CN103215367A - 一种基于vigs系统在油桐中研究杨树功能基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、低成本研究杨树功能基因的新方法。本发明的技术方案是一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，包括如下步骤：a、构建载体；b、转化；c、转入油桐；d、检测。本方法简单高效，成本低廉，适合大规模筛选杨树基因的功能。

Description

一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法。

背景技术

杨树（Populus spp.）是世界范围内种植最为广泛的一种速生树木。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，是重要的建筑用材和造纸原料，同时还可作为可再生能源的原料。毛果杨的基因组测序已经于2006年完成（Tuskan et al.,2006），杨树基因组包含45000个蛋白编码基因，并且其中大约12%的基因不能够在模式植物拟南芥中找到同源基因。因此，找到快速而有效的方法阐明这些基因的功能意义重大。

近年来，研究植物基因功能的方法主要是通过根癌农杆菌介导的遗传转化产生稳定表达的转基因植株，然而这种方法由于周期较长，只适应于小部分基因，并且在后期鉴定转基因阳性是需要鉴定大量植株才能得到阳性株系（Takata.,2012）,获得的转基因植株往往含有一个至多个拷贝的外源基因（Spielmann et al.,1986）。现已证明，多拷贝数的外源基因在转录翻译过程中存在基因沉默的现象，导致其表达不稳定（Lechtenberg et al.,2003）。

与稳定表达的方法研究基因功能相比，农杆菌介导的在活细胞内瞬时转化的方法具有明显的优势，但是是一种不稳定，容易引起植物自身的免疫防卫反应而导致现象不明显或无现象（Anand et al.,2008），而且表型持续时间短，不利于长期观察。

研究发现，RNA病毒介导的基因沉默（VIGS）可以特异性地沉默目的基因，是一种快速高效地研究基因缺失的一种强大工具，并且已经在多种植物中，尤其是草本植物中获得了成功（Annette and Matthias,2010）。而由烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介导的VIGS由于其寄主范围广、构建方便、效果明显等特点，成为目前应用范围最广的病毒载体。

在木本植物里，Ye等人发现麻风树是烟草脆裂病毒的宿主之一，运用TRV病毒介导的VIGS可以有效地沉默麻风树中的基因，使植株的表型发生一定变化（Ye et al.,2009）。

油桐作为一种重要的油料树种，从其种子榨取的桐油是墨水、染料、树脂等的原料（Sonntag,1979）。最近的报道称桐油还可以用来制造生物柴油（Chen et al.,2010）。油桐(Vernicia fordii)和麻风树（Jatropha curcas L）同属大戟科，也可以诱导出TRV病毒介导的VIGS，因此如果能够有一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，将大大推动杨树的基因研究，但是目前并没有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、低成本研究杨树功能基因的新方法。

本发明的技术方案是一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，包括如下步骤：

a、构建载体：扩增杨树待研究基因片段，与TRV2载体相连接，转化农杆菌GV3101；

b、转化：将转后的阳性农杆菌菌液与TRV1菌液按菌体质量比1︰1混合；

c、转入油桐：通过注射的方法将混合菌液接种在2～3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可；

d、检测：大约2～3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。

采用本发明方法，仅需要将目的基因的非全长片段连接到TRV2载体上，就可以进行油桐的侵染，不需要周期长的稳定表达步骤和无菌操作，而且能够在短时间内产生表型。本方法简单高效，成本低廉，适合大规模筛选杨树基因的功能。通过这种筛选方式，可以对大量杨树基因的功能进行粗判，为进一步研究这些基因提供依据和方向。

