NL9400518A

NL9400518A - Werkwijzen voor het kweken en het zich doen voortplanten van mannelijke steriele planten.

Info

Publication number: NL9400518A
Application number: NL9400518A
Authority: NL
Original assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 1993-07-14
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 1995-02-01
Also published as: US5650559A; JPH0731307A

Description

"Werkwijzen voor het kweken en het zich doen voortplanten van mannelijke steriele planten"

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Deze uitvinding heeft betrekking op nieuwe methoden voor het kweken van en het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant. Meer in het bijzonder heeft deze uitvinding betrekking op nieuwe methoden voor het kweken en zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant gebaseerd op een cel die een kern van een gewenste zuivere lijn als kern met zich draagt en als cytoplasma een cyto-plasma bezit dat mannelijke steriliteit overbrengt.

(l) Als gevolg van de snelle ontwikkeling van plantbio-technologie in recente jaren zijn er verscheidene middelen voor het verbeteren van plantvariëteiten ontwikkeld. Bij deze middelen voor het verbeteren van plantvariëteiten neemt een mannelijke steriele voorraad een zeer belangrijke plaats in. Bijvoorbeeld het verzamelen van zaad van een F1-hybride van een groente die tot de familie van de Cruciferae behoort wordt over het algemeen uitgevoerd door gebruik te maken van een "in zichzelf onverenigbaar" inteeltlijn waarin bevruchting niet normaal wordt uitgeveerd als gevolg van het feit dat stuifmeel niet kiemt, de stpifmeelbuis niet kan uitgroeien in de stamper, de groeisnelheid van de stuifmeelbuis verlaagd of onderbroken wordt, enz. ondanks bestuiving, omdat een dergelijke lijn hoewel zij monoklineus is en de reproductieve organen van beide sexen zich gelijktijdig ontwikkelen, onverenigbaar is. Niettemin is het bekend dat er sommige inteeltlijnen zijn waarvan het moeilijk is om de gewenste Fj^-hybrides op efficiënte wijze te verkrijgen, omdat zij zwak zijn in die "met zichzelf onverenigbaarheid" hoewel zij in hun praktische eigenschappen persé uitstekend zijn. Wanneer de produktie van een Fi-hybride onder gebruikmaking van een mannelijke steriele voorraad als vrouwelijke ouder gewenst wordt in dergelijke gevallen, wordt er geen stuifmeel geproduceerd door gezegde vrouwelijke ouder en kan dientengevolge de efficiënte produktie van een F1-hybride as bovenbeschreven worden bereikt.

(2) Met betrekking tot gezegde produktie van een mannelijke steriele voorraad worden tegenwoordig de volgende nadelen aangewezen.

Als één van de middelen voor het produceren van een mannelijke steriele plant kan de kernsubstitutietehcniek worden genoemd waarbij een kern van een reeds gevestigde mannelijke steriele plant wordt vervangen door een kern van een gewenste plant.

Volgens deze "kernsubtitutietechniek", wordt een mito-chondoriaal DNA bekend als een genetische bron van mannelijke steriliteit in het cytoplasma bewaard, waardoor de mannelijke steriliteit persé bewaard blijft.

Niettemin met betrekking ook tot een chloroplast waarvan bekend is dat die z'n eigen genen bevat die een serieuze invloed uitoefenen op de expressie van de kenmerken van een plant, blijft ook de chloroplast van gezegde mannelijke steriele voorraad als een oudervoorraad gelijktijdig bewaard. Dientengevolge in het geval dat een mannelijke steriele voorraad als een oudervoorraad niet verwant is aan een voorraad die een kern biedt, dan zijn er gevallen waarin een onvoordelig fenomeen voor de produktie van een plant wordt opgewekt door de interactie tussen gezegde chloroplast en gezegde celkern. __

Bijvoorbeeld in het geval dat een "kern gesubstitueerd type (Ogura) Brassica campestris" wordt geproduceerd onder gebruikmaking van het Ogura cytoplasma van een Japanse radijs [Ogura, H; Mem. Pac. Agri., Kagoshima Univ., vol. 6, pp. 39-78 (1968)] als het cytoplasma dat voorziet in mannelijke steriliteit en een kern van een plant behoren tot Brassica camoestris vertegenwoordigt door een Chinese kool als een kern, dan leedt gezegde plant aan chlorosis bij lage temperaturen. Daarenboven wordt de groei van necatariën in gezegde plant niet gezien, zodat het moeilijk wordt om een insect zoals een honingbij of dergelijke aan te trekken die een rol hebben bij het transporteren van stuifmeel. Dientengevolge lijkt het moeilijk om te zeggen dat gezegde plant een gunstige voorraad is om te worden ontwikkeld.

(3) Vervolgens tussen de bovengenoemde Ogura radijscel en een plant behorend tot Brassica Napus (koolzaad, is het bestudeerd om een somatische hybride te gebruiken die geproduceerd kan worden door het fuseren van protoplast van gezegde planten als een mannelijke steriele voorraad [Pelle-tier et al., Mol. Gen. Genet., vol. 191, blz. 244-250 (1983)] .

