CN111432630A - Tbrfv抗性番茄植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对TBRFV具有抗性的番茄()植物，所述植物在11号染色体上在SEQ ID No.1与53之间包含QTL。11号染色体上所述QTL的存在通过使用选自包括SEQ ID No.4至52的组的至少一个标记来鉴定。该QTL是如同包含在其代表性种子以保藏号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏于NCIMB的番茄植物的基因组中一样。

Description

TBRFV抗性番茄植物
本发明涉及对番茄褐皱果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，TBRFV)有抗性的番茄(Solanum lycopersicum)植物。本发明还涉及产生这种番茄植物的方法以及鉴定和选择这种植物的方法。本发明还涉及所述番茄褐皱果病毒抗性番茄植物的后代、种子和果实，适于产生所述番茄植物的繁殖材料，以及包含这种番茄果实或其部分的食品。本发明还涉及由番茄褐皱果病毒抗性番茄产生的或可再生成番茄褐皱果病毒抗性番茄植物的细胞或组织培养物。本发明还涉及用于鉴定番茄褐皱果病毒抗性番茄植物的标志物以及所述标志物的用途。
种植番茄作物时遇到的问题之一是各种病毒的出现。已经鉴定了抗许多已知病毒的抗性，所述抗性通过育种引入到合适的番茄品种中。这使得种植者即使在生产过程中存在某种病毒时也能获得良好的产量。然而，新的病毒或已知病毒的新毒株经常被鉴定出来，在某些情况下其会破坏可供利用的抗性。
2015年，新的烟草花叶病毒在番茄中的出现被发表(Salem等:A new tobamovirusinfecting tomato crops in Jordan.Arch Virol.2016Feb；161(2):503-6.Epub 2015Nov19)。该病毒显示与已知的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)和番茄轻度斑驳病毒(Tomato mild mottle virus，ToMMV)相关，与ToMMV和ToMV的最密切相关序列具有约80％至90％的序列同一性。植物的症状相当轻微，但几乎所有的果实上都存在非常严重的褐色皱纹症状。观察到该病毒破坏了常用的抗ToMV抗性基因的抗性:Tm-1、Tm-2和Tm-22，也称为Tm-2a。后来的公开文献显示，在以色列也发现了所述病毒，并确定该病毒也能感染椒类(辣椒(Capsicum annuum))植物(Luria等(2017):A new Israeli tobamovirus isolate infects tomato plants harboring Tm-22resistance genes.PLoS ONE 12(1):e0170429.Doi:10.1371/journal.pone.0170429)。症状似乎因受影响的品种而异，在某些情况下，症状主要以严重或轻微的花叶、坏死、叶片扭曲或其他症状的形式出现在营养部位。由于该病毒明显不同于已知的番茄病毒，因此用新的名称对其进行了描述:番茄褐皱果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，TBRFV)。
由于果实上症状的严重程度，TBRFV的存在对番茄种植者的影响非常大，因为其使水果基本上无法销售。到目前为止，还没有发现抗该病毒的抗性。该病毒至少可以通过机械方式传播，这使得传播很容易和迅速，并且难以控制。病毒的传播也可能通过受感染的种子发生。
本发明的一个目的是提供抗番茄褐皱果病毒(TBRFV)的番茄种的番茄植物。
由于与这种新的TBRFV传播很快并对某些地区的番茄生产造成了重大影响的问题，因此获得抗性番茄植物的紧迫性非常高。另外，由于其非常有效的传播，预期该病毒能够迅速传播到其他地区。因此，组织了大规模的种质筛选，以便深入了解可能来源的存在。
番茄具有多种野生近缘种，其具有抗病性，是有价值的育种资源。因此，许多最新的番茄品种已经拥有一个或多个来自野生种的基因渗入。然而，目前栽培的番茄品种，包括已从野生近缘种中获得烟草花叶病毒抗性基因的品种，似乎很容易被这种新病毒感染。这可能意味着鉴定抗性并不简单。
令人惊讶的是，在广泛筛选后，可以鉴定出对TBRFV具有高度抗性的醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)种中的3份种质(实施例1)。随后建立了研究项目，以确定该抗性是否可以转移到番茄上，并确定该抗性背后的遗传学。
一方面，在三个醋栗番茄来源GNL.3919、GNL.3920和GNL.3951与内部育种系之间进行杂交，接着进行种群开发，诸如F2、F3和回交群体，以用于QTL作图。对所有世代进行生物测定，以确认和监测各种群体中的抗性，并确定遗传性。通过分子标记对QTL的鉴定和表征使人们有机会使用遗传连锁标记鉴定QTL的存在，从而鉴定抗性的存在，这显然比使用生物测定更加高效得多。
为此，进行了QTL定位研究。针对F2群体的第一QTL定位鉴定了11号染色体上的QTL区域，该区域存在于基于所有三个番茄来源开发的群体中。
本发明提供了对番茄褐皱果病毒(TBRFV)具有抗性的番茄植物，该植物在11号染色体上包含QTL。11号染色体上的该QTL特别地是来源于醋栗番茄种的QTL或由醋栗番茄渐渗的QTL。