附图说明

图1：TRV2载体图谱；

图2：用带有杨树PDS和CLA1基因序列的病毒（TRV-PtPDS和TRV-PtCLA1）侵染油桐幼叶约20天后，新叶的表现型；

图3：退绿的油桐新叶中油桐PDS和CLA1基因的表达量检测的琼脂糖凝胶电泳结果，在不同循环数下（20-35循环），处理过的植株两种基因的表达量较对照都明显减少；

图4：退绿油桐叶片的叶绿素含量测定，与对照相比，两种基因沉默的叶片叶绿素的含量明显减少。

具体实施方式

本发明一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，包括如下步骤：

a、构建载体：扩增杨树待研究基因片段，与TRV2载体相连接，转化农杆菌GV3101；

b、转化：将转后的阳性农杆菌菌液与TRV1菌液按菌体质量比1︰1混合；

c、转入油桐：通过注射的方法将混合菌液接种在2～3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可；

d、检测：大约2～3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。

TRV病毒的基因组在天然状态下由两条双链RNA组成，RNA1主要为复制酶和转移蛋白的编码序列，RNA2主要为衣壳蛋白的编码序列。在构建此病毒载体时，人为将RNA1和RNA2分别与植物表达载体连接并命名为TRV1和TRV2。当需要沉默某基因时，只需要将此基因部分序列的PCR产物通过TRV2上的多克隆位点与之连接，然后将TRV1和连接目的基因的TRV2分别转入农杆菌GV3101中一起侵染植物。当两种载体都整合到同一个细胞的基因组中，在35S强启动子的启动下转录出病毒的RNA1和RNA2，这样就将被拆分的病毒基因组重新组合到了一起，使病毒回复活性，而带入的目的基因片段通过RNAi使其內源的基因沉默。

下面以毛白杨PtPDS基因和PtCLA1基因为例来说明本发明方法。

实施例1 杨树总RNA提取和反转录合成cDNA

1、杨树总RNA提取

以杨树幼叶为材料，将RNA提取中所用的药勺、杵、研钵等均用95%酒精灼烧至冷却后使用。取石英砂一勺于加热器中加热10min冷却后使用。1.5mL离心管、塑料制品等均使用经RNase处理（RNase Free）的AXYGEN产品。

总RNA提取按照华舜Server-SPIN DNA-free Plant RNA Isolation Kit操作步骤进行：

1）在1.5mL离心管中加入裂解液（500μL RL+100μL 10%PVP+10μL 2-ME）；

2）在液氮冷冻条件下将杨树幼叶（100mg）和石英砂混合快速研成粉末，在液氮完全挥发之前，将粉末全部转移到事先配制好的裂解液中，移液枪快速吹打混匀样品；

3）室温放置5min后，全部移入过滤柱中，13400rpm离心5min，将上清全部移入另一个离心管中；

4）加入上清液一半体积的W3，混匀后，全部移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中，若总体积超过750μL，则分多次上柱；

5）加入400μL RP，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

6）加入400μL W3液，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

7）向吸附膜中央加入40μL DNaseΙ工作液。室温静置15min后，加入200μL RP液。离心1min。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

8）加入600μL W3液，离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；

9）加入250μL W3液，静置1min，离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；

10）将吸附柱移入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜正中央加入50μL纯水，静置1min，离心2min。将RNA轻微混匀后，保存于-70℃备用。

2、杨树总RNA反转录合成cDNA

用TaKaRa One-step RT PCR Kit试剂盒进行反转录，反应体系如表1所示：

表1 反转录的反应体系

反转录的反应程序：37℃，15min；85℃，5s。终止反应后，将反应产物于-20℃储存备用。

实施例2 PCR引物的设计和PCR扩增获得目的片段

1、PCR引物设计

登陆PHYTOZOME（http://www.phytozome.com），查询到杨树PtPDS基因和PtCLA1基因的CDS序列。用DNA Star和Vector NTI8引物设计软件，分别设计了PtPDS和PtCLA1部分序列的特异性引物。

PtPDS片段的上游引物序列为：5′-CCGCTCGAGCTTAGAAGCTGCCTTGTTATC-3′（SEQ ID No.1），划线部分为XhoI识别位点，下游引物序列：5′-CGAGCTCCCATCTTGAGCCTCAACAT-3′（SEQ ID No.2），划线部分为SacI识别位点（目的片段504bp）。

PtCLA1片段的上游引物序列为：5’-CCGCTCGAGTGGGAGAAGAGACAAGATGC-3’（SEQ ID No.4），划线部分为XhoI识别位点，5’-CCGGAATTCACCAAGCACTTCAAAGAGGG-3’（SEQ ID No.5），划线部分为EcoRI识别位点（目的片段511bp）。

