CN104004746A - 一种保持种子活力的玉米单粒胚乳dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于农业生物技术领域的玉米单粒胚乳DNA的提取方法。本发明先将种子浸泡，然后切去部分胚乳，再加入浸提缓冲液，在55℃水浴后将胚乳研磨；向胚乳中加入CTAB抽提液进行抽提，再加入蛋白酶K和醋酸钠，最后加入饱和酚和氯仿/异戊醇，离心；向上清液中加入异丙醇，离心，用70％乙醇冲洗沉淀，干燥，加入TE中溶解。本发明方法不破坏种子本身的生活力，切除部分胚乳后仍可育苗移栽，利于进行大规模分子标记辅助选择；其次，本发明方法提取的DNA浓度高、纯度高；此外，本发明方法可在室内对育种后代进行分子标记辅助选择，工作效率高，节约人力、物力和财力；最后，本发明被切割种子被感染发霉的概率低，育苗成功率高。

Description

一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法。

背景技术

分子标记辅助选择由于不受环境条件和基因互作影响、无组织和器官特异性，以及不受基因显隐性影响，可以直接对基因进行早代选择和多基因选择，具有育种进程快、育种时间短和育种效率高等优点，因而受到广泛的关注。但是要将分子标记辅助选择应用于育种实践面临的首要问题是在保证不破坏植株后代生长发育的情况下提取单株DNA，传统的提取单株DNA的方法一般是先将玉米材料在室内或田间培养至幼苗，然后采集玉米幼苗的部分叶片提取DNA，这种方法操作程序复杂、耗时长、取样麻烦、工作量大，并且需要较大的空间培养幼苗，占地多，大大加大了筛选成本，使大规模检测和筛选分子辅助选择标记受到限制。

如果在不破坏籽粒生活力的情况下切取籽粒部分胚乳用于提取DNA，在室内对与目的基因紧密连锁的分子标记进行快速、高效的鉴定和筛选，将大量不含目的基因的后代籽粒淘汰，而将被选籽粒直接种植，无疑将大大提高工作效率，减少人力、物力和财力的浪费。高玉峰等(中国农业大学学报,2011,16(6)32-36)和郭景伦(农业与技术,2005,25(5)113-114，118)等公开了利用碱煮法快速提取玉米籽粒胚乳DNA的方法，将切下来的玉米胚乳放在NaOH溶液中，然后放在沸水浴中加热，离心，最后得到胚乳DNA；但是从高玉峰公开的方法中提供的电泳图上基本看不见DNA的条带，说明所提取的DNA浓度较低；而郭景伦公开的方法中DNA电泳图上存在杂质较多,DNA有降解且纯度较低的问题。魏国燕等(安徽农业科学，2008，36(22):9408-9409)公开了采用高温法提取玉米籽粒胚乳DNA，但是由于在切割籽粒之前没有浸泡籽粒，这样在切籽粒时容易伤害到玉米胚，且切完后的干籽粒种下后所需的发芽时间较长，增加了被感染的几率和后期的育苗困难。因此，上述这些方法均不适合提取高质量的玉米单粒胚乳DNA，其在分子标记辅助选择方面的应用受到很大的限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法。利用本发明方法提取的DNA浓度高，纯度高，而且被切除部分胚乳的籽粒可育苗后移栽，获得正常植株。

实现本发明的技术方案如下：

本发明一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法，按照如下步骤进行：

(1)、将干玉米种子(以下简称种子)放在铺有滤纸的培养皿中，然后向培养皿中加入去离子水，使种子完全浸没在水中；再置于光照培养箱里，在25℃、光照12h/天的条件下浸泡种子24～48h；

(2)、将步骤(1)中浸泡过的种子取出，用吸水纸吸干种子上的水分，然后用消毒后的手术刀切取种子的胚乳部分,并且对种子的胚不能造成损伤，将切取的胚乳放在EP(规格为2ml)管里；其中所切去的胚乳占浸泡后种子总重的1/4～1/3；

