KR101352035B1 - 벼도열병 저항성 ＯｓＡＢＰ57 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼도열병 저항성 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 벼도열병 저항성 단백질의 세포내 수준을 조절하여 식물의 벼도열병 저항성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 벼를 포함하는 식물을 벼도열병 저항성 품종육성으로 개발 가능하며 이로부터 농약사용절감과 함께 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

Description

벼도열병 저항성 ＯｓＡＢＰ57 유전자 및 이의 용도{OsABP57 gene enhancing resistance to Magnaporthe oryzae and use thereof}

본 발명은 벼도열병 저항성 유전자 및 이의 용도에 관한 발명이다.

벼는 종자 생산이 목적인 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나이나, 벼에는 60 여종 이상의 각종 병해가 발생하고 있고, 해에 따라서 그 피해가 극심할 경우 50~90%의 감수를 가져 오기도 한다. 이와 같은 피해는 인류의 안정적 식량 확보의 가장 큰 장애로 대두 되어왔고, 일례로 우리나라의 경우에도 1978년에 통일계 품종에 벼 이삭 도열병이 발생하여 식량안보 차원에서 심각한 문제를 일으키고 그 결과로 대량의 쌀을 외국에서 도입하게 되는 등 한동안 사회문제가 된 바 있다.

벼도열병은 Magnaporthe oryzae에 의하여 유발되는 병이다. 병원균인 Magnaporthe oryzae는 불완전균류에 속하며 분생포자를 형성하는데, 균사 발육 온도는 16~40℃이고 최적 온도는 27~29℃이다. 분생포자의 발아 최적온도는 25~28℃이다. 도열병균은 피해 짚의 목 가지 마디에서 균사의 상태로 월동하거나, 잡초에서 월동한 후 다음해 전염원이 된다. 일단 벼도열병균의 분생자경이 형성되고 분생포자 형성, 분생포자 이탈, 분생포자의 비산, 식물체에의 부착, 발아, 부착기형성,침입, 병반형성의 과정을 거친다. 병발생 환경을 살펴보면 온도는 27~29℃와 90%이상의 습도에서 발병률이 높다.

벼도열병균을 포함한 병해충 방제를 위한 노력의 일환으로, 종래 인공 합성된 농약을 개발하여 방제에 이용하는 방법이 주로 이용되어 왔다. 그러나 인구의 끊임없는 증가로 인해 더 많은 양의 식량 확보가 필요하게 되면서 이를 위한 대량재배는 병해충의 대량발생으로 이어지고, 이들의 방제를 위한 합성 농약의 남용으로 인해 자연 생태계의 파괴는 물론 잔류독성, 인축에 대한 독성, 약제 내성인 새로운 병해충의 출현 등의 문제가 야기되었다. 아울러, 이를 대체하기 위하여 신농약(저독성농약, 야생형물농약 또는 생물농약)의 개발을 위한 연구가 진행되고 있으나 그 개발속도가 수요를 충족시키지 못하고 있다. 또한, 환경보호운동과 오염되지 않은 청정농산물을 취하려는 인류의 성향은 인축에 해가 없고 잔류독성이나 자연생태계 파괴의 우려가 없는 새로운 방법을 절실히 요구하고 있다.

이에, 유전공학기술이 발달되면서 병 저항성 형질전환 식물이 농약을 적게 사용하면서도 안정적인 식량작물을 생산할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 식물의 병 저항성 기작을 연구하여 인축 및 환경에 독성이 없는 새로운 개념의 식물보호제를 개발하려는 시도가 선진국을 중심으로 이루어지고 있다.

이러한 경향의 일환으로, 벼도열병에 대한 저항성을 증진시키는 유전자가 밝혀졌으며, 예컨대 벼 유래 OsCK1 유전자(특허 등록번호 제10-0682129호), Pi5-1 단백질(특허 등록번호 제10-099037호), 및 OsLRP (Oryza sativa Leucine Rich Repeat protein) 유전자(특허 등록번호 제10-0803393호)가 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자인 OsABP ₅₇ 유전자에 대해서는 개시된 바 없다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, OsABP ₅₇ 유전자를 이용하여 벼를 포함하는 식물에서의 도열병 저항성 작물 개발을 통해 농약사용절감과 함께 이로 인한 생산성 향상 및 안전한 농산물공급을 가능하게 하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 OsABP ₅₇ 유전자 및 이의 용도를 제공하는 바, 보다 상세하게는 벼(Oryza sativa)에서 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시킴으로써 식물의 벼도열병 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

이하. 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 벼도열병 저항성 단백질에 관한 것이다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 벼도열병에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OsABP₅₇ 단백질의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsABP₅₇의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 OsABP₅₇ 단백질과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 OsABP₅₇의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 OsABP₅₇ 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 OsABP₅₇ 단백질을 암호화하는 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 OsABP₅₇ 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 과발현 재조합 발현 벡터인 pABP₅₇_OE와 발현억제 벡터인 pABP₅₇_RNAi는 gateway system을 이용하여 제작하였다(도 1 참조). 벼의 Cytochrome C 프로모터와 3' pinII terminator를 이용하였으며, 선택 마커(selection marker)로는 Bar 유전자를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.

