CN103882011A

CN103882011A - 一种高通量快速提取植物总dna的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN103882011A
Application number: CN201410115308.0A
Authority: CN
Inventors: 王雪艳; 潘潞琪; 陆雯; 俞晓平
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明公开了一种高通量快速提取植物总DNA的方法及其试剂盒。所述方法包括：将植物组织浸入缓冲液A中，沸水浴70～120s后加入缓冲液B，混匀离心，取上清液即获得总DNA。所述缓冲液A为0.05～0.12M的NaOH水溶液，所述缓冲液B中含有0.08～0.12%BSA和8～12%PVP中的至少一种、90～100mM Tris-HCl（pH8.0）、1.8～2.5mM EDTA（pH8.0）。本发明的缓冲液A和缓冲液B的组成单一，方便配制且易于保存，在4℃放置3个月后仍能提取到高质量的总DNA；本发明的方法简便易行，耗时短，获得的上清液中总DNA质量较好且非常稳定。

Description

一种高通量快速提取植物总DNA的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及植物DNA提取技术领域，具体涉及一种高通量快速提取植物总DNA的方法及其试剂盒。

背景技术

随着生物技术和植物基因工程的快速发展，以转基因技术为手段的植物遗传改良已成为农业生物技术育种的重要途径。而植物基因组DNA的提取和纯化是基因工程研究的基础操作，实施分子标记、基因文库构建、转基因检测、分子标记育种都是要以提取DNA为前提的。

目前，植物DNA的常规提取方法主要有SDS/酚/氯仿提取法、CTAB法、尿素提取法等，但这些方法操作复杂、耗时长，提取效率低，难以适用于大量样品的检测，而且使用了大量挥发性有机溶剂，产生大量的有毒废液，同时危害操作人员健康。因此建立一种简便有效的DNA提取方法是十分必要的。

公开号为CN102643800B的中国专利文献公开了一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒，该试剂盒包括缓冲液A和缓冲液B，其中，缓冲液A是由以下成分组成的水溶液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）5mmol/L，NaCl0.25M，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）2g/100ml，Tris-HCl缓冲液（1M、pH8.0）10ml/100ml；缓冲液B是由以下成分组成的水溶液：Tris-HCl缓冲液（1M、pH8.0）10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）25mmol/L，NaCl1.4M，CTAB3g/100ml，偏亚硫酸氢钠1g/100ml，抗坏血酸钠1g/100ml，PVP2g/100ml，β-巯基乙醇100μl/100ml。提取植物DNA时，（1）将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；（2）将缓冲液B与步骤（1）所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液；所述放置的方法为60℃-70℃水浴90-120min；（3）用氯仿异戊醇溶液从步骤（2）中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA。

该试剂盒和提取方法的不足之处在于，两种缓冲液的组成均较为复杂，仍含有挥发性有机溶剂，提取后产生大量的有毒废液，仍未消除传统方法中所存在的缺陷；提取方法也较为复杂繁琐，耗时较长。

文献（Zhanguo Xin,Jeff P.Velten,Melvin J.Oliver,and John J.Burke.High-Throughput DNA Extraction Method Suitable for PCR.BioTechniques,2003,34:820-826.）公开了一种用于高通量提取植物DNA的缓冲液A和缓冲液B，该缓冲液A是由以下成分组成的水溶液：0.1M NaOH，2%tween20，缓冲液B是由以下成分组成的水溶液：100mM Tris-HCl，2mM EDTA。这两种缓冲液的不足之处在于，提取的总DNA质量较差，以该总DNA进行PCR获得的扩增产物最大只有300bp，并且这两种缓冲液只能现配现用，若放置一段时间后再进行总DNA提取，DNA的提取率明显降低。

发明内容

本发明提供了一种高通量快速提取植物总DNA的试剂盒，该试剂盒中的两种缓冲液组成简单，保存时间长，提取到的总DNA质量较好。

一种高通量快速提取植物总DNA的试剂盒，包括缓冲液A和缓冲液B，所述缓冲液A为0.05～0.12M的NaOH水溶液，所述缓冲液B中含有90～100mM Tris-HCl（pH8.0）、1.8～2.5mM EDTA（pH8.0）。

本发明还提供了一种利用所述试剂盒提取植物总DNA的方法，包括：将植物组织浸入缓冲液A中，沸水浴70～120s后，加入缓冲液B，混匀离心，取上清液即获得总DNA。

上述获得的上清液可直接作为PCR模板使用，并且PCR过程中，无须再向PCR体系中添加任何稳定剂和抗氧化剂。

作为优选，所述植物组织为新鲜叶片，叶片经打孔器打孔取样后再与缓冲液A混合。保证DNA提取较为均匀高效。

缓冲液A中仅含有NaOH，省掉了Tween20等其他物质，使得缓冲液A不会过于黏稠，便于保存，提DNA时不必每次都现配缓冲液A。

作为优选，所述缓冲液A为0.1M的NaOH水溶液。叶片与缓冲液A的混合比例优选为0.01g：65～85μl，更优选为0.01g：75μl。强碱条件下细胞更易破裂，从而促使细胞核中的染色体DNA释放。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起DNA双链之间氢键的解离而变性，为防止双链DNA变性过度，保证提取效率，本发明一方面将细胞裂解过程置于沸水浴中进行，沸水浴能进一步促使细胞裂解，缩短DNA在碱液中的停留时间。作为优选，沸水浴的时间为120s。沸水浴时间过长会破坏DNA，发生断裂等情况。叶片与缓冲液A的适当混合比例，同样保证NaOH不会破坏DNA。