(3)、向步骤(2)的EP管中加入浸提缓冲液300～500ul，然后在55℃下水浴60min，每隔30min轻摇一次；其中所述的浸提缓冲液的组成成分及其比例为：200mM Tris-HCl(pH＝8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，超纯水1L；

(4)、将步骤(3)的EP管中的所有胚乳和浸提缓冲液倒入研钵中，研磨成匀浆，然后向研钵中加入CTAB抽提液300～500ul，摇动研钵，使研钵壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后将液体倒回到原EP管中；

(5)、向步骤(4)的EP管中加入蛋白酶K1.0～4.0ul，在65℃水浴40min，每隔10min轻摇一次；其中所述的蛋白酶K的浓度为20mg/ml；

(6)、向步骤(5)的EP管中加入pH5.2、3M醋酸钠100～300ul，然后在-20℃冰箱中静置10min，再向EP管加入65℃预热的饱和酚350～450ul和室温下的体积比为24：1的氯仿/异戊醇溶液350～450ul，混匀，静置5min；接着在4℃、12000rpm条件下离心10min，吸取上清液700～900ul至新的EP管(规格为1.5ml，下同)中；然后向EP管加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，室温下静置10min，每隔2min轻摇一次；再在4℃、12000rpm条件下离心10min，倒掉上清液；

(7)、向步骤(6)的EP管中加入70％乙醇800～1000ul，摇动EP管，用食指轻弹EP管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起来，再在4℃、12000rpm条件下离心2min，倒掉上清液；此步骤用70％乙醇重复冲洗1-3次；

(8)、将步骤(7)中的EP管倒扣在铺有滤纸的桌面上，静置1min，然后将EP管放在瞬时离心机上离心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用移液枪将管底的乙醇吸干，接着放在通风橱中干燥2～5min；干燥后，向EP管中加入30～100ul TE使DNA溶解。

上述提取方法步骤(1)中所述的培养皿的直径为9cm；所述的加入去离子水的量为20～50ml。

上述提取方法步骤(2)中所述的消毒是指用75％酒精消毒。

上述提取方法步骤(4)中所述的CTAB抽提液的组成成分比例为：2％CTAB，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)，20mM EDTA(pH＝8.0)，1.4M NaCl，1％PVP和超纯水1L。

本发明中所述的种子和籽粒为同一概念。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明方法不破坏种子的生活力，提取胚乳DNA后的玉米籽粒仍可育苗移栽，获得正常植株，这样既能保证获得高质量DNA，又兼顾到优良/目的种质的保种问题，对于分子标记辅助选择具有重要的意义。(2)、利用本发明方法提取的DNA浓度高、纯度高，该DNA样品不仅可以用于PCR检测，还可用于各类分子生物学研究。(3)、本发明方法可用于玉米种植前的早期检测，工作效率高，节约人力、物力和财力，并使大规模进行分子标记辅助选择成为可能。(4)、本发明方法中先将玉米籽粒浸泡，不仅便于胚乳的切割，以及切割时不易伤害玉米胚，而且大大缩短籽粒的发芽时间，从而降低籽粒种下后被感染发霉的概率，育苗的成功率高。(5)、本发明方法将切下的胚乳直接加入浸提缓冲液水浴加热，避免液氮研磨籽粒，因为加入液氮后的胚乳后会变得异常坚硬，很难研磨，如果提取的样品很多，一个人很难完成，而且对于操作不熟练的人很容易被液氮冻伤；另外，浸提缓冲液中含有的SDS在较高温度(55～65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，浸提缓冲液中含有的EDTA中有Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子，这些金属离子会抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。(6)、本发明方法中加入蛋白酶K可以将胚乳中的蛋白质分解，并且含有的SDS可以增加蛋白酶K的活性，从而增加DNA提取的纯度(从A₂₆₀/A₂₈₀比值看，1.8～2.0表示DNA纯度好)。(7)、本发明方法中加入的醋酸钠与DNA形成盐，增加了DNA的溶解度，使DNA更多的溶解在上清液中，进而使提取的DNA浓度高，本发明方法中提取的DNA浓度大于200ng/ul以上，有的杂交种的DNA浓度甚至达到3000ng/ul以上。