상기 식물은 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스, 옥수수, 양파, 파, 부추, 마늘, 택사, 지모, 천문동, 은방울꽃, 패모, 맥문동, 진황정, 여로, 대나무, 호접란(phalaenopsis spp), 춘란(Cymbidium goeringii), 양란(Cymbidium ssp), 덴파레(Dendrobium phalaenopsis), 풍란(Neofinetia falcata), 나도풍란(Aerides japonicum) 카틀레아(Cattleya ssp), 온시디움(oncidium ssp), 브라시아(Brassia ssp), 반다(Vanda ssp), 파피오페딜럼(Paphioedilum ssp), 말토니아(Miltonia ssp) 및 한란(Cymbidium Kanran) 등의 식물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 재조합 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하였으며, 벼에 접종하여 ABP₅₇ 유전자의 과발현체와 발현억제체를 각각 제작하였다.

다른 양태로, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물의 벼도열병 저항성을 조절하는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물의 벼도열병 저항성을 향상시키는 방법 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물 벼도열병 저항성이 향상된 식물에 관한 것이다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 OsABP57 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 OsABP57 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1의 OsABP57 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, M1 RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형 또는 머리핀(hairpin) 형　또는　microRNA　형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 유전자에 대한 안티센스 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 OsABP ₅₇ 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 형질전환킴으로써 OsABP ₅₇ 의 세포내 발현 수준을 증가시켰다. 그리고 이러한 OsABP ₅₇ 의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과 OsABP ₅₇ 의 과발현이 벼도열병에 대한 저항성을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

OsABP ₅₇ 유전자를 이용한 형질전환 식물의 벼도열병에 대한 저항성을 이용하여, 벼를 포함하는 식물을 벼도열병 저항성 품종육성으로 개발 가능하며 이로부터 농약사용절감과 함께 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 OsABP ₅₇ 유전자의 발현 조절 운반체 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 OsABP ₅₇ 유전자에 의한 도열병 저항성 변화를 평가한 사진 및 그래프이다.
도 3은 형질전환벼에서 OsABP ₅₇ 유전자 및 PR1b의 도열병 접종 전 및 후의 발현 변화 (RT-PCR)를 나타내는 사진 결과이다. 도 3에서 dpi는 days post inoculation를 의미한다.
도 4는 형질전환벼에서 OsABP ₅₇ 유전자 및 PR1b의 도열병 접종 전 및 후 발현 변화 (Real Time PCR)를 나타내는 그래프이다.

이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, OsABP ₅₇ 유전자 발현 조절에 따른 도열병 저항성 변화를 하기와 같은 방법으로 평가하였다.

1. 접종

형질전환 모본인 낙동에 친화적인 도열병균 Magnaporthe oryzae KJ201과 KJ401을 접종원으로 이용하였다. 각 균주를 oatmeal 배지에 접종한 후 22℃, 광조건에서 2주간 배양하여 분생포자생성을 유도하였다. 멸균수를 배지에 붓고 loop로 긁은 다음 miracloth로 걸러 균사체가 제거된 분생포자 현탁액을 제조한 후 포자농도를 2 × 10⁵/ml로 적정한 후 Tween20으로 250 ppm이 되도록 가하였다. 6주간 기른 낙동과 각 형질전환체들의 표면이 포자현탁액에 고루 덮이도록 분무접종한 후 25℃, 100% 상대습도에서 20시간 동안 방치하였다. 병 진전을 매일 관찰하였고 낙동의 이병율이 70 - 80%가 되었을 때 형질전환체의 병 진전율을 국제미작연구소의 기준에 따라 0 - 9 스케일(scale)로 관찰하였다. 각 식물체는 라인마다 20개 이상을 사용하였으며 최소 3회 이상 접종실험을 반복하였다. 접종 실험 결과 OsABP₅₇ 과발현 2개 라인(line)에서는 친화적인 2개 균주 모두에 강한 저항성이 관찰되었고 RNA 간섭을 이용하여 OsABP₅₇ 발현을 억제한 형질전환 라인들은 상대적으로 모본인 낙동보다 높은 이병률을 보였다. 사진 측정 결과 및 이병률 비교 평가 결과 그래프를 도 2에 나타내었다.