In een dergelijke somatisch hybride, waarbij de mannelijke steriliteit van de Ogura radijscel behouden blijft, tegelijkertijd waarmee een chloroplast afgeleid van de Ogura radijscel afvalt en alleen een chloroplast van een plant behorend tot het bovengenoemde genus Brassica behouden blijft. Als een resultaat hiervan, heeft gezegde somatische hybride voordelen doordat de bovengenoemde chlorosis en onbevredigende groei van nectariën onherkenbaar worden.

Niettemin is er een grens aan het soort plant behorend tot het genus Brassica dat toegepast kan worden in bovengenoemde protoplastfusie uit technisch oogpunt. Daarom is het op dit moment moeilijk om een mannelijke steriele somatische hybride vrijelijk te produceren, hetgeen een kweker wil, direct middels de bovengenoemde protoplastfusietechnieken.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Dientengevolge ligt het probleem dat op te lossen is met de onderhavige uitvinding in het voorzien in een nieuwe methode voor het kweken van een plant welke methode gebruik maakt van een- mannelijke steriele voorraad die de bovenge noemde uitstekende karakteristieken bezit en die het mogelijk maakt om een dergelijke somatische hybride die mannelijke steriliteit bezit vrijelijk te produceren zoals een kweker wil.

De onderhavige uitvinders hebben een intensieve bredere en diepere studie gemaakt om het bovenstaande probleem op te lossen. Als een resultaat daarvan, hebben zij gevonden dat het mogelijk is om een plant te produceren behorend tot het genus Brassica die de gezegde gewenste karakteristieke behoud en die tegelijkertijd de mannelijke steriliteit bruikbaar voor de produktie van een F1-hybride bij het terugkruisen van gezegd somatisch hybride met een gewenste plant van het genus Brassica behoud.

Dat wil zeggen de strekking van de onderhavige uitvinding ligt in de volgende zaken.

(1) Een methode voor het kweken van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit bezit verkregen door protoplast-fusietechnieken gebaseerd op een somatische hybride plantcel die het cytoplasma draagt dat mannelijke steriliteit veroorzaakt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica camoestris met een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea , Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica -iuncea die het bovenstaande cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica nuncea.

(2) Een werkwijze voor het kweken van een mannelijke steriele plant volgens het bovenstaande (1), waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.

(3) Een methode voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit verkregen door protup-lastfusietechnieken gebaseerd op een somatische hybride-plantcel die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit overdraagt bezit, tezamen met een kern van een plant behoren tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Naous of Brassica iuncea die het bovenstaande cytoplsma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica olearacea, Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea.

(4) Een werkwijze voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant als in het bovenstaande (3) beschreven, waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt voorzien in een nieuwe methode voor het kweken van planten onder gebruikmaking van een mannelijke steriele plantvoorraad die uitstekende eigenschappen bezit, die het mogelijk maakt om een dergelijke somatische hybride die mannelijke steriliteit bezit te produceren als de kweker wenst.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Fig. 1 laat de oorsprong van elke PCR primer (sonde) zien.

Fig. 2 is een elektroforesepatroon (1) die de resultaten van RFLP in mitochondriale»DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (zonder ATPA) .

Fig. 3 is een elektroforesepatroon (2) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (zonder, atp 6) .

Fig. 4 is een elektroforesepatroon dat de resultaten van RFLP in chloroplast DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, EcoRI fragment van een chloroplast DNA).

Fig. 5 is een elektroforesepatroon (3) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien [sonde, cox I (+ atp A) ] .

Fig. 6 is een elektroforesepatroon (4) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, cox I (+ atp A) ] .

Fig. 7 is een elektroforesepatroon (5) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, atp A) .

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Hieronder wordt de onderhavige uitvinding in detail beschreven.

A. Produktie van een plant die mannelijke steriliteit bezit gebaseerd op een somatisch hybride verkregen door protoplastfusietechnieken die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit draagt overbrengt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica camoestris.

Als voorbeelden van "een plant behorend tot Brassica oleracea" waaruit een somatische hybridecel kan worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusie-technieken worden hier als bijzonder geschikte planten genoemd, een kool, een broccolo, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, een koolrabi, spinazi, een kairan (de albograbragroep van Brassica oleracea L.), een boerenkool, waaronder "Kinkei 210", een F1 hybridevariëteit en de oude lijn "F" (welke allebei zijn geproduceerd door SAKATA SEED CORPORATION) omdat cellen van gezegde planten makkelijk geïsoleerd worden als protoplasten om gefuseerd te worden met andere protoplasten.