11号染色体上的QTL位于SEQ ID No.1与SEQ ID No.53之间。在本发明的QTL的侧翼按递增的优先顺序为SEQ ID No.4和SEQ ID No.52、SEQ ID No.5和SEQ ID No.52、SEQID No.5和SEQ ID No.51、SEQ ID No.4和SEQ ID No.33、SEQ ID No.5和SEQ ID No.11或SEQ ID No.6和SEQ ID No.11、或SEQ ID No.7和SEQ ID No.11。11号染色体上的本发明的QTL的侧翼最优选为SEQ ID No.8和SEQ ID No.10。如本文中所用，侧翼意指序列代表QTL区域的边界，因此是QTL的一部分。
用于鉴定本发明的QTL在11号染色体上的存在的标记以递增的优先顺序选自包括SEQ ID No.4至52的组、或者选自包括SEQ ID No.5至52的组、或者选自包括SEQ ID No.5至51的组、或者选自包括SEQ ID No.4至33的组、或者选自包括SEQ ID No.5至11的组、或者选自包括SEQ ID No.6至11的组、或者选自包括SEQ ID No.7至11的组。用于鉴定本发明的QTL的标记最优选选自包括SEQ ID No.8至10的组。如本文中所用，用于鉴定所述QTL的标记是由图1中存在于所述QTL中的序列表示的标记。
用于鉴定本发明的QTL的存在的另外的标记可基于本发明的抗性植物与易感对照植物之间的任何其它多态性，其中多态性以递增的优先顺序位于SEQ ID No.4与SEQ IDNo.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.51之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.33之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.11之间，或SEQ ID No.6与SEQ ID No.11之间。用于鉴定本发明QTL存在的另外的标记最优选基于本发明的抗性植物与易感植物之间的任何其它多态性，其中所述多态性位于SEQ ID No.7与SEQ ID No.11之间(实施例2)。
图1给出了SEQ ID No的序列，所述序列可用作标记或用于开发标记，以鉴定本发明的QTL在11号染色体上的存在，导致番茄植物的TBRFV抗性。表3显示了标记分数，即序列中鉴定QTL的存在、并因此鉴定抗性植物的核苷酸，以及图1序列中SNP的位置。当标记的序列位于例如可公共获得的番茄的基因组参考序列的SL3_00版本上时，可以推导出所述标记序列中SNP多态性对应的物理位置。这个位置也示于表3中。公共番茄基因组参考序列的SL3_00版本可以例如在Solgenomics网站(solgenomics.net)上获得，并且是如本文所用的“公共番茄基因组”的参考。本发明的QTL和标记的位置可从公共图谱导出，并且这些位置是相对于所述物理位置的。
与SNP位点处的野生型核苷酸相比，鉴定标记的存在特别地通过鉴定该SNP位置上指示所述抗性的核苷酸的存在来进行，所述核苷酸是如同确定SEQ ID No的任何序列中存在的；表3中指示了与抗性遗传连锁并因此指示抗性的SNP的位置和核苷酸。野生型核苷酸是存在于公共基因组中该位置上的核苷酸。
如本文中所用，番茄植物是番茄种的植物。
如本文中所用，针对番茄褐皱果病毒的抗性是针对Salem等(2016，上文)中描述的病毒的抗性，所述病毒被赋予NCBI分类学编号1761477。
如本文中所用，当标记和TBRFV抗性在由包含本发明的QTL的植物与缺乏该QTL的植物之间的杂交产生的分离群体中共分离时，所述标记与本发明的QTL遗传连锁，因此可用于鉴定本发明的QTL。
本发明的TBRFV抗性以中间体方式遗传。如本文中所用，中间体是指当本发明的QTL纯合存在时，其赋予比本发明的QTL杂合存在时更高水平的TBRFV抗性。然而，本发明的QTL的杂合存在仍然赋予了一定水平的TBRFV抗性，这可被定义为耐受性。纯合和杂合植物的TBRFV抗性均使植物更适合在其中存在TBRFV的条件下栽培。因此，两种抗性水平都被认为是改良的农艺性状。当QTL纯合存在时，获得最高水平的抗性。
TBRFV抗性的存在可通过生物测定，例如使用烟草花叶病毒的标准sap-机械接种技术来确定，所述sap-机械接种技术是本领域技术人员已知的，并且例如也描述于Luria等(2017，上文)中。对番茄幼苗症状的观察可在接种后12-18天(dai)左右进行。
通过与已知对TBRFV易感的对照品种进行比较来确定TBRFV抗性。可用作对照的对TBRFV易感的番茄品种的实例是Candela F1和Razymo F1。由于在本发明之前没有已知的抗TBRFV的番茄品种，所以在本发明进行之前不可能包括抗性对照。按0-4级对抗性适当地评分；分数的等级可见于表1中。
表1:TBRFV抗性评分量表
Figure BDA0002511583580000051
如本文中所用，当使用根据表1的评分时，所述QTL纯合存在的TBRFV抗性番茄植物具有0或1的评分，或至多低于2的评分。耐受性植物的评分低于3。
具有导致TBRFV抗性的本发明QTL的番茄植物可以从保藏为NCIMB 42882、NCIMB42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890的种子生长而来。NCIMB 42882是从GNL.3951开发而来的。NCIMB 42885是由GBN.3920开发而来的。NCIMB 42887和NCIMB 42890是从GNL.3919开发而来的。
