幼苗。
第十六圖係顯示這些SKIN基因會抑制幼苗在水中生長所必要的糖生成。SKIN-Ox和SKIN-Ri系的水稻種子在空氣中、或在具有或沒有90mM蔗糖的水裡萌發不同的時間長度。每天對幼苗芽的長度進行測量。誤差棒係表示芽長度的S.E.(n=10)。圖面1：空氣中；圖面2：水中；圖面3：具有蔗糖的水中。代表系的數據也見於第六圖。
第十七圖係顯示SKIN和SnRK1A主要在細胞質中相互作用。將質體構築體轉染至大麥糊粉層，並在-S培養基中培育24小時。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm的光學切片。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。方框表示第七圖所示的圖像。
第十八圖係顯示那些沒有NLS的SKIN係定位在細胞質中。使用Ubi：SKIN△NLS-GFP轟擊大麥糊粉層細胞。細胞用100mM葡萄糖(+S)或不用葡萄糖(-S)處理24h。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm
的光學切片。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。方框表示第七圖所示的圖像。
第十九圖係顯示SKIN會在大多數水稻組織中表現。從水稻幼苗(7天齡)、成熟的植物(3月齡)、花和未成熟花序(授粉後1至22天，DAF)中純化總RNA。使用SKIN1和SKIN2的特異性引子對RNA進行定量RT-PCR分析。將最高的mRNA量設定為100%。將最低的mRNA量定為數值1X，其他樣品的mRNA量則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的SE。
第二十圖係顯示過度表現SKIN之基因轉殖水稻的生長對ABA抑制更加敏感。基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SK1N2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)的種子在含有不同ABA濃度的水中於28℃以14h光照/10h黑暗迴圈的條件下萌發並生長6天。在第6天對幼苗進行拍照。芽長度的定量資料如第九圖B所示。
第二十一圖係顯示ABA和山梨醇會抑制SnRK1A在激活αAmy3 SRC啟動子方面的功能。將報告子SRC-35Smp：Luc在有或無效應子的情況下轉染至水稻胚或大麥糊粉層，並在有或無ABA的條件下培育24h，然後進行螢光素酶活性測定。將僅經過SRC-35S mp-Luc構築體轟擊並培養在+S培養基中的胚或糊粉層的螢光素酶活性設定為1X，其他數值則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的標準差(SE)。(A)質體構築。(B)單獨使用效應子Ubi：SnRK1A、Ubi：SKIN1或Ubi：SKIN(Ri)和報告子SRC-35S mp：Luc轉染大麥糊粉層，或用效應子Ubi：SnRK1A和Ubi：SKIN或Ubi：SKIN(Ri)和報告子SRC-35S mp：Luc共轉染大麥糊粉層。(C)轉染或未轉染Ubi：SnRK1A(上方圖面)後在有或無1μM ABA或50mM山梨醇之情況
下培育的水稻胚，以及轉染或未轉染Ubi：SnRK1A(下方圖面)後與5μM ABA或400mM山梨醇共同培育的大麥糊粉層。
第二十二圖係顯示在糖缺乏時ABA會在細胞質中限制這些SKIN、SnRK1A和MYBS1的表現。用所示的質體構築體共轉染大麥糊粉層，並在具有ABA(+ABA)或沒有ABA(-ABA)的+S培養基或-S培養基中培育48小時。為每種細胞製備30個厚度為0.9至1.1μm的光學切片，但此處只顯示了5個有規則間隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分別表示在細胞質和細胞核中較強的GFP訊息，c和n分別表示在細胞質和細胞核中較弱的GFP訊息。方框表示第十圖所示的圖像。(A)單獨用SKIN1-GFP、SKIN2-GFP、SnRK1A-GFP或MYBS1-GFP轉染的大麥糊粉層。(B)單獨用MYBS1-GFP轉染，或用MYBS1-GFP和SnRK1A或SnRK1A(Ri)共轉染大麥糊粉層。(C)用SnRK1A-GFP和SKIN(Ri)共轉染大麥糊粉層。(D)野生型水稻(WT)或用SnRK1A-GFP或MYBS1-GFP轉染之過度表現SKIN(Ri)的基因轉殖水稻。
第二十三圖係顯示SKIN1而非SKIN2對種子發育的妨礙係透過抑制澱粉和GA之生物合成所必須的酶來達成。(A)將相同數量的基因轉殖系SnRK1A-Ri(127-13)、SKIN1-Ox(O3)和SKIN1-Ri(R3)種子以首尾相接方式排列進行長度比較(上方圖面)，並以兩側相接方式排列進行寬度比較(下方圖面)。(B)分別測量SKIN1-Ox、SKIN1-Ri和SnRK1A-Ri系這三種獨立的基因轉殖植物之1000顆籽粒的重量(上方圖面)，以及每種植物的籽粒長度、厚度和寬度以及籽粒產量。(C)從基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)和SKIN2-Ri(R1)的未成熟花序中萃取總RNA，並用SKIN1、SKIN2、GIF和GA3ox2特異性引子進行定量RT-PCR分析。將最高的mRNA量設定為100%。將最低的mRNA量定為數值1X，
其他樣品的mRNA量則相對於此數值來進行計算。誤差棒係顯示三次重複試驗的SE(n=12)。顯著性水準：*p<0.1，**p<0.05。
第二十四圖係顯示SKIN會阻礙植物生長。本實驗中使用了野生型及基因轉殖系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)和SKIN2-Ri(R1)。對抽穗期間植物的高度進行測量，以±表示SE(n=9)。
第二十五圖係顯示在2014年的春季(二月至七月)種植於旱田(non-irrigated fields)裡的野生型(WT)、三個獨立的SKIN1-Ox系(O2、O3以及O6)和三個獨立的SKIN1-Ri系(R2、R3以及R5)。收穫後測定籽粒產量。誤差棒係表示標準差SD(n=10)。t檢定的顯著性水準：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
本研究中使用了水稻(Oryza sativa cv Tainung 67)和大麥(Hordeum vulgare cv Himalaya)。胚的癒傷組織(calli)在含有3%蔗糖和10mM 2,4-D(即2,4-二氯苯氧乙酸)的MS培養基(Murashige & Skoog medium)中誘導5天。在進行水稻幼苗的水耕栽培(hydroponic culture)時，係使用1.5% NaOCl和Tween 20對種子消毒1h，並用蒸餾水充分清洗，並在具有濕濾紙的培養皿中在28℃以14h光照/10h黑暗迴圈的條件下(除非另有說明)進行萌發。SnRK1A敲減(knockdown)的基因轉殖水稻係得自先前研究(Lu at al.,2007)。
我們之前的研究顯示，雖然使用了不同的系統，但大麥糊粉層中
