CN116355946A - 源于棉花二倍体野生种异常棉的抗旱相关的ssr序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了源于棉花二倍体野生种异常棉的抗旱相关的SSR序列及其应用。本发明提供了特定DNA片段或其相关生物材料在培育抗旱棉花品种或品系或提高棉花的抗旱性中的应用；所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自SSR分子标记NAU2914(SEQ ID No.1)起至SSR分子标记JAAS6420(SEQ ID No.7)止的片段；所述相关生物材料为含有所述特定DNA片段的载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。本发明所提供的染色体片段在抗旱棉花育种中具有重要应用价值，同时本发明开发的SSR分子标记为培育能应用于生产的抗旱棉花品种提供分子基础。
Description
技术领域
本发明涉及棉花育种领域，具体涉及源于棉花二倍体野生种异常棉的抗旱相关的SSR序列及其应用。
背景技术
棉花是重要的经济作物和纺织原料。棉花虽然起源于干旱和半干旱地区，但在栽培棉驯化过程中，对纤维产量、品质和生育期等性状的连续选择，极大降低了棉花的遗传多样性，加强棉花抗旱新材料的创制和探索具有十分重要的意义。
棉属有52个种(其中46个二倍体，6个异源四倍体)，分布于热带和亚热带地区。由于大部分野生种栖息地在干旱和半干旱地区，棉花野生种对干旱缺水环境具有较强的适应性，但由于棉花种间杂交的不亲和性加之棉属基因组的复杂性，对野生种抗旱性的系统研究与育种利用至今鲜有报道。棉属二倍体野生种异常棉(Gossypium anomalum)生长于非洲的西南和撒哈拉沙漠的边缘，具有较强的抗旱性，是陆地棉遗传改良的宝贵基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种源于棉花二倍体野生种异常棉的抗旱相关的SSR序列及其应用。
第一方面，本发明要求保护特定DNA片段或其相关生物材料在如下任一中的应用：
(A1)培育抗旱棉花品种或品系；
(A2)提高棉花的抗旱性；
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自SSR分子标记NAU2914起至SSR分子标记JAAS6420止的片段；
所述SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述相关生物材料为含有所述特定DNA片段的载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。
所述载体可为人工染色体载体，如细菌人工染色体或酵母人工染色体等。所述重组菌和所述转基因细胞系含有所述人工染色体载体。
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
所述特定DNA片段包括位于异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、SSR分子标记NAU1322(见下文)、SSR分子标记JAAS0199(见下文)、SSR分子标记JAAS3476(见下文)、SSR分子标记JAAS4933(见下文)、SSR分子标记JAAS5813(见下文)和所述SSR分子标记JAAS6420；
所述特定DNA片段与位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段序列相同。
含有异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420的植株抗旱性提高。
在所述应用中，可以用所述特定DNA片段替换受体亲本原有染色体片段，得到抗旱性提高的棉花品种或品系。
第二方面，本发明要求保护SSR分子标记或成套SSR分子标记在筛选特定DNA片段以培育抗旱性提高的棉花品种或品系中的应用；
所述SSR分子标记为如下(a1)-(a7)中任一；所述成套SSR分子标记由如下(a1)-(a7)组成；
(a1)SSR分子标记NAU2914：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)SSR分子标记NAU1322：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a3)SSR分子标记JAAS0199：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(a4)SSR分子标记JAAS3476：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(a5)SSR分子标记JAAS4933：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(a6)SSR分子标记JAAS5813：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(a7)SSR分子标记JAAS6420：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子。
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
所述特定DNA片段包括位于异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、所述SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420。
所述特定DNA片段与位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段序列相同。
含有异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420的植株抗旱性提高。
第三方面，本发明要求保护引物对或成套引物对或含有所述引物对或所述成套引物对的试剂盒在筛选特定DNA片段以培育抗旱性提高的棉花品种或品系中的应用；