NCIMB 42882具有本发明的TBRFV抗性，并在11号染色体上包含本发明的QTL，所述QTL按递增的优先顺序位于SEQ ID No.1与53之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.51之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.33之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.11之间，或SEQ ID No.6与SEQ ID No.11之间。NCIMB 42882中的本发明的QTL最优选地位于SEQ ID No.7与SEQ ID No.11之间。所述QTL以纯合子形式存在于保藏NCIMB 42882中。
NCIMB 42885具有本发明的TBRFV抗性，并在11号染色体上包含本发明的QTL，所述QTL按递增的优先顺序位于SEQ ID No.1与53之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.51之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.33之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.11之间，或SEQ ID No.6与SEQ ID No.11之间。NCIMB 42885中的本发明的QTL最优选地位于SEQ ID No.7号和SEQ ID No.11之间。所述QTL以纯合子形式存在于保藏NCIMB 42885中。
NCIMB 42887具有本发明的TBRFV抗性，并在11号染色体上包含本发明的QTL，所述QTL按递增的优先顺序位于SEQ ID No.1与53之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.51之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.33之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.11之间，或SEQ ID No.6与SEQ ID No.11之间。NCIMB 42887中的本发明的QTL最优选地位于SEQ ID No.7和SEQ ID No.11之间。所述QTL以纯合子形式存在于保藏NCIMB 42887中。
NCIMB 42890具有本发明的TBRFV抗性，并在11号染色体上包含本发明的QTL，所述QTL按递增的优先顺序位于SEQ ID No.1与53之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.52之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.51之间，或SEQ ID No.4与SEQ ID No.33之间，或SEQ ID No.5与SEQ ID No.11之间，或SEQ ID No.6与SEQ ID No.11之间。NCIMB 42890中的本发明的QTL最优选地位于SEQ ID No.7与SEQ ID No.11之间。所述QTL以纯合子形式存在于保藏NCIMB 42890中。
在11号染色体上包含本发明的QTL的植物可在TBRFV生物测定中用作抗性对照品种。当待评估的植物、品系或群体在生物测定中显示出与NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB42887或NCIMB 42890相同的抗性水平，并且该植物、品系或群体在11号染色体上包含如本文所述的QTL时，该植物、品系或群体被认为具有本发明的TBRFV抗性，因此是本发明的植物。
本发明的植物任选地是栽培的番茄植物，其具有改进的农艺性状，使其适合于商业栽培。本发明还涉及从本发明的植物收获的番茄果实，其中番茄果实在其基因组中包含本发明的QTL，所述QTL在植物中导致TBRFV抗性。这种番茄果实在本文中也被称为“本发明的果实”或“本发明的番茄果实”。如本文中所用，“番茄果实”包括由番茄种的植物产生的果实。
本发明提供了11号染色体上的QTL，所述QTL与至少一个标记遗传连锁，所述标记选自按递增的优先顺序包含SEQ ID No.4至52的组，或包含SEQ ID No.5至52的组，或包含SEQ ID No.5至51的组，或包含SEQ ID No.4至33的组，或包含SEQ ID No.5至11的组，或者来自包含SEQ ID No.6至11的组，或者包含SEQ ID No.7至11的组，其中所述QTL在番茄植物中的存在导致TBRFV抗性。本发明的QTL最优选地与选自包含SEQ ID No.8至10的组中的至少一个标记遗传连锁。
本发明涉及用于产生TBRFV抗性番茄植物的方法，其包括在11号染色体上引入QTL，其中在番茄植物中QTL区域的侧翼按递增的优先顺序为SEQ ID No.4和SEQ ID No.52、或SEQ ID No.5和SEQ ID No.52、或SEQ ID No.5和SEQ ID No.51、或SEQ ID No.4和SEQ IDNo.33、或SEQ ID No.5和SEQ ID No.11、或SEQ ID No.6和SEQ ID No.11、或SEQ ID No.7和SEQ ID No.11。最优选地，引入的QTL的侧翼为SEQ ID No.8和SEQ ID No.10。