MYBS1功能的糖調控(Lu et al.,2002)，使用水稻胚時MYBS1功能的SnRK1A調控(Lu et al.,2007)、使用水稻懸浮細胞時SnRK1A表現的CIPK 15調控(Lee et al.,2009)、以及使用水稻和大麥糊粉層時MYBS1和MYBGA相互作用的調控及MYBS1的細胞核質穿梭(nucleocytoplasmic shuttling)(Hong et al.,2012)都是一致的。對螢光素酶活性的短期表現測定(transient expression assay)來說，糊粉層/胚便於大規模樣品製備、粒子轟擊和蛋白萃取的操作，優於水稻胚乳。為了研究與目標蛋白融合之GFP的細胞定位，較佳係使用大麥糊粉層，因為水稻糊粉層是單層細胞且較脆弱，而大麥糊粉層有3至4層且相對較堅實，更便於在顯微鏡底下操作。此外，與洋蔥表皮細胞相較之下，大麥或水稻糊粉層細胞具有相對而言大很多的細胞核、以及較小的液泡，這更有利研究蛋白的入核運輸。
質體p3Luc.18包含αAmy3 SRC(轉錄起始位點上游第-186至-82位置)，其係與CaMV35S最小啟動子-Adh1內含子-螢光素酶cDNA(Luc)融合基因融合在一起(Lu et al.,1998)。質體pUG包含β-葡萄糖醛酸酶cDNA(GUS)，其係融合在Ubi啟動子和Nos終止子之間(Christensen and Quail,1996)。質體pUbi-SnRK1A-Nos包含SnRK1A全長cDNA，其係位於Ubi啟動子和Nos終止子之間(Lu et al.,2007)。質體pUbi-SnRK1A-KD-Nos包含編有SnRK1A激酶域之密碼的cDNA，其係位於Ubi啟動子和Nos終止子之間(Lu et al.,2007)。質體pUbi-SnRK1A-RD-Nos包含編有SnRK1A調控域之密碼的cDNA，其係位於Ubi啟動子和Nos終止子之間(Lu et al.,2007)。質體p5xUAS-35SminiP-Luc-Nos包含5個UAS的串聯重複，其係融合至CaMV35S最小啟動子-Adh1內含子-Luc融合基因的上游(Lu et al.,
1998)。pAHC包含Luc cDNA，其係位於Ubi啟動子和Nos終止子之間(Bruce et al.,1989)。
為了選殖出與SnRK1A相互作用的蛋白，透過cDNA融合來構建酵母(Saccharomyces cerevisiae)雙雜交cDNA基因庫，其中cDNA係從缺乏蔗糖8小時之水稻懸浮細胞分離的poly(A)mRNA中取得，並與噬菌體載體pAD-GAL4-2.1中的GAL4激活域(GAL4 activation domain，GAD)DNA融合。使大約1x106個轉型細胞(transformants)在缺乏白胺酸、色胺酸和組胺酸、但含有15mM的3-胺基-1,2,4-三唑(3-AT)的合成性完全培養基(SC培養基)中進行雙雜交篩選。HIS3報告基因的表現使得選殖體得以在選擇性培養基上生長，且在推定為陽性之轉型細胞中測試其他報告基因(例如lacZ)的誘導情形。透過重新轉型到酵母中來對陽性選殖體進行評估，並透過DNA序列分析來鑑定cDNA插入片段(inserts)。
依照製造商(Clontech,USA)的描述使用YeastmarkerTM Transformation System 2來研究SnRK1A與SKIN間的相互作用。前述酵母雙雜交測試係在酵母(S.cerevisiae)菌株AH109以及Y187(Clontech)中進行，前述酵母菌株含有在GAL4回應元件控制下的報告基因HIS3和lacZ(Chien et al.,1991)。選殖體會在選擇性培養基上生長，並透過酵母菌活性濾膜分析法(colony-lift filter assay method)來測試β-半乳糖苷酶的活性。
使用GATEWAY基因選殖系統(Invitrogen,USA)來生成所有的構築體。首先生成能夠在所有實驗中使用的的目的載體(destination vector)。為
了生成在水稻胚之暫態表現測試中使用的構築體，用BamHI對質體pAHC18進行酶切(digest)，以移除螢光素酶cDNA插入片段，接著加入雙-HA標籤，生成pAHC18-2HA。用EcoRV處理使pAHC18-2HA成為線狀結構，並將兩側有attR1和attR2的ccdB DNA片段插入Ubi啟動子和Nos終止子之間，生成pUbi-2HA-ccdB-Nos。為了生成在水稻穩定轉型中使用的構築體，用HindIII處理使pUbi-2HA-ccdB-Nos成為線狀結構，並將之插入已經用同樣的限制性內切酶處理而成為線狀結構的雙元載體pSMY1H(Ho et al.,2000)，生成目的載體pSMY1H-pUbi-2HA-DEST-Nos。
為了生成在酵母雙雜交測試中使用的構築體，用SmaI處理含有與Gal4結合域DNA融合之ADH1啟動子的pAS2-1(ADH1-GAD)、以及含有與Gal4激活域DNA融合之ADH1啟動子的pGAD424(ADH1-GBD)，使之成為線狀結構，接著將兩側有attR1和attR2位點的ccdB DNA片段插入ADH1-GAD或ADH1-GBD的下游，生成目的載體GAD-ccdB和GBD-ccdB。透過PCR合成SKIN1、SKIN2以及SnRK1A(野生型或截短型(truncated))的編碼序列，並用pENTRTM/Directional TOPO Cloning Kits(Invitrogen，USA)將之插入attL1和attL2位點之間，生成pENTR-SKIN和pENTR-SnRK1A。融合在GAD和GBD之C端的各種基因係透過GATEWAY λ重組系統(LR Clonase IIenzyme mix kit,Invitrogen)而受ADH1啟動子的驅動。
為了生成SKIN RNA干擾(RNAi)構築體，透過PCR合成兩個307bp片段和245bp片段，這兩個片段分別源自SKIN1和SKIN2之cDNA的3'UTR。將兩者當中的任意一個以反義方向及正義方向融合在750bp GFP之cDNA的兩側。將前述SKIN RNAi片段插入pENTRTM/D-TOPO中attL1和attL2位點之間，生成pENTR-SKIN-Ri。透過GATEWAY λ重組系統(LR Clonase II enzyme mix kit,Invitrogen)生成入門載體(entry vector)pENTR-
SKIN(Ri)，並透過該GATEWAY λ重組系統生成pSMY1H-SKIN-Ri(包括pSMY1H-SKIN1-Ri和pSMY1H-SKIN2-Ri)。
源自SKIN1之3'UTR的307bp片段(SEQ ID NO：58)：
源自SKIN2之3'UTR的245bp片段(SEQ ID NO：59)：
源自GFP之cDNA的750bp片段(SEQ ID NO：60)：
為了研究蛋白細胞定位，將SKIN之全長cDNA插入pENTRTM/D-TOPO中attL1和attL2位點之間，生成入門載體pENTR-SKIN。透過GATEWAY λ重組系統將pENTR-SKIN中的SKIN插入到pSMY1H-pUbi-2HA-DEST-Nos中pUbi-2HA的下游，生成pSMY1H-pUbi-2HA-SKIN-Nos。
為了生成不含NLS的SKIN(SKINΔNLS)構築體，將缺少NLS編碼(KRRR)DNA的SKIN cDNA插入pENTRTM/D-TOPO中attL1和attL2位點之間，生成入門載體pENTR-SKINΔNLS。透過GATEWAY λ重組系統將pENTR-SKINΔNLS中的SKINΔNLS插入到pUbi-2HA-DEST-Nos中pUbi-2HA的下游，生成pUbi-2HA-SKINΔNLS-Nos，並將該片段另插入pUbi-GFP-DEST-Nos中pUbi-GFP的下游，生成pUbi-GFP-SKINΔNLS-Nos。
將用於過度表現SKIN1和SKIN2的質體(即pSMY1H-pUbi-2HA-