附图说明

图1.本发明方法提取的玉米胚乳DNA的电泳图谱；其中M为maker，1-6分别为郑58的不同籽粒。

图2.CTAB法提取的玉米胚乳DNA的电泳图谱；其中M为maker，1-6分别为郑58的不同籽粒。

图3.本发明方法提取的不同玉米杂交种和自交系的胚乳DNA的电泳图谱；其中M为maker，1为农大108，2为郑单958，3为莘州158，4为农华101，5为青农8号，6为NS39，7为郑58，8为黄478，9为青农105，10为昌7-2。

图4.被切除部分胚乳的种子发芽照片。

图5.被切除部分胚乳的种子根部和胚部照片。

图6.以本发明方法提取的胚乳DNA为模版扩增SSIIb和HMG基因的PCR产物电泳图谱。其中M为maker；1、3、5、7分别为郑单958、农大108、昌7-2、郑58的SSIIb基因的扩增产物；2、4、6、8分别为郑单958、农大108、昌7-2、郑58的HMG基因的扩增产物。

具体实施方式

实施例1玉米自交系郑58单粒胚乳DNA提取

按照如下方法进行：

(1)、浸泡种子。取6粒郑58(郑58是目前生产上最常用的玉米自交系，6粒种子按照1-6顺序编号)的干种子(下面简称种子或籽粒)用天平称量每个单粒的重量(见表1)，并在种子的一面(非胚面)写上序号，将称量好的种子放进铺有滤纸的直径为9cm的培养皿中，加入去离子水50ml，使种子完全浸没在水中，然后置于光照培养箱中，在25℃、光照12h/天条件下培养48小时。

(2)、将步骤(1)中浸泡过的种子从光照培养箱里取出，用吸水纸吸干种子上的水分，然后用75％酒精消毒后的手术刀切取种子的胚乳部分(注意：不要切到玉米籽粒的胚，不然会影响以后发芽、育苗)，所切去的胚乳约占浸泡后种子总重的1/4～1/3，将切取的胚乳放在EP管(规格2ml，下同)里；计算出切下胚乳干重以及切下干重占总干重的百分比如(见表1)。

表1：郑58种子干重、湿重、切下的胚乳湿重、干重及所占干重的百分比测定结果

注：切下干重＝干重/湿重×切下重量，切下干重占总干重(％)＝切下干重/干重×100％

(3)、向步骤(2)的EP管中加入浸提缓冲液(其组成成分及其比例为：200mM Tris-HCl(pH＝8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，超纯水1L)400ul，然后在55℃下水浴60min，每隔30min轻摇一次。

(4)、将步骤(3)的EP管中的所有胚乳和浸提缓冲液一起倒入研钵中，研磨成匀浆，然后向研钵中加入CTAB抽提液(其组成成分及其比例为：2％CTAB；100mM Tris-HCl(pH＝8.0)，20mM EDTA(pH＝8.0)，1.4M NaCl，1％PVP，超纯水1L)400ul，摇动研钵，使研钵壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后将液体倒回到原EP管中。

(5)、向步骤(4)中的EP管加入蛋白酶K(20mg/ml)2.5ul，然后在65℃下水浴40min，每隔10min轻摇一次。

(6)、向步骤(5)中的EP管里加入3M醋酸钠(pH＝5.2)200ul，然后在-20℃冰箱中静置10min，然后向EP管中加入65℃预热的饱和酚400ul和室温下氯仿/异戊醇(V/V24：1)溶液400ul，混匀，静置5min；接着在4℃、12000rpm条件下离心10min，吸取上清液900ul至新的EP管(规格为1.5ml，下同)中；然后向EP管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，室温下静置10min，每隔2min轻摇一次，使其充分沉淀；再在4℃、12000rpm下离心10min,倒掉上清液(注意：不要将白色沉淀倒出)。

