CN102234325A

CN102234325A - 植物低钾敏感型相关的蛋白AtLKR1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102234325A
Application number: CN201010164414XA
Authority: CN
Inventors: 武维华; 刘丽丽; 任慧敏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2030-04-29
Also published as: CN102234325B

Abstract

本发明公开了一种植物低钾敏感型相关蛋白AtLKR1及其编码基因与应用。所述蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低钾敏感型相关的由1)衍生的蛋白质。将本发明的基因AtLKR1在目的植物中过表达后，植物就表现低钾敏感性状，可作为土壤钾指标的指示植物，预警土壤的低钾；反之，将本发明所提供的AtLKR1基因敲除掉或使AtLKR1基因表达量降低，植物就表现耐低钾性状。本发明的基因对培育耐低钾新品种，以及植物对低钾耐受的研究具有重要意义。

Description

植物低钾敏感型相关的蛋白AtLKR1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物低钾敏感型相关的蛋白AtLKR1及其编码基因与应用。

背景技术

钾是植物细胞中最丰富的阳离子之一，也是植物生长所必需的三大营养元素之一，在植物整个生命活动中都起着重要作用。它不仅参与植物的许多生理、生化代谢过程，还通过调控光合作用、呼吸作用和许多酶系统的功能而对植物的生长发育、产量形成等产生重要影响。

在我国限制农作物生产发展的重要因素之一就是我国大部分耕地土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏。尽管提高钾肥施用量可以大幅度地提高作物产量，但大量进口钾肥无论从经济上还是从长远的战略意义上考虑，都有一定的局限性。因此，了解和认识植物对低钾胁迫的反应机制，进而提高农作物的耐低钾能力，已成为如何进一步提高农作物产量的重要研究工作。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种典型的双子叶模式植物，具有个体小、生长周期短、遗传背景简单清楚、易被诱变等特点，其作用与动物实验中的实验鼠、果蝇、线虫等相当，已被广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效方法，而且目前已得到大量的T-DNA插入突变体。通过对突变体的研究，可以较为方便地获得一些有重要应用价值的植物功能基因。

拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到与之同源的序列，有关拟南芥的绝大多数发现也都能应用于其他植物研究。以往的研究已经证明，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。面对土壤缺钾的问题，克隆植物低钾敏感基因能够作为土壤缺钾的一个指标，即时反映土壤中钾的状态；同时可通过抑制低钾敏感基因的表达来培育作物耐低钾新品种，这对作物改良及新品种的培育具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物低钾敏感型相关蛋白AtLKR1及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物低钾敏感型相关蛋白，名称为AtLKR1，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0生态型，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低钾敏感型相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的AtLKR1分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列；为了使1)中的AtLKR1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的AtLKR1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的AtLKR1的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物低钾敏感性相关蛋白的编码基因(命名为AtLKR1)也属于本发明的保护范围。

上述植物低钾敏感性相关蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

序列表中序列1的核苷酸序列由1344个碱基组成，其编码序列为自序列表中序列1的第1-1344位核苷酸，编码具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKR1)。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述AtLKR1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述植物低钾敏感型相关蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有AtLKR1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBIB、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用AtLKR1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Super启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组载体具体为在pCAMBIA1300：Super的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表达载体；所述pCAMBIA1300：Super是将序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子插入pCAMBIA1300的HindIII和XbaI酶切位点间得到的载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育低钾敏感型的转基因植物的方法。

本发明提供的培育低钾敏感型的转基因植物的方法，是将上述的编码基因(AtLKR1基因)转入目的植物中，得到低钾敏感性强于所述目的植物的转基因植物。

携带有本发明的AtLKR1基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

具体地，上述的编码基因通过上述的重组表达载体导入所述目的植物中的。

上述目的植物可以是双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥。

本发明的另一目的在于提供培育耐低钾胁迫的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐低钾胁迫的转基因植物的方法是将所述的基因(AtLKR1)在目的植物体内敲除或抑制目的植物体内基因(AtLKR1)的表达后，得到的耐低钾胁迫性高于所述目的植物的转基因植物。

