CN117126961A - 玉米叶夹角lg2基因的分子标记及其开发方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用,涉及植物分子标记开发技术领域。本发明提供了玉米叶夹角LG2基因的分子标记snym26A,位于玉米3号染色体179389140bp‑179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子;snym26A为玉米3号染色体179389140bp‑179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子上重复次数变异的四个碱基CATT。本发明采用上述分子标记,进行基因型检测和基因型分类,为生产实践中叶夹角的性状选育提供参考,还可以简单快速的对玉米叶夹角进行基因型分类和鉴定,有利于选育玉米理想株型品种。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子标记开发技术领域,尤其是涉及玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用。
背景技术
玉米理想株型最早由Duvick提出,玉米理想株型包括紧凑株型、茎杆韧性强、根系发达、整齐一致的穗位高度、适应机械化、适当叶间距和耐密等。培育理想株型,提高光合效率对粮食增产有重要影响,而叶夹角对单位面积内的光合利用率有紧密联系,研究发现,种植密度越大,紧凑型玉米能更高效利用太阳辐射(Duvick,2005;Strable et al.,2021a)。李登海等认为玉米叶夹角最优角度与生长时期和叶位有关,生长前期如大喇叭口期,叶片生长角度整体为平展型,抽雄后穗下叶为平展型,穗上叶为紧凑型(李登海,2004)。玉米穗上部叶片紧凑,穗位部叶片平展对透光率和光合效率提高有利。紧凑型玉米种植密度提高有利于优化玉米冠层光氮分布,增加玉米穗部和穗下部光能截获量,促进生长后期干物质积累,单位面积产量随之提高(柏延文等,2020;Hepworth et al.,2015)。肖万欣等认为紧凑型玉米根茎部对氮素有较强的适应性,增加氮肥施加可降低紧凑型玉米棒三叶的叶夹角大小,提高紧凑型玉米穗位部叶片光合性能,还发现紧凑型玉米高氮高密度环境下的形态生理协调性比平展型玉米好,生育后期物质转化效率高,群体产量紧凑型玉米更高(肖万欣等,2017;Du et al.,2017)。研究发现,虽然紧凑型玉米密植时产量优势大,但随着密度增加,玉米株高、穗位高、穗高系数均升高,玉米倒伏率随穗位高增加而增加,玉米穗行数、穗粒数和百粒重随穗位增加而减少,保证群体产量的前提是寻找紧凑型玉米的合适种植密度(田再民等,2016)。研究人员利用由昌7-2选育的无叶舌新种质10H045为父本,郑58、WX201620和WX201623为母本杂交,F1后代比昌7-2为父本的杂交后代的叶夹角和叶向值显著减小,产量显著提高(郑向阳等,2021;Wu et al.,2016)。前人将植株表现为平展的高产玉米杂交种“先锋3306”,通过人工育种选择,减小穗上部叶片的叶夹角10°,产量增加了14%(Pendleton et al.,1968)。对上个世纪90年代培育的玉米新品种调查发现,叶夹角从60°降低到30°,产量提高了15%~30%(Ku L X et al.,2010;Lauer et al.,2012)。这些研究说明叶夹角和叶面积指数的改善,以及提高光捕获和产量之间存在一定联系。通过降低叶夹角,或者减小叶向值,是玉米育种中获得理想株型的一项重要途径(Messina etal.,2011;Zhang N et al.,2021;Zhang D et al.,2018;Chen M et al.,2016)。因此本发明提供玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用。
发明内容
本发明的目的是提供玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用,利用snym26A分子标记对F3:4家系进行标记基因型检测和基因型分类,结合表型计算效应值,为生产实践中叶夹角的性状选育提供参考,snym26A分子标记还可以简单快速的对玉米叶夹角进行基因型分类和鉴定,有利于选育玉米理想株型品种。
为实现上述目的,本发明提供了玉米叶夹角LG2基因的分子标记,包括分子标记snym26A,snym26A位于玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子;snym26A为玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子上重复次数(5次)变异的四个碱基CATT。