(7)、向步骤(6)的EP管中加入70％乙醇1ml，轻摇EP管，用食指轻弹管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起来，再在4℃、12000rpm下离心2min，倒掉上清液；此步骤用70％乙醇重复冲洗2次。

(8)、将步骤(7)中的EP管倒扣在铺有滤纸的桌面上，静置1min，然后将EP管放在瞬时离心机上离心20s，使EP管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用100ul的移液枪将管壁的乙醇吸干，接着放在通风橱中干燥4min，管底看不见有液体存在为止；干燥后，向EP加入50ul TE使DNA溶解。

实施例2玉米杂交种和玉米自交系的单粒胚乳DNA的提取

(一)、试验材料：

5个玉米杂交种：农大108、郑单958、莘州158、青农8号、农华101；

5个玉米自交系：NS39、郑58、黄478、青农105、昌7-2。

(二)、试验方法

(1)、浸泡种子。取10个玉米品种的干种子(编号1-10，市场上购买或本实验室保存)，每个品种取一粒记录每一粒种子的重量(见表2)，并在种子的一面标注上品种的名称(非胚乳面)，放在铺有滤纸的直径为9cm的培养皿中，加入50ml去离子水，使种子完全浸没在水中，置于光照培养箱里，在25℃、光照12h/天条件下浸泡36h。

(2)、将步骤(1)浸泡过的的种子取出，先用吸水纸吸干种子上的水分，然后用75％酒精消毒后的手术刀切取种子的胚乳部分(注意：不要切到玉米籽粒的胚，这样会影响以后发芽和育苗)，所切去的胚乳约占浸泡后种子总重的1/4～1/3，将切取的胚乳放在EP管(规格2ml，下同)里，并计算出切下干重及切下干重占干重的百分比如(表2)所示：

表2：实施例2种子湿重、切下的胚乳湿重、干重及切下干重占总干重的百分比测定结果

注：切下干重＝干重/湿重×切下重量切下干重占总干重(％)＝切下干重/干重×100％

(3)、向步骤(2)的EP管中加入浸提缓冲液(其组成成分及其比例为：200mM Tris-HCl(pH＝8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，超纯水1L)400ul，然后在55℃下水浴60min，每隔30min轻摇一次。

(4)、将步骤(3)的EP管中的所有胚乳和浸提缓冲液一起倒进研钵中，研磨成匀浆，然后向研钵中加入CTAB抽提液(CTAB抽提液的组成成分比例为：2％CTAB；100mM Tris-HCl(pH＝8.0)，20mM EDTA(pH＝8.0)，1.4M NaCl，1％PVP，超纯水1L)400ul，摇动研钵，使研钵壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后将液体倒回到原EP管中。

(5)、向步骤(4)中的EP管加入蛋白酶K(20mg/ml)2.5ul，在65℃下水浴40min，每隔10min轻摇一次。

(6)、向步骤(5)中的每个EP管中加入3M醋酸钠(pH＝5.2)200ul，然后在-20℃冰箱中静置10min，再向每个EP管加入65℃预热的饱和酚400ul和室温下的氯仿/异戊醇(V/V24：1)400ul，混匀，静置5min；接着在4℃、12000rpm条件下离心10min，吸取上清液900ul至新的EP管(规格为1.5ml，下同)中；然后向EP管加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，室温下静置10min，每隔2min摇动EP管一次；再在4℃、12000rpm条件下离心10min，倒掉上清液。

(7)、向步骤(6)的向EP管中加入70％乙醇1ml，摇动EP管，用食指轻弹管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起来，然后在4℃、12000rpm条件下离心2min，倒掉上清液；此步骤用70％乙醇重复冲洗3次。