Als voorbeelden van "een somatische hybrideplant tus-senplanten behorend tot het genus Brassica" waaruit gezegde somatische hybridecel kan worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusietechnieken, kunnen worden genoemd een hakuran (kunstmatig gesynthetiseerde Brassica Napus.), die bekend is als een interspecies hybride van een hybride van een kool en een Chinese kool en dergelijke. Het is bekend geweest dat het van oorsprong moeilijk is om de protoplastfusietechnieken volledig toe te passen op hun Chinese kool behorend tot Brassica campestris [Jourdan, P. & E. D. Earle; J. Amer. Hort. Sci., vol. 114, blz. 343-349 (1989)]. Het verdient daarom de voorkeur om een Hakuran te gebruiken als "een somatische hybrideplant tussen planten behorend tot het genus Brassica" waarop protoplast fusie-technieken volledig kunnen worden toegepast volgens de onderhavige kweekmethoden omdat het een overbruggingsplant kan zijn voor het produceren van een mannelijke steriele Chinese kool.

Als voorbeelden van een cytoplasma dat mitochondria draagt die mannelijke steriliteit overbrengen, kunnen worden genoemd het Ogura cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een Japanse radijs, het SHIGA-THOMPSON cytoplasma en POLIMA cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een koolzaad, het ANANO cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een mosterdzaad, het MURALIS cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van Diplo-tasis muralis enz. Onder deze mannelijke steriliteit overbrengende cellen, kan het Ogura cytoplasma genoemd worden als bijzonder voordelig omdat -een zogenaamd restoratiegen, dat de fertiliteit van een plant herstelt, zeer zeldzaam tot expressie wordt gebracht zelfs als gezegd cytoplasma wordt overgebracht in een plant van het genus Brassica zodat de mannelijke steriliteit persé stabiel behouden kan blijven.

Als protoplast fusietechnieken hetgeen technieken zijn voor het bereiden van een somatische hybridecel tussen een plant-cel behorend tot het bovengenoemde genus Brassica en een cel die een cytoplasma bezit dat mannelijke steriliteit overbrengt in de onderhavige uitvinding, kunnen gebruikelijke technieken die nu worden toegepast op plantencellen worden geadopteerd [Kao N.K. en M.R. Michayluk; Planta, vol. 115, blz. 355-367 (1974)].

In het bijzonder, worden celwanden verwijderd van plantencellen bedoeld om te worden gefuseerd om protoplasten te isoleren en dan worden gezegde protoplasten met elkaar gefuseerd. Als voorbeelden van fusiemethode in dit geval, kunnen worden genoemde de traditionele techniek gebruik makend van polyethyleenglycol als een fusogeen; de elektro-fusietechniek omvattende het zich tot een parelketting laten vormen van protoplasten door elektriciteit en hierop direct stroom toe te passen. Wanneer de fusieefficiëntie in acht genomen wordt, dan kan de later genoemde elektrofusietech-niek als de voordelige fusietechniek genoemd worden.

Na het uitvoeren van protoplastfusie, kan gezegde fuseerde protoplast verder worden geïnduceerd tot een gewenste plant door het kweken van die gefuseerde protoplast volgens een op zich bekende methode. Bijvoorbeeld wordt de gefuseerde protoplast gekweekt in een callus kwekend medium bijvoorbeeld het Yamashita & Shimamoto's medium (Jpn. J. Breeding,· vol. 34, supplement volume no. 2, blz. 30-3 (1984)] om kleine callus te bereiden, waarna gezegde kleine callus op regeneratiemedia worden geplaatst die worden bereid door het toevoegen van planthormonen zoals cytokinine en dergelijke aan verschillende basale media om de kleine callus te kweken en de gewenste planten te induceren.

Overigens, van welke hybridecellen de gefuseerde myto-chondriale DNA's en chloroplast DNA's afkomstir zijn kan worden bevestigd door gezegde -SNA's te extraheren en de enzymrestrictiepatronen daarvan. te analyseren met de RFLP methode onder gebruikmaking van een bekende probe, of een vergelijkbare methode.

B. Terugkruisen van een somatische hybrideplant voorzien van mannelijke steriliteit verkregen als eerder genoemd met een gewenste plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica •iuncea die het bovengenoemde cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt alsmede een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea.

Gezegde terugkruising wordt uitgevoerd door het direct terug te kruisen van een somatische hybrideplant voorzien van mannelijke steriliteit verkregen als bovengenoemd met een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris . Brassica Napus of Brassica iuncea waarvan de produk-tie gewenst is. Over de frequentie van zulke terugkruisingen valt het volgende te zeggen, de somatische hybrideplant komt dichter bij de pure lijn van een plant behorend tot het genus Brassica als een doel van het terugkruisen wanneer het terugkruisen meer frequent wordt herhaald. En met betrekking tot eigenschappen van het cytoplasma gedurende deze periode, die van moederplant blijven bewaard. Dat wil zeggen, de bovengenoemde mannelijke steriliteit blijft bewaard zoals hij is in nakomelingen planten ongeacht de frequentie van gezegde terugkruising. In een specifieke procedure voor de terugkruising, wordt de ovulecultuur gezamenlijk geadopteerd gedurende de eerste twee keren en daarna wordt gebruikelijke terugkruising uitgevoerd. Hoewel de frequentie van gezegde terugkruising afhangt van de mate van verwantschap tussen een somatische hybrideplant die mannelijke steriliteit bezit en een plant behorend tot gezegd genus Brassica die waarvan de produktie gewenst is en hoe^zuiver de mannelijke steriele plant die geproduceerd moet woeden bedoeld is, is het over het algemeen tenminste 5 keer, bij voorkeur ongeveer 7 keer.