本发明还提供了上述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的特异性引物,分子标记snym26A的特异性上游引物F的序列如SEQ ID NO.1所示,特异性下游引物R的序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了上述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的开发方法,包括以下步骤:
S1、CTAB法提取玉米基因组DNA;
S2、进行PCR扩增,得到PCR产物;
S3、对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行基因分型。
优选的,所述步骤S2中PCR反应体系为:DNA模板2μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,2×Vazyme Lamp Master Mix(dye plus)5μL,灭菌ddH2O 2μL,总体积10μL;
PCR反应程序为:①预变性94℃5min,②变性94℃30s,③退火60℃30s,④延伸72℃30s,⑤重复②~④步28个循环,⑥充分延伸72℃5min,⑦保存4℃。
玉米叶夹角LG2基因的分子标记的特异性引物在检测玉米叶夹角性状的试剂或试剂盒中的应用。
玉米叶夹角LG2基因的分子标记在玉米选育中的应用。
本发明所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用的优点和积极效果是:
1、本发明利用snym26A分子标记对F3:4家系进行标记基因型检测和基因型分类,结合表型计算效应值,为生产实践中叶夹角的性状选育提供参考。
2、本发明中的snym26A分子标记可以简单快速的对玉米叶夹角进行基因型分类和鉴定,有利于选育玉米理想株型品种。
下面通过附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明中L1(紧凑型)和L2(平展型)玉米植株的表型图;
图2为本发明中snym04、snym05、snym26A、snym27四个分子标记的位置;
图3为本发明中聚丙烯酰胺凝胶电泳部分结果图;
图4为本发明中L1和L2杂交后代LG2基因标记辅助改良效果植株表型图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义,本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
除非另外定义,本发明使用的溶液、试剂盒、仪器及DNA扩增引物等均为常规使用。
玉米叶夹角LG2基因的分子标记,包括分子标记snym26A,分子标记位于玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子。
snym26A为玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子上重复5次变异的四个碱基CATT。
玉米叶夹角LG2基因的分子标记的特异性引物,分子标记snym26A的特异性上游引物F的序列如SEQ ID NO.1所示,特异性下游引物R的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1
1.1实验材料及田间种植方法
316份自交系,分别于2021年和2022年种植于沈阳农业大学北试验田。试验小区行长5m,行距0.6m,株距25cm,单行区,两次重复。
课题组前期使用先玉335二环选系早代材料与郑58杂交选育出一对叶夹角有显著表型差异的高世代姊妹系L1(紧凑型)和L2(平展型),和它们作为亲本构建获得的含有190个单株的F2群体以及其单株自交生成的190个F2:3家系;由F2群体中目标区段杂合的单株自交获得的F3群体衍生的164个F3:4家系。种植方法,小区行长4m,行距0.6m,株距25cm。亲本材料分为97500株/hm2和52500株/hm2两个密度种植,每个材料2次重复,种植10行区,行长4m,行距60cm。图1为L1(紧凑型)和L2(平展型)玉米植株的表型,左为L1(紧凑型)植株,右为L2(平展型)植株。
1.2CTAB法提取玉米基因组DNA
使用2×CTAB裂解液(北京酷来博科技)提取叶片DNA,方法如下:
(1)玉米苗期取样,选择叶脉两侧幼嫩的植株叶片大约2.0g,装入写有编号的2ml离心管,并将样品迅速放入液氮中,冷冻后利用研磨仪研磨,设置速度12000rpm/min研磨时间5min。
(2)提前用恒温水浴锅65℃预热CTAB,移液枪吸取800μL的CTAB加入到研磨后的样品粉末中,涡旋振荡10s,将离心管放回65℃水浴锅中水浴40min,期间每10min颠倒摇匀一次。