上述目的植物可以为双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥。

实验证明：将本发明的基因AtLKR1在目的植物中过表达后，植物就表现低钾敏感性状，可作为土壤钾指标的指示植物，预警土壤的低钾；反之，将本发明所提供的AtLKR1基因敲除掉或使AtLKR1基因表达量降低，植物就表现耐低钾性状。本发明的基因对培育耐低钾新品种，以及植物对低钾耐受的研究具有重要意义，如利用本发明的基因可设计小干扰RNA对该基因的表达进行干扰、插入突变该基因或者缺失突变该基因，从而提高植物对低钾的耐受能力。

附图说明

图1是AtLKR1T-DNA插入突变体插入示意图及基因敲除鉴定，(A)AtLKR1基因结构图：实心盒为外显子，线条为内含子，数字为核苷酸，1为转录起始点，突变体中的T-DNA插入位置已用箭头指出；(B)Northern blots鉴定突变体lkr1-a、lkr1-b中AtLKR1的表达情况。

图2是lkr1突变体表型检测，是Col、lkr1-a、lkr1-b在MS培养基和LKLN培养基上生长10天后的表型比较。

图3是Col、lkr1-a和lkr1-b突变体在不同钾浓度条件下表型检测。

图4是AtLKR1恢复突变材料表达量鉴定及低钾条件下表型检测，(A)Col、lkr1-a突变体、AtLKR1恢复突变材料(com-1和com-4)在MS培养基和LKLN培养基上生长12天后的表型比较；(B)RT-PCR鉴定AtLKR1恢复突变材料。

图5是AtLKR1过表达材料鉴定及低钾条件下表型检测，(A)Col、lkr1-a突变体、AtLKR1过表达材料(OE-5和OE-9)在MS培养基和LKLN培养基上生长10天后的表型比较；(B)Northern blots鉴定AtLKR1过表达材料。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、与植物钾营养相关的蛋白及其编码基因的获得

提取7天拟南芥(Columbia型又称Col-0生态型)(购自美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))幼苗的总RNA、用Takara公司的DNA酶消化RNA中的DNA，用消化后产物进行反转录得到cDNA。以此cDNA为模板、利用分别设有Xba I/EcoR I和Sac I/Sal I酶切位点的一对引物进行PCR扩增，得到与钾营养相关基因的CDS全长。引物序列如下：

Primer1：5′-AAtctagagaattcATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3′(Xba I/EcoR I)

Primer2：5′-GAgagctcgtcgacTTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3′(Sac I/Sal I)

采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5.0μL，10mM dNTP mix 1.0μL，引物各1.0μL，Pyrobest酶0.5μL，模板3.0μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，60℃30s，72℃1.5min，循环数30个，72℃延伸10min。

将扩增片段用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，为本发明的调控植物响应低钾胁迫CDS基因命名为AtLKR1，序列表中序列1的核苷酸序列由1344个碱基组成，其编码序列为自序列表中序列1的第1-1344位核苷酸，编码具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKR1)。将上述获得的正确的含有AtLKR1的重组载体命名为pMD18-AtLKR1。

实施例2、与植物钾营养相关的蛋白及其编码基因的功能验证

一、突变体的鉴定

从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得到编号为SALK 058629(lkr1-a)和SALK_014699(lkr1-b)的T-DNA插入突变体。其各自DNA水平的鉴定引物为

SALK_058629LP：5-TGCCAAGTGAAAAATATAATGGCA-3，

RP：5-CGTCACAAAATGGTCGAACAGG-3

SALK_014699LP：5-TTCAAACCGAGTTTGAGGATG-3

RP：5-TATCCATGAACGCTTTCGAAC-3

为了进一步确定其转录水平上是否敲除，我们将拟南芥野生型(Columbia型)和突变体lkr1材料(lkr1-a和lkr1-b)布在MS培养基上生长一周，取样(约100mg)提取RNA。