(8)、将步骤(7)中的EP管倒扣在铺有滤纸的桌面上，静置1min，然后将EP管放在瞬时离心机上离心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，然后用移液枪(规格100ul)将管底70％乙醇吸干，接着放在通风橱中干燥4min，直到管底看不见有液体存在为止；干燥后，向EP加入50ul TE使DNA溶解。

实施例3利用本发明方法提取的胚乳DNA的浓度和纯度鉴定试验

(一)本发明方法提取的胚乳DNA的质量鉴定：

吸取6×DNA上样缓冲液(北京全式金生物技术有限公司)1ul和实施例1中提取的胚乳DNA溶液6ul进行混合，然后吸取混合后的的样品6ul点到0.8％琼脂糖凝胶制成的点样孔里，maker点5ul，110V下电泳20min。结果(见图1)DNA条带清晰可辨，杂质很少，表明本发明方法提取的胚乳DNA浓度高，纯度高。

(二)、本发明方法提取的胚乳DNA的浓度和纯度鉴定对比试验

(1)材料：(a)本发明方法实施例1制备的郑58单粒胚乳DNA溶液；(b)按照常规的CTAB法，同样切取6粒郑58玉米籽粒1/4～1/3胚乳重量提取的胚乳DNA。

(2)试验方法：用移液枪吸取实施例1制备的的郑58单粒胚乳DNA溶液1ul滴在微量分光光度计(NanoDrop2000)上；分别测定DNA浓度及纯度；同样将按照CTAB法提取的胚乳DNA溶液1ul滴在微量分光光度计(NanoDrop2000)上，测定其DNA浓度及纯度。

表3：本发明方法提取的郑58单粒胚乳DNA浓度及纯度测定结果

序号	A260	A280	A260/A280	浓度(ng/ul)
					1	4.186	2.340	1.79	209.3
2	6.750	3.857	1.75	337.5

3	5.274	3.060	1.72	263.7
					4	25.958	13.476	1.93	1297.9
5	5.511	2.943	1.87	275.6
					6	4.718	2.666	1.77	235.9

结果(见表3)显示本发明方法提取的胚乳DNA的浓度为在200ng/ul～300ng/ul，个别甚至达到1000ng/ul以上，完全满足分子生物学要求，并且A₂₆₀/A₂₈₀的比值都在1.8-2.0，凝胶电泳后DNA条带(见图1)清晰可辨，杂质也很少，说明本发明方法提取的的胚乳DNA无论是浓度还是纯度都很高。

用常规的CTAB法，同样切取6粒郑58玉米籽粒1/4～1/3胚乳重量进行单粒胚乳DNA提取，然后用微量分光光度计(NanoDrop2000)测量其浓度。结果(见表4)显示它们的DNA浓度大多在42～108ng/ul，对所提取的DNA进行凝胶电泳，结果(见图2)显示DNA条带较弱，表明DNA浓度较低，这种浓度达不到较高的分子生物学实验的要求。

表4：常规CTAB法提取的郑58单粒胚乳DNA浓度及纯度测定结果

序号	A260	A280	A260/A280	浓度(ng/ul)
					1	1.221	0.666	1.83	61
2	1.669	1.023	1.63	83.5
					3	2.165	1.246	1.74	108.3
4	0.844	0.482	1.75	42.2
					5	1.747	1.124	1.55	87.3
6	1.619	0.91	1.78	81

同时对比高玉峰提取的胚乳DNA电泳图(中国农业大学学报,2011,16(6)34)发现他们的方法提取的DNA，在电泳图上DNA条带基本看不见，说明用他们的方法提取的DNA浓度更低。