当植物在性别上相容时，可通过常用的育种技术，诸如杂交和选择，从包含QTL的另一种植物中引入本发明的QTL。这种引入可来自同一物种的植物(所述植物通常可容易地杂交)，或者来自相关物种的植物。杂交的困难可通过本领域已知的技术(诸如胚胎拯救)来克服，或者可以应用顺式发生。本文所述的合适标记用于跟踪QTL掺入另一种植物。
上述方法尤其可用于将本发明的QTL引入适合于引入这种遗传信息的植物物种。在一个特定的实施方案中，可以例如通过使用标准育种方法将所述QTL从包含该QTL的醋栗番茄植物引入到缺乏该QTL的番茄植物中。在另一个实施方案中，可使用标准育种方法将所述QTL从包含该QTL的番茄植物引入到缺乏该QTL的番茄植物中。
11号染色体上的所述QTL可从其代表性种子以保藏号NCIMB42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏于NCIMB的番茄植物，或者从NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB42890的保藏种子，或者从其有性或营养后代引入。在番茄中引入11号染色体上的QTL导致TBRFV抗性。
或者，可以例如通过使用转基因方法从另一种性不相容的植物转移或引入本发明的QTL。可适当使用的技术包括技术人员已知的一般植物转化技术，诸如使用土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法。基因组编辑方法，诸如CRISPR/Cas系统的使用，也可能用于获得本发明的植物。
本发明还涉及包含纯合地或杂合地导致TBRFV抗性的本发明的QTL的本发明植物，所述植物是近交系、杂种、双单倍体的植物或分离群体的植物。优选地，本发明的植物是非转基因植物。
本发明还涉及在染色体11上包含本发明QTL的番茄种子，其中从该种子生长的植物是对TBRFV具有抗性的本发明植物。本发明还涉及由本发明的植物产生的种子，其中该种子具有本发明的QTL，因此由所述种子生长的植物是本发明的植物。
此外，本发明还涉及包含本发明的番茄果实或其部分的食品或加工食品。所述食品可能已经历了一个或多个加工步骤。这种加工步骤可包括但不限于以下处理或其组合中的任何一种：去皮、切割、清洗、榨汁、烹饪、冷却或包含本发明的果实的沙拉混合物。获得的加工形式也是本发明的一部分。
本发明还涉及适于产生本发明的番茄植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者适于营养繁殖，并且特别地选自插条、根、茎、细胞、原生质体；或者适于可再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎；其中由繁殖材料产生的植物包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL，其赋予TBRFV抗性。本发明的植物可用作繁殖材料的来源。
本发明还涉及包含如本文所定义的本发明QTL的细胞。本发明的细胞可获自本发明的植物或存在于其中。这样的细胞可呈分离的形式，或为完整植物的一部分，或为其一部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞包含决定如本文所述的QTL的遗传信息，所述QTL导致培养的番茄植物的TBRFV抗性。本发明植物的每一个细胞都携带导致TBRFV抗性的遗传信息。本发明的细胞还可以是能够再生为本发明的新植物的可再生细胞。在本说明书中，所述遗传信息的存在是11号染色体上本发明QTL的存在，其中所述QTL是如本文所定义的。
本发明还涉及本发明植物的植物组织，其包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL。所述组织可以是未分化的组织或已分化的组织。未分化的组织是例如茎尖、花药、花瓣、花粉，并且可以用于微繁殖以获得新的小植株，所述小植株生长成本发明的新植物。所述组织还可从本发明的细胞中生长而来。
此外，本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织或种子的后代，所述后代包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL，所述QTL的存在(优选以纯合形式)导致TBRFV抗性。这种后代本身可以是植物、插条、种子、细胞或组织。
如本文中所用，“后代”旨在指来自与本发明的植物杂交的第一代后代和所有进一步的后代，其中杂交包括与自身杂交或与另一植物杂交，并且其中被确定为后代的后代包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL，所述QTL导致对TBRFV的抗性。在该杂交中使用的本发明的植物任选地是保藏的NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887、NCIMB 42890的植物或其后代种子，所述后代种子是通过将从保藏的种子生长的植物与其自身或与另一种植物杂交一个或多个后续世代的直接后代或进一步的后代。
“后代”还包括在11号染色体上携带本发明的QTL并对TBRFV具有抗性的番茄植物，并且通过营养繁殖或另一种增殖形式从本发明的另一植物或植物的后代获得。
本发明还涉及本发明的番茄植物的适于有性繁殖的部分，所述植物部分在染色体11上包含本发明的QTL，所述QTL是如本文中所定义的。这种部分例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。