正常MS培养基组成为：每升溶液含1650mg NH₄NO₃，1900mg KNO₃，370mgMgSO₄·7H₂O，170mg KH₂PO₄，440mg CaCl₂·2H₂O，22.3mg MnSO₄·4H₂O，0.83mg KI，0.025mg CuSO₄·5H₂O，6.25mg H₃BO₅，0.025mg CoCl·6H₂O，8.65mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，27.8mg FeSO₄·7H₂O，37.3mg Na₂EDTA。拟南芥种子在MS上培养条件采用全日照光照培养，温度22℃，光强100μmol/(m²*s)。

RNA提取方法按Invitrogen Trizol Reagent的产品说明书进行。经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。用紫外分光光度计和电泳方法相结合作精确定量。

然后进行如下操作：

(1)配制1.2％(w/v)琼脂糖的甲醛变性凝胶：1.2g琼脂糖，10ml 10×MOPS缓冲液，75ml DEPC-H₂O，加热融化后冷至50-60℃时加入15ml甲醛；混匀后灌胶；凝胶室温放置约1小时后放入1×MOPS电泳缓冲液中，上样前预电泳30分钟(60V)；

(2)RNA样品处理：10-30μg总RNA，加2倍体积(v/v)的RNA loading buffer，混匀后65℃加热5-10分钟，置于冰上3-5分钟；

(3)电泳：在1×MOPS电泳缓冲液中进行电泳分离；电压10V/cm，电泳至溴酚篮距边缘约2cm处停止，约需2小时；

(4)凝胶扫描及浸泡：紫外灯下扫胶，然后切去多余的边缘胶条；用250ml 10×SSC浸泡凝胶两次以洗去甲醛，每次20分钟，浸泡完毕可直接转膜。

(5)转膜：在磁盘中加入10×SSC溶液250mL，架一块玻璃板，在上方放一层宽于凝胶的滤纸，两头浸入液体中，滤纸与玻板间不能有气泡，将凝胶倒扣于滤纸上排尽气泡，用parafilm封好胶块四周；剪取与胶大小一致的尼龙膜，在10×SSC中润湿，铺于胶上，再依次加3张滤纸、数层吸水纸，其上压一块玻璃板及重物；以10×SSC为转移液，利用毛细管转移法转膜1～2天。

转膜完毕后，在膜上标记加样孔位置，用2×SSC漂洗尼龙膜，取出用滤纸吸干或晾干；将尼龙膜包在滤纸中于80℃烘1～2h以使DNA与杂交膜紧密结合，之后用于分子杂交。

(6)探针纯化及标记：PCR扩增目的基因的特异性片断(500bp左右)，经纯化试剂盒纯化后，定量备用。

LKR1 probe(495bp)引物：F：5’-AAATGGAAGAAACCGCAAAGC-3’

R：5’-TTTCAAACCGAGTTTGAGGA-3’

探针标记按Amersham Biosciences的Rediprime^TM II Random Prime LabellingSystem试剂盒说明进行。在PCR反应管中加入25ng纯化的目的片段，加pH 8.0的TE buffer至45μl，95℃变性5min，迅速放于冰上冷却；将变性后的cDNA加入到Amersham公司的探针标记反应管中，到同位素室加入40～50μCi³²P-dCTP反复吹吸12次，37℃水浴反应2h以上。

(7)预杂交与杂交：将杂交膜放入杂交管中，带有RNA的一面向里，加入7～15mL预热到65℃的Church缓冲液，65℃预杂交4～5h；

将标记好的探针沸水中变性15min，冰上迅速冷却5min；弃去管中Church，重新加入7-8mL Church，加入变性好的探针，65℃杂交16h以上。

(8)洗膜；杂交结束后，分别用2×SSC+0.5％(w/v)SDS，1×SSC+0.5％(w/v)SDS，0.5×SSC+0.5％(w/v)SDS在65℃下洗膜(可据实际情况确定洗膜的次数)，每次15min，并不断用monitor检测信号。

(9)放射自显影：

洗膜完毕后，用保鲜膜包好，放入暗盒，压磷屏，1-2天后扫磷板。如要更换探针杂交，之前先用0.1-0.5％(w/v)SDS煮膜15min，2×SSC漂洗10min再进行后面的杂交。