实施例4、本发明方法提取的不同玉米品种胚乳DNA浓度和纯度测定

(一)、试验材料：实施例2提取的农大108、郑单958、莘州158、青农8号、农华101、NS39、郑58、黄478、青农105、昌7-2的胚乳DNA溶液。

(二)试验方法：

(1)不同玉米品种单粒胚乳DNA的浓度和纯度测定：

用移液枪吸取实施例2提取的不同玉米品种单粒胚乳DNA溶液1ul滴在微量分光光度计(NanoDrop2000)上，测定各个品种的DNA浓度及纯度。

表5：使用本发明方法提取的不同玉米品种的DNA浓度及纯度测定结果

品种名称	A260	A280	A260/A280	浓度(ng/ul)
					农大108	3.306	1.914	1.73	165.3
郑单958	4.718	2.693	1.75	235.9
					莘州158	4.368	2.419	1.81	218.4
农华101	72.941	37.213	1.85	3647
					青8号	6.764	3.748	1.80	338.2
NS39	8.171	4.476	1.83	408.5
					郑58	13.325	6.938	1.92	666.3
黄478	4.661	2.978	1.57	233.1
					青农105	15.348	8.56	1.79	767.4
昌7-2	27.656	14.074	1.97	1382.8

结果(见表5)显示10个不同玉米品种的胚乳DNA浓度基本在200ng/ul～400ng/ul，有的杂交种的DNA浓度浓度甚至达到3000ng/ul以上，完全满足分子生物学要求，并且A₂₆₀/A₂₈₀的比值大都在1.8～2.0，说明本发明方法提取的胚乳DNA不仅浓度高，其纯度也高。

(2)、不同玉米品种单粒胚乳DNA的质量鉴定

吸取6×DNA上样缓冲液(北京全式金生物技术有限公司)1ul和实施例2中提取的单粒胚乳DNA溶液6ul进行混合，然后吸取混合后的的样品6ul，在0.8％琼脂糖凝胶上、在100V条件下进行电泳20min，其中maker点5ul，电泳结果(见图3)所提取的单里胚乳DNA条带清晰，杂质很少，说明本发明方法提取的胚乳DNA的浓度和纯度都很高，质量好。

(3)、被切除部分胚乳的种子发芽试验

将实施例2步骤(2)中切完胚乳的10粒种子种在装有营养土的发芽盒里，放到25℃光照培养箱中(光照12h，暗处理12h)，每隔一天浇一次水，注意不要水太多，否则种子会发霉，10d后观察，结果(见图4和图5，图4和图5是同一发芽试验照片，只是侧重部位不同)所示，有3粒发芽不好，其余7粒种子发芽很好，说明切掉1/4～1/3胚乳的玉米种子，种下后还能继续生长发芽，获得正常植株。说明本发明方法既保证了获得高质量DNA，又兼顾到了优良/目的种质的保种问题，对于分子标记辅助选择有重要意义。

实施例5本发明方法提取的玉米单粒胚乳DNA质量的PCR鉴定试验

(一)试验材料

实施例2制备的昌7-2、郑58、郑单958和农大108的单粒胚乳DNA。

(二)试验方法

(1)、分别以昌7-2、郑58、郑单958和农大108的单粒胚乳DNA为模板，以SSIIb-F和SSIIb-R为引物进行PCR扩增，扩增所得为大小为79bp的淀粉合成酶IIb基因(Starch synthase IIb,简称为SSIIb)(见图6)SSIIb-F：CCAATCCTTTGACATCTGCTCC(SEQ ID No：1)，SSIIb-R：GATCAGCTTTGGGTCCGG(SEQ ID No：2)；

(2)、分别以昌7-2、郑58、郑单958和农大108的单粒胚乳DNA为模板，以HMG-F和HMG-R为引物进行PCR扩增，扩增所得为大小为114bp高迁移基团基因(High mobilitygroup,简称为HMG)；所述的引物为：HMG-F：TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA(SEQ ID No：3),HMG-R：GCTA CATAGGGAGCCTTGTCCT(SEQ ID No：4)。