另外，本发明涉及适合营养繁殖的本发明番茄植物的一部分，其特别地是在11号染色体上包含本发明的QTL的插条、根、茎、细胞或原生质体，所述QTL是如本文中所定义的。前面提及的植物的一部分被认为是繁殖材料。由繁殖材料产生的植物包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL，所述QTL的存在导致TBRFV抗性。
本发明还涉及本发明的植物的组织培养物，其也是繁殖材料，并且在其基因组中的11号染色体上包含本发明的QTL，所述QTL是如本文中所定义的。组织培养物包含可再生细胞。这种组织培养物可选自或源自植物的任何部分，特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子或茎。所述组织培养物可被再生为包含如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL的番茄植物，其中再生的番茄植物表达TBRFV抗性，并且也是本发明的一部分。
本发明另外涉及本发明的植物在植物育种中的用途。因此，本发明还涉及培育抗TBRFV的栽培番茄植物的育种方法，其中使用包含如本文所定义的染色体11上的本发明QTL的植物，所述QTL向另一种植物赋予所述抗性。将代表可用于植物育种以开发具有TBRFV抗性的另一植物的植物的种子以登录号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887和NCIMB42890的NCIMB保藏在NCIMB中。
本发明还涉及如本文所定义的11号染色体上的本发明QTL用于开发对TBRFV有抗性的番茄植物的用途。
本发明还涉及用于鉴定茄番茄植物的TBRFV抗性的标记，所述标记按递增的优先顺序选自包括SEQ ID No.4至52的组、或包括SEQ ID No.5至52的组、或包括SEQ ID No.5至51的组、或包括SEQ ID No.4至33的组、或包括SEQ ID No.5至11的组、或包括SEQ ID No.6至11的组、或包括SEQ ID No.7至11的组，用于鉴定11号染色体11上的QTL。用于鉴定本发明QTL的标记最优选选自包括SEQ ID No.8至10的组。基于所述SEQ ID No之间的如上定义的区域中的任一个中的多态性开发的任何其他标记也是本发明的一部分。
来自包括SEQ ID No.4至52的组、或来自包括SEQ ID No.5至52的组、或来自包括SEQ ID No.5至51的组、或来自包括SEQ ID No.4至33的组、或来自包括SEQ ID No.5至11的组、或来自包括SEQ ID No.6至11的组、或包括SEQ ID No.7至11的组或最优选来自包括SEQID No.8至10的组的任何标记用于鉴定番茄植物的TBRFV抗性的用途也是本发明的一部分。这些标记中的任一个也可用于开发其它标记，以用于通过确定所述SEQ ID No.之间的区域中的任何其它多态性来鉴定导致TBRFV抗性的11号染色体上的QTL，所述用途也是本发明的一部分。
本发明还涉及选择TBRFV抗性番茄植物的方法，其包括鉴定11号染色体上本发明QTL的存在，以及选择包含所述QTL的植物作为TBRFV抗性植物。
使用选自包括SEQ ID No.4至52的组、或包括SEQ ID No.5至52的组、或包括SEQID No.5至51的组、或包括SEQ ID No.4至33的组、或包括SEQ ID No.5至11的组、或包括SEQID No.6至11的组、或包括SEQ ID No.7至11的组或最优选地包括SEQ ID No.8至10的组的标记，适当地鉴定11号染色体上所述QTL的存在。
本发明还涉及测试番茄植物在其基因组中赋予TBRFV抗性的11号染色体上本发明QTL的存在的方法，其包括检测标记序列在番茄植物基因组中的存在，所述标记序列选自由SEQ ID No.4至52组成的组、或由SEQ ID No.5至52组成的组、或由SEQ ID No.5至51组成的组、或由SEQ ID No.4至33组成的组、或由SEQ ID No.5至11组成的组、或由SEQ ID No.6至11组成的组、或由SEQ ID No.7至11组成的组或最优选地由SEQ ID No.8至10组成的组。
测试番茄植物在其基因组中赋予TBRFV抗性的11号染色体上本发明QTL的存在的方法，任选地还包括选择包含所述QTL的番茄植物作为TBRFV抗性植物。
本发明还涉及产生TBRFV抗性番茄植物的方法，所述方法包括:
a)将在11号染色体上包含本发明QTL的本发明植物与另一种植物杂交；
b)任选地对由杂交产生的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交，以获得后续代群体；
c)从杂交产生的植物或从后续代群体中选择在本文所定义的11号染色体上包含所述QTL的植物，所述植物对TBRFV具有抗性。
选择在11号染色体上包含所述QTL的植物合适地通过使用与QTL遗传连锁的分子标记来进行，所述标记选自包括SEQ ID No.4至52的组、包括SEQ ID No.5至52的组、包括SEQ ID No.5至51的组、包括SEQ ID No.4至33的组、包括SEQ ID No.5至11的组、包括SEQID No.6至11的组、包括SEQ ID No.7至11的组或最优选包括SEQ ID No.8至10的组，用于鉴定11号染色体上的所述QTL。可选择地或另外地，对植物根据表型选择对TBRFV具有抗性，特别地通过进行针对TBRFV抗性的生物测定。
