CN107828780A - 一种玉米籽粒dna提取及基因型鉴定的方法 - Google Patents

一种玉米籽粒dna提取及基因型鉴定的方法 Download PDF

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丁照华
赵苏娴
王志武
卢增斌
齐世军
陈凯
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Abstract

本发明公开了玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，包括以下步骤：1)在玉米籽粒的侧上部位打孔，将胚乳粉状物样品收集在称量纸上；2)将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中，将钻孔后的玉米种子放在相应位置存储；3)通过碱法提取DNA，向96孔板的每个样品孔中加入40μL 0.1mol/L NaOH，在PCR仪温度为99℃处理14分钟，室温放置5‑10分钟，自然冷却，6000g离心2min，加入0.1mol/L HCl溶液40μL混匀，6000g离心5min。转移上清液60μL至新的96孔板中，在‑20℃稳定储存或在后续的PCR反应体系中用于PCR反应；4)PCR反应体系中采用1×PCRbuffer扩增缓冲液，5)PCR反应完成后加入上样缓冲液，在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳；6)鉴定筛选合适基因型的玉米籽粒，玉米籽粒包衣用于后续种植。

Description

一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法
技术领域
本发明涉及玉米籽粒DNA检测技术领域，尤其涉及通过简易的方法提取玉米籽粒DNA、通过PCR进行基因型鉴定的快速无损的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法。
背景技术
玉米是重要的粮饲兼用作物，随着2010年玉米基因组测序的完成，玉米功能基因组学研究呈现突飞猛进的局面，许多控制玉米重要农艺性状的基因或位点相继被克隆和鉴定，为玉米分子育种提供了优良的基因资源。目前国外内利用分子标记辅助玉米育种已成功应用于抗病基因的标记、定位、抗虫转基因以及部分农艺性状等方面的研究。但目前国内分子标记辅助选择玉米育种与田间传统育种相结合方面仍是苗后田间大量取单株叶片，然后从单株叶片中提取DNA进行基因型检测，这种操作不仅步骤复杂，耗时时间长，而且效率低。而传统玉米单粒种子基因组DNA提取方法是将未发芽的种子粉碎或者直接从种子胚中提取DNA，这样种子遭到了不可逆的破坏，无法再进行种植；国内也有研究通过对玉米单粒种子进行切取部分胚乳取样，进行DNA提取，但切取的胚乳相对耗时较长，且耗力，此外没有进行粉碎，DNA效率有待提高。因此本研究通过采用机械，优化DNA的提取及鉴定方法，以期解决快速高效的玉米籽粒基因型鉴定的问题，同时通过种子后期包衣的方法，解决基因型鉴定过的种子发霉及出苗率不高的问题，为分子育种技术的优化提供参考。
发明内容
本发明的目的就是克服现有技术中的上述不足和缺陷，提供一种快速、高效、无损发芽势的玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法；本发明克服了现有技术的玉米籽粒基因型鉴定耗时、耗力以及种子发芽势降低等缺点。该方法所采用的仪器设备以及药品试剂成本低且容易采购，本发明中的实验方法简单易操作，工作效率高，一个熟练的操作者一小时可以完成100粒玉米种子的DNA提取。
本发明所采用的技术方案为：
一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，包括以下步骤：
1)在玉米籽粒的侧上部位打孔，获取玉米胚乳粉状物样品，将散落的胚乳粉状物样品收集在称量纸上；
2)胚乳粉状物样品收集，待获得一定量的胚乳粉状物样品后，称量纸合拢，分别将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中，将钻孔后的玉米种子放在相应位置存储；
3)通过碱法提取DNA，具体步骤是，完成胚乳粉状物样品收集后，向96孔板的每个样品孔中加入40μL 0.1mol/L NaOH，在PCR仪温度为99℃处理14min，室温放置5-10min，然后自然冷却，6000g离心2min，加入0.1mol/L HCl溶液40μL，混匀，6000g离心5min，转移上清液60μL至新的96孔板中，在-20℃稳定储存或直接在后续的PCR反应体系中用于PCR反应；
4)所述PCR反应体系中采用1×PCRbuffer扩增缓冲液，扩增缓冲液的成分为：10mMTris-HCl，pH8.3；50mM KCl；2.0mM MgCl2，150μM dNTPs，150pM引物，1U Taq DNA聚合酶，1.5μL上述提取的DNA溶液总反应体系为10μL；
5)PCR反应完成后，加入适量的上样缓冲液，在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳；
6)鉴定筛选合适基因型的玉米籽粒，并对玉米籽粒包衣用于后续的种植。
所述步骤1)采用微型电钻在玉米籽粒的侧上部位打孔，钻头直径为1.5mm，转速为200-400rad/min。