引物由华大基因（北京）代为合成。PCR所用反应试剂均为TaKaRa公司产品：dNTPMixture（各2.5mM），Taq DNA聚合酶（5U/μL），附10×PCR Buffer（0.1M Tris-HCl[pH 8.3]),0.5M KCl）和MgCl2（25mM）。

2、PCR扩增获得目的片段

以杨树cDNA为模板扩增PtPDS和PtCLA1基因片段，反应体系见表2。

表2 扩增PtPDS和PtCLA1基因片段的体系

加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。外源基因和内源基因各加样10管。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，34个循环。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带清晰，大小正确，可按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒如下操作步骤，对目的条带进行回收。在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μL体积）。按如下操作进行回收：

①加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后与75℃加热，间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化。

②加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇（加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色）。

③吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

④将制备管置回2mL离心管，加500μLBuffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。

⑤将制备管置回2mL离心管，加700μLBuffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBuffer W2洗涤一次12000rpm离心1min。

⑥将制备管置回2mL离心管，12000rpm离心1min。

⑦将制备管置与1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25～30μLEluent，室温静置1min。12000rpm离心1min洗脱DNA。

实施例3 TRV2-PtPDS和TRV2-PtCLA1载体构建和转化农杆菌GV3101

将扩增片段胶回收之后，PtPDS片段和TRV2载体用XhoI和SacI酶切之后连接，PtCLA1片段和TRV2载体用XhoI和EcoRI酶切之后连接。酶切体系见表3。TRV2病毒载体的图谱见图1。

表3 酶切体系

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR扩增目的基因片段和酶切验证，得到转化子，并保存菌种。

分别提取从阳性转化子大肠杆菌中提取TRV2-PtPDS和TRV2-PtCLA1质粒，步骤按照Plasmid Mini Kit试剂盒提取步骤，具体操作如下：

①取培养至对数期的菌液于EP管中，13400rpm离心1min收集菌体，弃上清。

②加入预冷的已加入RNase A的SolutionI 250μL涡旋重悬菌体混匀。

③加入250μL SolutionII动作轻柔上下颠倒5-6次，混匀后静置2min。

④加入350μL SolutionIII，上下颠倒5-6次至沉淀出现，13400rpm离心10min。

⑤取上清加入吸附柱（约700μL上清），吸附柱放置于2mL的收集管中，10000rpm室温离心1min，弃液。

⑥加入500μL HB Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

⑦加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

⑧重复第7步，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

⑨将吸附柱放于收集管中，空管13400rpm离心2min。

⑩将吸附柱放于另外一支新的离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，静置2min，13400rpm离心1min。于-20℃保存备用。

转化农杆菌的操作如下：

①取5μL TRV2-PtPDS和TRV2-PtCLA1质粒分别于200μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，混匀。

②立即在冰上放置30min，迅速放入液氮2min，37℃水浴5min。

③加入800μL空的YEP液体培养基，混匀后置28℃、200rpm培养4-6h。

④5000rpm离心8min，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却的涂布棒将100μL菌液均匀涂于YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan+50mg/L Gen固体培养基上，28℃条件下倒置培养2d。

⑤将工程菌命名为GV3101-TRV2-PtPDS和GV3101-TRV2-PtCLA1，加15%甘油保存于-80℃，用于后续侵染实验。

实施例4 农杆菌介导的病毒感染

（1）取出保存好的菌种GV3101-TRV2-PtPDS和GV3101-TRV2-PtCLA1，在YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan+50mg/L Gen农杆菌固体培养基上划线长出单菌落后，再挑取单菌落在YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan+50mg/L Gen液体培养基上培养过夜，以此作为一活菌液。与此同时取出TRV1菌种同样按照前面的方法处理获得TRV1一活菌液。

（2）吸取上述两种一活菌液500μL分别于50mL相同的农杆菌液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600为0.6～0.8。

（3）将培养好的菌液倒入50mL已灭菌的离心管中，4℃，4000rpm离心10min，弃滤液。

（4）采用50mL 0.203mg/mL Mgcl₂·6H₂O+MES 2.13g/L+200μmol/LAS液体培养基重悬菌体，28℃，200rpm培养至OD600为1.5左右，重悬时间为4-6h。