所述引物对为如下(b1)-(b7)中任一；所述成套引物对由如下(b1)-(b7)组成；
(b1)引物对1：根据SEQ ID No.1所示的SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列设计得到；
(b2)引物对2：根据SEQ ID No.2所示的SSR分子标记NAU1322的核苷酸序列设计得到；
(b3)引物对3：根据SEQ ID No.3所示的SSR分子标记JAAS0199的核苷酸序列设计得到；
(b4)引物对4：根据SEQ ID No.4所示的SSR分子标记JAAS3476的核苷酸序列设计得到；
(b5)引物对5：根据SEQ ID No.5所示的SSR分子标记JAAS4933的核苷酸序列设计得到；
(b6)引物对6：根据SEQ ID No.6所示的SSR分子标记JAAS5813的核苷酸序列设计得到；
(b7)引物对7：根据SEQ ID No.7所示的SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列设计得到。
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
所述特定DNA片段包括位于异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、所述SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420。
所述特定DNA片段与位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段序列相同。
在本发明的具体实施方式中，所述引物对1由SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；所述引物对3由SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的两条单链DNA组成；所述引物对4由SEQID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成；所述引物对5由SEQ ID No.16和SEQ IDNo.17所示的两条单链DNA组成；所述引物对6由SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示的两条单链DNA组成；所述引物对7由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成。
含有异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420的植株抗旱性提高。
所述试剂盒中还可含有PCR扩增缓冲液、双蒸水、DNA聚合酶、dNTP等中的任一种或多种。
第四方面，本发明要求保护SSR分子标记或成套SSR分子标记或特定DNA片段在鉴定或者辅助鉴定棉花抗旱性中的应用；
所述SSR分子标记为如下(a1)-(a7)中任一；所述成套SSR分子标记由如下(a1)-(a7)组成；
(a1)SSR分子标记NAU2914：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)SSR分子标记NAU1322：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a3)SSR分子标记JAAS0199：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(a4)SSR分子标记JAAS3476：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(a5)SSR分子标记JAAS4933：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(a6)SSR分子标记JAAS5813：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(a7)SSR分子标记JAAS6420：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子。
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
所述特定DNA片段包括位于异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、所述SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420。
所述特定DNA片段与位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段序列相同。
含有异常棉8号染色体上的所述SSR分子标记NAU2914、SSR分子标记NAU1322、所述SSR分子标记JAAS0199、所述SSR分子标记JAAS3476、所述SSR分子标记JAAS4933、所述SSR分子标记JAAS5813和所述SSR分子标记JAAS6420的植株抗旱性提高。
第五方面，本发明要求保护引物对或成套引物对或含有所述引物对或所述成套引物对的试剂盒在鉴定或者辅助鉴定棉花抗旱性中的应用；
所述引物对为如下(b1)-(b7)中任一；所述成套引物对由如下(b1)-(b7)组成；
(b1)引物对1：根据SEQ ID No.1所示的SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列设计得到；
(b2)引物对2：根据SEQ ID No.2所示的SSR分子标记NAU1322的核苷酸序列设计得到；
(b3)引物对3：根据SEQ ID No.3所示的SSR分子标记JAAS0199的核苷酸序列设计得到；
(b4)引物对4：根据SEQ ID No.4所示的SSR分子标记JAAS3476的核苷酸序列设计得到；
(b5)引物对5：根据SEQ ID No.5所示的SSR分子标记JAAS4933的核苷酸序列设计得到；
(b6)引物对6：根据SEQ ID No.6所示的SSR分子标记JAAS5813的核苷酸序列设计得到；