用75％的酒精清洗掉钻头参与的胚乳粉状物样品，并用吸水纸擦拭干净后用于下个玉米籽粒的处理，同时更换新的称量纸。
所述步骤2)将胚乳粉状物样品聚集在称量纸的中间位置，用挖耳勺将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中。
所述步骤4)的PCR反应条件为：温度95℃时3min1个循环，温度95℃变性30秒，温度55℃退火30秒，温度72℃延伸30秒(扩增片段不可太长，主要用于分子标记的鉴定)，合计42个循环；最后温度72℃延伸5min。
所述步骤5)采用浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。
本发明的有益效果是：
1.本发明的玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法克服了现有技术的玉米籽粒基因型鉴定耗时、耗力以及种子发芽势降低的缺点，本发明采用的仪器设备以及药品试剂成本低且容易采购，本发明中的实验方法简单易操作，工作效率高，一个熟练的操作者一小时可以完成100粒玉米种子的DNA提取。
2.解决了现有技术的方法存在的操作步骤复杂、耗时时间长、效率低的缺点，也解决了现有技术中将未发芽的种子粉碎或者直接从种子胚中提取DNA、使得种子遭到了不可逆的破坏无法再进行种植的问题，同时解决了现有技术中对玉米单粒种子进行切取部分胚乳取样进行DNA提取存在的切取的胚乳相对耗时较长、且耗力，没有进行粉碎、DNA效率低的问题。
3.本发明通过采用微型电钻在玉米籽粒的侧上部位打孔，钻头直径为1.5mm，转速为200-400rad/min，优化DNA的提取及鉴定方法，能够快速高效地实现玉米籽粒基因型鉴定，同时通过种子后期包衣的方法，解决基因型鉴定过的种子发霉及出苗率不高的问题，优化了分子育种技术。
4.通过步骤4)采用一下的PCR反应条件：温度95℃时3min1个循环，温度95℃变性30秒，温度55℃退火30秒，温度72℃延伸30秒，保证扩增片段不太长，能够充分满足用于分子标记的鉴定，能够显著提高提取及基因型鉴定的工作效率，降低操作者工作强度，降低工作成本。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面详细解释本发明的实施方式。
一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，采用电路板电钻，在玉米籽粒合适位置取材于96孔板中，同时将取材后的种子放置在固定位置，通过碱法提取DNA；骤三：利用PCR进行分子标记的扩增，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行玉米籽粒基因型的鉴定和筛选；步骤四：对筛选获得的合适基因型的种子，进行包衣，用于后续的种植，包括以下步骤：
1)在玉米籽粒的侧上部位打孔，获取玉米胚乳粉状物样品，将散落的胚乳粉状物样品收集在称量纸上；
2)胚乳粉状物样品收集，待获得一定量的胚乳粉状物样品后，称量纸合拢，分别将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中，将钻孔后的玉米种子放在相应位置存储；
3)通过碱法提取DNA，具体步骤是，完成胚乳粉状物样品收集后，向96孔板的每个样品孔中加入40μL 0.1mol/L NaOH，在PCR仪温度为99℃处理14min，室温放置5-10min，然后自然冷却，6000g离心2min，加入0.1mol/L HCl溶液40μL，混匀，6000g离心5min，转移上清液60μL至新的96孔板中，在-20℃稳定储存或直接在后续的PCR反应体系中用于PCR反应；
4)所述PCR反应体系中采用1×PCRbuffer扩增缓冲液，扩增缓冲液的成分为：10mMTris-HCl，pH8.3；50mM KCl；2.0mM MgCl2，150μM dNTPs，150pM引物，1U Taq DNA聚合酶，1.5μL上述提取的DNA溶液总反应体系为10μL；
5)PCR反应完成后，加入适量的上样缓冲液，在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳；
6)鉴定筛选合适基因型的玉米籽粒，并对玉米籽粒包衣用于后续的种植。
所述步骤1)采用微型电钻在玉米籽粒的侧上部位打孔，钻头直径为1.5mm，转速为200-400rad/min。
用75％的酒精清洗掉钻头参与的胚乳粉状物样品，并用吸水纸擦拭干净后用于下个玉米籽粒的处理，同时更换新的称量纸。
所述步骤2)将胚乳粉状物样品聚集在称量纸的中间位置，用挖耳勺将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中。
所述步骤4)的PCR反应条件为：温度95℃时3min1个循环，温度95℃变性30秒，温度55℃退火30秒，温度72℃延伸30秒(扩增片段不可太长，主要用于分子标记的鉴定)，合计42个循环；最后温度72℃延伸5min。
所述步骤5)采用浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。
虽然本发明已示出和描述了本发明实施例，对本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，都属于本发明的上述权利要求保护范围之内。