另一方面，沸水浴完成后，立即加入缓冲液B混匀，10000×g离心1min。缓冲液B与缓冲液A的体积比为1:0.9～1.1，更优选为1:1。

缓冲液B中的Tris-HCl（pH8.0）和EDTA（pH8.0）能中和缓冲液A的强碱环境，保护从细胞中释放的DNA免受破坏，防止过度变性。EDTA在Tris-HCl中能够更加有效地螯合二价金属离子，进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，起到保护DNA的作用，延长DNA的保存时间。

作为优选，所述缓冲液B中含有100mM Tris-HCl（pH8.0）、2mMEDTA（pH8.0）。若无特殊说明，本发明中缓冲液A和缓冲液B均为水溶液。

本发明中，所述缓冲液B中还含有0.08～0.12%BSA和8～12%PVP中的至少一种；优选为含有1%BSA和10%PVP。PVP能够抑制氧化速度，保护体系中的DNA免受降解。并且，由于上清液中的总DNA成分复杂，量也较少，在PCR时BSA可对Taq酶起保护作用，防止酶的分解和非特异性吸附，减轻酶的变性，提高扩增效率。

一般的PCR试剂盒中不包含PVP和BSA，PCR时需要另外配制PVP和BSA加入到PCR体系中，步骤繁琐，容易出错。本发明将PVP和BSA直接加在缓冲液B中，不仅PCR扩增效率有所提高，还简化了PCR步骤。当利用本发明方法获得的上清液进行PCR时，PCR体系中无须再添加任何DNA稳定剂和抗氧化剂，利于加快PCR进程。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的试剂盒中，缓冲液A和缓冲液B的组成均较为单一，方便配制且易于保存，在4℃放置3个月后仍能提取到高质量的总DNA；

（2）本发明的植物DNA提取方法简便易行，耗时较短，获得的上清液中总DNA质量较好且非常稳定，以该DNA为模板进行PCR时能扩增出最大700bp的片段；

（3）本发明取样方法简单快速，可将不同植物（或单株）组织样品置于96孔板中，一次性提取96组植物总DNA。

附图说明

图1为实施例5和对比例1采用新鲜配制的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图2为实施例5和对比例1采用在4℃放置1周后的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图3为实施例5和对比例1采用在4℃放置2周后的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；图1、2、3中，M为DNA分子量标准TaKaRaDL2000DNA mark，各条带从上到下依次是2000、1000、750、500、250、100bp；a、b、c、d泳道分别为引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R；6a、6b、6c、6d泳道分别为对比例1利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；5a、5b、5c、5d泳道分别为实施例5利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；

图4为实施例1～4采用新鲜配制的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图5为实施例1～4采用在4℃放置1个月后的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图6为实施例1～4采用在4℃放置2个月后的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图7为实施例1～4采用在4℃放置3个月后的缓冲液提取总DNA时的PCR检测结果；

图4～7中，M为DNA分子量标准TaKaRa DL2000DNA mark，a、b、c、d泳道分别为引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R；1a、1b、1c、1d泳道分别为实施例1利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；2a、2b、2c、2d泳道分别为实施例2利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；3a、3b、3c、3d泳道分别为实施例3利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；4a、4b、4c、4d泳道分别为实施例4利用引物a-F/a-R、引物b-F/b-R、引物c-F/c-R、引物d-F/d-R进行扩增获得的扩增产物；

图8为采用实施例1的方法提取9种植物总DNA的PCR检测结果；其中，A、B、C、D、E、F、G、H和I分别代表水稻、小麦、大麦、茭白、拟南芥、烟草、油菜、茶叶和兰花；a、b、c、d、e、f、g、h、i分别代表水稻、小麦、大麦、茭白、拟南芥、烟草、油菜、茶叶和兰花的空白对照。

具体实施方式

实施例1

一种提取水稻总DNA的方法，包括：用打孔器取新鲜植物叶片约0.01g至1.5ml离心管中，向离心管中加入75μl缓冲液A，沸水浴120s后加入75μl缓冲液B，混匀，10000×g离心1min，取上清液即获得总DNA。

其中，缓冲液A为0.1M的NaOH水溶液；

缓冲液B为含有以下成分的水溶液：1%BSA、8%PVP40、100mMTris-HCl（pH8.0），2.5mM EDTA（pH8.0）。

取4μl上清液作为模板，进行PCR反应，若不立即使用，可保存于-20℃。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