经Northern杂交分析，结果如图1所示，AtLKR1的突变体lkr1-a和lkr1-b在转录水平上均被敲除。

二、突变体的表型检测

1、突变体在LKLN(低钾低铵)培养基上的表型观察：

1L的LKLN培养基的配置方法：370mg MgSO₄·7H₂O，144mg NH₄H₂PO₄，706mgCa(NO₃)₂·4H₂O；22.3mg MnSO₄·4H₂O，0.83mg KI，0.025mg CuSO₄·5H₂O，6.25mgH₃BO₅，0.025mg CoCl·6H₂O，8.65mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，27.8mgFeSO₄·7H₂O，37.3mg Na₂EDTA，用电阻大于16MΩ的双蒸水定容至1L。pH为5.70-5.75，LKLN培养基中钾浓度70-100μmol/L，相当于7.077-10.11mg的KNO₃，该钾来源于广东汕头琼脂粉中的钾。

萌发条件表型筛选：将春化好的种子播于正常MS和LKLN培养基上，生长大约10天左右，拟南芥种子培养条件采用全日照光照培养，温度22℃，光强100μmol/(m²*s)。

结果如图2所示，由于受到低钾胁迫野生型出冠部开始表现发黄的缺钾症状，而两个突变体株系lkr1-a和lkr1-b冠部仍保能保持绿色，说明AtLKR1参与了低钾通路，是低钾敏感基因。

2、不同钾浓度条件下表型检测

设置如下的培养基：在LKLN基础上添加不同浓度的KNO₃(分别是100uM，200uM，2000uM)，其余成分不变。

将lkr1-a、lkr1-b和野生型拟南芥种子播在上述的不同钾浓度的培养基中培养，培养条件是日照光照培养，温度22℃，光强100μmol/(m²*s)。结果如图3所示，从左往右图中添加的KNO₃依次是10.11mg、20.22mg、202.2mg，随着钾浓度的升高，突变体和野生型之间的差异就逐渐消失了，说明了该基因主要是在低钾条件下起作用，所观察到的表型是依赖于钾浓度的。

三、恢复突变体的表型检测

1、恢复突变体的构建

提取10天拟南芥(Columbia型)幼苗的总DNA，以此DNA为模板、利用一对引物进行PCR扩增，得到相关基因的Promoter序列。引物序列如下：

Primer1：5′-ATaagcttTACTAAAACGGCAAATACTAAAC-3′(HindIII)

Primer2：5′-ACggatccTTTCTTTTTCCGATTAAGAAA-3′(BamH I)

采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5.0μL，10mM dNTP mix 1.0μL，引物各1.0μL，Pyrobest酶0.5μL，模板3.0μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，56℃30s，72℃2min，循环数30个，72℃延伸10min。

对PCR产物进行测序，得到1749bp的核苷酸片段我们将其命名为proAtLKR1。将为proAtLKR1连接到pMD18-T载体得到的重组载体命名为pMD18-proAtLKR1。

将以上所获得的含有AtLKR1基因的重组载体pMD18-proAtLKR1和载体pCAMBIA1300，同时用内切酶HindIII和BamH I进行大体系酶切。将所切得的proAtLKR1基因片段和线性化的pCAMBIA1300质粒片段进行回收，连接，并酶切验证，即获得验证正确的含有pAtLKR1基因的重组载体并将其命名为proAtLKR1-pCAMBIA1300。

将实施1获得的含有AtLKR1基因CDS序列的重组载体pMD18-AtLKR1和上述获得的重组载体proAtLKR1-pCAMBIA1300同时用内切酶BamH I和Sac I进行大体系酶切。将所切得的AtLKR1基因CDS片段和线性化的proAtLKR1-pCAMBIA1300质粒片段进行回收，连接，并酶切验证，即获得验证正确的含有AtLKR1基因Promoter和CDS的重组载体并将其命名为AtLKR1-pCAMBIA1300。