(b7)引物对7：根据SEQ ID No.7所示的SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列设计得到。
在本发明的具体实施方式中，所述引物对1由SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；所述引物对3由SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的两条单链DNA组成；所述引物对4由SEQID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成；所述引物对5由SEQ ID No.16和SEQ IDNo.17所示的两条单链DNA组成；所述引物对6由SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示的两条单链DNA组成；所述引物对7由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成。
所述试剂盒中还可含有PCR扩增缓冲液、双蒸水、DNA聚合酶、dNTP等中的任一种或多种。
第六方面，本发明要求保护一种培育抗旱性提高的棉花品种或品系的方法，包括如下步骤：用前文第一方面中所述特定DNA片段替换受体亲本原有染色体片段，得到抗旱性提高的棉花品种。
在上述各方面中，所述抗旱性体现在如下中的全部或部分：存活率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、气孔密度、叶绿素含量、净光合速率和蒸腾速率。
在上述各方面中，所述棉花选自以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过远缘杂交和分子标记辅助选择等技术相结合，将异常棉8号染色体上位于SSR分子标记NAU2914和JAAS6420之间的片段置换于陆地棉苏8289遗传背景中，获得了具有渐渗染色体片段的抗旱棉花系。因此，本发明开发的染色体片段(异常棉8号染色体上位于SSR分子标记NAU2914和JAAS6420之间的片段)在今后抗旱棉花育种中具有重要应用价值。
(2)分子标记辅助目标片段选择，具有早期鉴定，快速鉴定以及准确性和稳定性高的特点，因此本发明提供的7个SSR分子标记及其引物对有望大大提高棉花育种的抗旱性状的选择效率及育种速度，对于加快棉花抗旱新品种的培育进程具有重要意义。
(3)本发明提供的抗旱棉花系，通过SSR分子标记及其引物对可用于抗旱基因进行精细定位及相关基因克隆与功能分析，不但可以阐明棉花抗旱性状的分子遗传机制，而且为培育能应用于生产的抗旱品种提供材料与分子基础。
附图说明
图1为单片段渐渗系CSSL49的BC4F3胶图。
图2为基于SSR标记的单片段渐渗系CSSL49基因型示意图。注：灰色代表陆地棉基因型，深灰色代表异常棉基因型。
图3为7个SSR分子标记在单片段渐渗系CSSL49的BC4F4世代检测结果。
图4为干旱胁迫下单片段渐渗系CSSL49和苏8289苗期的表型。
图5为不同干旱胁迫时期单片段渐渗系CSSL49和苏8289脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的比较。
图6为不同干旱胁迫时期单片段渐渗系CSSL49和苏8289的气孔密度、叶绿素含量、净光合速率及蒸腾速率的比较
具体实施方式
本发明采用的陆地棉-异常棉渐渗系的构建方法，包括如下步骤：
(1)以陆地棉86-1为母本，异常棉为父本，杂交获得了三倍体F1，并通过秋水仙素加倍获得了六倍体F1杂种(Zhang et al.2014)。以六倍体F1为母本，陆地棉苏8289为轮回亲本，通过连续回交四次、自交两次到BC4F3世代，每一世代利用覆盖基因组的异常棉特异SSR标记进行辅助选择(Zhai et al.2015)，获得了异常棉8号染色体的单片段渐渗系CSSL49(Xu et al.2022)。利用均匀覆盖异常棉染色体组的230个SSR标记对CSSL49进行全基因组前景与背景鉴定，其中7个SSR分子标记的PCR扩增产物在单片段渐渗系CSSL49和轮回亲本苏8289之间有差异。
(2)为了验证SSR鉴定的异常棉渐渗系CSSL49的基因型是否纯合，种植单片段渐渗系CSSL49的BC4F4世代自交的16个单株、轮回亲本苏8289、陆地棉86-1、异常棉和六倍体，各取幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA。以轮回亲本苏8289、陆地棉86-1、异常棉、六倍体和BC4F4世代单片段渐渗系CSSL49自交的16个单株DNA为模板，利用7个SSR标记进行PCR扩增(NAU2914、NAU1322、JAAS0199、JAAS3476、JAAS4933、JAAS5813和JAAS6420)。结果发现，基因型不分离，表明异常棉渐渗系CSSL49已稳定遗传，为纯合的渐渗系。
(3)异常棉8号染色体单片段渐渗系CSSL49与轮回亲本苏8289相比，其植株表现为株型紧凑，叶色深，掌状叶缺刻大等抗旱表型，苗期和花铃期干旱胁迫试验中，与轮回亲本相比，具有较好的抗旱性。本发明获得了源于异常棉抗旱性状的单片段渐渗系，为促进目标基因的精细定位及图位克隆创造了重要材料。利用本发明的分子标记，可以快速的鉴定棉花植株抗旱性状，为异常棉渐渗系抗旱的分子机制研究奠定技术基础。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
陆地棉86-1(G.hirsutum var.86-1)、陆地棉苏8289(G.hirsutum var.Su8289)和异常棉(Gossypium anomalum)：均记载于“Caijiao Zhai,Peng Xu,Xia Zhang等.Development of Gossypium anomalum derived microsatellite markers and theiruse for genome-wide identification of recombination between the G.anomalumand G.hirsutum genomes.Theoretical and Applied Genetics,2015,128(8):1531-1540”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