在本发明的一个实施方案中，用于产生抗TBRFV的番茄植物的方法中的本发明植物是从以NCIMB登录号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏的种子中生长而来的植物，或其后代植物，所述后代植物是通过将从保藏的种子生长而来的植物与其自身或与另一种植物杂交一个或多个后续世代而获得的直接或进一步的后代。
本发明还提供了将另一种所需性状引入到包含TBRFV抗性的番茄植株中的方法，所述方法包括：
a)将在11号染色体上包含所述QTL的本发明番茄植物与包含所述其他所需性状的第二番茄植物杂交，以产生F1后代；
b)任选地在F1中选择包含TBRFV抗性和所述其他所需性状的植物；
c)将所述任选地选择的F1后代与任一亲本杂交，以产生回交后代；
d)选择包含TBRFV抗性和所述其他所需性状的回交后代；以及
e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次，以产生选定的第四或更高回交后代，其包含所述其他所需性状并具有对TBRFV的抗性。任选地进行回交直至回交后代稳定，并可用作亲本系，这可在多达10次回交后达到。
在本发明的一个实施方案中，在将另一个所需性状引入包含对TBRFV的抗性的番茄植物的方法中使用的本发明植物是从以NCIMB登录号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB42887或NCIMB 42890保藏的种子生长而来的植物，或其后代植物，所述后代植物是通过将从保藏的种子生长而来的植物与其自身或与另一种植物杂交一个或多个后续世代而获得的直接后代或进一步后代。
任选地，自交步骤在任何杂交或回交步骤之后进行。对在11号染色体上包含导致TBRFV抗性的本发明QTL和所述其他所需性状的植物的选择可选地可在该方法的任何杂交或自交步骤之后进行。所述其他所需性状可以选自但不限于以下组:对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、对昆虫或害虫的抗性、改善的萌芽、植物尺寸、植物类型、改善的保存期、水胁迫和热胁迫耐受性以及雄性不育性。本发明包括通过该方法生产的番茄植物和由此获得的番茄果实。
本发明还涉及通过使用在其基因组中包含本发明QTL的植物材料的组织培养产生在11号染色体上包含本发明QTL的番茄植物的方法，其中所述QTL的存在导致对TBRFV的抗性。
本发明还涉及通过使用在其基因组中包含本发明QTL的植物材料的营养繁殖产生在11号染色体上包含本发明QTL的番茄植物的方法，其中所述QTL的存在导致对TBRFV的抗性。
本发明还提供通过使用双单倍体生成技术生成纯合地包含本发明QTL并且对TBRFV具有抗性的双单倍体品系，来产生在11号染色体上包含本发明QTL并具有本文所定义的对TBRFV的抗性的番茄植物的方法。
本发明还涉及产生如本文所定义的在11号染色体上包含本发明QTL的番茄植物的方法，其中所述QTL的存在导致TBRFV抗性，所述方法包括将包含所述QTL的种子生长成所述番茄植物。在一个实施方案中，所述方法中使用的种子是以保藏号NCIMB 42882、NCIMB42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏在NCIMB的种子或其后代种子，所述后代种子是通过将从保藏的种子生长而来的植物与其自身或与另一植物杂交一个或多个后续世代而获得的直接后代或进一步的后代。
本发明还涉及种子生产方法，其包括从本发明的种子生长番茄植物，允许该植物生产带有种子的果实，收获果实，并提取那些种子。种子的生产适宜地通过自身杂交或与另一种植物(任选地也是本发明的植物)杂交来进行。如此产生的种子具有生长成包含本发明的QTL并对TBRFV具有抗性的植物的能力。
本发明还涉及杂交种子和生产所述杂交种子的方法，其包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得的杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物是本发明的植物，其包含如本文所定义的11号染色体上的本发明的QTL。可从杂交种子生长而来的、包含所述QTL的所得杂交植物也是本发明的植物，所述杂交植物具有对TBRFV的抗性。
提供本发明的TBRFV抗性的亲本可以是直接从保藏的种子生长而来的植物。亲本也可以是来自保藏的种子的后代植物，其为通过自身杂交或与另一种植物杂交一次或多次而获得的直接后代或进一步的后代，或者是来自经鉴定已获得本发明的QTL并因此通过其它方式获得本发明的TBRFV抗性的种子的后代植物。
如本文所用的11号染色体上本发明QTL的基因渗入意指通过标准育种技术，将来自包含所述QTL的供体植物的QTL导入不携带所述QTL的受体植物，其中通过观察对TBRFV的抗性，可对包含本发明QTL的植物进行表型选择，或者可通过使用本文所定义的标记，通过标记辅助育种，或者这些选择方法的组合进行选择，所述标记优选地选自包括SEQ ID No.4至52的组、或包括SEQ ID No.5至52的组、或包括SEQ ID No.5至51的组、或包括SEQ IDNo.4至33的组、或包括SEQ ID No.5至11的组、或包括SEQ ID No.6至11的组、或包括SEQ IDNo.7至11的组或者最优选地包括SEQ ID No.8至10的组。选择在F1或从受体植物与供体植物之间的初始杂交的任何进一步的世代中开始，随后是与其自身或与另一种植物之间的进一步杂交，适当地通过使用本文鉴定和定义的标记来进行。本领域技术人员熟悉创建和使用可用于鉴定所述QTL或与所述QTL遗传连锁、并因此可鉴定本发明的TBRFV抗性或与其遗传连锁的新的分子标记。用于本发明植物的鉴定和选择的此类标记的开发和使用也是本发明的一部分。