将AtLKR1-pCAMBIA1300利用农杆菌转化侵染突变体植株lkr1-a，从而获得AtLKR1恢复突变材料T1代。经过在含50μg/L潮霉素的MS培养基上筛选转AtLKR1-pCAMBIA1300拟南芥阳性植株并进行分离比统计，在T3代即得到转AtLKR1-pCAMBIA1300拟南芥单拷贝纯合株系，即AtLKR1恢复突变株系AtLKR1-pCAMBIA1300-1和AtLKR1-pCAMBIA1300-4，简写为com-1和com-4。

2、拟南芥野生型(Columbia型)、恢复突变材料种子(com-1，com-4)和lkr1-a突变体的分子检测以及表型观察

将拟南芥野生型(Columbia型)、恢复突变材料种子(com-1，com-4)和lkr1-a突变体分别布在MS培养基上生长一周，取样(约100mg)提取RNA。按照SUPERSCRIPTII的使用说明，合成cDNA。

设计引物进行定量PCR扩增检测转录水平上是否将AtLKR1的表达水平恢复到野生型状态。所用引物是：

Primer1：5’-catat gATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3’，

Primet2：5’-ctcgag TTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3’

基因的扩增条件如下：将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20L体系，内含10×PCR Buffer 2L，2.5mM dNTP mix 0.4L，10M Primer1和Primer2各0.4L，Taq enzyme(15U/uL)0.1L。在PE9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，57℃30s，72℃3min10s，共计30个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(3092bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

EF基因为内标基因，作为对照，其引物是：

EF-F：5’-ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’

EF-R：5’-TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3’。

其扩增方法为：将上述合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20L体系，内含10×PCR Buffer 2L，10mM dNTP mix 0.4L，10M EF-F和EF-R各0.4uL，Taq enzyme(15U/uL)0.1uL。在PE9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，共计20个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(685bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

结果表明如图4B，在com-1、com-4和Col中都能检测到AtLKR1的表达，而在lkr1-a突变体中没有检测到该基因的表达，且com-1、com-4中AtLKR1的表达量和Col中AtLKR1的表达量基本相同。

将经检测过的材料种子(Col，com-1，com-4，lkr1-a)低温处理3天后播于正常MS和LKLN培养基上，生长大约10天左右，如图4A，可以看出com-1和com-4将lkr1-a突变体冠部耐低钾的表型恢复了，和野生型没有明显区别，说明lkr1-a突变体冠部较野生型耐低钾的表型确实由于AtLKR1的缺失所以起的。

四、AtLKR1过量表达植株(Super：AtLKR1-9和Super：AtLKR1-5)的获得

1、中间载体pCAMBIA1300：Super的构建

利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT和tctagaCTAGAGTCGATTTGGT从质粒pMSP-1(GenBank号为EU181145)中扩增出核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子的Super启动子序列；将扩增得到的Super启动子用HindIII和XbaI双酶切，回收Super启动子片段，插入到质粒pCAMBIA1300(GenBank号为FJ362601)的HindIII和XbaI酶切位点之间中，得到pCAMBIA1300：Super质粒。

2、Super：AtLKR1的构建

将实施例1获得的含有AtLKR1基因的重组载体pMD18-AtLKR1和上述步骤1获得的中间载体pCAMBIA1300：Super，同时用内切酶XbaI和Sac I进行大体系酶切。将所切得的AtLKR1基因片段和线性化的pCAMBIA1300：Super质粒片段进行回收，连接，并酶切验证，即获得验证正确的含有AtLKR1基因的重组载体并将其命名为Super：AtLKR1。

将Super：AtLKR1利用农杆菌转化侵染Columbia野生型拟南芥植株。从而获得AtLKR1过量表达T1代转Super：AtLKR1拟南芥植株。经过在含50μg/L潮霉素的MS培养基上筛选转Super：AtLKR1拟南芥阳性植株并进行分离比统计，在T3代即得到转Super：AtLKR1拟南芥单拷贝纯合株系，即AtLKR1过量表达株系Super：AtLKR1-5和Super：AtLKR1-9，简写为OE-5和OE-9表示。

将野生型拟南芥(Columbia型)、AtLKR1过量表达植株(Super：AtLKR1拟南芥单拷贝纯合株系，名称为Super：AtLKR1-5和Super：AtLKR1-9，即OE-5和OE-9)种子在MS培养基萌发生长，培养条件采用全日照光照培养，温度22℃，光强100μmol/(m²*s)。取生长7天的上述材料约100mg提取RNA。RNA提取方法及检测、Northern杂交方法和所用目的基因探针引物同实施二。