Daarenboven kan de ovule cultuurmethode [Nishi et al.; Jpn. J. Breed., vol. 8, blz. 215-222 (1959)] gezamenlijk worden geadopteerd in de bovenstaande terugkruising om efficiënt generaties nakomelingen te verkrijgen. In het geval in het bijzonder van het uitvoeren van een afgelegen hybridisatie van een plant tussen planten die niet congeen maar xenogeen zijn, dan is de bovenstaande gezamenlijke adoptie bevoorkeurt.

Overigens is er geen restrictie voor een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica camoestris. Brassica Napus of Brassica iuncea als onderwerp van deze terugkruising voor zover het een plant is behorend tot gezegd genus Brassica. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica oleracea. kunnen worden genoemd een kool, een broccola, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, koolrabi, spinazi, een kairan (de albograbra groep van Brassica oleracea L.), een boerenkool, enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica camoestris kunnen worden genoemd een Chinese kool, een knol, een chingensai (Brassica rapa L. var. chinenis), een komatsuna (Brassica rapa L. var. pervidis), Nabana (Brassica rapa L. var. am-plexicaulis), een Nozawana (Brassica rapa L. var. rapa), een geselecteerd nakomelingenschap van (een Chugokusaishin x een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad) enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica Napus kunnen worden genoemd een koolzaad, een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad als een hybridisatie nakomelingenschap van (herfst-gedicht x brocoli), enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica ïuncea kunnen worden genoemd een bladmosterd, een gekraagd bladmosterd, een oliebladmosterd, een takana (Brassica iuncea Czern en Coss var. ineglifolia Kitamura), een zaasai (Brassica iuncea var. bulbifera Mas.), enz. Hieronder, een combinatie in een mannelijke steriele somatische hybrideplant als een ouderplant is kool-radijs-MS-2 en een plant als onderwerp van terugkruisen is diegene behorend tot Brassica oleracea^· een combinatie waarin gezegd de mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-1 is en een plant als onderwerp van terugkruising is diegene behorend tot Brassica Napus, een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-2 is en een plant als onderwerp van terugkruisen is diegene behorend tot Brassica oleracea. en een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-3 is en een plant als onderwerp van terugkruising is diegene behorend tot Brassica camoestris. zijn degene die de voorkeur verdienen vanwege eenvoud van terugkruisen.

VOORBEELDEN

Hieronder wordt de onderhavige uitvinding in meer detail beschreven verwijzend naar voorbeelden. Echter, de technische omvang van de onderhavige uitvinding is in geen geval restrictief geïnterpreteerd vanwege gezegde voorbeelden.

Voorbeeld 1 (A) Produktie van een mannelijke steriele fusieplant van het genus Brassica l) Isolatie van protoplasten die cytoplasma's bezitten die mannelijke steriliteit overbrengen.

Een Japanse radijs met mannelijk steriel cytoplasma (Ogura) of een kerngesubstitueerde Chinese kool voorzien van genoemde cytoplasma (Ogura) werden aseptisch bewaard en gekweekt in een kweekfles voor ongeveer 1 maand, gevolgd door het snijden van bladeren van de gekweekte planten. De gesneden bladeren werden behandeld met een enzymoplossing die 0,1 % Pectylase Y-23, 2 % Cellulase Onozuka R-10 en 0,5 M mannitol bevatte bij 28°C gedurende 2 uur. Vervolgens werden de protoplasten gezuiverd en geprepareerd onder gebruikmaking van gezegde enzymoplossing volgens een gebruikelijke methode [Nagata, T. en Takebe, I.; Planta, vol. 99, blz. 12 (1971)].

Met betrekking tot bovenstaande mannelijke steriele kern gesubstitueerde Chinese kool, werden protoplasten UV bestraald gedurende 120 tot 180 sec. onder gebruikmaking van een UV lamp op en schone tafel na zuivering en daarna onderworpen aan het volgende protoplast fusieproces.

Met betrekking tot een Japanse radijs, werden de gezuiverde protoplasten als bovengenoemd direct onderworpen aan protoplastfusie.

2) Bereiding van protoplasten van een plant van genus Brassica waarin de mannelijke steriele kenmerken worden overgebracht.

Een blad was verzameld van een aseptische zaailing van een kool (Fx variëteit "Kinshi 201" of de ouderlijn daarvan "F"), waaruit protoplasten werden geprepareerd volgens de bovenstaande protoplastbereidingsmethode. Een volgens een dergelijke bereidingsmethode gezuiverde en geïsoleerde protoplasten werden behandeld door ze onder te dompelen in 7,5 mm aceetamide gedurende 15 min., te centrifugeren bij 800 touren per min. gedurende 3 min. om protoplasten te oogsten en dan te wassen met een W5 oplossing om de gewenste protoplasten te bereiden.

3) Protoplastfusie.