本发明将在以下实施例中进一步说明，所述实施例仅用于说明目的。所述实施例无意以任何方式限制本发明。在实施例和申请文件中，参考以下附图。
附图
图1–SEQ ID Nos.1至53的核苷酸序列。
保藏物
将产生TBRFV抗性植物的在11号染色体上纯合地包含本发明QTL的番茄的种子于2017年11月9日保藏于NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK，保藏登录号为NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887和NCIMB42890。
实施例
实施例1
番茄的TBRFV抗性的生物测定和保藏物开发
由于新的TBRFV烟草花叶病毒的存在，以及这种病毒很容易在大范围内传播的威胁导致越来越多的问题，于是组织了广泛的种质筛选。潜在抗性材料的筛选是通过生物分析进行的。由于病毒是通过机械方式传播的，因此在生物测定中使用了标准的机械接种技术。当时还不知道抗性材料，所以不可能包括抗性对照。然而，很容易包括易感对照；Candela F1被包括在内，因为其被公布为易感的，而Razymo F1也被包括作为第二易感对照。为了确定栽培材料中是否已经存在抗性，还包括了大量商购可得的杂交番茄品种。
将待测种质的种子播种在标准育苗托盘中，在播种后3周接种每种种质11个苗。接种后2周，以及再次在接种后3周，根据表1对症状进行评分。
通过在与硅藻土混合的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中碾磨用TBRFV感染的番茄植物的叶子制备接种物。在用接种物轻轻摩擦叶子之前，用金刚砂粉末撒在植物上。
在大型筛选中，三个醋栗番茄种质GNL.3919、GNL.3920和GNL.3951被鉴定为对TBRFV具有抗性。在第一次和第二次观察中，所有三份种质都具有100％抗性，没有表现出任何症状，因此评分为0。对于Candela F1和Razymo F1，所有植物的评分均为4，因此它们是高度易感的。包括在内的其他商业番茄品种主要评分为3和4，没有一个显示出抗性植物。
将鉴定的抗性醋栗番茄来源与内部番茄品系TB1、TB2和TO1杂交。随后生长来自这些杂交的F1植物，并且也获得F2种子。再次建立了新的大型筛选，其包括每个群体的来源、育种系、F1植物和184株F2植物。接种后两周该筛选的亲本和F1的平均评分可见于表2中。单个F2植株的评分如预期那样分离，因此评分范围为0至4。当植物在第一次观察中评分为3时，就像内部育种系TB1、TB2和TO1的情况一样，则除去该植物，不进行第二次观察。
从分离的F2群体中选择抗性植物并使其自交。使用来自QTL分析的平行开发的标记(见实施例2)，选择具有已鉴定的QTL的植物。随后将来自这些单个植物的种子(其中所有三种来源都有代表)保藏为NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887和NCIMB 42890。NCIMB42882是由与GNL.3951的杂交开发而来。NCIMB 42885是由与GNL.3920的杂交开发而来。NCIMB 42887和NCIMB 42890是由与GNL.3919的杂交开发而来。所有保藏的植物在11号染色体上都有纯合的所述QTL。
表2–TBRFV生物测定结果
编号 平均品系或F1评分
TB1 F8 3
TB2 F9 3
TO1 F9 3
GNL.3920 F6 0.5
GNL.3951 F6 0.5
GNL.3919 F6 0.5
(TB1 x GNL.3920) F1 1.0
(TB2 x GNL.3920) F1 3.0
(TO1 x GNL.3920) F1 0.5
(TB1 x GNL.3951) F1 1.0
(TB2 x GNL.3951) F1 3.5
(TO1 x GNL.3951) F1 1.5
(TB1 x GNL.3919) F1 0.5
(TB2 x GNL.3919) F1 2.4
(TO1 x GNL.3919) F1 0.5
对F2和F3植物进行了进一步的观察，所述植物被选择为纯合性地具有所述QTL，这证实了该QTL的存在导致疾病评分平均为0-1，偶尔接近1.5(根据表1中描述的等级)。用育种系作为轮回亲本进行回交，并且在回交世代的随后的自交群体中，也发现该QTL的纯合存在导致对TBRFV具有抗性的植物。
实施例2
QTL作图和标记开发
为了从已鉴定的来源对赋予TBRFV抗性的QTL进行作图，对表2中7个F1的F2群体的184株植物进行了TBRFV抗性的表型分析；亲本也包括在内作为参考；从每株植物中获取DNA样品用于基因分型。根据表1的表型评分0至4存在于所有F2群体中。
每个群体都构建了遗传图谱；去除了非多态性标记和具有强烈分离偏离(segregation distortion)的标记。对于每个群体，对约400至450个标记进行了作图，所述标记在基因组中均匀分布，平均间距为2-3cM。确定标记顺序；公共基因组装配用于确定连锁群的编号和取向。从七张独立的图谱中创建了共有图谱(consensus map)。
将表型评分、基因型数据和包含标记位置的共有图谱用作QTL作图的输入数据。进行了QTL分析，对数据的作图初步鉴定出三个QTL：一个在11号染色体上，一个在12号染色体上，一个在6号染色体上。