经Northern杂交分析，OE-5和OE-9中基因的表达水平明显高于野生型，如图5B所示。

五、过表达株系、突变体、野生型、在低钾条件下的表型观察

将野生型(Columbia型)、lkr1-a突变体种子和经过检测的AtLKR1过表达植株OE-5和OE-9的种子低温处理3天后播于正常MS和LKLN培养基上，生长大约10天左右观察性状。表型分析结果表明如图5A，过表达材料冠部较野生型敏感，表现为冠部发白，而突变体冠部则表现出较野生型耐低钾的表型。

序列表

<110>中国农业大学

<120>植物低钾敏感型相关的蛋白AtLKR1及其编码基因与应用

<160>4

<210>1

<211>1344

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atgagtggaa gcagaaggaa ggcgacgccg gcgagtagga cgcgagtagg gaattacgag 60

atgggacgaa ctctcggaga aggaagcttc gctaaggtga aatacgccaa gaacaccgtc 120

accggagatc aagccgctat caaaatcctc gaccgagaaa aggtcttccg tcacaaaatg 180

gtcgaacagc ttaaaagaga aatatctaca atgaaactga ttaaacatcc aaatgtggtt 240

gaaatcattg aggttatggc gagcaaaacg aagatctata tcgttcttga gcttgtcaat 300

ggaggtgaac tctttgataa aatcgcgcaa caagggaggc ttaaggagga tgaagctcgg 360

agatattttc agcagctcat caatgctgtg gattactgcc acagtcgagg tgtctaccac 420

agagatctca agcctgaaaa tctgatcctt gacgcaaatg gggttttgaa agtctctgat 480

tttgggttaa gcgccttctc acgacaagtt cgggaagatg gtttgcttca tacagcttgt 540

ggaacgccaa actacgttgc ccctgaggtt ttgtcggaca aaggctatga cggtgcagca 600

gcagatgtct ggtcttgtgg tgtcattctc tttgtgctta tggctggtta cttgcctttt 660

gatgagccga atctcatgac attatacaaa cgtatatgca aggctgagtt tagctgccca 720

ccatggttct cgcaaggtgc caagagagtc atcaagcgta ttctcgaacc caaccctatt 780

accagaataa gtattgcaga gttgctcgaa gatgaatggt tcaagaaagg gtacaagccg 840

ccatcatttg accaagatga cgaggacata accatagatg atgttgatgc tgcttttagt 900

aactccaagg aatgtcttgt aactgagaag aaggagaaac ctgtatccat gaacgctttc 960

gaacttatct ctagctcaag cgagttcagt cttgaaaact tgttcgagaa gcaagcgcaa 1020

cttgtgaaga aagaaacgcg gtttacttct caacgatctg cgagtgaaat aatgtcgaaa 1080

atggaagaaa ccgcaaagcc attaggcttt aatgtccgta aagacaacta caagataaaa 1140

atgaaaggag acaaaagtgg tcgtaaaggt cagctctccg tagctacaga ggtgtttgaa 1200

gtggcgccat cattgcatgt ggtagagctt aggaaaaccg gtggtgatac cctcgagttt 1260

cacaagttct acaaaaactt ctcatctgga ttaaaggatg tagtctggaa tactgatgca 1320

gccgctgaag aacaaaagca ataa 1344

<210>2

<211>447

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Ser Gly Ser Arg Arg Lys Ala Thr Pro Ala Ser Arg Thr Arg Val

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Glu Met Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ala Lys

20 25 30

Val Lys Tyr Ala Lys Asn Thr Val Thr Gly Asp Gln Ala Ala Ile Lys

35 40 45

Ile Leu Asp Arg Glu Lys Val Phe Arg His Lys Met Val Glu Gln Leu

50 55 60

Lys Arg Glu Ile Ser Thr Met Lys Leu Ile Lys His Pro Asn Val Val

65 70 75 80

Glu Ile Ile Glu Val Met Ala Ser Lys Thr Lys Ile Tyr Ile Val Leu

85 90 95

Glu Leu Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys Ile Ala Gln Gln Gly