实施例1、与棉花抗旱性状相关的染色体片段的确定及相关分子标记的开发
一、试验材料
陆地棉86-1(G.hirsutum var.86-1)、陆地棉苏8289(G.hirsutum var.Su8289)和异常棉(G.anomalum)。
二、试验方法
1、DNA提取
棉花DNA的提取采用改良的CTAB(Paterson et al.,1993)与上海浦迪生物科技有限公司新型植物基因组DNA提取试剂盒相结合的方法，具体步骤如下：
(1)取样。选取每个植株的幼芽(约0.5cm2大小)放置在2mL EP管内，短暂放在冰盒中等待提取；
(2)配制提取液。将DNA缓冲液置于65℃水浴锅中预热，取100mL缓冲液于锥形瓶中，加入半药匙抗坏血酸和1mLβ-巯基乙醇，混匀；
(3)磨样。在每个EP管中放入钢珠，加入500μL提取液，用全自动样品快速研磨仪，研磨180s；
(4)取上清。65℃水浴40min，每隔10min上下翻转摇晃几次水浴完成后，12000rpm离心15min，吸取250μL上清液转移到一批新的1.5mL离心管中；
(5)利用试剂盒提取DNA(上海浦迪生物科技有限公司新型植物基因组DNA提取试剂盒)。向离心管中加入500μL试剂FC，震荡混匀，连同沉淀一起倒入试剂盒中的吸附柱，12000rpm离心1min；弃去滤液，向吸附柱中加入800μL试剂GW，12000rpm离心1min；弃去滤液，12000rpm空甩离心1min；将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，开盖静置，待试剂GW中的酒精充分挥发；向吸附柱中加入100μL的65℃无菌水，12000rpm离心1min，弃去吸附柱，在离心管上做好标记，DNA提取完毕；
(6)检测浓度。DNA提取之后，用多功能酶标仪检测其浓度，经检测合格后-20℃保存，浓度不达标的样品做好标记，需重新提取。
2、PCR反应
本实验使用的2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)，包含3G Taq DNAPolymerase、dNTP Mix、可视化红色染料以及优化的缓冲体系，购于南京诺唯赞生物技术公司，PCR反应体系见表1。
表1、PCR反应体系
| PCR试剂 | 用量 |
| 2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye) | 5.0μL |
| 正向引物 | 1.0μL |
| 反向引物 | 1.0μL |
| DNA | 2.0μL |
| ddH2O | 补足至10μL |
PCR反应在Applied Biosystems PCR仪上进行，反应程序为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；16℃保温
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)做胶：把成套的两块玻璃板对齐，平放，两边用夹子夹紧，至于平板上，凹槽处半插入104齿梳子。从梳子处缓慢倒入8％的聚丙烯酰胺凝胶(29：1)，将梳子完全插入凹槽，放置2h；
(2)装槽：把有凝胶的玻璃板装入电泳槽中，倒入1×TBE电泳缓冲液，并用夹子两边加紧，继续加入电泳缓冲液，没过凝胶，拔梳子；
(3)点样：上样量为1μL，每板加样96个，用50bp的DNA marker做标记；
(4)电泳：180V恒压环境下电泳1.5h；
(5)染色及显色过程：a固定：将拆下来的凝胶放入固定液中(10％乙醇+0.5％冰乙酸)12min；b染色：固定结束后，将固定液到出去，将染色液倒入(0.2％硝酸银水溶液)，12min后，蒸馏水漂洗3次；c显色：1.5％氢氧化钠+0.4％甲醛加入，摇晃，到胶片上条带显示清楚即可结束，适倒掉显色液，用自来水冲洗4次，将胶片放置在灯箱上拍照。
4、读带
将凝胶放置到X光观片灯，记录带型。与苏8289相同的带型读为“1”，与异常棉相同带型的读为“2”，杂合带型读为“3”，缺失带读为“-”。
5、标记的选择与鉴定
(1)以陆地棉86-1为母本，异常棉为父本，通过秋水仙素加倍获得了六倍体F1杂种。利用形态学、细胞学、分子标记等技术鉴定证明我们获得加倍成功的六倍体杂交种(XiaZhang,Caijiao Zhai,Linchi He,Qi Guo,Xianggui Zhang,Peng Xu,Hongmei Su,Yuanyong Gong,Wanchao Ni,Xinlian Shen.Morphological,cytological and molecularanalyses of a synthesized hexaploid derived from an interspecific hybridbetween Gossypium hirsutum and G.anomalum.The Crop Journal,2014,2(5):272-277.)。
以六倍体F1为母本、苏8289为轮回亲本继续连续回交四次、自交两次到BC4F3世代，每一世代利用覆盖基因组的异常棉特异SSR标记进行辅助选择(Zhai et al.2015)，获得了异常棉8号染色体的单片段渐渗系CSSL49(Zhenzhen Xu,Jiedan Chen,Shan Meng,PengXu,Caijiao Zhai,Fang Huang,Qi Guo,Liang Zhao,Yonggang Quan,Yixin Shangguan,Zhuang Meng,Tian Wen,Ya Zhang,Xianggui Zhang,Jun Zhao,Jianwen Xu,JianguangLiu,Jin Gao,Wanchao Ni,Xianglong Chen,Wei Ji,Nanyi Wang,Xiaoxi Lu,ShihongWang,Kai Wang,Tianzhen Zhang,Xinlian Shen.(2022)Genome sequence of Gossypiumanomalum facilitates interspecific introgression breeding.PlantCommunications,https://doi.org/10.1016/j.xplc.2022.100350)。