SKIN，包括pSMY1H-Ubi-2HA-SKIN1-Nos和pSMY1H-Ubi-2HA-SKIN2-Nos)以及用於默化SKIN1和SKIN2的質體(即pSMY1H-SKIN-Ri，包括pSMY1H-SKIN1-Ri和pSMY1H-SKIN2-Ri)分別導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，依照先前文獻所述(Ho et al.,2000)來進行水稻轉型。轉型後獲得許多基因轉殖株，其中(SKIN2-Ox)O2、(SKIN1-Ox)O3、(SKIN1-Ri)R3、(SKIN2-Ri)R1過度表現或默化效果較佳，故被挑選出來用於接下來的實驗。此外，還使用了其他SKIN-Ox株(O6)和SKIN-Ri株(R2、R5)。
依照之前先前文獻所述(Chen et al.,2006)製備用於粒子轟擊的水稻胚。用報告子、效應子和內部對照物轟擊水稻胚，若為單個效應子，其比例為4：2：1，或若為兩個效應子，其比例為4：2：2：1。由於每個獨立實驗中的轉型效率可能不同，使用內部對照物(Ubi：：GUS)將報告子的酶活性值標準化。將經轟擊的水稻胚分為兩等份，其中一份在含有100mM Glc的MS液體培養基中培育24h，另一份在含有100mM甘露醇的MS液體培養基中培育24h。使用細胞溶解緩衝液(0.1M磷酸鉀，pH 7.8，1mM EDTA，10%甘油，1% triton X-100和7mM β-巰基乙醇)從胚中萃取總蛋白。使用GUS測定緩衝液(0.1M磷酸鈉，20mM EDTA，0.2%肌胺酸，0.2% Triton X-100和20mM β-巰基乙醇)進行GUS活性測定。GUS和螢光素酶的活性測定方法見於先前文獻(Lu et al.,1998)。所有的轟擊至少重複三次。
依照先前文獻所述，進行大麥糊粉/胚乳的暫態表現測試(Hong et al.,2012)。每個獨立的實驗包括三次重複，每次處理使用了6個胚乳，重複三次，得出相似的結果。依照先前文獻所述，進行螢光素酶和GUS活性測試
(Hong et al.,2012)。誤差棒係顯示三次重複試驗的SE。
使用Trizol試劑(Invitrogen)從水稻幼苗的葉片中萃取總RNA，並用不含RNA酶(RNAse)的DNA酶I(DNAse I)進行處理(Promega,Madison,WI)。將5到10μg RNA用於使用反轉錄酶(Applied Biosystems,Foster City,CA)的cDNA製備，然後將cDNA稀釋至10ng/μl貯藏。將5μl cDNA和引子以及2 X Power SYBR Green PCR Master mix試劑(Roche)混合，並送入ABI 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。透過相對定量CT法(delta-delta CT method)評估不同樣品間的數量變異，並用18S核糖體RNA擴增作為內部對照組，以將所有資料標準化。
生成針對源自SnRK1A的合成肽(5’-RKWALGLQSRAHPRE-3’，胺基酸殘基385至399)的抗SnRK1多株抗體。購得針對HA標籤的鼠單株抗體(Sigma)。依照先前文獻所述進行西方墨點分析(Lu et al.,2007)。使用與辣根過氧化物酶共軛結合且針對兔免疫球蛋白G的抗體(Amersham Biosciences)作為二抗。透過化學發光以及電化學發光(ECL)來檢測蛋白訊號(Amersham Biosciences)。蛋白的麗春紅S(Ponceau S)染色結果係作為填載量對照組。
依照先前文獻所述進行本實驗(Lee et al.,2009)。在空氣中萌發時，係將種子放置在含有半強度MS瓊脂培養基的50ml離心管中用水浸濕的3M
濾紙上。在水中萌發時，係將種子放置在50ml離心管中，將滅菌水仔細倒入管中以避免產生氣泡，隨後用蓋子將離心管密封。
依照先前文獻所述進行SKIN-GFP、SnRK1A-GFP以及MYBS1-GFP融合蛋白之細胞定位的檢測(Hong et al.,2012)。將去胚的大麥(embryoless barley)和水稻種子用1% NaOCl消毒30分鐘，並在含有20mM CaCl2以及20mM琥珀酸鈉的緩衝液(pH 5.0)中培育4天。使用刮鬍刀片刮去胚乳中的澱粉，以分離糊粉層。將4個糊粉層排列在10cm的盤子中進行轟擊。使用蔡司共聚焦顯微鏡(LSM510META)以488nm雷射(激發)和515nm至560nm的長通濾波器(發射)來檢查表現GFP的糊粉層。
表1和表2列出了所有用於質體構築選殖的引子。表3列出了用於定量RT-PCR的引子。
SKIN1(AK060116)；SKIN2(AK072516)；SnRK1A(AB101655.1)；MYBS1(AY151042.1)；αAmy3/RAmy3D(M59351.1)；αAmy8/RAmy3E(M59352.1)，編碼EP3A之Cys蛋白酶(AF099203)；編碼Lip1之GDSL-基序脂肪酶(AK070261)；編碼Phospho1之磷酸酶樣(AK061237)；編碼ST之糖轉運子家族蛋白(AK069132)；ZmMTD1(ACG28615.1)；ZmKCP(ZAA48125.1)；Sorghum02g028960(XP_002462609.1)；AtKCP(NC_003076.8)；AtKCL1(NC_003075)；AtKCL2(NC_003071)；BnKCP1(AY211985)；ZmMTD186T7R4(EU961029)。
為了鑑定與SnRK1A相互作用的成分，我們進行了酵母雙雜交篩選。將SnRK1A的全長cDNA與GAL4激活域DNA融合(GAD-SnRK1A)，作為誘餌，來篩選源自蔗糖缺乏之水稻懸浮細胞的水稻cDNA基因庫。據此鑑定出一個編碼新蛋白的基因，該蛋白被稱為SnRK1A相互作用的負向調控因子1(SnRK1A-interacting negative regulator 1，SKIN1)。水稻基因組的生物資訊學分析也鑑定出一個SKIN1的類似物，稱為SKIN2。使用酵母雙雜交測定來分析與GAL4結合域融合的SKIN(GBD-SKIN)和GAD-SnRK1A間的相互作用。SKIN1和SKIN2均會在酵母中與SnRK1A相互作用。
SKIN1的核苷酸序列如下所示：SEQ ID NO：1
SKIN1的胺基酸序列如下所示：SEQ ID NO：2
SKIN2的核苷酸序列如下所示：SEQ ID NO：3
SKIN2的胺基酸序列如下所示：SEQ ID NO：4
兩個SKIN的胺基酸序列有59%的同一性和69%的相似性(第十三圖)。生物資訊學分析鑑定出在SKIN1、SKIN2和來自不同植物種屬的若干個其他相關蛋白中具有一高度保守的GKSKSF域(GKSKSF domain，KSD)(第一圖A和第十三圖)。這些蛋白的其他保守域(conserved domain)包括一個推定的核定位訊息(nuclear localization signal，NLS)以及蛋白激酶A誘導域(protein kinase A-inducible domain，KID)樣序列(第一圖A)。在這些基因當中，只有來自Brassica napus且含有KID域的蛋白(BnKCP1)已被定性。BnKCP1是一種定位在核中的蛋白，係透過其C端磷酸化的KID域與阿拉伯芥中的組蛋白脫乙醯酶(HDA19)相互作用，而KID域中的Ser188對其與HDA19的相互作用、以及激活下游基因來回應寒冷逆境和肌黴素處理的過程來說都是必要的(Gao et al.,2003)。這些SKIN的胺基酸序列與BnKCP1有40%的同一性和54%的相似性。胺基酸序列的親緣樹分析顯示這些含有KSD的蛋白可以分為雙子葉簇和單子葉簇(第一圖B)。