Claims (6)

1.一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，包括以下步骤：
1)在玉米籽粒的侧上部位打孔，获取玉米胚乳粉状物样品，将散落的胚乳粉状物样品收集在称量纸上；
2)胚乳粉状物样品收集，待获得一定量的胚乳粉状物样品后，称量纸合拢，分别将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中，将钻孔后的玉米种子放在相应位置存储；
3)通过碱法提取DNA，具体步骤是，完成胚乳粉状物样品收集后，向96孔板的每个样品孔中加入40μL 0.1mol/LNaOH，在PCR仪温度为99℃处理14min，室温放置5-10min，然后自然冷却，6000g离心2min，加入0.1mol/LHCl溶液40μL，混匀，6000g离心5min，转移上清液60μL至新的96孔板中，在-20℃稳定储存或直接在后续的PCR反应体系中用于PCR反应；
4)所述PCR反应体系中采用1×PCRbuffer扩增缓冲液，扩增缓冲液的成分为：10mMTris-HCl，pH8.3；50mM KCl；2.0mM MgCl2，150μM dNTPs，150pM引物，1U Taq DNA聚合酶，1.5μL上述提取的DNA溶液总反应体系为10μL；
5)PCR反应完成后，加入适量的上样缓冲液，在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳；
6)鉴定筛选合适基因型的玉米籽粒，并对玉米籽粒包衣用于后续的种植。
2.如权利要求1所述的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，所述步骤1)采用微型电钻在玉米籽粒的侧上部位打孔，钻头直径为1.5mm，转速为200-400rad/min。
3.如权利要求2所述的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，用75％的酒精清洗掉钻头参与的胚乳粉状物样品，并用吸水纸擦拭干净后用于下个玉米籽粒的处理，更换新的称量纸。
4.如权利要求1所述的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，所述步骤2)将胚乳粉状物样品聚集在称量纸的中间位置，用挖耳勺将预定量的胚乳粉状物样品转移到96孔板中。
5.如权利要求1所述的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，所述步骤4)的PCR反应条件为：温度95℃时3min 1个循环，温度95℃变性30秒，温度55℃退火30秒，温度72℃延伸30秒，合计42个循环；最后温度72℃延伸5min。
6.如权利要求1所述的一种玉米籽粒DNA提取及基因型鉴定的方法，其特征是，所述步骤5)采用浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132963A (zh) * 2019-04-26 2019-08-16 安徽省农业科学院烟草研究所 一种快速鉴定糯玉米种质的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102156058A (zh) * 2006-11-13 2011-08-17 先锋高级育种国际公司 为种子分析而去除特定种子组织或结构的基于修剪的种子采样
CN102533935A (zh) * 2011-12-29 2012-07-04 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法
CN104004746A (zh) * 2014-05-23 2014-08-27 青岛农业大学 一种保持种子活力的玉米单粒胚乳dna的提取方法
CN106604636A (zh) * 2014-08-29 2017-04-26 先锋国际良种公司 植物胚储存和操纵

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102156058A (zh) * 2006-11-13 2011-08-17 先锋高级育种国际公司 为种子分析而去除特定种子组织或结构的基于修剪的种子采样
CN102533935A (zh) * 2011-12-29 2012-07-04 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法
CN104004746A (zh) * 2014-05-23 2014-08-27 青岛农业大学 一种保持种子活力的玉米单粒胚乳dna的提取方法
CN106604636A (zh) * 2014-08-29 2017-04-26 先锋国际良种公司 植物胚储存和操纵

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VARAPORN SANGTONG等: "Serial extraction of endosperm drillings (SEED)—A method for detecting transgenes and proteins in single viable maize kernels", 《PLANT MOLECULAR BIOLOGY REPORTER》 *
郑淑波等: "适用于分子育种的玉米种子无损基因型鉴定技术优化", 《分子植物育种》 *
郭景伦: "适用于分子标记辅助育种的玉米单粒胚乳DNA快速提取方法", 《农业与技术》 *
高玉峰等: "适用于分子育种的玉米种子无损基因型鉴定技术优化", 《中国农业大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132963A (zh) * 2019-04-26 2019-08-16 安徽省农业科学院烟草研究所 一种快速鉴定糯玉米种质的方法

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