(2)分别取异常棉单片段渐渗系CSSL49的BC4F3植株、陆地棉86-1、轮回亲本苏8289、异常棉和六倍体F1的幼嫩叶片，利用CTAB法提取DNA作为模板，用本课题组前期开发的均匀覆盖异常棉染色体组的230个SSR标记对CSSL49进行全基因组前景与背景鉴定。结果显示，仅7个SSR分子标记的扩增产物在单片段渐渗系CSSL49和轮回亲本苏8289之间有差异(图1)，图2为异常棉渐渗系CSSL49的基因型示意图。同时包含7个分子标记特异条带的异常棉染色体片段即为异常棉单片段渐渗系CSSL49。7个分子标记(NAU2914、NAU1322、JAAS0199、JAAS3476、JAAS4933、JAAS5813、JAAS6420)具体序列如下：
SSR分子标记NAU2914：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
SSR分子标记NAU1322：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
SSR分子标记JAAS0199：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
SSR分子标记JAAS3476：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
SSR分子标记JAAS4933：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
SSR分子标记JAAS5813：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
SSR分子标记JAAS6420：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子。
用于扩增上述7个SSR分子标记的引物对如表2所示。
表2、用于扩增各SSR分子标记的引物
SSR标记分析：在基因型数据收集时将与苏8289和86-1相同的带型记为“1”，与异常棉相同的带型记为“2”，与六倍体F1相同的带型记为“3”，带型缺失或模糊记为“-”。
图1中为上述7个SSR分子标记在单片段渐渗系CSSL49的BC4F3世代的检测结果。每个标记的第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F1的基因型，第6泳道为CSSL49的基因型；CSSL49的基因型与六倍体F1的基因型相同，原因如下：异常棉B1与陆地棉At亚组易发生重组。一般情况下，陆地棉Dt亚组还存在一个与At亚组同源的未发生重组的SSR位点。PCR扩增时，引物与异常棉B1组SSR位点结合的同时，还与Dt亚组的SSR位点结合，因此，CSSL49的基因型与六倍体F1相同。为了验证这一结论，在CSSL49的BC4F4群体中，选择自交的16个单株进行基因型检测，结果发现，其基因型不分离，表明CSSL49已稳定遗传，为纯合的异常棉渐渗系(图3)。
图3为上述7个SSR分子标记在CSSL49的BC4F4世代检测结果。第1泳道为Marker，第2泳道为苏8289的基因型，第3泳道为86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F1的基因型，第6泳道-第21泳道为BC4F4群体中16个单株的基因型。
6、苗期抗旱性状的表型鉴定
培养箱中种植CSSL49和轮回亲本苏8289，培养条件：光照/黑暗时间为16h(28℃)/8h(25℃)，湿度60％。单片段渐渗系CSSL49和轮回亲本苏8289生长至两叶一心时，每个材料纸杯中浇水70mL，干旱20d后复水，观察幼苗表型并在复水后3d统计存活率，3次生物学重复，每个生物学重复选取20株长势一致的幼苗进行测定(图4，表3)。
表3、单片段渐渗系CSSL49与受体苏8289的抗旱表型统计
从图4和表3可以看出，异常棉8号染色体单片段渐渗系CSSL49(与轮回亲本苏8289相比，差别仅在于8号染色体上的相应片段被“位于异常棉8号染色体上自SSR分子标记NAU2914起至SSR分子标记JAAS6420止的片段”所渐渗，基因组其余部分与轮回亲本苏8289完全一致)复水后存活率极显著高于轮回亲本苏8289，可作为棉花抗旱育种和抗旱遗传机制研究的一个重要材料。
7、CSSL49和苏8289花铃期的抗旱形态和生理生化测定
在旱棚中种植CSSL49和轮回亲本苏8289，花铃期浇足水后开始进行干旱处理。干旱胁迫0d、5d和17d时，对CSSL49和轮回亲本苏8289进行形态指标和生理生化指标测定。
(1)酶活测定
干旱胁迫0d和17d时，选取异常棉渐渗系CSSL49和轮回亲本苏8289倒四叶进行相关生理生化指标测定，包括丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脯氨酸(proline,PRO)和可溶性糖含量以及过氧化物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。均采用试剂盒测定，具体操作参照试剂盒说明书进行。试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所，包括丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)、脯氨酸(Pro)测定试剂盒(比色法)、植物可溶性糖检测试剂盒(蒽酮比色法)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法)。以上所有生理生化指标测定均进行3次生物学重复，每次重复选取5个单株的叶片混合后进行测定。
(2)叶片气孔密度的测定
分别在干旱胁迫处理下的0d、5d、17d采集棉花倒四叶，每个材料每个重复分别采集3片，将叶片鲜样放入冰盒带回实验室，剪去叶片缘并且避开叶脉并将其制成长宽相对一致的临时装片，光学显微镜下观察，移动装片并拍照记录，随后用物镜测微尺量得视野的长宽，计算出视野面积，统计每个视野里的气孔数目，计算单位面积的气孔密度。每个材料每个叶片拍三个视野。