(3)水浴完成后冷却2min,加入500μL的氯仿-异戊醇混合液(24:1),剧烈震荡混匀。离心机设置12000rpm/min离心10min。
(4)移液枪吸取上步离心管中上清液到新的带编号的1.5mL离心管中。上步离心后会分为三层:上层为水相,中间为蛋白和植物碎片,下层为有机相。吸取时避免触及蛋白和有机相。如果不小心吸取到中下层,或中间层较厚,应少吸取水相,或吸取之后再加入500μL氯仿-异戊醇混合液,重新混匀离心取上清。
(5)在上清液中加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,置于-20℃沉淀30min以上,12000rpm/min离心10min,弃上清。
(6)沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000rpm/min离心5min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于80ul去离子水中,37℃温育30min。置于-20℃保存。
1.3PCR扩增及测序
设计特异性引物F:CTCCCGATGTCCCATGATCA(SEQ ID NO.1),R:GCAGAGAGCGAATCACCAAG(SEQ ID NO.2),进行PCR扩增。DNA模板2μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,2×Vazyme Lamp Master Mix(dye plus)5μL,灭菌ddH2O 2μL,总体积10μL;
PCR反应程序为:①预变性94℃5min,②变性94℃30s,③退火60℃30s,④延伸72℃30s,⑤重复②~④步28个循环,⑥充分延伸72℃5min,⑦保存4℃。
snym04、snym05、snym27分子标记的引物如表1所示。
PCR反应体系为:DNA模板2μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,2×Accurate TaqMix(dye plus)5μL,灭菌ddH2O 2μL,总体积10μL。
PCR反应程序为:①预变性94℃30s,②变性98℃10s,③退火58℃30s,④延伸72℃1min,⑤重复②~④步34个循环,⑥充分延伸72℃5min,⑦保存4℃。
表1与snym26A连锁标记的引物信息
snym04、snym05、snym26A、snym27的位置如图2所示。
1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳及基因型分型
(1)用无水乙醇擦拭过的玻璃板组装好后,用铁夹固定好,调至水平状态。
(2)取20%的非变性胶50mL~60mL,加入140μL的20%过硫酸铵(APS)和140μL的四甲基乙二胺,慢慢摇晃混匀(注意不可用力摇晃,防止产生气泡)。
(3)将配置好的非变性胶灌入玻璃板中,注意灌胶过程中,胶不能有气泡出现,如果有气泡产生,可以用胶条勾出,灌完胶后,插入梳子,等待胶片完全凝固后使用。
(4)将凝固好的玻璃板固定在电解槽中,加入1×TBE电解液,拔掉梳子,注意在拔梳子的过程中要水平拔出,以免胶孔被堵住,对点样产生影响,每个泳道点样量为2.5μL~3μL,同时在合适的位置点入1μL~1.5μL的Marker,用于区分胶片的顺序。
(5)电泳仪的电压设置为300V,电流设置为200A,电功率设置为100W,电泳150min~180min(根据DNA片段的大小设定电泳时间),电泳结束后,将胶片取下(注意取胶片时一定要慢取、轻放,防止把胶片弄碎,影响读带),进行银染显色。
(6)固定:将取出的胶片至于1800mL蒸馏水、200mL无水乙醇、10mL冰醋酸的溶液,在摇床上轻轻摇晃10min。
(7)染色:将胶片放置于2g硝酸银,1500mL蒸馏水的溶液中,在摇床上轻轻摇晃7min~9min。
(8)漂洗:将取出的胶片放置于2000mL的蒸馏水中,慢慢冲洗30s。
(9)显影:将漂洗完成的胶片放置于氢氧化钠和甲醛的混合溶液中,在摇床上轻轻摇晃,待出现清晰的条带后转移至蒸馏水中。
(10)记录:将取出的胶片放到照胶仪上,读带并拍照保留。分子标记带型的记录分别用1、2、3和0表示,与紧凑型L1带型相同的记作“1”,与平展型L2带型相同的记做“2”,与杂合带型相同的记做“3”,缺失或不清晰记做“0”。
1.5使用Maize6H-60k芯片鉴定玉米群体的基因型。
1.6基因效应值计算
将基因分型后的结果对比表型叶夹角数值,与紧凑型亲本L1一致的基因型为AA,与平展型亲本L2一致的基因型为BB,等位基因效应值为二者均值的差。基因贡献率为效应值与群体最大叶夹角的比值。