為了找出這些SKIN中會與SnRK1A相互作用的功能域，將5個截短型SKIN1與GBD融合並進行酵母雙雜交測定分析(第十四圖A)。將SKIN1截短至包含第1至83個胺基酸(生物資訊學程式預測這些胺基酸是推定的捲曲螺旋域(coiled-coiled domain))，並將其截短至包含第1至159個胺基酸(在KID域的5'端終止的序列)。在酵母中，所有缺少第1至83個胺基酸之截短型SKIN1 cDNA都不會與SnRK1A相互作用，而第1至83個胺基酸本身能夠與SnRK1A相互作用(第十四圖B)，這顯示SKIN1(1-83)足以
與SnRK1A在酵母中相互作用，且為必要序列。
為了找出SnRK1A在酵母雙雜交測試中會與SKIN相互作用的域，將包含激酶域(KD)的SnRK1A(1-279)，包含KD以及自動抑制域(AID)的SnRK1A(1-331)，以及包含調節域(RD)的SnRK1A(280-503)(Lu et al.,2007)與GAD融合。只有全長的SnRK1A和SnRK1A(1-331)能夠與SKIN1和SKIN2相互作用(第十四圖C)，這顯示KD以及AID足以與這些SKIN在酵母中相互作用是充分，且為必要序列。
為了進一步驗證SKIN與SnRK1A在植物中的物理性相互作用，進行了水稻胚雙雜交測試。將與GBD融合並在Ubi啟動子的控制下表現的截短型SKIN1和SKIN2作為效應子，並將融合到CaMV35S最小啟動子-螢光素酶(Luc)之cDNA(5xUAS：Luc)上游的5個上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)的串聯重複作為報告子(第二圖A)。除了缺乏N端區域的SKIN1(84-259)與SKIN2(86-261)以外，SnRK1A與每個截短型SKIN1共同表現都可提高螢光素酶活性(第二圖B)。也在植物中鑑定了SnRK1A中會與SKIN相互作用的功能域。SnRK1A全長和其KD均會與SKIN1和SKIN2有相互作用(第二圖C)；然而酵母雙雜交研究的結果顯示KD和AID均為與SKIN1和SKIN2相互作用所必須的序列，這一點兩者結果不同(第十四圖C)。這些資料證實了這些SKIN與SnRK1A在水稻細胞中有物理性相互作用，以及SKIN1的N端第1至83個胺基酸和SKIN2的N端第1至85個胺基酸分別會與SnRK1A的KD相互作用。
SKIN在調控SnRK1A功能上的角色最早是透過使用水稻胚暫態表現的
功能獲得及喪失分析(gain- and loss-of-function analyses)來進行研究。以在Ubi啟動子控制下表現的SnRK1A和SKIN的cDNAs以及SKIN RNA干擾(Ri)構築體作為效應子，將與CaMV35S最小啟動子以及Luc cDNA融合的αAmy3 SRC(SRC-35Smp：Luc)作為報告子(第三圖A)。在含100mM葡萄糖(+S)或不含葡萄糖(-S)的條件下培育24小時，SnRK1A的過度表現會增強αAmy3 SRC啟動子，這些SKIN的過度表現會抑制αAmy3 SRC啟動子，而SKIN(Ri)的過度表現則會解除αAmy3 SRC啟動子的抑制(第三圖B)。SKIN和SnRK1A的共過度表現會將αAmy3 SRC啟動子抑制至類似於SKIN單獨過度表現時的量，而SKIN(Ri)和SnRK1A的共過度表現會在+S和-S的條件下增強αAmy3 SRC啟動子(第三圖B)。這些結果顯示這些SKIN基因會拮抗被SnRK1A激活之αAmy3的表現。
先前技術業已揭露(Lu et al.,2007)，在糖缺乏條件下，非轉型之水稻胚中的內源性SnRK1A的累積會增加(第三圖C，泳道1和2)。這些SKIN單獨或與SnRK1A共同的暫態過度表現都不會改變SnRK1A的累積量，但重組的SnRK1A會增加SnRK1A總量(第三圖C，泳道5至12)，這顯示這些SKIN會拮抗SnRK1A的活性，而不是影響SnRK1A的蛋白累積量。
為了進一步理解SKIN拮抗SnRK1A功能的機制，我們對SKIN拮抗SnRK1A活性的功能域進行了研究。使用在Ubi啟動子控制下表現的野生型及截短型SKIN1作為效應子，並以SRC-35Smp：Luc作為報告子(第三圖A)。SKIN1(1-83)以及SKIN1(160-259)並沒有拮抗SnRK1A的功能(第三圖D)，這顯示位於第84至159個胺基酸的區域可能負責對SnRK1A功能的拮抗。刪除第84至159個胺基酸後的SKIN1會喪失抑制功能，進一步證實了這個觀點(第三圖D)。
由於高度保守的KSD剛好位於SKIN1的第84至159個胺基酸內(第
十三圖)，將KSD從SKIN1中刪除或以6個丙胺酸(Ala)取代。兩種突變形式的SKIN1均喪失了它們對αAmy3 SRC啟動子的抑制功能(第三圖E)。有趣的是，我們注意到，在+S和-S的條件下，這些缺失了第84至159個胺基酸或KSD域的SKIN實際上都會提高SnRK1A的功能(第三圖D及E)，這暗示了這些截短型SKIN的功能可能是作為內源性SKIN的顯性負向調控因子。然而，這些研究證實了這些SKIN是SnRK1A的負向調控因子，且這些SKIN的KSD對這些SKIN基因在抑制作用中所扮演的角色來說是必要的。
在攜帶有Ubi：SKIN和Ubi：SKIN(Ri)構築體的基因轉殖水稻中，進一步研究了這些SKIN在調控SnRK1A依賴性糖缺乏訊息傳導途徑方面所扮演的角色。在兩天齡基因轉殖水稻幼苗中，野生型的內源性SKIN mRNAs累積量在-S條件下會向上調控，SKIN默化(SKIN-Ri)系的內源性SKIN mRNAs累積量在+S或-S條件下都會減少，而SKIN過度表現(SKIN-Ox)系的重組SKIN累積量在+S或-S條件下均顯著提高(第四圖A，圖面1)。在-S條件下的野生型中，SnRK1A依賴性糖缺乏訊息傳導途徑的標誌物(包括MYBS1、αAmy3以及αAmy8)會受到誘導而表現出來，但在+S或-S條件下的SKIN-Ox系中，它們都會顯著減少(第四圖A，圖面2至4)。
之前我們的研究發現，在萌發剛開始的時候，任何營養缺乏訊息都可協調地開啟用以代謝貯存在胚乳中之各種營養的水解酶和轉運子的表現(Hong et al.,2012)。為了確定該SnRK1A依賴性途徑是否也會調控這些基因，我們隨機選擇了四個負責碳、氮和磷酸營養代謝的代表性基因供進一步分析。這些基因包括糖轉運子(sugar transporter，ST)、GDSL-基序脂肪
酶(GDSL-motif lipase，Lip1)、半脒胺酸蛋白酶(cysteine protease，EP3A)以及磷酸酶樣蛋白(phosphatase-like protein，Phospho1)。一般而言，這四種基因的轉錄較少，但會被營養缺乏的狀況激活(Hong et al.,2012)。這裡我們顯示了前述四種基因之mRNA的累積也會在-S條件下被激活，並在SKIN-Ox系中受到抑制(第四圖A，圖面5至8)。當SKIN-Ri系在+S條件下時，所有受測基因的累積量會有些許增加，而在-S條件下則否，這可能是在前述實驗條件下，SKIN1和SKIN2的功能冗餘(functional redundancy)所造成的。作為對照的水稻泛素基因UbiQ5的表現在SKIN-Ox系和SKIN-Ri系中沒有發生變化(第四圖A，圖面9)。
在-S條件下，內源性SnRK1A的累積量略高，在基因轉殖水稻中這些SKIN的過度表現也並沒有改變這個模式，但重組SnRK1A會使SnRK1A總量略微增加(第四圖B)，這表示SnRK1A依賴性訊息傳導途徑受到抑制並不是SnRK1A蛋白累積量降低所造成的。