计算公式：气孔密度＝气孔数目/视野面积
(3)叶片叶绿含量测定
分别在干旱胁迫0d、5d和17d时利用SPAD-502便携式叶绿素测定仪(soil-plantanalysis development section,日本柯尼卡美能达)对棉花的倒四叶进行测定，SPAD值(soil and plant analyzer development)表征叶绿素含量，每个材料设3次生物学重复，每次重复选取5个单株进行测定。
(4)光合生理特性的测定
在干旱胁迫0d、5d和17d的上午9：00-11：00之间使用便携式光合仪LI-6400光合测定系统测定CSSL49和苏8289倒四叶净光合速率(Pn，μmol m-2s-1)和蒸腾速率(Tr，mmol m-2s-1)，每个材料设3次生物学重复，每次重复选取5个单株进行测定。
结果显示：干旱胁迫处理后17d，轮回亲本苏8289和CSSL49倒四叶中的丙二醛含量与干旱前比均有不同程度的增加，且轮回亲本积累的丙二醛含量极显著高于CSSL49(图5)，表明干旱胁迫下轮回亲本叶片膜脂过氧化程度加剧，受害程度更深，而CSSL49叶片受害程度较浅，抗旱性较强；与干旱0d相比，干旱胁迫处理后17d，苏8289和CSSL49中脯氨酸和可溶性糖含量具有不同程度的升高，且在干旱17d天，CSSL49中超氧化物歧化酶、脯氨酸和可溶性糖含量均极显著高于苏8289(图5)；与干旱0d相比，干旱胁迫后5d和17d，轮回亲本苏8289和CSSL49倒四叶的气孔密度和净光合速率具有不同程度的降低，而叶绿素含量和蒸腾速率则分别出现先降低后升高或先升高后降低的趋势(图6)。干旱胁迫后5d，CSSL49的气孔密度显著高于苏8289。干旱胁迫后5d和17d，CSSL49中叶绿素含量显著和极显著高于苏8289(图6)。干旱胁迫后17d，CSSL49的蒸腾速率和净光合速率分别显著低于和高于苏8289(图6)；由此推断，与苏8289相比，CSSL49在苗期和花铃期具有较强的抗旱性，其抗旱性可能与叶绿素含量、气孔密度、蒸腾速率、净光合速率、超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量有关。
由上述实验结果，可见：含有位于异常棉8号染色体上自SSR分子标记NAU2914起至SSR分子标记JAAS6420止的染色体片段可提高棉花的抗旱能力。该染色体片段上的7个SSR分子标记(NAU2914、NAU1322、JAAS0199、JAAS3476、JAAS4933、JAAS5813、JAAS6420)以及开发的引物对(表2)可以用于筛选目标染色体片段以培育抗旱能力提高的棉花品种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.特定DNA片段或其相关生物材料在如下任一中的应用：
(A1)培育抗旱棉花品种或品系；
(A2)提高棉花的抗旱性；
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自SSR分子标记NAU2914起至SSR分子标记JAAS6420止的片段；
所述SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述相关生物材料为含有所述特定DNA片段的载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
3.SSR分子标记或成套SSR分子标记在筛选特定DNA片段以培育抗旱性提高的棉花品种或品系中的应用；
所述SSR分子标记为如下(a1)-(a7)中任一；所述成套SSR分子标记由如下(a1)-(a7)组成；
(a1)SSR分子标记NAU2914：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)SSR分子标记NAU1322：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a3)SSR分子标记JAAS0199：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(a4)SSR分子标记JAAS3476：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(a5)SSR分子标记JAAS4933：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(a6)SSR分子标记JAAS5813：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(a7)SSR分子标记JAAS6420：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子；
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
4.引物对或成套引物对或含有所述引物对或所述成套引物对的试剂盒在筛选特定DNA片段以培育抗旱性提高的棉花品种或品系中的应用；
所述引物对为如下(b1)-(b7)中任一；所述成套引物对由如下(b1)-(b7)组成；
(b1)引物对1：根据SEQ ID No.1所示的SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列设计得到；
(b2)引物对2：根据SEQ ID No.2所示的SSR分子标记NAU1322的核苷酸序列设计得到；
(b3)引物对3：根据SEQ ID No.3所示的SSR分子标记JAAS0199的核苷酸序列设计得到；
(b4)引物对4：根据SEQ ID No.4所示的SSR分子标记JAAS3476的核苷酸序列设计得到；
(b5)引物对5：根据SEQ ID No.5所示的SSR分子标记JAAS4933的核苷酸序列设计得到；
(b6)引物对6：根据SEQ ID No.6所示的SSR分子标记JAAS5813的核苷酸序列设计得到；