通过对针对抗性而分离的群体的进一步观察，以及随后对QTL的精细作图，发现对TBRFV抗性的主要贡献是由于11号染色体上QTL的存在。通过这种精细作图，可进一步缩窄11号染色体上的QTL区域。对原始QTL内的重组体的鉴定最初产生了约54Mbp的较小区域。甚至更进一步的精细作图产生了包含来自来源的约7.7Mbp至10.1Mbp的基因渗入的小区域。显示抗性的最终重组体仅具有来自来源的约8.6至10.1Mbp的小基因渗入，所述基因渗入位于SEQ ID No.7与SEQ ID No.10之间。基于公共SL3_00番茄图谱的精确位置可见于表3中。表3列出了在该分析中鉴定存在于所述QTL区域中的多态性SNP标记。这些标记的序列如图1所示。这些标记可用于鉴定QTL在由保藏物生长而来的植物或其后代中的存在。还可将这些标记用于鉴定赋予TBRFV抗性的本发明QTL在包含所述QTL的任何其他群体中的11号染色体上的存在。
表3.SNP标记–核苷酸和物理位置。
Figure BDA0002511583580000191
Figure BDA0002511583580000201
Figure BDA0002511583580000211
PCT/RO/134表
Figure QDA0002511583780000011
Figure QDA0002511583780000021
Figure QDA0002511583780000031
Figure QDA0002511583780000041

Claims (17)

1.一种具有对TBRFV的抗性的番茄(Solanum lycopersicum)植物，所述植物在11号染色体上包含QTL，其中11号染色体上的所述QTL位于SEQ ID No.1与SEQ ID No.53之间。
2.如权利要求1所述的番茄植物，其中通过使用选自包括SEQ ID No.4至52的组的至少一种标记来鉴定11号染色体上所述QTL的存在。
3.如权利要求1或2所述的番茄植物，其中在其代表性种子以保藏号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏在NCIMB的番茄植物的基因组中，所述QTL的侧翼为SEQ ID No.4和SEQ ID No.52。
4.如权利要求1-3中任一项所述的TBRFV抗性番茄植物的细胞，所述细胞在其基因组中的11号染色体上包含如权利要求1-3中任一项所定义的QTL。
5.一种番茄种子，其中由所述种子生长而来的植物由于在其基因组中存在如权利要求1-3中任一项所定义的11号染色体上的QTL而对TBRFV具有抗性。
6.一种适于产生如权利要求1-3中任一项所述的番茄植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者适于营养繁殖，并且特别地选自插条、根、茎、细胞和原生质体；或者适于可再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎；其中由所述繁殖材料产生的所述植物在11号染色体上包含如权利要求1-3中任一项所定义的导致TBRFV抗性的QTL。
7.一种用于鉴定番茄植物中的TBRFV抗性的标记，所述标记选自包括SEQ ID No.4至52的组。
8.一种用于在番茄植物中鉴定导致TBRFV抗性的11号染色体上的QTL的标记，所述标记选自包括SEQ ID No 4至52的组。
9.如权利要求7或8所述的标记用于鉴定番茄植物中的TBRFV抗性的用途。
10.一种用于产生TBRFV抗性番茄植物的方法，其包括在番茄植物中在11号染色体上引入如权利要求1-3中任一项所定义的QTL。
11.一种用于选择TBRFV抗性番茄植物的方法，其包括鉴定11号染色体上如权利要求1-3中任一项所定义的QTL的存在，以及选择包含所述QTL的植物作为TBRFV抗性植物。
12.如权利要求11所述的方法，其中使用选自包括SEQ ID No.4至52的组中的标记来鉴定11号染色体上所述QTL的存在。
13.一种用于产生对TBRFV具有抗性的番茄植物的方法，所述方法包括:
a)将权利要求1-3中任一项所述的在11号染色体上包含所述QTL的植物与另一种植物杂交；
b)任选地对步骤a)中杂交产生的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交，以获得下一代群体；
c)从步骤a)中的杂交产生的植物或从步骤b)的下一代群体中选择如权利要求1-3中任一项所定义的在11号染色体上包含所述QTL的植物，所述植物对TBRFV具有抗性。
14.如权利要求13所述的方法，其中通过使用与所述QTL遗传连锁的分子标记来选择在11号染色体上包含所述QTL的植物，所述标记选自包括SEQ ID No 4至52的组。
15.如权利要求13所述的方法，其中对对TBRFV具有抗性的植物进行表型选择，特别地通过使用TBRFV抗性的生物测定。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中如权利要求1-3中任一项所述的植物是由以NCIMB登录号NCIMB 42882、NCIMB 42885、NCIMB 42887或NCIMB 42890保藏的种子生长而来的植物，或其后代植物。
17.一种产生杂交种子的方法，其包括使第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物是在11号染色体上包含如权利要求1-3中任一项所定义的QTL的本发明的植物，其对TBRFV具有抗性，其中所述QTL的存在在从所述种子生长而来的所述杂交植物中导致对TBRFV的抗性。
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