2. OsABP ₅₇ 유전자 및 PR1b 유전자의 도열병 접종 전·후 발현 확인

도열병 접종 전 및 후에 낙동 및 각 형질전환체에서 OsABP ₅₇ 유전자의 전사량을 RT-PCR로 확인하였다. 도열병 접종 직전, 그리고 도열병 접종 24시간 후 라인당 각각 5개 식물체에서 2장씩의 잎을 수거한 후 이들로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA 1 ug을 template로 하여 cDNA pool 20㎕을 만든 다음 멸균증류수 40㎕를 가하였다. ABP57_1050F　 (5'-aaaatgcccgcatatgaaag-3')와 ABP57_1534R (5'-atttcaggcgcagtagagga-3') 프라이머를 이용하여 RT-PCR한 결과 접종에 상관없이 과발현형질전환체들에서는 OsABP ₅₇ 유전자의 전사량이 낙동 모본에 비하여 월등히 높았고 RNA 간섭 형질전환체들에서는 전사율이 현저히 낮았다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 동일한 cDNA pool에서 각각 UBQ5_83F (5'-cgaagatccaggacaaggag-3')과　 UBQ5_466R (5'-aagcctgctggttgtagacg-3') 프라이머를 이용하여 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자의 전사를 조사한 결과 모든 처리구에서 비교적 고른 발현을 보여 OsABP57 유전자의 발현결과를 신뢰할 수 있었다.

또한, 벼와 도열병의 친화적 관계에서는 방어관련 유전자인 PR1b의 전사가 지연되어 최초의 발현은 접종 후 48 - 60 시간 대에, 그리고 최대 발현은 접종 후 72시간에 관찰된다. 반면 비친화적인 관계에서는 접종 16 - 24 시간 후 PR1b의 최대 전사가 일어난다. OsABP ₅₇ 유전자의 과발현이 PR1b의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상기 cDNA pool에서 PR1b 특이적 프라이머인 OsPR1b_5F (5'-AGGTATCCAAGCTGGCCATTG-3')와 OsPR1b_593R (5'-TATGGACCGTGGACCTGTTTAC-3')을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 접종 전 PR1b의 발현은 낙동을 포함한 모든 식물체에서 거의 관찰할 수 없을 정도로 낮았으나 접종 후 24시간 대에 OsABP ₅₇ 과발현체들에서는 높은 수준의 PR1b 전사가 관찰되었다. 이 결과는 OsABP ₅₇ 전사가 벼 도열병에 대한 벼의 방어관련 태세를 강화시킴을 의미한다고 생각된다.

상기 RT-PCR 결과를 보다 정확하게 계량화하기 위하여 Real Time PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머와 cDNA는 모두 RT-PCR의 경우와 동일하며 합성한 cDNA pool은 BioRad사의 2 × SYBR Green PCR mixture와 MyiQ Real Time PCR 기기를 이용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도열병 접종은 과발현체와 RNA 간섭형질전환체에서 OsABP ₅₇ 유전자의 발현에 큰 영향을 주지 않았지만 PR1b의 발현에는 큰 영향을 주어 OsABP ₅₇ 유전자 과발현체에서는 낙동 모본에 비해 700배 이상의 발현이 관찰되기도 하였다.

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5. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 벼도열병 저항성 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 벼도열병 저항성 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 벼도열병 저항성이 향상된 형질전환 식물체.
6. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물의 벼도열병 저항성을 조절하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물의 벼도열병 저항성을 향상시키는 것에 특징이 있는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 단백질을 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 식물에 형질전환하거나, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 식물세포에 도입하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스, 옥수수, 양파, 파, 부추, 마늘, 택사, 지모, 천문동, 은방울꽃, 패모, 맥문동, 진황정, 여로, 대나무, 호접란(phalaenopsis spp), 춘란(Cymbidium goeringii), 양란(Cymbidium ssp), 덴파레(Dendrobium phalaenopsis), 풍란(Neofinetia falcata), 나도풍란(Aerides japonicum) 카틀레아(Cattleya ssp), 온시디움(oncidium ssp), 브라시아(Brassia ssp), 반다(Vanda ssp), 파피오페딜럼(Paphioedilum ssp), 말토니아(Miltonia ssp) 및 한란(Cymbidium Kanran)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

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