100 105 110

Arg Leu Lys Glu Asp Glu Ala Arg Arg Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Asn

115 120 125

Ala Val Asp Tyr Cys His Ser Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys

130 135 140

Pro Glu Asn Leu Ile Leu Asp Ala Asn Gly Val Leu Lys Val Ser Asp

145 150 155 160

Phe Gly Leu Ser Ala Phe Ser Arg Gln Val Arg Glu Asp Gly Leu Leu

165 170 175

His Thr Ala Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Ser

180 185 190

Asp Lys Gly Tyr Asp Gly Ala Ala Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val

195 200 205

Ile Leu Phe Val Leu Met Ala Gly Tyr Leu Pro Phe Asp Glu Pro Asn

210 215 220

Leu Met Thr Leu Tyr Lys Arg Ile Cys Lys Ala Glu Phe Ser Cys Pro

225 230 235 240

Pro Trp Phe Ser Gln Gly Ala Lys Arg Val Ile Lys Arg Ile Leu Glu

245 250 255

Pro Asn Pro Ile Thr Arg Ile Ser Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asp Glu

260 265 270

Trp Phe Lys Lys Gly Tyr Lys Pro Pro Ser Phe Asp Gln Asp Asp Glu

275 280 285

Asp Ile Thr Ile Asp Asp Val Asp Ala Ala Phe Ser Asn Ser Lys Glu

290 295 300

Cys Leu Val Thr Glu Lys Lys Glu Lys Pro Val Ser Met Asn Ala Phe

305 310 315 320

Glu Leu Ile Ser Ser Ser Ser Glu Phe Ser Leu Glu Asn Leu Phe Glu

325 330 335

Lys Gln Ala Gln Leu Val Lys Lys Glu Thr Arg Phe Thr Ser Gln Arg

340 345 350

Ser Ala Ser Glu Ile MET Ser Lys Met Glu Glu Thr Ala Lys Pro Leu

355 360 365

Gly Phe Asn Val Arg Lys Asp Asn Tyr Lys Ile Lys Met Lys Gly Asp

370 375 380

Lys Ser Gly Arg Lys Gly Gln Leu Ser Val Ala Thr Glu Val Phe Glu

385 390 395 400

Val Ala Pro Ser Leu His Val Val Glu Leu Arg Lys Thr Gly Gly Asp

405 410 415

Thr Leu Glu Phe His Lys Phe Tyr Lys Asn Phe Ser Ser Gly Leu Lys

420 425 430

Asp Val Val Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ala Glu Glu Gln Lys Gln