之前我們的研究發現，在SnRK1A敲除(knockout)(snf1a)和SnRK1A敲減(knockdown)(SnRK1-Ri)的突變體中，萌發和幼苗生長會變得遲緩(Lu et al.,2007)。既然這些SKIN會抑制基因轉殖水稻中SnRK1A依賴性營養缺乏訊息傳導途徑(第四圖)，我們進一步研究了這些SKIN在植物生長中的生理功能。SKIN-Ox和SKIN-Ri基因轉殖系在光照/黑暗迴圈或連續黑暗的條件下生長6天。與野生型相較之下，SKIN-過度表現(SKIN-Ox)基因轉殖系芽和根的生長會受到抑制，但SKIN1-默化(SKIN1-Ri)基因轉殖系芽和根的生長則會增強，而且這個差別在連續黑暗的條件下會更為明顯(第五圖A，圖面1)。定量分析顯示，在光照/黑暗迴圈條件下幼苗芽和
根的長度在SKIN-Ox系較短而在SKIN-Ri系較長，且這個差別在連續黑暗的條件下會更為明顯(第五圖B，圖面1)。如果向SKIN-Ox和SKIN-Ri系提供3%(88mM)的蔗糖，則不論生長條件如何，都不會檢測到芽和根方面的差異(第五圖A和5B，圖面2)，這顯示蔗糖能夠恢復SKIN-Ox系的生長。
為了證實這些SKIN的過度表現對幼苗生長的抑制是由於α-澱粉酶表現降低以致於從種子澱粉水解而產生高需求碳源所造成的，對αAmy3的表現進行了檢測。在連續黑暗的條件下，野生型3天齡幼苗中的αAmy3表現會被誘導出來，但在所有的生長條件下，SKIN-Ox系中的誘導量會降低，而SKIN-Ri系的誘導量會增加(第五圖C，圖面1)。氮對於幼苗生長也是必要的。這些SKIN對於EP3A表現的調控與它對αAmy3的調控類似，只是在連續黑暗的條件下，EP3A在SKIN-Ri系中的表現並不會增加(第五圖C，圖面2)。
之前我們的研究顯示，SnRK1A是在低氧條件下水稻萌發和幼苗生長的重要的調控因子(Lee et al.,2009)。因此，我們也研究了這些SKIN在調控低氧逆境反應時所扮演的角色。如第六圖和第十六圖所示，在空氣中，SKIN-Ox系芽的延伸會比野生型慢一些(圖面1)，而在水中，芽的延伸則嚴重地受到抑制(圖面2)。在水中，被延遲的芽延伸能夠藉由蔗糖而恢復(圖面3)。SKIN-Ri系的生長類似於野生型。這些結果進一步證實這些SKIN會抑制SnRK1A依賴性途徑，而在低氧條件下萌發後幼苗生長期間使種子澱粉水解所致的糖生成能力減弱。
確定了SKIN和SnRK1A的亞細胞定位(subcellular localization)。由於這些SKIN會與SnRK1A的KD相互作用，將SnRK1A的全長、KD和RD與綠色螢光蛋白(GFP)融合，並在Ubi啟動子的控制下在大麥糊粉細胞暫態表現系統中表現(Hong et al.,2012)。如第七圖和第十七圖所示，SnRK1A-GFP和SnRK1A-KD-GFP大部分位在細胞質中，少部分位在細胞核內；SnRK1A-RD-GFP主要位在細胞核內；而SKIN1-GFP主要位在細胞核內，少部分位在細胞質中。SnRK1A-GFP和SKIN1共表現時，會將所有SnRK1A-GFP排出核外。SKIN1-GFP與SnRK1A或SnRK1A-KD共表現時，會將所有的SKIN1-GFP隔離在細胞質中，而其與SnRK1A-RD共表現時，會維持SKIN1-GFP的核定位。這些研究證實了SKIN1會透過SnRK1A-KD與SnRK1A相互作用，這與使用植物雙雜交測試獲得的結果是一致的(第二圖C)，而這種相互作用會將這些SKIN和SnRK1A留在細胞質中。
由於SnRK1A和這些SKIN既出現在細胞質，也出現在細胞核中(第七圖)，我們測定了這些SKIN在細胞核和細胞質中是否都會拮抗SnRK1A的功能。將這些SKIN中推定的NLS刪除(SKINΔNLS)並將其與GFP融合(第八圖A)。在+S和-S條件下，SKIN-GFP主要定位在細胞核中，而SKINΔNLS-GFP僅僅定位在細胞質中(第八圖B和第十八圖)，這顯示所預測的NLS是有功能的。有或無NLS之SKIN-GFP與SnRK1A的共表現會將αAmy3 SRC啟動子抑制至當SKIN-GFP單獨過度表現時的水準(第八圖C)。這也顯示，細胞質中的SKIN能夠將SnRK1A捕獲至細胞質，這會阻遏MYBS1表現的向上調控，而MYBS1是αAmy3 SRC活性所需的因子。
能夠在幼苗、成熟植物的所有組織、花和未成熟花序中檢測到兩種SKIN的表現，在幼苗的第一個葉片中或在開花後四天時它們被誘導表現的程度特別高(第十九圖)。我們也測定了這些SKIN的表現是否受到非生物逆境的調控。將水稻幼苗進行乾旱(暴露於乾燥空氣中)、鹽(200mM NaCl)、寒冷(4℃)以及低氧處理。SKIN1和SKIN2之mRNA累積量在乾旱逆境後4h分別被誘導至高達79和66倍；在鹽逆境後6h分別被誘導至高達2.3和1.7倍；在寒冷逆境後48h，SKIN1和SKIN2之mRNA累積量均被誘導至4.6倍；在ABA處理後24h，分別被誘導至4.2和1.7倍；在低氧處理後48h，分別被誘導至3.5和5.1倍(第九圖A)。
為了確定這些SKIN對於ABA回應/訊息傳遞是否重要，使SKIN-Ox和SKIN-Ri系在包含不同濃度之ABA的水中萌發。野生型和所有基因轉殖系之生長的抑制程度會隨著ABA濃度從1μM到10μM而有所增加。然而，與野生型相較之下，SKIN-Ri系的生長受到1μM和5μM ABA抑制的程度較低，而SKIN-Ox系的生長則受到抑制的程度則高得多(第九圖B和第二十圖)。這些結果證實這些SKIN會提高ABA的敏感性。
以上研究顯示，這些SKIN在+S培養基中僅定位在細胞核中，但在-S培養基中，他們在細胞質中的量會增加，且它們在細胞核和細胞質中均可拮抗SnRK1A的功能(第七圖和第八圖)。既然多種非生物逆境以及ABA都會誘導這些SKIN的表現，有必要確定這些SKIN是否能會以逆境依賴性的方式在細胞核和細胞質間穿梭。在水稻胚和大麥糊粉中，ABA和山梨醇
(後者係用以模擬滲透逆境)不僅自身會抑制，而且能夠拮抗經SnRK1A激活的αAmy3 SRC啟動子(第二十一圖)。ABA還會增強SnRK1A和這些SKIN在水稻胚中的相互作用(第二圖D)。因此，ABA被當做逆境訊息誘導子。使與GFP融合之兩種SKIN、SnRK1A及MYBS1在有或無ABA的+S或-S培養基中培育的大麥糊粉層中暫態表現。在有或無ABA的+S培養基中，SKIN-GFP和SnRK1A-GFP分別僅定位在細胞核和細胞質中(第十圖A和第二十二圖A，圖面1-3)。在不含ABA的-S培養基中，可在細胞質中檢測到SKIN-GFP，且有相當數量的SnRK1A位在細胞核中，然而，在含有ABA的-S培養基中，SKIN-GFP和SnRK1A-GFP都僅僅定位在細胞核中(第十圖A和22A，圖面5-7)。定量分析顯示，在缺乏ABA時，SnRK1A-GFP在+S或-S培養基中定位在細胞核內的百分比分別是19.7%和64.0%，這顯示糖缺乏會促進SnRK1A的核定位(表4)。在-S培養基中，SnRK1A-GFP定位在細胞核中的百分比會從無ABA時的64.0%降到有ABA時的8.0%，這顯示ABA會抑制SnRK1A的核定位(表4)。
在+S培養基中，MYBS1-GFP主要定位在細胞質中，而在沒有ABA的-S培養基中，則僅僅定位在細胞核中，這與我們之前的研究是一致的(Hong ct al.,2012)。然而，在含有ABA的-S培養基中，MYBS1-GFP變成僅僅定位在細胞質中(第十圖A和第二十二圖A，圖面4和8)。已知MYBS1會在轉錄層次被SnRK1A活化(Lu et al.,2007)。我們發現，在+S培養基中，SnRK1A的過度表現也會促進MYBS1的入核運輸，而在-S培養基中，SnRK1A默化會抑制MYBS1的入核運輸(分別見於第十圖B和第二十二圖B，圖面2和3)，這顯示SnRK1A係足以促進MYBS1的核定位，且為必要因子。這些研究也顯示，在-S培養基中，SnRK1A和MYBS1的核定位係受到ABA的抑制。