实施例2
2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳部分结果如图3所示。
2.2LG2为控制玉米叶夹角的候选基因,本发明利用获得的snym04、snym05、snym26A、snym27四个分子标记对F3:4家系164个穗行进行标记基因型检测和基因型分类,结合表型计算效应值,结果如表2所示。
表2 F3:4家系的标记表型效应分析
注:AA基因型与L1一致为紧凑型,BB基因型与L2一致为平展型,大写字母表示基因型间在P<1%水平差异显著性。
由表2看出,包含LG2基因片段的snym26A标记穗上三叶叶夹角效应值较大,贡献率最大,该标记对叶夹角的鉴定效果最好。
2.3利用检测效果最好的标记snym26A对316份自交系进行基因型分型。其中标记与亲本L1一致为AA的自交系个数为173个,与亲本L2一致为BB的自交系个数为80个。基于不同叶位进行对比,标记为AA的自交系穗上第一叶叶夹角平均值为19.08°,为BB的自交系叶夹角平均值25.94°,它们之间差异极显著,效应值为6.86°,贡献率13.69%;标记为AA的自交系穗上第二叶叶夹角平均值18.44°,标记为BB的自交系叶夹角平均值为26.92°,它们之间差异极显著,效应值为8.48°,贡献率为14.27%;标记为AA的自交系穗上第三叶叶夹角平均值为18.63°,标记为AA的叶夹角平均值为29.32°,它们之间差异极显著,效应值为10.69°,贡献率为8.79%。结果见表2。
表2标记snym26A对自交系基因分型及表型贡献分析
图4为本发明中L1和L2杂交后代LG2基因分子标记辅助改良效果植株表型图,可以得出两株玉米植株的叶夹角有明显的区别,说明本申请的分子标记可以简单快速的对玉米叶夹角进行基因型分类和鉴定,有利于选育玉米理想株型品种,为生产实践中叶夹角的性状选育提供参考。
因此,本发明采用上述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记及其开发方法和应用,利用snym26A分子标记对F3:4家系进行标记基因型检测和基因型分类,结合表型计算效应值,为生产实践中叶夹角的性状选育提供参考,snym26A分子标记还可以简单快速的对玉米叶夹角进行基因型分类和鉴定,有利于选育玉米理想株型品种。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.玉米叶夹角LG2基因的分子标记,其特征在于:包括分子标记snym26A,snym26A位于玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子;
snym26A为玉米3号染色体179389140bp-179389305bp处的Zm00001d042777基因片段的第4内含子上重复次数变异的四个碱基CATT。
2.如权利要求1所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的特异性引物,其特征在于:分子标记snym26A的特异性上游引物F的序列如SEQ ID NO.1所示,特异性下游引物R的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的开发方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、CTAB法提取玉米基因组DNA;
S2、进行PCR扩增,得到PCR产物;
S3、对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行基因分型。
4.根据权利要求3所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的开发方法,其特征在于,所述步骤S2中PCR反应体系为:DNA模板2μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,2×Vazyme LampMaster Mix(dye plus)5μL,灭菌ddH2O 2μL,总体积10μL;
PCR反应程序为:①预变性94℃5min,②变性98℃30s,③退火60℃30s,④延伸72℃30s,⑤重复②~④步28个循环,⑥充分延伸72℃5min,⑦保存4℃。
5.如权利要求2所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记的特异性引物在检测玉米叶夹角性状的试剂或试剂盒中的应用。
6.如权利要求1所述的玉米叶夹角LG2基因的分子标记在玉米选育中的应用。
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