De protoplasten van een Japanse radijs met mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura) verkregen in bovenstaande l) en de jodoaceetamide behandelde kool protoplasten verkregen in bovenstaande 2) werden respectievelijk behandeld om een concentratie van 1 x 106 cellen/ml te verkrijgen. Na het mixen van 1 ml porties van de respectievelijke protoplasten, werd 3 ml van een 33 %-ige polyethyleenglycol (hierna afgekort tot PEG) oplossing toegevoegd en werd gemengd.

Daarna werd een 0,1 M calciumchloride oplossing aan gezegd mengsel toegevoegd, gevolgd door fusie bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het supernatant verwijderd, en de gefuseerde cellen werden gewassen met een CPW oplossing [Freason et al.; Dev. Biol. Vol. 33, blz. 130-137 (1973)] en onderworpen aan kweek.

In het geval dat de UV bestraalde protoplasten van de kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura) verkregen in bovenstaande 1) en de koolprotoplasten verkregen in bovenstaande 2) werden gefuseerd, werden beide protoplasten respectievelijk ge bracht op een concentratie van l x 10® cel/ml op de wijze als boven beschreven, en werden de bovenstaande protoplasten in gelijke hoeveelheden gemixt. De celfusie werd elektrisch uitgevoerd gebruikmakend van een model 301 van BTX, Ine. waarbij 30 v/cm van een alternerende stroom werd toegepast op de gemengde cellen gedurende 30 sec. gevolgd door toepassen van 1400 v/cm van directe stroom op gezegde cellen voor 20 μs.

4) Kweek van een gefuseerde protoplast en regeneratie van een plant.

Na de bovenstaande fusiebehandeling onder gebruiking van een PEG oplossing of door middel van elektrische pulsen, werd de gefuseerde protoplast gekweekt op callus ondersteunend medium [een gemodificeerd MS medium dat 0,3 m mannitol, 0,5 mg/1 2,4-dichlorofenoxyazijnzuur (hierna afgekort tot 2,4-D), 0,35 mg/1 naftaleenazijnzuur (hierna afgekort tot NAA) en 0,5 mg/1 benzylaminopurine (hierna afgekort tot BAP) bevat, gevolgd door toevoegen van een medium met dezelfde samenstelling behalve dat zijn 0,2 molair mannitol bevat op de tiende dag na het begin van de kweek. Na nog 10 dagen werden de kolonies overgebracht naar een 100 ml flacon waarin een vergelijkbaar samengesteld mannitol vrij medium was gebracht en dan geroteerd voor kweek bij 2 touren per minuut. Na 7 dagen van een dergelijke rotatiekweek, werden callus gegroeid tot 1 tot 2 mm lengte in een subcultuur gebracht op regeneratiemedia [MS media bevattende 1 mg/1 benzyladenine (BA)] om de inductie van onvoorziene knoppen te bevorderen. Op deze wijze verkregen onvoorziene knoppen werden overgebracht naar BAP-vrij MS media. Na wortelschie-ten werden de plantjes gekweekt door ze te acclimatiseren aan de omgeving buiten volgens een gebruikelijke methode. Na bloeien werden de condities van stuifmeelproduktie van de plantjes visueel geëvalueerd om mannelijke steriele individuen te selecteren. _ 5) Selectie van een mannelijke steriele plant.

Met betrekking tot de aanwezigheid van mannelijke steriliteit, werden de bloeiende planten in het bovengenoemde 4) één voor één onderzocht.

Als resultaat van de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijk steriel cytoplasma (Ogura) met een kool, werd verkregen een mannelijke steriele plant dragende het gemengde kariotype van een kool en een Japanse radijs (hierna gerefereerd als kool MS-1) en een mannelijke steriele plant die het kariotype van alleen een kool droeg (hieronder gerefereerd als kool MS-2), welke beide goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur vertoonden (chlorosis) bij lage temperaturen.

Overigens, zaden van bovengenoemde kool MS-2 zijn gedeponeerd bij het ATCC als "Cabbage Cybrid CMS-2" met het accessienr. ATCC 75488.

Als resultaat van de protoplastfusie van een kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijk steriele cytoplasma's (Ogura) met een kool, werden hakuran type mannelijke steriele planten, die respectievelijk 32, 44 en 34 chromosomen bezaten die allen goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur bij lagere temperatuur vertoonden verkregen. Hierna wordt naar deze planten gerefereerd als Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3 respectievelij ik.

Overigens, zaden van de bovengenoemde Hakuran MS-3 zijn gedeponeerd in het ATCC als "Hakuran Cybrid CMS-3" met het accessienr. ATCC 75489.

(B) Analyses met de PCR techniek en de RFLP techniek.

Gebruikmakend van vier soorten nieuwe mannelijke steriele lijnen als testvariëteiten te weten een mannelijk steriele variëteit kool MS-2 verkregen door de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriel cytoplasma (Ogura) met een kooien mannelijke steriele variëteiten (Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3) verkregen door de protoplastfusie van een kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cyto- plasma's (Ogura) en een kool; een Japanse radijs voorzien van (Ogura) cytoplasma's als bron van gebruikelijke mannelijke steriele cellen; en een vertiele kool gebruikt voor celfusie (F-l variëteit, Kinshi 201) werden de analyses van mitochondrialen DNA's en chloroplast DNA's uitgevoerd volgens de volgende PCR techniek en RFLP techniek.