435 440 445

<210>3

<211>1749

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

tactaaaacg gcaaatacta aaccctgaaa ggaaactgtg tgagaaacag ttaggcccct 60

tgaccatctt tgttcaacgt tgtcaacgaa aaaaaaatgg aaccataaag gataattaat 120

tgtatcacaa aaagacaaac acaaattatt gaatatacca tcacttatca gtatataatt 180

ttatacaaat gctttaaata acaaatatta tgtagaaaaa gagaaaagaa acttaacttg 240

gtcaatttga tcatttgtgt aaacgatgat gcggaacata tgcgataata atgttattgg 300

atggcaaaaa aaaaaaaaag tattttagtt gggccctaat gttaattcac aatcaagcct 360

aaatttggtt aatgggccaa tctttcttat atatgtagga ctcggatgtt cggtctactc 420

gaactatcta caaaccaagc taaaccgaaa gtaaatacaa aatcaaacca aataatagtt 480

tggtttatat aggttttaaa ttttaatcca tataatccaa taagttccaa ctcataacca 540

ggaaaataaa aaaaatgtgg aatgaagaag ttcaaattga taaccaaatg aattgctttc 600

atatgatggt gacgtgatgt ttttgtaccg gactcaatta ttggaacgag tggttcattg 660

tgcattattt gcattttctt ttgttcgtaa tatactaaca tatctaaaaa attattgtat 720

cattattact agtcatgcaa taaatcatca actcacactg tctgccacac ttttttaatt 780

tttctgcgta ttttggcatt atcatatgaa agaaaataag agaaacaaat aaaggaaaga 840

agaaaaataa aaacattatc acattctgtg aaatctctga gtttatcagg aaggatatgt 900

ggggttcata ttcataccgt tccctttact cacatcgtca catggaaaga tcaactattt 960

caattatcta tttatttatt atcatatact ttaaataatc aaatttagaa ccgttacaaa 1020

caaaaataaa cagctacatc aaatttaaac aaaagtaagt atatgcgaat attatcatag 1080

atttaaacaa aatttgacca agatataaca atcatcattt aactaccaac atttgatata 1140

tgtatttatt gttcttaggt agtttccaac ttctaactaa agacaaaaaa aaaagttata 1200

tttagagaat atttctacat gaaaagaata caactatatc aaataatatg ataacagtca 1260

actttgaaca tcagtagaat ggaatgaatc actgaaagat atactcatat acacataaag 1320

attaaggaca tcaaatcaca tcccttacaa ataaaaccat atccacataa atttaaaacc 1380

ccaaaatttt cataaaatcc atatacttaa acaggagttt ctgtatatag ttaccacaca 1440

agaacaaaat tatggaattt ttttatatga atgaagaatg aacgttacga acgtacacaa 1500

gtacaaataa cacgggactg acgcggaaca gagcaaaata atgatttttg acattacgtg 1560

gcatacggga cccacaatac gcgcgtgact cccagtcgcg cctattaaat ctctcgctcg 1620

tccactttct ctcgtcagcc ttaaaaccag gcagccacta gaagaaggag agatattgag 1680

ggagaagaat cacattgata gattcgccgc cgatctagag ccgttgattt tcttaatcgg 1740

aaaaagaaa 1749

<210>4

<211>1112

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ggatccctga aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct tatcgaccat 60

gtacgtaagc gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg ttgtgggcct 120

gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc atcgcaccgg 180

tgagtaatat tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag gatccctgaa agcgacgttg 240

tgttaacatc tacaaattgc cttttcttat cgaccatgta cgtaagcgct tacgtttttg 300

gtggaccctt gaggaaactg gtagctgttg tgggcctgtg gtctcaagat ggatcattaa 360

tttccaccta cgatgggggg catcgcaccg gtgagtaata ttgtacggct aagagcgaat 420

ttggcctgta ggatccctga aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct 480

tatcgaccat gtacgtaagc gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg 540

ttgtgggcct gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc 600

atcgcaccgg tgagtaatat tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag gatccgcgag 660

ctgctcaatc ccattgcttt tgaagcagct caacattgat ctctttctcg atcgagggag 720

atttttcaaa tcagtgcgca agacgtgacg taagtatccg agtcagtttt tatttttcta 780

ctaatttggt cgtttatttc ggcgtgtagg acatggcaac cgggcctgaa tttcgcgggt 840

attctgtttc tattccaact ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt tgaatagata 900

cgctgacacg ccaagcctcg ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta cagcaagaac 960

ggaatgcgcg tgacgctcgc ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg ataaatagcc 1020

ttgcttccta ttatatcttc ccccaaatta ccaatacatt acactagcat ctgaatttca 1080

taaccaatct cgatacacca aatcgactct ag 1112

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中的序列1；

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的构建方法是：将权利要求2-4中任一所述的基因插入pCAMBIA1300：Super载体的XbaI和KpnI酶切位点之间构成的重组表达载体；

所述pCAMBIA1300：Super载体的是将核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子插入pCAMBIA1300质粒的HindIII和XbaI酶切位点之间构成的载体。

6.一种培育低钾敏感型的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到低钾敏感性强于所述目的植物的转基因植物。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述目的植物优选为拟南芥。

9.一种培育耐低钾胁迫的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的基因在目的植物体内敲除或抑制目的植物体内权利要求2或3所述的基因的表达后，得到的耐低钾胁迫性高于所述目的植物的转基因植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为拟南芥。