(b7)引物对7：根据SEQ ID No.7所示的SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列设计得到；
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述示SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述引物对1由SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9所示的两条单链DNA组成；
所述引物对2由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；
所述引物对3由SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的两条单链DNA组成；
所述引物对4由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成；
所述引物对5由SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA组成；
所述引物对6由SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示的两条单链DNA组成；
所述引物对7由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成。
6.SSR分子标记或成套SSR分子标记或特定DNA片段在鉴定或者辅助鉴定棉花抗旱性中的应用；
所述SSR分子标记为如下(a1)-(a7)中任一；所述成套SSR分子标记由如下(a1)-(a7)组成；
(a1)SSR分子标记NAU2914：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(a2)SSR分子标记NAU1322：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a3)SSR分子标记JAAS0199：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(a4)SSR分子标记JAAS3476：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(a5)SSR分子标记JAAS4933：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(a6)SSR分子标记JAAS5813：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(a7)SSR分子标记JAAS6420：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子；
所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上至少含有自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段；
进一步地，所述特定DNA片段为位于异常棉8号染色体上自所述SSR分子标记NAU2914起至所述SSR分子标记JAAS6420止的片段。
7.引物对或成套引物对或含有所述引物对或所述成套引物对的试剂盒在鉴定或者辅助鉴定棉花抗旱性中的应用；
所述引物对为如下(b1)-(b7)中任一；所述成套引物对由如下(b1)-(b7)组成；
(b1)引物对1：根据SEQ ID No.1所示的SSR分子标记NAU2914的核苷酸序列设计得到；
(b2)引物对2：根据SEQ ID No.2所示的SSR分子标记NAU1322的核苷酸序列设计得到；
(b3)引物对3：根据SEQ ID No.3所示的SSR分子标记JAAS0199的核苷酸序列设计得到；
(b4)引物对4：根据SEQ ID No.4所示的SSR分子标记JAAS3476的核苷酸序列设计得到；
(b5)引物对5：根据SEQ ID No.5所示的SSR分子标记JAAS4933的核苷酸序列设计得到；
(b6)引物对6：根据SEQ ID No.6所示的SSR分子标记JAAS5813的核苷酸序列设计得到；
(b7)引物对7：根据SEQ ID No.7所示的SSR分子标记JAAS6420的核苷酸序列设计得到。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述引物对1由SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9所示的两条单链DNA组成；
所述引物对2由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；
所述引物对3由SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的两条单链DNA组成；
所述引物对4由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成；
所述引物对5由SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA组成；
所述引物对6由SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示的两条单链DNA组成；
所述引物对7由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述抗旱性体现在如下中的全部或部分：存活率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、气孔密度、叶绿素含量、净光合速率和蒸腾速率。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述棉花选自以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体。
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