為了確定在含有ABA的-S培養基中SnRK1A-GFP和MYBS1-GFP的專屬細胞質定位的成因是否就是SKIN和SnRK1A之間的相互作用，使
SnRK1A-GFP和SKIN(Ri)在大麥糊粉層中暫態地共表現。在-S培養基中且有SKIN(Ri)存在的情況下，無論是否有ABA存在，SnRR1A-GFP都會在細胞核內大量累積(第十圖C和第二十二圖C)。用SnRK1A-GFP和MYBS1-GFP轉染到過度表現SKIN(Ri)的基因轉殖水稻中。同樣地，無論是否有ABA存在，SnRK1A-GFP和MYBS1-GFP在-S培養基中都會在細胞核內大量累積(第十圖D和第二十二圖D)。這些研究顯示，ABA會促進這些SKIN和SnRK1A間的胞質相互作用，且會減少SnRK1A和MYBS1的核定位。
SKIN1係透過抑制澱粉和GA之生物合成所必須的酶來抑制種子發育
已有人提出這些SnRK1係與碳水化合物代謝和澱粉生物合成相關(Polge and Thomas,2007)，故我們對SKIN1-Ox、SKINI-Ri以及SnRK1A-Ri基因轉殖系的穀粒品質進行了檢測。SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri系的種子尺寸小於野生型(第二十三圖A)。定量分析顯示SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri系的種子長度、厚度和寬度(第二十三圖B)，及其千粒重和籽粒產量(第二十三圖B)均顯著低於野生型和SKIN1-Ri系。
帶有細胞壁轉化酶(cell-wall invertase)(CIN2)編碼的GIF1(籽粒不完全填穗1(Grain Incomplete Filling 1))基因對於在早期籽粒填穗期間的碳分配來說是必要的(Wang,2008 #765)。透過定量RT-PCR分析，我們發現SKIN1-Ox基因轉殖系之未成熟花序的GIF1 mRNA量也減少了40%(第二十三圖C)。近來，我們發現組成型活性(constitutively active)鈣依賴型蛋白激酶1(CDPK1-Ac)會抑制GA生物合成時必要之GA3ox2的表現，且會使基因轉殖水稻的籽粒尺寸變小(Ho,2013 #909)。我們發現，在SKIN1-Ox基因轉殖系中的GA3ox2 mRNA量減少了60%(第二十三圖C)。
在SnRK1A-Ri系中，GIF1的表現降低了20%，但GA3ox2的表現沒有變化，這顯示，GA3ox2的調控是SnRK1A非依賴型的。
總之，這些研究顯示，植物中籽粒的發育會隨著SnRK1A活性的降低而受到阻遏，這是由於SKIN1量增加的緣故，SKIN1會抑制澱粉和GA生物合成必要的酶。
在田間條件下，SKIN1-Ox成熟植物的高度只有輕微降低(第二十四圖)。然而，在SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri植物中的籽粒大小，重量和產量有顯著的減少(第二十三圖A和第二十三圖B)。儘管已有研究顯示，在馬鈴薯塊莖中，SnRK1係透過轉錄調控涉及澱粉生物合成的酶來間接控制碳水化合物的代謝(Halford,2003 #134；Polge,2007 #356)，但我們無法檢測可能涉及發育中水稻種子之澱粉生物合成的幾種酶之編碼mRNA累積量的變化，例如澱粉分支酶I(branching enzyme I，BEI)、異澱粉酶1(isoamylase 1，ISA1)、澱粉合成酶I(starch synthase I)(SSI、SSIIIa、SSIVa)、顆粒結合型澱粉合成酶(granule-bound starch synthase)(GBSSI)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase)(AGPS2a、AGPS1、AGPL1)以及蔗糖合成酶(sucrose synthase)(Ss1,Ss2,Ss3)(數據未顯示)。
在酵母中，為了要在作為替代碳源之蔗糖上生長，必須要有SNF1激酶複合物來對葡萄糖可抑制之轉化酶(glucose-repressible invertase)進行轉錄誘導(Hardie,1998 #129)。在植物中，細胞壁轉化酶會將從供源組織轉運過來的蔗糖切割成可被細胞吸收而用於積儲組織之澱粉生物合成的葡萄糖和果糖，被認為是供源-積儲調控的關鍵酶(Roitsch,1999 #906)。對於在水稻早期籽粒填穗期間的碳分配來說，GIF1是必要的，而gif1突變體雖然顯示出正常的形態和結實，但粒重卻降低了(Wang,2008 #765)。本研究證明了GIF1在水稻中係受SnRK1A依賴型途徑調控。這些GA也會調控繁殖器
官的發育，包括雄花和雌花在內(King,2003 #917)，而GA3ox2是GA生物合成的必要酶(Olszewski,2002 #754)。SKIN1可以獨立地抑制SnRK1A訊息傳遞和GA生物合成途徑，這是基於以下觀察結果得出的結論：第一，SKIN1-Ox系的籽粒產量下降比SnRK1A-Ri系更顯著(第二十三圖B)。第二，在SKIN1-Ox系中，GIF1的表現降低了40%；而在SnRK1A-Ri系中，其表現降低了20%(第二十三圖B)。第三，GA3ox2在SKIN1-Ox系中有降低(第二十三圖C)。
這些SKIN是會與SnRK1A相互作用並拮抗其功能的新型調控子
這些SKIN與SnRK1A會在酵母和植物細胞中進行物理性相互作用(第二圖和第十二圖)。目前已在植物中鑑定出幾個會與SnRK1相互作用的蛋白。例如，會在酵母中與阿拉伯芥的兩個SnRK1(AKIN10和AKIN11)相互作用的PRL1 WD蛋白，它會在阿拉伯芥中對這兩個SnRK1及下游經葡萄糖調控之基因的活性進行負向調節(Bhalerao et al.,1999)。大麥基因SnIP1會與種子特異性的SnRK1在活體外進行相互作用(Slocombe et al.,2002)。來自苔蘚小立碗蘚(Physcomitrella patens)的兩個蛋白PpSK11和PpSK12會在酵母中與SnRK1進行相互作用並抑制其活性(Thelander et al.,2007)。然而，這些蛋白與這些SKIN基因沒有同源性。
在這些SKIN中的KSD是在所有單子葉植物和雙子葉植物的SKIN同源物中高度保守的序列，並同時具有保守的C端NLS序列，該NLS係代表從5個植物物種中鑑定出來、與SKIN密切相關之家族最獨特的特徵(第一圖A)。在該來自單子葉植物中的蛋白家族中也有其他幾個明顯的保守域，這意味著在單子葉植物和雙子葉植物間可能存在有不同的結構及/或功能特徵。以前並不知道SKIN相關家族的任何一個成員有KSD的功能，這
裡我們證明了KSD在拮抗SnRK1A功能方面是必要的(第三圖D)。在酵母和植物細胞中，SKIN1之N端第1至83個胺基酸和SKIN2之N端第1至85個胺基酸會與SnRK1A-KD進行相互作用(第二圖和第十四圖)。但是，KSD並非位於這些區域(第三圖D)。目前還不清楚SKIN-KSD如何干擾SnRK1A的功能。這些SKIN的N端有幾個高度保守的區域，而它們當中有一些也是單子葉植物所特有的。這些SKIN基因當中會與SnRK1A-KD進行相互作用的核心域仍有待更好的定義。