预变性94℃3min后，94℃30min，58℃30min，72℃30s-2min，循环35次后，延伸72℃7min。

本实施例中，采用四对引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，以扩增产物来判断提取的总DNA的质量优劣。四对引物的碱基序列以及扩增产物信息详见表1：

表1

实施例2

一种提取水稻总DNA的方法，包括：用打孔器取新鲜植物叶片约0.01g至1.5ml离心管中，向离心管中加入65μl缓冲液A，沸水浴70s后加入65μl缓冲液B，混匀，10000×g离心1min，取上清液即获得总DNA。

其中，缓冲液A为0.12M的NaOH水溶液；

缓冲液B为含有以下成分的水溶液：11%PVP40、102mM Tris-HCl（pH8.0），2.2mM EDTA（pH8.0）。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

本实施例中，采用与实施例1相同的四对引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳。

实施例3

一种提取水稻总DNA的方法，包括：用打孔器取新鲜植物叶片约0.01g至1.5ml离心管中，向离心管中加入85μl缓冲液A，沸水浴90s后加入85μl缓冲液B，混匀，10000×g离心1min，取上清液即获得总DNA。

其中，缓冲液A为0.09M的NaOH水溶液；

缓冲液B为含有以下成分的水溶液：0.08%BSA、90mM Tris-HCl（pH8.0），1.8mM EDTA（pH8.0）。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

实施例4

一种提取水稻总DNA的方法，包括：用打孔器取新鲜植物叶片约0.01g至1.5ml离心管中，向离心管中加入75μl缓冲液A，沸水浴70s后加入75μl缓冲液B，混匀，10000×g离心1min，取上清液即获得总DNA。

其中，缓冲液A为0.1M的NaOH水溶液；

缓冲液B为含有以下成分的水溶液：90mM Tris-HCl（pH8.0），1.8mMEDTA（pH8.0）。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

实施例5

其中，缓冲液A为0.1M的NaOH水溶液；

缓冲液B为含有以下成分的水溶液：100mM Tris-HCl（pH8.0），2mMEDTA（pH8.0）。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

对比例1

按照文献（Zhanguo Xin,Jeff P.Velten,Melvin J.Oliver,and John J.Burke.High-Throughput DNA Extraction Method Suitable forPCR.BioTechniques,2003,34:820-826.）记载的方法提取水稻总DNA，包括：

用打孔器取新鲜植物叶片约0.01g至1.5ml离心管中，向离心管中加入75μl缓冲液A，置于95℃水浴中孵育10min后加入75μl缓冲液B，混匀，10000×g离心1min，取上清液即获得总DNA。

其中，缓冲液A为含有以下成分的水溶液：0.1M NaOH，2%Tween20；

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

结论分析

1实施例5与对比例1比较

由图1可见，当实施例5、对比例1均采用新鲜配制的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA，并以该总DNA为模板进行PCR扩增时，实施例5和对比例1获得的扩增产物条带均清晰明亮，表明所提取的总DNA质量相当。

由图2可见，当实施例5、对比例1均采用在4℃下放置1周后的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA，并以该总DNA为模板进行PCR扩增时，实施例5的扩增产物条带仍旧清晰明亮，而对比例1的扩增产物条带则稍嫌模糊。

由图3可见，当实施例5、对比例1均采用在4℃下放置2周后的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA，并以该总DNA为模板进行PCR扩增时，实施例5的扩增产物条带较为清晰明亮，而对比例1的扩增产物条带则几乎无法辨识。

由此可见，与对比例1相比，实施例5的缓冲液A和缓冲液B更易保存，在4℃放置2周后仍能提取到高质量的总DNA。

2实施例1～4比较

由图4可见，当实施例1～4均采用新鲜配制的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA，并以该总DNA为模板进行PCR扩增时，实施例1～3获得的扩增产物条带均清晰明亮，而实施例4的扩增产物条带则稍嫌模糊。表明总DNA提取过程中，含有BSA和PVP中至少一种的缓冲液B能够提高总DNA的稳定性，防止其被降解。

由图5（采用在4℃下放置1个月后的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA）、图6（采用在4℃下放置2个月后的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA）、图7（采用在4℃下放置3个月后的缓冲液A和缓冲液B提取水稻总DNA）可见，在4℃下放置3个月后，实施例1～3的缓冲液A和缓冲液B仍能提取到质量较好的总DNA，其中实施例1的提取效果更佳；而实施例4的提取效果始终一般。

采用实施例1的方法分别提取水稻、小麦、大麦、茭白、拟南芥、烟草、油菜、茶叶和兰花的总DNA，并进行利用表2中的引物进行PCR扩增，扩增结果如图8所示。

表2

由图8可见，实施例1的缓冲液和方法适用于以上9种植物的DNA提取及PCR扩增，适用范围较广。