（5）最后将两种悬好的菌液按照1:1的比例混匀后，即可用于侵染实验。

（6）选取生长2-3周的种子萌发幼苗作为材料，采用事先已灭菌的注射器在顶端幼嫩的叶片背后及叶脉周围扎些小洞，再用注射器吸取菌液通过压迫法注射入小洞及其周围，待吸收后多打几次。

（7）侵染后的小苗至于25℃暗培养1d，之后取出于25℃，光照时数12h/d条件下培养3-4周后可观察表型的变化。并以侵染空载体的pTRV2幼苗作为阴性对照。

实施例5 油桐内源PDS基因和CLA1基因表达情况分析

选取侵染后的油茶和油桐植株以及对照植株进行总RNA的提取，步骤同前按照华舜ColumnMate Plant RNA Isolation Mini Kit操作手册进行。并进行电泳检测。

为了检测PDS基因和CLA1基因在侵染植株中的表达情况，采用Oligo DT引物按照TaKaRa One-step RT PCR Kit试剂盒进行反转录合成cDNA，反应体系和程序同前。引物序列如下，扩增得到的序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示。PCR反应体系见表4。

PDS-F:5’-CTTAGAAGCTGCCTTGTTATC-3’（SEQ ID No.10）

PDS-R:5’-CACTGTTCCATCATCATTTAG-3’（SEQ ID No.11）

CLA1-F:5’-TGGGAGAAGAGACAAGATGC-3’（SEQ ID No.13）

CLA1-R:5’-ACCAAGCACTTCAAAGAGGG-3’（SEQ ID No.14）

表4 PCR反应体系

PCR反应程序：94℃预变性10min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，分别采用循环数为20、23、26、29、32、35，最后72℃延伸10min。进行电泳检测，结果如图3所示，对照在29个循环时PDS和CLA1基因的片段开始在琼脂糖凝胶上显现荧光，但是TRV-PtPDS和TRV-PtCLA1植株是在32个循环时才能检测到荧光，说明在cDNA浓度相当（以18S为内参照基因，扩增得到序列如SEQ ID No.18）的情况下，TRV-PtPDS和TRV-PtCLA1植株中的PDS和CLA1基因的表达量明显减少。

以18S作为半定量RT-PCR的内参照，PCR反应体系和程序同PDS和CLA1。

18S-F:5’-GAAACACGAAACGAGAAGAG-3’（SEQ ID No.16）

18S-R:5’-GCAATTCACACCAAGTATCG-3’（SEQ ID No.17）

实施例6 沉默组织的叶绿素测定

如图2所示，TRV-PtPDS和TRV-PtCLA1植株和对照相比，新生的叶片发生褪绿的现象，叶片的颜色分布为网状。导致此现象的原因可能是由于叶绿素合成减少，因此为证明此猜想进行了叶绿素含量的测定。

取0.1g退绿的油桐新叶，加入1mL丙酮、少许石英砂和碳酸钙粉末在碾钵中研磨，直至看不到叶肉组织。将磨好的匀浆用滤纸过滤，用80%的丙酮洗脱滤纸，直到不再残留叶绿素，将滤液用80%丙酮定容直100mL，最后测定滤液在OD645和OD653的吸光值。实验重复3次，如图4所示，TRV-PtPDS和TRV-PtCLA1植株和对照相比，叶绿素A、叶绿素B和总叶绿素的含量都有明显减少。

综上实验结果，通过病毒介导的基因沉默，使油桐PDS和CLA1基因受到破坏，其基因编码产物减少，最终致使叶绿素的合成量下降而让叶片显现褪绿的现象。说明PDS和CLA1都是叶绿素合成途径上的关键酶基因。

通过上述实施例也可看出，本发明方法能用于基因功能的研究和预判。

参考文献

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Claims (1)

1.一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、构建载体：扩增杨树待研究基因片段，与TRV2病毒载体相连接，转化农杆菌GV3101；

b、转化：将转后的阳性农杆菌菌液与TRV1菌液按菌体质量比1︰1混合；

c、转入油桐：通过注射的方法将混合菌液接种在2～3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可；

d、检测：大约2～3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。

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