據我們所知，該新蛋白家族唯一一個其功能已有所研究的成員是蕓薹屬(Brassica)的BnKCP1，它被認為是一個在阿拉伯芥中會與組蛋白去乙醯化酶(histone deacetylase)HDA19相互作用、並啟動低溫誘發性基因(cold-inducible genes)的轉錄因子(Gao et al.,2003)。BnKCP1中的KID對其與HDA19之間的相互作用來說是必要的，它也與哺乳動物cAMP反應元件結合(cAMP-responsive element-binding，CREB)蛋白家族中的KID具有一定的功能相似性(Gao et al.,2003)。典型的KID係由RRXS(其中X代表任意胺基酸)組成(Gonzalez et al.,1991)，在SKIN1和SKIN2(RRAS)中都是保守的序列，然而它在整個蛋白胺基酸序列中的相對位置與它在BnKCP1中的相對位置截然不同(第一圖)。KID是否也在這些水稻的SKIN中發揮作用仍有待確定。
在酵母中觀察到SnRK1A複合物的多個亞單元具有類似的結構性、功能性及調節性相互作用，這也存在於植物中(Lu et al.,2007；Polge and Thomas,2007；Halford and Hey,2009)。在酵母中，Snf1在含有葡萄糖的培養基中係位於細胞質，而當葡萄糖缺乏時，在Gal83的協助下，大部分的Snf1都會移位進細胞核(Vincent et al.,2001)，而Snf1-RD負責與Gal83的相互作用(Jiang and Carlson,1997)。在-S培養基中會在細胞核檢測到
SnRK1A-RD(第七圖)，這可能是由於它未與其他細胞質因子進行相互作用、或未與水稻Gal83類似物進行有效相互作用的關係。大量的SnRK1A-GFP係定位於細胞質內，這可能是透過用於共同入核運輸之SnRK1A-KD或不足量的內源性Gal83類似物，而由其他細胞質因子所捕獲的(第七圖)。然而在-S培養基中，SnRK1A在細胞之核內的累積量明顯高於+S培養基(第十圖A，圖面3)。
現已證明，Snf1和SnRK1的核定位分別對於它們在酵母細胞和阿拉伯芥葉肉原生質體中的蛋白激酶活性而言是必要的(Vincent et al.,2001；Cho et al.,2012)。目前還不清楚SnRK1的核定位對於營養缺乏訊息傳遞途徑的調控是否是必要的。我們之前的研究顯示，糖缺乏會誘導SnRK1的表現(Lu et al.,2007)。因此，在-S培養基中，細胞核內的SnRK1A量可能會增加。這些有或沒有NLS的SKIN都保持了它們的拮抗活性(第八圖C)，顯示這些SKIN對於SnRK1A的拮抗作用與其細胞定位無關。沒有ABA時，SnRK1A在+S條件下並不存在於細胞核中(第十圖A，圖面3)，但在-S條件下，它會存在於細胞核和細胞質中(第十圖A，圖面7)。儘管SnRK1A顯著的提高了αAmy3 SRC啟動子的活性，但在-S條件下，前述SRC的活性會被這些SKIN抑制至背景值(第三圖B和第八圖C)。因此，這些SKIN可能會在細胞核和細胞質中拮抗內源性SnRK1A。
目前已知，在有限能源的適應方面，SnRK1能夠在苔蘚和高等植物之間進行相似生理活性的調控。小立碗蘚(Physcomitrella patens)之兩個SnRK基因的雙敲除突變體(snf1a和snf1b)在黑暗狀態下代謝澱粉儲備的能力會
降低，且只要透過供給葡萄糖或提供持續光照就能保持存活(Thelander et al.,2004)。這個突變體在正常的白天(16h)-夜晚(8h)迴圈下無法生長，推測是因為在黑暗中不能進行正常碳水化合物代謝的關係(Thelander et al.,2004)。使阿拉伯芥的兩個SnRK1基因(KIN10和KIN11)過度表現，會在低光照且能源有限的情況下增加主根的生長，而透過經病毒誘導之基因默化所產生的kin10和kin11的雙敲減突變體，阻滯了葉片在夜間的澱粉代謝，並進而阻滯幼苗生長(Baena-Gonzalez et al.,2007)。儘管已經有報導提出SnRK1會在植物中調控供源組織和積儲組織之間的碳分配(Roitsch,1999)，但由於高等植物之snrk1無效突變體(null mutants)有一些固有的生長缺陷，SnRK1在供源-積儲交流中之功能的分子和細胞機制尚不清楚。
在水稻中，SnRK1家族有兩個成員：SnRK1A/OSK1和SnRK1B/OSK24，它們的胺基酸序列具有74%同源性(Takano et al.,1998；Lu et al.,2007)。我們之前的研究證實了SnRK1A(而非SnRK1B)在生長的幼苗當中介導了糖缺乏訊息級聯反應(Lu et al.,2007)。由於SnRK1A均勻地表現在各種生長的組織中(包括幼根和幼芽、花和未成熟種子)，因此SnRK1A在糖調控當中所扮演的角色應該比SnRK1B更加廣泛(Takano et al.,1998)。SnRK1A在MYBS1和αAmy3 SRC的上游起作用，而且在水稻中種子萌發和幼苗生長的調控方面扮演關鍵角色(Lu et al.,2007)。能夠在幼苗、成熟植物、花以及未成熟花序的所有組織中檢測到兩種SKIN的表現(第十九圖)。這些研究顯示，SnRK1A和這些SKIN在萌發的種子和生長的幼苗中都會表現出來。
我們證明了這些SKIN足以拮抗SnRK1A功能，且對這個拮抗作用來說是必要的(第三圖B)。並且，在基因轉殖水稻中，發現在早期幼苗生長階段調控胚乳中營養代謝的供源-積儲交流是透過SnRK1A依賴性營養缺乏
訊息傳導途徑發揮作用的。這些SKIN的表現會受糖缺乏的誘導，與糖乏訊息傳遞途徑中的組成分類似(第四圖、圖面1)。在+S和-S條件下，SKIN-Ox系的MYBS1以及多種水解酶之mRNA累積量會受到抑制；但在SKIN-Ri系中，它們在+S條件下的累積量僅有輕微增加，而在-S條件下則沒有。SKIN1和SKIN2可能有冗餘功能，這些功能會使單一SKIN默化系在-S條件下對於提高內源性基因表現的反應不明顯。
在SKIN-Ox植物中，幼苗芽和根的生長會受到抑制，而在SKIN-Ri植物則受到促進，而與會透過光合作用產生糖的光照/黑暗迴圈條件相較之下，這些效果在黑暗、模擬糖缺乏的條件下會更加明顯(第五圖A和第五圖B)。SKIN-Ox和SKIN-Ri植物之幼苗生長的延遲和促進分別會伴隨αAmy3表現的減少和增加(第五圖C)。而且，SKIN-Ox幼苗的生長可以透過投與外源糖類而得以恢復。在低氧條件下，也有觀察到SKIN過度表現對幼苗生長產生類似的負面作用(第六圖)。這些研究顯示，SnRK1A依賴性糖需求訊息足以促進來自胚乳/糊粉(供源)的糖供給，(在此產生用於營養代謝的水解酶)(第四圖和第五圖)，並將其供給到萌發的胚/生長的幼苗(積儲)(在此利用營養)，且對這些過程來說是必要的，同時它也容許植物在黑暗或低氧環境下生長。在幼苗中，EP3A的表現係受這些SKIN的調控，與αAmy3類似(第五圖C)，這顯示其他營養的需求量雖然較少，但也很可能是透過經SnRK1A調節的途徑協調地產生。
植物經常遭受環境逆境(例如，水缺乏、水災、極端溫度，以及高鹽)，這些環境逆境常常抑制光合作用、影響碳水化合物分配、限制生長，並因此使產量顯著降低。幾方面的證據顯示ABA可能是一種在非生物逆境下透
過這些SKIN基因調控SnRK1A依賴性糖缺乏訊息傳導途徑的關鍵訊息分子。首先，多種非生物逆境和ABA都能誘導這些SKIN的表現(第九圖A)。第二，ABA和這些SKIN拮抗SnRK1A功能的方式相類似(第十圖)。第三，ABA會促進SnRK1A和這些SKIN之間的相互作用(第二圖D)。第四，這些SKIN的過度表現會促進經ABA介導、對幼苗生長的抑制作用(第九圖B)。糖缺乏會促進、而ABA會抑制SnRK1A的核定位，這項發現進一步支持前文的觀點(第十圖A，圖面3)。有趣的是，在-S條件下有ABA存在時，這些SKIN會從細胞核重新定位至細胞質中，這一過程會伴隨著SnRK1A和MYBS1被排除至核外的現象(第十圖A，圖面5至8)。SnRK1A被排除至核外是由於它和這些SKIN會在細胞質中相互作用，因為在-S條件下進行ABA處理時，在暫態過度表現SKIN(Ri)之大麥糊粉細胞中使這些SKIN基因默化(比較第十圖C和第十圖A，圖面7)、或在穩定過度表現SKIN(Ri)之基因轉殖水稻糊粉層細胞中使這些SKIN基因默化(第十圖D，比較圖面2、3和圖面1)，都會顯著提高SnRK1A在核中的累積量。