1) PCR techniek

Uit bladeren op de 40ste tot de 50ste dag na zaaien werd chloroplast DNA (hierna afgekort tot cpDNA) en mito-chondriaal DNA hierna afgekort tot mtDNA) volgens de Kemble (1987) methode geëxtraheerd en onderworpen aan PCR-analyse.

PCR-primers werden zodanig bereid dat specifieke plaatsen op mtDNA's van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura), een gewone mannelijke vertiele Japanse radijs, een mannelijke steriele koolzaad voorzien van S type cytoplasma die reeds beschreven zijn (Thompson, 1972; Shiga, T. en Baba, S., 1973) en een mannelijke steriele koolzaad voorzien van Polima-type cytoplasma's [Fu, T.D.; Cruciferae News Letter, vol. 6, blz. 6-7 (1981)] zouden kunnen worden geamplificeerd.

Dat wil zeggen dat primers waarvan elk zo was gekozen dat zij de regio beginnend bij het promotordeel 300-bp stroomopwaarts van de transcriptie initiatieplaats van DNA coderend voor ATPase subunit 6 in bovengenoemd mtDNA zou kunnen amplificeren [Kadowaki, K. et al.; Mol. Gen. Gent., vol. 224, blz. 10-16 (1990)] (hierna afgekort tot atp 6) tot aan de helft (-1) of het geheel (-2) van het structurele gen (hierna afgekort tot ORF) werden gesynthetiseerd. De base-volgorde van de respectievelijke primers A tot F zijn A (sequentie nr. 1), B (sequentie nr. 2), C (sequentie nr. 3), D (sequentie nr. 4), E (sequentie nr. 5) en F (sequentie nr. 4). De combinaties en de te amplificeren onderwerpen van deze primers zijn de volgende:-* A + B : Og - 1 A + C:0g-2 D + B : P - 1 D + C : P - 2 E + B : N - 1 E + C : N - 2 F + B : R - 1 F + C : R - 2

Overigens, tussen de bovengenoemde primers, werd de verwantschap tussen Og en R (Ogura en een Japanse radijs) ontworpen volgens "Christopher A. Makaroff, Ingrid J. Ape en Jeffrey D. Palmer; The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, blz. 11706-11713 (1989)".

De verwantschap tussen N en P (Napus en Polima) werd ontworpen volgens "Mahipal Singh en Gregory G. Brown, the Plant Cell, vol. 3, blz. 1349-1362 (1991).

De amplificatie werd uitgevoerd door gezegde primers als PCR primers toe te passen en mtDNA's van de bovengenoemde verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellen als templates (sjabloon) te gebruiken en een hittecyclus te herhalen van 94°C (1 min.), 55°C (l min.) en 72°C (2 min.) voor 30 keer. De verkregen PCR amplificatieprodukten werden middels agarose elektroforese geanalyseerd.

Met betrekking tot chloroplast (cp) DNA's, werd de analyse uitgevoerd gebruikmakend van sondes bereid door het digereren van chloroplast DNA's van Brassica Napus met een restrictie-enzym EcoRI en integratie van de digesten in Blue Script plasmiden.

De resultaten van deze analyses zijn gegeven in tabel 1.

TABEL 1 PCR-analyse in cpDNA' s en mtDNA' s van de verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellen

In tabel 1 wordt met + de mate van aanwezigheid van PCR produkt aangegeven in die zin dat de kwantiteit van verkregen PCR produkt groter wordt als het aantal plusjes toeneemt. Aan de andere kant betekent - dan geen PCR op het produkt werd verkregen. Verder betekent cp dat een chlorop-last DNA als template werd gebruikt en betekent mt dat een mitochondriaal DNA als template werd gebruikt. De gebieden van amplificatie met verschillende PCR's zijn weergegeven in tabel 1.

Uit deze resultaten werd het duidelijk dat in het geval van het Hakuran MS-1 cytoplasma een nieuw PCR produkt kon worden verkregen wanneer het gebied van amplificatie door PCR was vastgelegd voor N-l en N-2 voor het cpDNA, wanneer vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma zoals dat in de natuur bestaat.

Additioneel vormde het Hakuran MS-2 cytoplasma PCR produkten met N-l en N-2 voor zowel het cpDNA en het mtDNA als vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur.

Aan de andere kant, vormde het Hakuran MS-3 cytoplasma PCR produkten met N-l en N-2 voor cpDNA alleen, vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur.

En, het kool MS-2 cytoplasma, hetzelfde als voorgenoemde MS-2, vormde PCR produkten met N-l en N-2 voor zowel het cpDNA als het mtDNA.