(3)、上述(1)和(2)中具体PCR扩增方法为：取8个200ul的EP管，按下述方法加入样品，PCR反应试剂盒(北京全式金生物技术有限公司生产的2×TransStart FastPfu DNA SuperMix)。PCR扩增反应体系：总体积20μL，2×PCR mix10.0μL，上游引物(10μm/μL)0.8μL，下游引物(10μm/μL)0.8μL，·DNA1.6μL，灭菌蒸馏水6.8μL。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30sec，60℃延伸30sec，72℃退火30sec，循环(30次)；72℃延伸10min，反应结束后4℃保存待检。吸取6×DNA上样缓冲液(北京全式金生物技术有限公司生产)1ul和上述扩增的PCR产物6ul进行混合，然后吸取6ul混合后的的样品在3％的琼脂糖凝胶上在110V下电泳20min。

结果(见图6)以本发明方法提取的昌7-2、郑58、郑单958和农大108的胚乳DNA作为模板进行的PCR扩增，扩增产物的目的条带清晰，无杂带和杂质，说明本发明方法提取的胚乳DNA浓度高、纯度好、质量高，完全符合分子生物学的要求，可以用于分子标记辅助选择及其他分子生物学试验。

Claims (4)

1.一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法，其特征在于按照如下步骤进行：

(1)、将干玉米种子放在铺有滤纸的培养皿中，然后向培养皿中加入去离子水，使种子完全浸没在水中；再置于光照培养箱里，在25℃、光照12h/天的条件下浸泡种子24～48h；

(2)、将步骤(1)中浸泡过的种子取出，用吸水纸吸干种子上的水分，然后用消毒后的手术刀切取种子的胚乳部分,并且对种子的胚不能造成损伤，将切取的胚乳放在规格为2ml的EP管里；其中所切去的胚乳占浸泡后种子总重的1/4～1/3；

(3)、向步骤(2)的EP管中加入浸提缓冲液300～500ul，然后在55℃下水浴60min，每隔30min轻摇一次；其中所述的浸提缓冲液的组成成分及其比例为：200mM Tris-HCl(pH＝8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，超纯水1L；

(4)、将步骤(3)的EP管中的所有胚乳和浸提缓冲液倒入研钵中，研磨成匀浆，然后向研钵中加入CTAB抽提液300～500ul，摇动研钵，使研钵壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后将液体倒回到原EP管中；

(5)、向步骤(4)的EP管中加入蛋白酶K1.0～4.0ul，在65℃水浴40min，每隔10min轻摇一次；其中所述的蛋白酶K的浓度为20mg/ml；

(6)、向步骤(5)的EP管中加入pH5.2、3M醋酸钠100～300ul，然后在-20℃冰箱中静置10min，再向EP管加入65℃预热的饱和酚350～450ul和室温下的体积比为24：1的氯仿/异戊醇溶液350～450ul，混匀，静置5min；接着在4℃、12000rpm条件下离心10min，吸取上清液700～900ul至新规格为1.5ml的EP管中；然后向EP管加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，室温下静置10min，每隔2min轻摇一次；再在4℃、12000rpm条件下离心10min，倒掉上清液；

(7)、向步骤(6)的EP管中加入70％乙醇800～1000ul，摇动EP管，用食指轻弹EP管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起来，再在4℃、12000rpm条件下离心2min，倒掉上清液；此步骤用70％乙醇重复冲洗1-3次；

(8)、将步骤(7)中的EP管倒扣在铺有滤纸的桌面上，静置1min，然后将EP管放在瞬时离心机上离心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用移液枪将管底的乙醇吸干，接着放在通风橱中干燥2～5min；干燥后，向EP管中加入30～100ul TE使DNA溶解。

2.按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于其步骤(1)中所述的培养皿的直径为9cm；所述的加入去离子水的量为20～50ml。

3.按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于其步骤(2)中所述的消毒是指用75％酒精消毒。

4.按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于其步骤(4)中所述的CTAB抽提液的组成成分比例为：2％CTAB，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)，20mM EDTA(pH＝8.0)，1.4M NaCl，1％PVP和超纯水1L。