已經證實，SnRK1會直接調控細胞質中酶活性，並作為基因表達的調控子(Halford and Hey,2009)。SnRK1A似乎會透過多種機制來調控糖缺乏訊息傳遞途徑。我們之前的研究顯示，SnRK1A會激活MYBS1啟動子活性，並很可能會直接將MYBS1磷酸化(Lu et al.,2007)。此外，先前文獻亦顯示，MYBS1的入核運輸會受到糖的抑制，糖缺乏則會助長這個作用(Hong et al.,2012)(第十圖B，圖面1)。這裡我們進一步證明了SnRK1A足以促進MYBS1在+S及-S條件下的入核運輸，而且也是必要因子(第十圖B，圖面2和3)。然而，相較於細胞核，有大量SnRK1A定位在細胞質中，但目前還不清楚MYBS1如何在細胞質或核中受到SnRK1A的調控。透過SKIN默化恢復SnRK1A的核定位也會使在-S條件下且進行ABA處理之基
因轉殖水稻中的MYBS1恢復在核中富集的情況(第十圖D，比較圖面5、6和圖面4)，這顯示SnRK1A和MYBS1的核定位緊密相連，並受這些SKIN抑制。可想而知，細胞質中的SKIN會妨礙SnRK1A和MYBS1的核定位，使得它們無法增加αAmy3 SRC活性。
簡言之，如第十一圖所示，積儲強度會是一種驅動力，而SnRK1A在供源-積儲交流中發揮核心的調控作用。不同的細胞定位似乎是這個調控過程中的關鍵因子。之前已經證實，重要的GA調控子MYBGA會促進MYBS1的功能和入核運輸(Chen et al.,2006；Hong et al.,2012)。在此，我們進一步證明，糖和營養需求這些來自積儲組織(萌發的胚和幼苗)的重要訊息會誘發兩種缺乏訊息分子(即，SnRK1A和MYBS1)的共核定位，從而在供源組織(胚乳)中誘導出營養代謝所必須的α-澱粉酶和其他水解酶。並且，逆境和ABA不僅會誘導SKIN的合成，而且會促使它從核中撤出至細胞質、或阻止它從細胞質進入細胞核。細胞質中的SKIN接著會與SnRK1A結合，並阻止SnRK1A和MYBS1進入細胞核，最終抑制了水解酶的產生。然而，因為SnRK1A會在細胞質內大量累積(甚至是在糖缺乏的情形下)，且SnRK1蛋白激酶的受質位於細胞質內(Halford and Hey,2009)，故不能排除SnRK1A可能會在細胞質中調控糖缺乏訊息傳遞途徑的可能性。值得注意的是，在缺乏ABA或逆境的情形下，SKIN係定位在細胞核內，但功能未知。
當前全球氣候變遷的趨勢是天氣會轉變成更極端的干擾，例如，高低溫、水災和水荒，這會使本已進入高原期的世界作物生產力惡化(IRRI,2010)。隨著全世界人口迅速增加，開發出更能忍受各種非生物逆境、同時保持產量潛能的作物仍是一項重要且富有挑戰性的任務。在植物中，這些SnRK1會在營養和生殖階段調控生長和發育各方面的因子(Polge and
Thomas,2007)。為了減輕SKIN過度表現對植物生長產生的負面影響，理解這些SKIN在非生物逆境下對植物生長在時間和空間上之限制的作用模式可能有助於穀物的改良，使其增強對非生物逆境的耐受性而不損失產量。
在臺灣國立中興大學的灌溉田(irrigated field)和旱田(non-irrigated field)裡種植野生型水稻(WT)及SKIN1-Ox和SKIN1-Ri基因轉殖水稻。在2014年的第一季中，氣候和颱風帶來了很多雨水，旱田不如期望的那樣乾燥。然而，第二十五圖顯示，即使在旱田條件不是很理想的情形下，SKIN1-Ri基因轉殖水稻依然增加了約7.4%的水稻產量。這證明內源性SKIN表現降低會增加水稻產量。如果旱田條件良好的話，產量的差別會更大。
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<223> 用於構築的DNA序列
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Claims (15)
- 一種基因質體，其包含：-啟動子；以及-編碼SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示之胺基酸的核苷酸片段，其中包含對應選自編碼SEQ ID NO：2之84-259域、1-159域、84-159域或GKSKSF域之核苷酸已被刪除或取代，或包含對應選自編碼SEQ ID NO：4之84-261域、1-165域、84-165域或GKSKSF域之核苷酸已被刪除或取代，其中該取代使該胺基酸所編碼之蛋白質喪失拮抗SnRK1A功能。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因質體，其中前述啟動子係為Ubi。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因質體，其中前述GKSKSF域係被AAAAAA所取代。
- 一種轉型植物細胞，其包含如申請專利範圍第1項所述之基因質體。
- 如申請專利範圍第4項所述之轉型植物細胞，其中前述啟動子係為Ubi。
- 如申請專利範圍第4項所述之轉型植物細胞，其中前述GKSKSF域係被AAAAAA所取代。
- 如申請專利範圍第4項所述之轉型植物細胞，其中前述植物是選自水稻、玉米、小麥、大麥、小米、甘蔗、芒草、柳枝稷或高粱的單子葉植物。
- 如申請專利範圍第4項所述之轉型植物細胞，其中前述植物是選自阿拉伯芥、番茄、馬鈴薯、蕓苔、大豆、芥花或甜菜的雙子葉植物。
- 一種製備基因轉殖植物的方法，其包含使用如申請專利範圍第1項所述之基因質體進行轉型，以得出基因轉殖植物。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中前述啟動子係為Ubi。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中前述GKSKSF域係被AAAAAA所取代。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其係藉由農桿菌進行轉型。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中前述植物是選自水稻、玉米、小麥、大麥、小米、甘蔗、芒草、柳枝稷或高粱的單子葉植物。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中前述植物是選自阿拉伯芥、番茄、馬鈴薯、蕓苔、大豆、芥花或甜菜的雙子葉植物。
- 一種增加植物產量的方法，包括：在一植物中過度表現編碼如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示之蛋白質，且其中包含對應選自編碼SEQ ID NO：2之84-259域、1-159域、84-159域或GKSKSF域之核苷酸已被刪除或取代，或包含對應選自編碼SEQ ID NO：4之84-261域、1-165域、84-165域或GKSKSF域之核苷酸已被刪除或取代，其中該取代使該蛋白質喪失拮抗SnRK1A功能；以及種植該植物；其中該植物是選自水稻、玉米、小麥、大麥、小米、甘蔗、芒草、柳枝稷或高粱的單子葉植物或選自阿拉伯芥、番茄、馬鈴薯、蕓苔、大豆、芥花或甜菜的雙子葉植物。
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