2) RFLP techniek

Uit de mesofylen van de mannelijke steriele kolen MS-1 en MS-2 verkregen door een protoplastfusie en de mannelijke steriele Hakuran MS-1, MS-2 en MS-3 verkregen met de protoplast fusie werden volgens de Kemble (1978) methode mpDNA's geëxtraheerd en vevolgens gedigereerd met restrictie enzymen BamHI en HindlII. Gezegde DNA-fragmenten werden geëlektrofo-reerd op 1 % agarose en vervolgens onderworpen aan sudden hybridisatie volgens het Genius systeem (geproduceerd door Boehringer Mannheim Co.). Als sondes werden DNA fragmenten coderend voor ATPase subunit a in het mtDNA van een rijst-plant [Kadowaki, K. et al.; Nucleic Acids Res., vol. 17, no. 5 (1990)] (hierna afgekort tot atp A), bovengenoemde atp 6 en cytochroom oxydase subunit 1 [Kadowaki, K. et al.; Nucleic Acids Res., vol. 17, no. 18 (1989)] (hierna afgekort tot cox-I) gebruikt.

Met betrekking ook tot het chloroplast DNA, werden cpDNA's geëxtraheerd volgens de bovengenoemde Kemble (1987) methode en gedigereerd met HindiII en EcoRI. Daarna werden de Southern hybridisatie uitgevoerd gebruikmakend van cpDNA probes (sondes) van het genus Brassica (fig. 2-7).

De resultaten van deze RFLP worden in tabel 2 weergegeven. _ TABEL 2

Resultaten van RFLP techniek in mtDNA's en cpDNA's van mannelijke steriele planten.

Naam atp A atp 6 cox I cpDNA(a) van de --- - - - lijn Bam Eco Hind Bam Eco Bam Eco Eco Hind kool radijs Og Og Og Og * Og Og Cab Cab

Mb“ 1 kool radijs Og Og Og Cab * Og Cab Cab Cab

Hakuran n n Λ yg.j Og Ree Ree Og * Og Og Cab Cab

Hakuran Rec Cab Rec Cab + Qg Cab Cab Cab

Hakuran og Og ND Og * Og Og Rec Rec

In tabel 2 betekent een "*" dat geen polymorfisme kon worden waargenomen, betekent "a" een chloroplast probe, betekent "Og" een Ogura type, betekent "Cab" een kooltype, "rec" een gerecombineerd type en betekent "ND" niet bepaald.

Als resultaat met betrekking tot kool MS-1 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-1), werd gevonden dat haar cpDNA was veranderd in dat van het kooltype, als vergeleken met het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma.

Met betrekking tot kool MS-2 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-2), atp 6 en cox I in het mtDNA daarvan waren veranderd in die behorend bij het kooltype en additioneel was het cpDNA eveneens veranderd in dat van het kooltype.

Met betrekking tot Hakuran MS-1 werd gevonden dat een nieuwe band werd gevormd en dat_recombinatie van genen toe te schrijven aan de protoplastfusie optrad in ATP-A in het mtDNA.

Met betrekking tot Hakuran MS-2 werd een nieuwe band toe te schrijven aan recombinatie gevormd in ATP-A in het mtDNA, vergelijkbaar met het Hakuran MS-1.

Met betrekking tot Hakuran MS-3 werd geen verschil gevonden in mtDNA tussen gezegd Hakuran MS-3 en het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma, vergelijkbaar met de resultaten van de bovengenoemde PCR techniek. In het cpDNA echter werd het duidelijk dat een een nieuwe band wejFd gevormd en dat dus recombinatie plaatsvond.

Als beschreven in bovenstaande l) en 2), werd het duidelijk dat de combinatie van de PCR techniek met de RFLP techniek gebruikmakend van een mtDNA en een cpDNA in een cytoplasma als indexes het mogelijk maakt om de definitieve indicatie van het verschil van het betrokken mannelijke steriele cytoplasma van de bestaande mannelijke steriele cytoplasma's en tegelijkertijd classificatie en karakterisa-tie van individuele cytoplasma's mogelijk maakt.

Voorbeeld 2

Produktie van de gewenste mannelijke steriele plant volgens terugkruisen.

Onder een somatische hybridecel van het genus Brassica die nieuwe mannelijke steriele cytoplasma's hadden verkregen volgens voorbeeld 1, werd kool MS-2 geacht in staat te zijn om te worden gehybridiseerd met een groep van conspecifieke oogst variëteiten omdat haar karyotype hetzelfde was als dat van Brassica oleracea.

Echter, vergeleken met het normale chromosoom aantal van een plant van de soort oleracea had de gezegde plant een toegenomen chromosoom aantal als gevolg van de protoplastfu-sie.

Daarom werd de ovule kweekmethode tezamen geadopteerd met het terugkruisen met het doel om efficiënt nakomelingschap te verkrijgen. Dat wil zeggen na gezegde terugkruising werden twee weken oude onvolwassen zaden aseptisch verzameld en vervolgens gekweekt door ze op MS media te plaatsen met een gehalveerde concentratie bevattende 5 % glucose en 1 g/1 Casamino zuur, zodat nakomelingschap verkregen werd. Door de gezamenlijke adoptie van gezegde ovule kweekmethode, werd kool MS-2 meerdere malen teruggekruist met pure lijnen van een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, een boerenkool, een kairan, spinazi een koolra-bie behorend tot de soort oleracia vergelijkbaar met de kool MS-2, maar door moederplantlijn gekweekt werd van het genus Brassica die een hoog zuivere kern van Brassica oleracea droeg met een nieuw mannelijk steriel cytoplasma van kool MS-2.

Overigens hoewel zo'n plant dichter komt bij de pure lijn variëteiten onderworpen aan de hybridisatie naarmate de frequentie van gezegde terugkruising toeneemt, werd dat concreet bepaald volgens de RAPD methode [Williams, J. G. et al.; Nucleic Acid Res., vol. 18, blz. 6531-6535 (1991)]. Met betrekking tot het kern DNA van het nakomelingschap verkregen met gezegde terugkruising werd het verschil tussen beide getest volgens de RAPD methode gebruikmakend van een commercieel verkrijgbare primer kit geproduceerd door Operon, Ine. (1000 Atlantic Ave., suite 108, Alameda, CA., USA). Als een resultaat daarvan werd gevonden dat het nodig was om gezegde terugkruising ongeveer 7 keer uit te voeren.

Op dit moment werd, om te bepalen dat de mannelijke steriliteit bewaard bleef omdat een mannelijk steriel cyto-plasraa wordt overgedragen van alleen de moederplant, werd een deel van gezegde planten die kool MS-2 mannelijke steriele cytoplasma's bezaten geïsoleerd vlak voor de bloei om ook te bevestigen dat zaden van zelf-bevruchtig nakomelingschappen niet kon worden verkregen.

Wanneer een nieuw mannelijk steriel cytoplasma Hakuran MS-l als moederplant genomen werd, werden synthetische koolzaadplanten voorzien van kerrien van zowel Brassica oleracea als Brassica campestris kunstmatig geproduceerd volgens de voorgenoemde ovule kweekmethode en werden die van Brassica campestris gebruikt voor terugkruising. In geval dat hakuran MS-2 als een moederplant genomen werd, werden een broccoli, een bloemkool en een kool behorend tot Brassica oleracea: een Chinese kool, een knol en zatsuna behorend tot Brassica campestris; en een bladmosterd behorend tot

Brassica ~iuncea teruggekruist. In het geval dat Hakuran MS-3 als moederplant genomen werd, werden een Chinese kool, zatsuna en kukidachina behorend tot Brassica campestris teruggekruist. In ieder geval werd de ovule kweekmethode gezamenlijk toegepast op de eerste generatie of de eerste tot de tweede generaties om nakomelingschappen te verkrijgen in de gezegde terugkruising. Met betrekking tot de frequentie van de terugkruising, het verschil in kern DNA tussen elke zuivere lijnvariéteit gebruikt voor gezegde terugkruising en elk nakomelingenschap dat werd verkregen werd getest volgens de RAPD methode, vergelijkbaar als beschreven voor kool MS-2.

Hieruit bleek dat in elk geval terugkruising bij voorkeur ongeveer 7 keer moest gebeuren. Additioneel, met betrekking tot mannelijke steriliteit in nakomelingschappen, werd het niet alleen gezien dat er geen stuifmeel werd geproduceerd maar werd ook bevestigd dat zaden van zelf bevruchte nakomelingenschappen niet werden verkregen wanneer een deel van de moederplanten werd geïsoleerd.

LIJST VAN SEQUENTIES:

Sequentie nr. l Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: TGCGAGTCAA TCCACTAACT 20

Sequentie nr. 2

Lengte van de sequentie: 20 -*

Soort sequentie: nucleïnezuur _

Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA

Sequentie: CTATTTGTTC CTTTACCAGG 20

Sequentie nr. 3 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: AACACTACTC TCATCCCTCG 20

Sequentie nr. 4 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA

Sequentie: ATCCTTTCGGC ACCTTGATCG 20

Sequentie nr. 5 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: AGCTTGGTAG CTCGCAAGGA 20

Sequentie nr. 6 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs --Topologie: lineair

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: CTAGTTGAGG TCTGAAAGCC 20

Claims

1. Een methode voor het kweken van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit bezit verkregen door protoplast-fusietechnieken gebaseerd op een somatische hybride plantcel die een cytoplasma draagt dat mannelijke steriliteit overbrengt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een somatische hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea , Brassica campestris. Brassica Naous of Brassica iuncea die het bovengenoemde cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt alsmede een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea.

2. Een methode voor het kweken van een mannelijke steriele plant volgens conclusie 1, waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door recombinatie van het Ogura cytoplasma.

3. Een methode voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant voorzien van mannelijke steriliteit verkregen door protoplastfusietechnieken gebaseerd op een hybride plantcel die het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een somatische hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris.-^Brassica Napus of Brassica •iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea die het bovengenoemde cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt alsmede een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea, Brassica campestris. Brassica Napus of Brassica iuncea draagt.

4. Een methode voor het zich doen voortplanten een mannelijke steriele plant volgens conclusie 3, waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cyto-plasma is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.